steffany de almeida ferreira...2016/02/24 · o câncer de mama (cid10 - c50) é uma doença...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA
ANÁLISE GLICÔMICA COMPARATIVA DE CARCINOMAS MAMÁRIOS
PRIMÁRIOS E METÁSTASES AXILARES CORRESPONDENTES
STEFFANY DE ALMEIDA FERREIRA
RECIFE
2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA
Steffany de Almeida Ferreira
ANÁLISE GLICÔMICA COMPARATIVA DE CARCINOMAS MAMÁRIOS
PRIMÁRIOS E METÁSTASES AXILARES CORRESPONDENTES
Prof. Dr. Eduardo Isidoro Carneiro Beltrão
RECIFE
2016
Tese de doutoramento apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Inovação
Terapêutica da Universidade Federal de
Pernambuco, como pré-requisito parcial
para a obtenção do Título de doutora em
Inovação Terapêutica.
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Doutorado
PPGIT/UFPE
2016
Não autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por
qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa,
desde que citada a fonte.
Catalogação na Fonte: Bibliotecário Bruno Márcio Gouveia, CRB-4/1788
Ferreira, Steffany de Almeida
Análise glicômica comparativa de carcinomas mamários primários e metástases axiliares correspondentes / Steffany de Almeida Ferreira. – Recife: O Autor, 2016. 120 f.: il.
Orientador: Eduardo Isidoro Carneiro Beltrão Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Inovação Terapêutica, 2016. Inclui referências, anexos e apêndices
1. Mamas – Câncer 2. Câncer – Aspectos genéticos I. Beltrão,
Eduardo Isidoro Carneiro II. Título 616.99449 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2016-080
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica
REITOR
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
VICE-REITORA
Profª. Dra. Florisbela de Arruda Câmara e Siqueira Campos
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Dr. Ernani Rodrigues de Carvalho Neto
DIRETORA DO CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
Profª. Dra. Maria Eduarda de Larrazábal
VICE- DIRETORA DO CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
Profª. Dra. Oliane Maria Correia Magalhães
COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA
Profª. Dra. Maira Galdino da Rocha Pitta
VICE- COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA
Prof. Luiz Alberto Lira Soares
FOLHA DE APROVAÇÃO
Nome: Steffany de Almeida Ferreira
Título: ANÁLISE GLICÔMICA COMPARATIVA DE CARCINOMAS MAMÁRIOS
PRIMÁRIOS E METÁSTASES AXILARES CORRESPONDENTES
Tese apresentada ao programa de Pós-graduação em Inovação Terapêutica vinculado
à Universidade Federal de Pernambuco para obtenção do título de doutora em
Inovação Terapêutica.
Aprovada em: 15/02/2016
Banca Examinadora
Prof. Dr. Eduardo Isidoro Carneiro Beltrão
Instituição: Depto. Bioquímica – Universidade Federal de Pernambuco - UFPE
Assinatura:______________________________________________________
Profa. Dra. Maria Betânia Melo de Oliveira
Instituição: Depto. Bioquímica – Universidade Federal de Pernambuco - UFPE
Assinatura:______________________________________________________
Profa. Dr. Claudio Gabriel Rodrigues
Instituição: Depto Biofísica e Radiobiologia– Universidade Federal de Pernambuco –
UFPE
Assinatura:______________________________________________________
Profa. Dra. Cíntia Renata Costa Rocha
Instituição: Depto. Bioquímica – Universidade Federal de Pernambuco - UFPE
Assinatura:______________________________________________________
Profa. Dra. Sinara Mônica Vitalino de Almeida
Instituição: Universidade de Pernambuco – UPE – Campus Garanhuns
Assinatura:______________________________________________________
DEDICATÓRIA
Às mulheres que direta ou indiretamente participaram deste projeto, em
especial à Cicília Farias.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, por todas as bênçãos e vitórias alcançadas em
minha vida!
Aos meus pais, Cristina e Aguinaldo, pilares de minha construção
enquanto ser humano, cristã, cidadã. Por acreditarem no meu potencial e me
apoiarem em todas as minhas escolhas. Pais melhores eu não poderia ter.
Amo vocês.
Ao meu marido, Márcio, meu eterno namorado, meu companheiro, meu
incentivador. Por compreender minha ausência em tantos momentos inclusive
fins de semana, pelos cuidados e conselhos diários, pelas madrugadas
acordado comigo, me fazendo companhia, me amando!
Aos meus companheiros de jornada, biomédicos extraordinários, amigos
fiéis que a vida acadêmica me trouxe, Amanda Aliança, Isabelle Freire, Jana
Sandes, Renato Silva, Luís Claudio do Nascimento, Lívia Bandeira, Rafael
Freitas, Veridiana Sales e Maria Carolina Accioly.
Aos meus queridos amigos enfermeiros, Mônica Brandão, Gutemberg
Leite, Natália Freitas e Tiago Souza.
À família BmC Juliana Vasconcelos, Jéssica Frutuoso, Bruno Trajano,
Igor Teixeira, Matheus Filgueira, Amanda Rodrigues, Arthur Clark, Aline
Larissa, Juliana Brandão, João Quirino, Diego Albuquerque, Marina Cartaxo,
Tiago Matos, Maria Seabra, Cíntia Rocha, Sinara Almeida e Carmelita
Cavalcanti pela amizade, carinho, solidariedade e convívio harmonioso.
Ao LIKA e todos seus funcionários, por propiciar o ambiente onde pude
desenvolver minha pesquisa.
À Paulo Germano, secretário do PPGIT, pela paciência, disponibilidade
e prestatividade até mesmo estando de férias!
Ao Programa de Pós-graduação em Inovação Terapêutica (PPGIT) e
todo seu corpo docente pela oportunidade e por ser o palco de todos os
ensinamentos adquiridos ao longo destes quatro anos.
À FACEPE, órgão fomentador de meus estudos, por acreditar no meu
projeto e investirem periodicamente recursos para manutenção do mesmo
(bolsa de doutorado).
A todas as mulheres, vítimas de câncer de mama, que aceitaram
participar deste estudo permitindo a execução deste projeto. Vocês são únicas
e guerreiras! E Deus tem uma missão na vida de cada uma.
E, finalmente, ao grande mestre Prof. Eduardo Beltrão, não há como
mensurar a minha admiração, gratidão e afeição por sua pessoa. Mais uma vez
obrigada pela oportunidade de trabalharmos juntos neste novo desafio, pelos
ensinamentos acadêmicos e extra-acadêmicos, por indicar o caminho entre as
pedras, por acreditar no meu potencial, por ser sempre esse ser iluminado,
tranquilo, leve e humano! Serei eternamente grata!
A todos e todas, muito obrigada.
RESUMO
FERREIRA, S. A. Análise glicômica comparativa de carcinomas mamários primários e
metástases axilares correspondentes. 2016. Tese (Doutorado). Universidade Federal
de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil.
O câncer de mama (CID10 - C50) é uma doença complexa que pode adquirir um
caráter mais invasivo e resistente por inúmeras mudanças moleculares que levam a
uma exacerbação da proliferação celular e uma instabilidade genética. A pesquisa
envolvendo linfonodos axilares comprometidos é de grande importância para o
reconhecimento e compreensão dos mecanismos iniciais relacionados ao processo de
metastatização. Evidências histoquímicas demonstram que a sialilação de superfícies
de células tumorais bem como a expressão de glicanos truncados está associada a
um fenótipo de tumor metastático, porém, o estudo deste perfil na metástase linfonodal
é pouco explorada. O objetivo deste estudo foi comparar o perfil de sialilação e a
expressão dos antígenos carboidratos não sialilados associados ao tumor mamário e
nos linfonodos correlacionando com as características clínico-patológicas e
biomarcadores clássicos para câncer de mama. O padrão de sialilação e a expressão
de glicanos truncados foi detectada por histoquímica com lectinas. Utilizou-se
imunohistoquímica para detecção das sialiltransferases e dos marcadores de rotina
para câncer de mama. Houve expressão de ácido siálico, especialmente na posição
α2,6 no tumor primário e no linfonodo axilar o que nos permite pensar na possibilidade
de que clones do tumor primário mantiveram suas características fenotípicas,
influenciadas pela sialilação, durante a invasão e metástase linfonodal. Não foi
verificada diferença significativa entre a expressão de ácido siálico e os biomarcadores
clássicos quer seja no carcinoma mamário quer seja no linfonodo axilar
correspondente. As análises da expressão de β-galactosideo α2,3 e α2,6
sialiltransferases reforçam esta hipótese. Além disso, houve expressão dos antígenos
truncados em ambos os sítios, o antígeno Tn foi mais expresso na metástase
linfonodal podendo ser resultante de um resgate deste antígeno para facilitar a sua
fixação no novo microambiente. A monitorização do perfil de sialilação bem como dos
glicanos truncados não sialilados pode ser importante para o diagnóstico de
metástases de tumores.
Palavras-chave: ácido siálico, antígenos carboidratos associados ao tumor,
carcinoma ductal invasivo, metástase linfonodal
ABSTRACT
FERREIRA, S. A. Glycomics comparative analysis of primary breast tumors and
corresponding axillary metastases. 2016. Thesis (Ph.D.). Federal University of
Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brazil.
Breast cancer (ICD10 - C50) is a complex disease that can acquire a more invasive
and resistant nature of many molecular changes that lead to the exacerbation of cell
proliferation and genetic instability. Research involving compromised axillary lymph
nodes is of great importance to the recognition and understanding of the mechanisms
related to early metastasizing process. Histochemical evidence demonstrates that
sialylation of tumor cell surfaces and the truncated glycan expression is associated with
a metastatic tumor phenotype, however, the study of lymph node metastasis in profile
is little explored. The aim of this study was to compare the sialylation profile and the
expression of non sialylated carbohydrate antigens associated with breast tumor and
lymph nodes correlated with clinicopathological features and classic biomarkers for
breast cancer. The pattern of sialylation and expression of truncated glycans was
detected by lectin histochemistry. Immunohistochemistry was used to detect the
sialyltransferases and routine markers for breast cancer. There was sialic acid
expression, especially in the α2,6 position in the primary tumor and axillary lymph node
which allows us to think about the possibility that the primary tumor clones maintained
their phenotypic characteristics, influenced by sialylation during the invasion and lymph
node metastasis. There was no significant difference between sialic acid expression
and classic biomarkers either in breast carcinoma either in the corresponding axillary
lymph node. The analyzes of β-galactoside expression α2,3 and α2,6 sialyltransferases
reinforce this hypothesis. Furthermore, there was expression of antigens truncated at
both sites, Tn antigen was expressed on most lymph node metastasis can be due to a
rescue of the antigen to facilitate their attachment to the new microenvironment.
Monitoring of sialylation profile as well as truncated sialylated glycans may not be
important for the diagnosis of tumor metastasis
Key-words: sialic acid, carbohydrate antigens associated with tumor, invasive ductal
carcinoma, lymph node metastasis
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribuição proporcional dos tipos de câncer mais incidentes
estimados para 2016, para o sexo feminino, exceto pele não
melanoma
20
Figura 2. Alterações no microambiente tumoral na progressão do câncer
de mama.
21
Figura 3. Organização esquemática da árvore linfática evidenciando o
linfonodo sentinela e demais linfonodos.
25
Figura 4. Classes comuns de glicoconjugados em células de mamíferos
27
Figura 5. Estrutura e biossíntese dos núcleos (core) dos O-glicanos
destacando os antígenos associados ao tumor no câncer de
mama
28
Figura 6. Importantes glicanos associados ao câncer
30
Figura 7. Distribuição de ácidos siálicos na superfície celular 32
Figura 8. Rota simplificada da biossíntese de Neu5Ac 34
Figura 9. Estrutura dos ácidos siálicos mais comuns 35
Artigo 1
Figure 1. Staining pattern of MAL II and SNA lectin. A: Invasive ductal
carcinoma with positive α2,3 sialic acid expression (magnification x
100). B: In Detail, cytoplasmic staining pattern of MAL II
(magnification x 400).C: Invasive ductal carcinoma with positive α2,6
sialic acid expression (original magnification x 100), C: Evaluation of
expression pattern of a2,6 sialic acid between IDC and LNM with
significant difference (p<0,05).
88
Figura 2. Sialyltransferase immunohistochemistry. A: Axillary lymph node
metastasis with positive ST3 Gal 1 expression (magnification x 100).
B: cytoplasmic staining pattern of ST3GAL 1 with lymphocytic infiltrate
surrounding (magnification x 400).C: Breast invasive ductal
carcinoma with positive ST6Gal 1 expression (magnification x 100),
D: cytoplasmic and membrane staining pattern of ST6Gal 1
(magnification x 400).
89
Artigo 2
Figure 1. Lectin histochemistry results. A: Tn antigen staining with VVA
presented significant difference between breast invasive ductal
carcinoma (IDC) and axillary lymph node metastases (LNM),
p=0.0338. B: T antigen staining with PNA was not significant in both
IDC and LNM (p>0,05).
107
Figura 2. Evaluation of antigen Tn expression by VVA lectin. A: Invasive ductal
carcinoma with positive antigen Tn expression (Scale bar: 100μm). B:
In Detail, cytoplasmic staining pattern of VVA (Scale bar: 50μm). C:
lymph node metastases with positive antigen Tn expression (Scale
bar: 100μm). D: In Detail, cytoplasmic and membrane staining pattern
of VVA (Scale bar: 50μm).
108
Figure 3. Evaluation of antigen T expression by PNA lectin. A: Invasive ductal
carcinoma with positive antigen Tn expression (Scale bar: 100μm). B:
In Detail, cytoplasmic staining pattern of PNA (Scale bar: 50μm).
109
LISTA DE TABELAS
Artigo 1
Table 1. Lectin histochemistry of sialic acid (Sia) expression using MAL
II and SNA lectins in breast invasive ductal carcinoma (IDC)
and axillary lymph node metastasis (LNM).
85
Table 2. Immunohistochemistry of β-galactoside α-2,3 sialyltransferase
(ST3Gal.I) and β-galactoside α-2,6 sialyltransferase (ST6Gal.I)
in breast invasive ductal carcinoma and axillary lymph node
metastasis (LNM).
85
Table 3. Relationship between α2,3 Sia expression with
clinicopathologic features and classical immunohistochemical
markers in invasive ductal carcinoma (IDC) and lymph node
metastasis (LNM)
86
Table 4. Relationship between α2,6 Sia expression with
clinicopathologic features and classical immunohistochemical
markers in invasive ductal carcinoma (IDC) and lymph node
metastasis (LNM)
87
Artigo 2
Table 1 Relationship between Tn and T expression with
clinicopathologic features in invasive ductal carcinoma (IDC)
105
Table 2 Evaluation of Tn antigen expression by lectin histochemistry
(VVA) with routine markers in breast invasive ductal
carcinoma (IDC) and axillary lymph node metastasis (LNM).
106
Table 3 Evaluation of T antigen expression by lectin histochemistry (PNA)
with routine markers in breast invasive ductal carcinoma (IDC) and
axillary lymph node metastasis (LNM).
106
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
CIS Carcinoma in situ
CDI Carcinoma ductal invasivo
CDIS Carcinoma ductal in situ
CLIS Carcinoma lobular in situ
CLI Carcinoma lobular invasivo
EMT Transição Epitelial-Mesenquimal (epithelial-mesenchymal
transition)
GnT-V N-acetil-glicosaminiltransferase V
HER-2 Receptor de fator de crescimento epidermal humano do tipo 2
(human epidermal growth factor receptor 2)
INCA Instituto Nacional do Câncer
Ki-67 Citoqueratina 67
LA Linfonodo axilar
LS Linfonodo sentinela
MAL II Maakia amurensis lectin II
ManNAc N-acetil-D-manosamina
Neu5Ac ácido N-acetil-neuramínico
Neu5Gl Ácido N-glicosil-neuramínico
RE Receptor de estrógeno
RNA Ácido ribonucleico (Ribonucleic acid)
RP Receptor de progesterona
Sia Ácido siálico (Sialic acid)
SNA Sambucus nigra agglutinin
STs Sialiltransferases
ST6Gal-I β-galactosideo α2,6 sialiltransferase
ST3Gal-I β-galactosideo α2,3 sialiltransferase
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 18
2 REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................................... 20
2.1 Câncer de mama ..................................................................................................... 20
2.2 Transição epitelial-mesenquimal e metástase ............................................... 22
2.3 Linfonodos axilares e a progressão tumoral .................................................. 24
2.4 Glicosilação e o câncer ........................................................................................ 26
2.5 Ácidos siálicos (Sia) .............................................................................................. 32
2.6 Lectinas: ferramentas na identificação do padrão de glicosilação .......... 36
3 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 40
3.1 Geral ........................................................................................................................... 40
3.2 Específicos ............................................................................................................... 40
4 MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 41
4.1 Materiais ................................................................................................................... 41
4.2 Amostras .................................................................................................................. 41
4.3 Aspectos éticos ...................................................................................................... 42
4.4 Histoquímica com Lectinas ................................................................................. 42
4.5 Imunohistoquímica ................................................................................................ 42
4.6 Hibridização in situ cromógena (CISH) ............................................................ 43
4.7 Análise digital de imagem .................................................................................... 44
4.8 Análise estatística .................................................................................................. 44
5 REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 45
6 ARTIGOS CIENTÍFICOS ................................................................................................ 61
6.1 Artigo 1 ............................................................................................................................ 61
6.2 Artigo 2 ............................................................................................................................ 87
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................................... 107
APÊNDICE A ....................................................................................................................... 108
APÊNDICE B ....................................................................................................................... 113
ANEXO I............................................................................................................................... 118
18
1 INTRODUÇÃO
O câncer de mama (CID10 – C50) é uma doença complexa que pode
adquirir um caráter mais invasivo e resistente por inúmeras mudanças
moleculares que levam a uma proliferação celular exacerbada e manutenção
de uma instabilidade genética. Esta heterogeneidade cria diferentes subgrupos
a nível molecular e causa diferentes resultados clínicos e respostas
terapêuticas (Baskin & Yigitbasi, 2010). O prognóstico/diagnóstico de
neoplasias mamárias é baseado na avaliação de parâmetros histopatológicos,
como acometimento de linfonodos axilares, tamanho do tumor, tipo histológico,
grau da patologia, presença de receptores hormonais (estrógeno e
progesterona) e amplificação do gene do receptor de fator de crescimento
epidermal humano tipo 2, HER-2 (human epidermal growth factor receptor 2)
(Sahai, 2007). A caracterização linfonodal constitui um dos fatores prognósticos
mais relevantes, sendo um componente essencial para avaliar o estadiamento
tumoral (Cavalli, 2009).
A metástase para o linfonodo axilar é uma etapa chave da progressão
tumoral no câncer de mama e está associada com um prognóstico
desfavorável. Entretanto, os mecanismos deste processo não são bem
compreendidos (Thongwatchara et al., 2011). A abordagem cirúrgica da axila
através do esvaziamento linfonodal ou biópsia do linfonodo sentinela é
imperativa, seja com finalidade terapêutica seja para avaliar o curso da doença
(Jacobs & Balch, 2009).
Diversos estudos genômicos foram realizados objetivando a
compreensão e o aprimoramento na identificação de alterações genéticas
relacionadas à carcinogênese mamária e evolução metastática (Vecchi et al.,
2008; Ellsworth et al., 2009). Os diversos genes avaliados, no entanto, não
oferecem informações completas sobre a regulação da expressão gênica,
modificações pós-traducionais e distribuição espaço-temporal dos produtos
protéicos em células e tecidos, essenciais para a elucidação das complexas
vias de interação (Hondermarck et al., 2008). Dentre as modificações pós-
traducionais, a glicosilação é a mais comum (Crespo et al., 2013), estando
19
presente em mais da metade de todas as proteínas humanas (Christiansen et
al., 2014).
A glicosilação pode atuar como um mecanismo-chave regulatório
controlando diversos processos fisiopatológicos. É amplamente conhecido que
a glicosilação aberrante tem sido implicada em muitas doenças diferentes,
devido às alterações associadas com a função biológica e dobramento de
proteínas (Potapenko et al., 2010; Christiansen et al., 2014; Cherian et al.,
2015). Diferentes tipos de glicoconjugados podem interferir com processos
importantes em células de câncer bem como com o microambiente do tumor,
levando a progressão do câncer (Pinho & Reis, 2015).
Em se tratando de glicosilação aberrante, foi observado que durante a
oncogênese há um aumento de sialilação na extremidade dos glicoconjugados,
formando sialilconjugados (Cazet et al., 2010). Níveis altos de antígenos de
carboidratos sialilados associados a tumor são frequentemente descritos como
parte da superfície de células do câncer e/ou secretadas nos fluidos biológicos
(Ferreira et al., 2013a; 2013b).
Análises do perfil glicômico de proteínas plasmáticas de pacientes com
câncer revelaram um aumento nos níveis de glicoproteínas sialiladas (Kyselova
et al., 2008) indicando que este carboidrato tem importância na progressão do
câncer e no seu diagnóstico (Alley & Novotny, 2010). Mudanças na sialilação
de glicoconjugados de superfície celular têm mediado à transição epitelial-
mesenquimal, processo fundamental para a progressão tumoral (Du et al.,
2015).
A glicosilação é vista como modulador do fenótipo maligno de
células cancerosas afetando sua capacidade metastática (Glavey et al., 2015),
além disso, o linfonodo axilar é preferencialmente escolhido por estas células
metastáticas como sítio secundário de colonização. Não há estudos na
literatura que enfoquem o padrão de glicosilação das células tumorais no
linfonodo. É sabido que as metástases são resultado da boa adaptação das
células cancerígenas, que migram de seu sítio primário até o local de
instalação do tumor secundário (Piacentini & Menezes, 2012). Nesse contexto,
a análise comparativa do perfil de glicosilação entre o sítio primário e sítio
secundário de carcinoma mamário pode oferecer informações que confirmem a
participação destes carboidratos no desenvolvimento da metástase mamária.
20
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Câncer de mama
O aumento da expectativa de vida, a transição epidemiológica vivida
atualmente, associados à industrialização e urbanização com exposição a uma
gama de agentes com potencial mutagênico e carcinogênico, têm propiciando
um aumento da incidência de câncer no Brasil e no mundo (Chammas, 2013).
Dentre os cânceres, destaca-se o câncer de mama, tipo mais comum em
mulheres, tanto no mundo desenvolvido quanto no menos desenvolvido.
Estima-se que em todo o mundo mais de 508 000 mulheres morreram em 2011
devido ao câncer de mama (World Health Organization - WHO, 2013).
O número de casos novos de câncer de mama esperado para o Brasil
em 2016 é de 57.960, sendo o mais frequente nas mulheres das regiões
Sudeste, Sul, Centro-Oeste e Nordeste. Na região Norte é o segundo tumor
mais incidente (INCA, 2016) (Figura 1).
Figura 1. Distribuição proporcional dos tipos de câncer mais incidentes estimados para 2016, para o sexo feminino, exceto pele não melanoma
Fonte: INCA, 2016
21
As células fenotipicamente normais (figura 2A) da mama apresentam as
primeiras lesões aparentes como as hiperplasias, onde células epiteliais
apresentam alterações estruturais, mas não atipia citológica, e poucas
alterações genéticas. Na forma de carcinoma in situ (CIS), a atipia citológica se
torna proeminente, com aumento significativo no índice mitótico e nas
alterações genéticas. As células tumorais podem, então, se estabelecer na
área de origem ou romper a membrana basal. Os carcinomas in situ são
caracterizados por apresentarem proliferação de células que permanecem
restritas aos ductos (figura 2B) ou lóbulos mamários. Dentro deste grupo, os
carcinomas ductais in situ (CDIS) podem ser subclassificados seguindo
padrões histomorfológicos do tecido, com os tipos mais frequentes designados
comedo, cribiforme, micropapilar, papilar e sólido (Bateman, 2007).
Figura 2. Alterações no microambiente tumoral na progressão do câncer de mama
Fonte: Adaptado de Cichon et al., 2010.
O carcinoma ductal in situ apresenta uma incidência de cerca de 23%
dos tumores mamários identificados, enquanto os carcinomas lobulares in situ
(CLIS) ocorrem em aproximadamente 3% das pacientes. A evolução destas
neoplasias pode ser muito variável e nem todos os CLIS evoluem para o perfil
invasor. O risco de invasividade, no entanto, é maior em mulheres que
apresentam um CIS primário (Eheman et al., 2009).
O diagnóstico de um carcinoma invasivo, ao contrário do in situ, é
determinado pela capacidade deste de invadir a membrana basal e
22
metastatizar para regiões distantes (Bateman, 2007) (figura 3C). Os
carcinomas ductais invasivos (CDI) são os mais frequentes e compreendem 65
a 80% dos casos de câncer de mama. Estes podem variar em tamanho,
aparência e consistência, dependendo da composição da lesão. O carcinoma
lobular invasor (CLI) abrange cerca de 10% de todos os carcinomas de mama
diagnosticados. Algumas neoplasias mistas, ductal/lobular, também são
observadas na população com taxas variadas de incidência (Eheman et al.,
2009).
A classificação de tumores malignos, incluindo lesões malignas da
mama, utiliza o sistema TNM que avalia prioritariamente a classificação por
extensão anatômica da doença, determinada clínica e histologicamente
(quando possível); onde T se refere à extensão do tumor primário, N à
ausência ou presença de metástase em linfonodos regionais, e M à ausência
ou presença de metástase à distância. Este sistema segue padrões
estabelecidos pela União Internacional de Combate ao Câncer (Brasil, 2010),
no entanto, aplica-se apenas a 80% dos tumores da mama.
2.2 Transição epitelial-mesenquimal e metástase
O processo metastático é complexo e se dá através de uma sequência
de passos distintos resultantes da interação entre as células tumorais e o
microambiente tumoral. Em cada passo, as células tumorais tem de superar os
sistemas de controle do organismo, modificar seu comportamento, alterar suas
características fenotípicas principais e se adaptar a novos ambientes para
desenvolver tumores em sítios distantes da neoplasia original. O primeiro
passo, a invasão, requer um comportamento neoplásico das células epiteliais
tumorais, que as tornem capazes de perder a adesão célula-célula e ganhar
mobilidade. Esse processo inicial capacita as células epiteliais a se desprender
do seu sítio de origem e invadir tecidos adjacentes. No segundo passo,
chamado intravasão, as células tumorais penetram através do endotélio
vascular sanguíneo ou linfático e ganham a circulação sistêmica. Apenas
algumas células tumorais presentes na circulação são capazes de sobreviver
neste ambiente (Valejo, 2010). Dados de estudos pré-clínicos em animais
23
revelam que menos que 0,02% das células tumorais circulantes podem
sobreviver e tem a capacidade de produzir metástases (Kimbung et al., 2015).
Para desenvolver metástase, as células neoplásicas devem invadir e
escapar de complexas barreiras físicas como a matrix extracelular, a
membrana basal e vascular (Vanharanta, 2013; Kimbung et al., 2015). O
terceiro passo é a extravasão, na qual as células tumorais penetram no
endotélio dos capilares e atingem sítios distantes. Neste novo ambiente, um
conjunto menor de células consegue proliferar formando micrometástases que
irão se transformar em tumores metastáticos secundários (Fidler, 2003; Valejo,
2010). Para atravessar todas essas etapas, necessárias à formação da
metástase, as células epiteliais malignas passam por diferentes transformações
tais como inativação do mecanismo de adesão célula-célula e aquisição de
capacidade de migração (Valejo, 2010).
A transição epitélio-mesenquimal (EMT) é um processo de trans-
diferenciação celular que permite que células epiteliais totalmente polarizadas
sofram várias mudanças bioquímicas, sendo capazes de adquirir identidade
mesenquimal e migrar para sítios distantes (Tarin et al., 2005; Thiery &
Sleeman, 2006; Lu et al., 2014). Morfologicamente, EMT é caracterizada pela
perda da adesão celular e aquisição de motilidade celular que correspondem
ao primeiro passo do processo metastático. Ao nível molecular, é caracterizado
pela diminuição da expressão de moléculas de adesão celular e marcadores
epiteliais, como E-caderina e α3 integrina, e um aumento da expressão de
proteínas de filamento intermediário e marcadores de células mesenquimais,
incluindo N-caderina, α-actina de músculo liso (α-SMA) e vimentina (Lu et al.,
2014).
Além das propriedades intrínsecas ao tumor, como acúmulo de
mudanças genéticas nas células transformadas, o microambiente onde está
inserido este tumor, bem como o microambiente no qual as células
metastáticas irão se fixar, desempenham importantes papéis no
desenvolvimento do processo metastático. As metástases são resultado da boa
adaptação das células cancerígenas, permitindo que se descolem de sua
colônia original e se movam através da matriz extracelular do tecido
circundante até a corrente sanguínea e vasos linfáticos até o local de
instalação do tumor secundário (Piacentini & Menezes, 2012). Nesse sentido, é
24
importante analisar como se apresenta o microambiente linfonodal sendo este,
geralmente, o primeiro local de fixação das células com potencial metastático.
É importante salientar que o processo de EMT é reversível, isto é, células
recentemente induzidas a mesenquimais podem, através da transição
mesequimal- epitelial (MET), voltar ao estado epitelial (Chaffer, 2011).
2.3 Linfonodos axilares e a progressão tumoral
A linfadenectomia axilar foi considerada, durante décadas, não só como
elemento prognóstico, mas também como importante recurso terapêutico, pela
baixa incidência de recidivas axilares após este procedimento (1 a 3%)
(Quadros & Gebrim, 2007). A difusão do rastreamento mamográfico,
entretanto, possibilitou o diagnóstico de tumores de menor diâmetro e, assim,
com menor probabilidade de comprometimento axilar, o que gerou
questionamento quanto à necessidade de linfadenectomia axilar (Bos et al.,
2009).
No último século, grandes avanços surgiram na forma de tratar o câncer
de mama (Cavalli, 2009). A remoção radical da glândula e das estruturas
adjacentes foi substituída por cirurgias conservadoras, tornando fundamental a
abordagem clínica de linfonodos axilares (LA). Os linfonodos estão associados
a ductos linfáticos que drenam vários tecidos e atuam como pontos de coleta
para fragmentos subcelulares e células que deixam seu local de origem (figura
3). Isso explica porque os gânglios são rotineiramente examinados para
determinar a presença de células tumorais, como advertência inicial da
presença de metástase (Weinberg, 2008).
Os LAs estão divididos basicamente em três níveis cirúrgicos em sua
disposição anatômica, tendo como referência o músculo peitoral menor, de
acordo com Comitê Unificado Americano em câncer (American Joint
Committee on Cancer - AJCC): nível I corresponde a linfonodos axilares
peitorais (anteriores), subcapsulares (posteriores) e umerais (laterais); nível II
se refere à linfonodos centrais, interpeitorais (Rotter) e alguns apicais; o nível
III, linfonodos axilares apicais (Mariani et al., 2001).
25
Figura 3. Organização esquemática da árvore linfática evidenciando o linfonodo sentinela e demais linfonodos.
Fonte: Adaptado de Mariani et al., 2001.
É sabido que fatores biológicos podem afetar a predileção de algumas
células malignas para elas seletivamente invadirem os gânglios linfáticos, ao
invés de órgãos viscerais, assim como certos tipos de tumores mestatizam
para certos órgãos e outros não (Fidler, 2003; Amersi & Giuliano, 2013). As
metástases para os linfonodos não são aleatórias. O linfonodo sentinela (LS) é
considerado o primeiro a receber a drenagem linfática da área tumoral,
decorrente da progressão ordenada de células pelo sistema linfático (Quadros
& Gebrim, 2007). Alguns autores (Rack et al., 2003; Vona-Davis et al., 2014)
têm constatado que o comprometimento linfonodal axilar no momento do
diagnóstico é um biomarcador de um fenótipo agressivo.
O reconhecimento da complexidade da biologia do tumor tem mudado o
tratamento do câncer, com uso mais liberal da terapia sistêmica para tratar
células cancerígenas ocultas onde quer que estejam no corpo.
Consequentemente, a decisão de administrar terapias sistêmicas é influenciada
por uma variedade de fatores relacionados ao paciente e ao tumor, com a
influência do status do gânglio linfático, mas não necessariamente ditando o
uso da quimioterapia (Paik et al., 2006; Albain et al., 2010). A presença ou
ausência de metástase linfonodal e o número de linfonodos positivos com
26
metástases determina a fase patológica do paciente. A metástase para o
linfonodo axilar continua a ser o mais importante preditor de recorrência geral e
sobrevivência em pacientes com câncer de mama (Amersi & Giuliano, 2013).
Apesar do conhecimento da condição dos linfonodos axilares ser
considerado a mais importante das informações prognósticas (Abreu &
Koifman, 2002), estando a metástase nos linfonodos axilares associada com
um risco elevado de recidiva (Barekati et al., 2012), não há estudos na
literatura que investiguem o padrão de glicosilação, especialmente o padrão de
sialilação, nas células metastáticas presentes neste sítio.
2.4 Glicosilação e o câncer
A glicosilação, modificação pós-traducional em organismos superiores,
consiste num processo biológico de adição ou remoção de um ou mais glicanos
a proteínas ou lipídeos, formando glicoconjugados (Campbel & Yarema, 2005),
alterando, assim, a sua estabilidade e função (Gill et al., 2010).
As cadeias sacarídicas presentes nos glicoconjugados são constituídas
por três regiões principais: a) o núcleo ou core, região onde se encontram os
carboidratos maís próximos do sítio de união com a cadeia polipeptídica; b) o
esqueleto, região onde o comprimento do oligossacarídeo é determinado e; c)
região periférica, onde se encontram os antígenos de importância biológica
como, por exemplo, os antígenos de grupo sanguíneo em glicolipídios (Velasco
et al., 2008)
Os glicoconjugados (figura 4), dependendo da molécula a que os
glicanos se ligam, podem ser glicoproteínas, glicolipideos, proteoglicanos ou
interações proteína-glicanos como lectinas (a interação é fraca e pode ser
revertida facilmente diferentemente dos exemplos anteriores),
glicosiltransferases e glicosidases –enzimas que podem ser ou não glicosiladas
e assim se tornam ou não glicoproteínas (Gill et al., 2010).
As glicoproteínas carregam um ou mais glicanos ligados covalentemente
a um esqueleto de polipeptídeo, usualmente via ligações de nitrogênio ou
oxigênio , nestes casos eles são conhecidos como N- glicanos ou O- glicanos ,
respectivamente (Pinho & Reis, 2015).
27
Figura 4. Classes comuns de glicoconjugados presentes na superfície celular de células de mamíferos.
Fonte: Adaptado de Pinho & Reis, 2015. Gal: galactose, GalNAc: N-acetilgalactosamina, Glc: glicose, GlcNAc: N-acetilglicosamina, Man: manose, GlcN: N-glicosamina, Xyl: xilose, Fuc: fucose, GlcA: ácido glicurônico, Sialic acid: ácido siálico, GPI: Glicosilfosfatidilinositol
Os N-glicanos, que geralmente apresentam um resíduo de N-acetil-D
glicosamina (GlcNAc) unida ao nitrogênio da asparagina (Asn), na sequência
Asn-X-Ser/Thr onde X pode ser qualquer resíduo de aminoácido menos Ser,
são classificados em três grandes grupos: a) com um alto conteúdo de manose
(Man) em sua estrutura, b) as estruturas de tipo lactosamínico, as quais têm
como característica principal a presença de Galβ(1-4)GlcNAc e c) as estruturas
híbridas, misto de estruturas lactosamínicas e de manoses (Velasco et al.,
2008). Por outro lado, os O-glicanos possuem uma N-acetil-D-galactosamina
(GalNAc) ligada a hidroxila de uma serina (Ser) ou de uma treonina (Thr) da
cadeia polipeptídica e apresentam uma maior variedade de estruturas que os
N-glicanos, sendo descritos cerca de oito núcleos (core) diferentes dos quais
se derivam as demais estruturas oligossacarídicas presentes nas O-
glicoproteínas (figura 5). Por sua complexidade e diversidade, os O-glicanos
participam de diversas funções como conformação da estrutura secundária,
terciária e quaternária de proteínas, como as mucinas, e evitam a agregação
de proteínas (Carraway & Hull, 1991; Velasco et al., 2008).
28
Figura 5. Estrutura e biossíntese dos núcleos (core) dos O-glicanos destacando os antígenos associados ao tumor no câncer de mama.
Fonte: Velasco, 2008.
Outras classes de glicoconjugados incluem os proteoglicanos e os
glicoesfingolipídeos. Proteoglicanos são glicoconjugados que tem um ou mais
glicosaminoglicano (GAG), como o sulfato de condroitina, sulfato de heparan e
sulfato de keratan (Varki, 2009; Pinto & Reis, 2015).
Proteínas de membrana e de secreção tem a glicosilação como um
evento prevalente em membrana e as proteínas secretadas desempenham um
papel decisivo em eventos de reconhecimento celulares envolvidos na adesão
celular, comunicação célula a célula e interação receptor-ligante (Taniguchi et
al., 2006; Yang et al., 2011). Os glicanos também influenciam criticamente as
propriedades físico-químicas das proteínas com impacto no dobramento da
proteína, solubilidade e turnover (Varki et al., 2009). Como resultado direto de
sua importância em uma variedade de processos biológicos e patológicos,
alterações na glicosilação de proteínas estão fortemente correlacionadas com o
29
prognóstico do câncer e propriedades das células tumorais malignas (Yang et
al., 2011).
As mudanças na glicosilação associadas com a transformação
oncogênica vêm sendo descritas há mais de seis décadas (Hakomori &
Murakami, 1968; Pinho & Reis, 2015). Estas observações foram fortalecidas
com o advento da tecnologia de anticorpos monoclonais, que mostraram que
os anticorpos tumor-específicos eram dirigidos contra epítopos de carboidratos
e, em muitos casos, eram antígenos oncofetais presentes em glicoproteínas e
glicoesfingolipídeos do tumor (Feizi, 1985; Holmes et al., 1987; Pinho & Reis,
2015).
As células tumorais exibem uma vasta gama de alterações na
glicosilação em comparação com suas contrapartes não-transformadas (Pinho
& Reis, 2015). De fato, uma das consequências da transformação maligna são
as mudanças na glicosilação, sobretudo na etapa de elongação de O-glicanos
determinando que alguns tipos de núcleos, que nas células normais se
encontram mascarados/disfarçados pela adição de outros açúcares, fiquem
expostos na superfície celular, resultando na formação de novos antígenos
associados ao câncer (figura 6). Os antígenos mais caracterizados no câncer
de mama são os antígenos Tn [GalNAc(α1-O-)Ser/Thr], o sialil-Tn [NeuA(α2-
6)GalNAc(α1-O-)Ser/Thr], o T ou TF [Gal(β1-3)GalNAc(α1-O-)Ser/Thr] e sialil-T
[NeuA(α2-6)Neu(α2-3)Gal(β1-3)GalNAc(α1-O-)Ser/Thr] (Brockhausen, 2006)
(figura 6). A expressão destes antígenos é o resultado de uma glicosilação
incompleta, originando cadeias de proteínas com oligossacarídeos curtos,
expondo carboidratos que se encontravam mascarados pela adição de outros
açúcares e originando novos antígenos. A expressão destes antígenos é
geralmente descontínua ao longo da cadeia polipeptídica (Velasco et al., 2008).
O antígeno T é um precursor do Core 2 dos O-glicanos, que pode ser
desmascarado se a célula cancerígena perder sua habilidade de sintetizá-lo.
Este antígeno consiste em uma estrutura Core 1 não sialilada (Galβ1-
3GalNAcαSer/Thr) inicialmente descrita em glicoforinas de células vermelhas
(Cazet et al., 2010).
Georg Springer foi o pioneiro no estudo do antígeno T no câncer de
mama. Utilizando um anti-soro anti-T, ele demonstrou que todas as células do
30
tumor mamário, mas não lesões benignas ou as glândulas mamárias normais,
expressavam o antígeno T (Cazet et al., 2010).
O antígeno Tn é o precursor do antígeno T ou TF que se forma pela
ação de uma β-galactosiltransferase, a qual pode estar bloqueada e provocar
uma sialilação precoce do antígeno (Zhuang at al., 1991), que normalmente se
encontra substituído por galactose (Gal) ou N-acetilglicosamina (GlcNAc), o
que permite a formação do esqueleto de oligossacarídeos e finalmente sua
terminação com a adição do ácido siálico (Sia). A expressão do antígeno sialil-
Tn está associada a diferentes carcinomas, como o adenocarcinoma gástrico
difuso, os cânceres de pulmão, cervico-uterino e de fígado (Cao et al., 1999;
Velasco, 2008).
Outras alterações aberrantes no perfil glicômico normal do soro têm sido
relatados para vários cânceres (Kyselova et al., 2008) e estas alterações têm
sido sugeridas, também, como uma possibilidade para a detecção precoce da
doença. Curiosamente, muitas das proteínas previamente relatadas como
indicadoras para câncer de mama são glicosiladas e outras glicoproteínas
específicas têm sido implicadas como indicadores de outros cânceres (Alley &
Novotny, 2010).
Figura 6. Importantes glicanos associados ao câncer.
Fonte: Adaptado de Pinho & Reis, 2015. Gal: galactose, GalNAc:
N‑acetilgalactosamina, Man: mannose, Fuc: fucose.
31
As mais frequentes mudanças que ocorrem na glicosilação aberrante de
células cancerígenas são sialilação, fucosilação, truncação de O-glicanos e N e
O-ramificações ligadas a glicanos (Hakomori, 2002; Arnold et al., 2008;
Christiansen et al., 2014; Pinho & Reis, 2015). Estes glicanos tumor-específicos
são considerados marcos (hallmarks) de células cancerígenas. A maior parte
inclui um aumento da sialilação (Hakomori, 2002; Pinho &Reis, 2015).
O aumento da sialilação é uma característica bem conhecida de células
transformadas (Cazet et al., 2010). Tal aumento tem sido, também, uma
característica em tecidos cancerígenos e sangue de pacientes com câncer de
mama (Ozturk et al., 2011). A sialilação é uma importante modificação na
glicosilação celular, os carboidratos sialilados têm um importante papel no
reconhecimento celular, adesão celular e sinalização celular. Um aumento na
sialilação global, especialmente na sialilação α2,6 e α2,3, tem sido associado
ao câncer. As cadeias lactosamínicas são frequentemente finalizadas com
ácido siálico (Pinho & Reis, 2015).
As glicoproteínas de superfície celular geralmente contêm ácido siálico
localizado no terminal não-redutor da cadeia sacarídica. Evidências
histoquímicas demonstram que a sialilação de superfícies de células tumorais
está associada a um fenótipo de tumor metastático (Varki & Varki, 2007). De
fato, a sialilação aberrante é mais frequente em células de tumores malignos.
Os ácidos siálicos, como monossacarídeos terminais, são adicionados à
proteína ou porções lipídicas, ligados a Galβ1, 3 GlcNAc / Glc através α2, 3 ou
α2,6 sendo mediados por uma variedade de processos patológicos. Os
resíduos de ácido siálico alterados estão intimamente associados com o
fenótipo maligno de células tumorais e potencial metastático (Cui et al., 2011).
Estas mudanças de sialilação na superfície têm sido relatadas refletindo a
quantidade, tipo, distribuição e colagem de ácidos siálicos de moléculas
adjacentes. Por exemplo, uma correlação positiva pode ser estabelecida entre
os níveis de sialilação de superfície celular e capacidade metastática de vários
tumores experimentais (Babál et al., 2006). Assim, a exploração das mudanças
da sialilação na superfície celular durante o desenvolvimento do tumor e a
progressão da doença pode oferecer excelentes oportunidades para identificar
biomarcadores de câncer sensíveis e específicos (Yang et al., 2011).
32
2.5 Ácidos siálicos (Sia)
A presença de Sia foi observada pela primeira vez por Levene &
Landsteiner (1927) nos EUA e por Walz (1927), na Alemanha, um açúcar
associado a lipídios purificados de animais que reagiram com reagente de Bial
originando uma cor púrpura, em vez da típica coloração verde (Sato & Kitajima,
2013).
Os ácidos siálicos (Sia) são derivados do ácido neuramínico, no qual o
grupo amino é substituído por um grupo acetila ou glicolil. São
monossacarídeos terminais em glicanos de glicoconjugados (ambos
glicolipídeos e glicoproteínas) expressos na superfície celular dos tecidos de
animais e microrganismos (figura 7). Sia são importantes em interações
extracelulares em virtude de sua posição terminal em glicoconjugados. Assim,
podem também ser parte de sítios de reconhecimento para a ligação de
agentes patogênicos (Varki & Varki, 2007).
Figura 7. Distribuição de ácidos siálicos na superfície celular
Fonte: Adaptado de Varki, 2007. Glc: glicose, Gal: galactose, Man: manose, GlcNAc: N-acetilglicosamina, GalNAc: N-acetilgalactosamina, Fuc: fucose, Sia: ácido siálico.
33
A estrutura destes ácidos siálicos possui carga negativa devido ao grupo
carboxílico. As variadas ligações que podem ser estabelecidas entre o átomo
de carbono na posição 2 dos ácidos siálicos e os glicanos, juntamente com as
corretas substituições ao nível dos átomos das posições 4, 5, 7, 8 e 9, originam
uma elevada diversidade destes açúcares (Varki et al., 2009). Os dois ácidos
siálicos mais prevalentes nas células de mamíferos são o ácido N-
glicolilneuramínico (Neu5Gc) e o ácido N-acetil neuramínico (Neu5Ac). A
principal diferença entre ambos é a presença de um átomo de oxigênio no
grupo N-glicolil do Neu5Gc (Varki, 2007).
Os ácidos siálicos são uma família de carboidratos complexos de nove
carbonos, normalmente ligados a outros carboidratos por meio de ligações α-
cetosídicas, que ocorrem na natureza em cerca de 50 tipos. Estes tipos diferem
entre si por variações do grau de substituição e oxidação no esqueleto
carbônico e têm como molécula precursora a N-acetil-D-manosamina
(ManNAc) (Varki, 2007) (Figura 8). Este precursor é biossintetizado a partir de
UDP-N-acetil-D-glicosamina, uma molécula obtida em meio intracelular ou a
partir de N-acetil-D-glicosamina (GlcNAc), com participação da enzima N-acetil-
D-glicosamina-2-epimerase (de Fátima et al., 2005) (Figura 8). A N-acetil-D-
manosamina produzida é fosforilada em C6 pela enzima N-acetil-D-
manosamina-6-quinase. A ação da enzima Neu5Ac aldolase (também
conhecida como ácido siálico 9-P sintase) sobre a N-acetil-D-manosamina6-
fosfato, na presença de fosfoenolpiruvato (FEP), gera uma base de Schiff e,
subsequentemente, o ácido siálico-9-P (ácido N-acetilneuramínico 9-fosfato)
(Figura 8). A perda do grupamento fosfato, mediada pela enzima ácido siálico
9-fosfato fosfatase fornece o ácido siálico (ácido N-acetilneuramínico –
Neu5Ac) livre que é direcionado ao núcleo da célula. Neste compartimento, o
ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) é ativado à custa de hidrólise de citidina
trifosfato (CTP), sendo formado CMP-ácido siálico que é transportado para o
complexo de Golgi (Jacobs et al., 2001). Após o seu transporte ativo na rede de
Golgi, a biossíntese de glicoconjugados sialilados é completada pela
transferência de Neu5Ac a ambas glicoproteínas e glicolipídeos nascentes
(Bayer et al., 2013), por ação de enzimas denominadas sialiltransferases
(Jacobs et al., 2001). Assim, glicoproteínas ou glicolipídeos sialilados são
secretados ou incorporados à membrana plasmática da célula (figura 8).
34
Figura 8. Rota simplificada da biossíntese do ácido N-acetil neuramínico (Neu5Ac).
Fonte: de Fátima et al., 2005.
O ácido siálico mais abundante existente em eucariotos é o ácido N-
acetil neuramínico (ácido 5-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-α-D-galacto-non-
2-ulopiranosônico - Neu5Ac), que foi isolado pela primeira vez por Gottschalk e
colaboradores (Gottschalk, 1951; de Fátima et al., 2005). Outros derivados
comuns, porém encontrados em menor quantidade, são ácido N-glicolil
neuramínico (Neu5Gl) e 5-hidroxineuramínico (ácido 3- desoxi-D-glicero-α-D-
galacto-non-2-ulopiranosônico - KDN) (Figura 9). Como componentes de
glicoconjugados, os ácidos siálicos são encontrados ligados a hexoses, como
α(2,3)- ou α(2,6)-β-Gal ou β-GalNHR e ligados a outros ácidos siálicos como
α(2,8) (de Fátima et al., 2005).
35
Figura 9. Estrutura dos ácidos siálicos mais comuns
Fonte: de Fátima et al., 2005. Ácido N-acetil neuramínico (Neu5Ac), ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc), ácido 3- desoxi-D-glicero-α-D-galacto-non-2-ulopiranosônico (KDN)
Durante as últimas décadas, muitos estudos têm elucidado estes
monossacarídeos ácidos para serem crucialmente associados aos diversos
processos biológicos (Bayer et al., 2013). Os ácidos siálicos estão intimamente
envolvidos em processos biológicos fundamentais à manutenção da vida, mas
em funções diferentes daquelas normalmente atribuídas a carboidratos como
armazenadores de energia (glicogênio e amido, por exemplo) ou como
componentes de blocos estruturais (quitina e celulose) (Berg et al., 2002; de
Fátima et al., 2005). Exemplos do papel dos ácidos siálicos em processos
biológicos incluem as funções de mediadores na adesão célula-célula,
mediadores na comunicação intercelular, renovadores celulares, receptores
para bactérias e vírus (Wilson et al, 2003; de Fátima et al., 2005), interações na
fertilização, a diferenciação, eventos imunológicos e neurológicos (Angata &
Varki, 2002; Sato & Kitajima, 2013). A posição de abertura máxima de resíduos
de ácido siálico em glicoproteínas e glicolipídeos torna-os acessíveis a
numerosos elementos de comunicação celular envolvidos na formação de
contatos com os componentes da mesma célula ou com células vizinhas, com
matriz extracelular ou com agentes patogênicos invasores (Bayer et al., 2013).
Em eritrócitos, os ácidos siálicos são mediadores na renovação celular.
Um dos eventos biológicos que determinam a “idade” do eritrócito, cuja vida
média é de aproximadamente 120 dias, é a perda dos resíduos de ácidos
siálicos presentes em seus glicoconjugados de membrana. As unidades de
ácidos siálicos encontradas nas extremidades protegem essas células da
captação pelo fígado. Quando os eritrócitos estão velhos e prontos para a
36
destruição e reposição, ocorre a remoção dos ácidos siálicos terminais pela
enzima sialidase expondo resíduos de galactose, que interagem com
receptores dos hepatócitos (de Fátima et al., 2005).
Uma das principais necessidades na pesquisa moderna do câncer de
mama é compreender os mecanismos moleculares que conduzem as células
tumorais à metástase, incluindo como e quando ocorre a ativação de novas
capacidades. A investigação da presença ou ausência de ácidos siálicos nos
diferentes sítios como tumor primário, linfonodos e plasma sanguíneo pode ser
de grande importância para o reconhecimento e compreensão dos mecanismos
iniciais relacionados ao processo de metastização. Além disso, a identificação
de glicoproteínas sialiladas comuns a estes sítios, passíveis de envolvimento
nesta etapa da carcinogênese mamária, podem auxiliar diretamente na busca
por novos marcadores moleculares para a detecção precoce de metástases e
prognóstico.
2.6 Lectinas: ferramentas na identificação do padrão de glicosilação
No final do século XIX, começaram a surgir evidências sobre a presença
na natureza de proteínas que possuíam a habilidade de aglutinar eritrócitos.
Estas proteínas foram referidas como hemaglutininas, ou fitoaglutininas, pois
elas foram originalmente encontradas em extratos de plantas. É consenso
acreditar que a primeira descrição de uma hemaglutinina foi feita por Peter
Hermann Stillmark na sua tese de doutorado apresentada em 1888 (Zanetti,
2007).
Em 1952, Watkins e Morgan demonstraram que a atividade aglutinante,
observada nas até então chamadas hemaglutininas, estava baseada na
atividade específica de ligação de uma dada lectina a carboidratos (Van
Damme et al., 1998). O termo lectina, do latim legere, foi proposto em 1954 por
Boyd e Sharpleigh, enfatizando a propriedade de algumas proteínas
aglutinarem seletivamente distintos tipos celulares, uma vez que o termo
significa escolher, selecionar (Van Damme et al., 1998; Van Damme, 2011).
Tão logo o reconhecimento das lectinas como moléculas ligantes a
carboidratos, as mesmas puderam ser distinguidas das outras proteínas com
base em critérios funcionais bem definidos. Devido a sua habilidade de se ligar
37
a carboidratos de forma altamente específica e geralmente reversível e sem
alterar a estrutura dos ligantes reconhecidos, as lectinas têm se destacado
como importantes ferramentas em pesquisas englobando diversas áreas da
ciência, em especial na bioquímica, na biologia celular e molecular, na
imunologia, na farmacologia, na medicina e análises clínicas (Lima, 2010).
Estudos têm empregado lectinas como potenciais anticarcinogênicos
(De Meija et al., 2003), conjugadas a agentes quimioterápicos úteis no
tratamento de tumores induzidos em animais (Haseenabeevi et al., 1991;
Pawar & Vavia, 2015) ou como sonda alternativa em imagens celulares e
biomarcadores (Weng et al., 2006; Ferreira et al., 2013a).
O interesse nas lectinas se intensificou quando se descobriu que elas
são ferramentas extremamente valiosas para investigação de glicanos de
superfície celular, para determinação do papel na diferenciação e crescimento
celular, nas interações de células com seu nicho e também numa variedade de
processos patológicos (Sharon, 2007).
Os maiores avanços em histoquímica advieram da descoberta das
lectinas promovendo um enorme impacto na biologia e histopatologia celular.
Por muitos anos, as lectinas foram usadas para isolar e purificar glicoproteínas
e determinar a posição de glicoconjugados nas células. As funções celulares
dos carboidratos unidos às proteínas foram relatadas e observou-se que eram
afetadas pela glicosilação e subsequentemente modificações e rearranjos ou
adição de açúcares em processos patológicos (Yamamotoa et al., 2005). As
lectinas, com suas propriedades exclusivas, se ligam a carboidratos específicos
presentes nos glicoconjugados na superfície celular permitindo uma
visualização das modificações na distribuição e arquitetura destes açúcares
frente a diferentes processos patológicos (Sharon, 2007).
Os primeiros estudos de cânceres empregando histoquímica com
lectinas foram realizados por Klein e colaboradores (1981). Os estudos
histoquímicos e/ou imunohistoquímicos, em que reações químicas são
realizadas em secções histológicas, são particularmente úteis para demonstrar
a arquitetura estromal de um tumor, por ressaltar estruturas da matriz
extracelular e frequentemente a dimensão da extensão tumoral. As lectinas
funcionam como ligantes de vários glicoconjugados que se encontram em
38
proporções variadas em diferentes membranas celulares e fluídos fisiológicos,
refletindo a diversidade de seus papéis biológicos (Sharon & Lis, 2004).
Dessa forma, devido à série de mudanças bioquímicas, como variações
do perfil de expressão de carboidratos, que ocorrem num ambiente celular em
processos neoplásicos, as lectinas tornam-se interessantes ferramentas
diagnósticas na diferenciação histoquímica para glicoconjugados de superfície
e intracelulares de células transformadas (Beltrão et al., 2001, 2003; Rego &
Beltrão, 2009; Sobral et al., 2010; Lima et al., 2010; Melo-Júnior et al., 2011;
Melo et al., 2011; Ferreira et al., 2013a; Dos Santos et al., 2014).
Dentre as lectinas, com uso em histoquímica, que reconhecem Sia
podemos citar a Sambucus nigra L. como fonte da SNA (Sambucus nigra
agglutinin). A árvore contém muitos componentes nas flores, frutos e casca que
podem ser explorados por suas propriedades anti-inflamatória, antiviral, anti-
proliferativa e inseticida, entre outros (Vandenbussche et al., 2004; Roschek et
al., 2009). Algumas destas propriedades parecem estar relacionadas com
lectinas conhecidas como Sambucus nigra agglutinins, das quais existem seis
subtipos conhecidos. A isoforma SNA I têm especificidade de ligação pela
sequência sacarídica NeuAc (α2, 6) Gal/GalNAc, isto é, reconhece resíduos de
ácido siálico na posição α2,6 (Shibuya et al., 1987; Lópes-Morales et al., 2010).
Já a MAA é uma lectina isolada da semente da planta Maackia
amurensis com fraco potencial hemaglutinante e forte potencial
leucoaglutinante para o linfoma de células de rato Bw5147 (Wang &
Cummings, 1987). Sua especificidade de ligação a carboidratos foi
determinada, em 1987, por Wang e Cummings. Estes autores observaram que
esta lectina reconhece a sequência trissacarídica NeuAc (α2,3)-Gal
β1,4GlcNAc/Glc, isto é, resíduos de ácidos siálicos na posição α2,3. A conexão
entre a marcação de MAA e o comportamento de invasão e metástase das
células cancerígenas foi analisada em alguns tumores e o resultado mostrou
uma estreita associação entre a marcação com esta lectina e a progressão
tumoral em cânceres gástricos e de pele não melanoma (Tang et al., 2003;
Wang et al., 2009; Jun et al., 2012; Ferreira et al., 2013a).
Outros exemplos de lectinas com especificidades carboidráticas
diferentes são; a VVA (Vicia Villosa agglutinin) que reconhece,
39
preferencialmente, resíduos terminais de α- ou β N-acetilgalactosamina,
especialmente resíduos de α-N-acetilgalactosamina ligados a serina ou
treonina de um polipeptídeo, o antígeno Tn (Kawaguchi et al., 2006) e a PNA
(Peanut agglutinin), lectina extraída do amendoim, que se liga ao antígeno
oncofetal de Thomsen-Friedenreich (Galβ1-3GalNacα-, ou antígeno T),
mostrando especificidade para câncer ou epitélio pré-cancerígeno (Campbell,
1995).
40
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Comparar o perfil de sialilação de glicoconjugados e a expressão dos
antígenos carboidratos não sialilados associados ao tumor em carcinoma
ductal invasivo (CDI) mamários humanos primários e linfonodos axilares
metastáticos (LNM) correspondentes.
3.2 Específicos
- Avaliar a expressão de ácido siálico por meio da histoquímica com as lectinas
Sambucus nigra agglutinin (SNA) e Maakia amurensis lectin (MAL II) em
carcinomas mamários primários, em linfonodos axilares correspondentes e
tecidos mamários saudáveis;
- Avaliar a expressão de β-galactosideo α2,3 sialiltransferase (ST3Gal I) e β-
galactosideo α-2,6 sialiltransferase (ST6Gal I) em carcinomas mamários
primários, em linfonodos axilares correspondentes e tecidos mamários
saudáveis através da imunohistoquímica;
- Avaliar a expressão de O-glicanos truncados, não sialilados, associados ao
câncer tais como antígeno T e antígeno Tn através da histoquímica com as
lectinas Vicia villosa aglutinin (VVA) e Peanut agglutinin (PNA) em carcinomas
mamários primários, em linfonodos axilares correspondentes e em tecidos
mamários saudáveis;
- Identificar a expressão de marcadores moleculares clássicos de carcinomas
mamários tais como receptor de estrógeno (RE), receptor de progesterona
(RP), Receptor de fator de crescimento epidermal humano do tipo 2 (HER-2) e
citoqueratina 67 (Ki-67) através da técnica de imunohistoquímica;
- Correlacionar o padrão de glicosilação para os açúcares alvo e a expressão
dos marcadores moleculares mamários de rotina em carcinomas mamários
primários e em linfonodos axilares correspondentes;
- Correlacionar às características clinico-patológicas e o perfil dos marcadores
moleculares mamários encontrados com a expressão de ácido siálico em
carcinomas mamários primários e em linfonodos axilares correspondentes;
41
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais
Lectinas biotiniladas (Vector Lab, USA): Sambucus nigra agglutinin
(SNA), Maakia amurensis Lectin (MAL II), Vicia villosa aglutinin (VVA) e Peanut
agglutinin (PNA). Anticorpos monoclonais: anti-ST3Gal 1 (AV45410) e anti-ST6
Gal 1 (WH0006480M1) da SIGMA, USA; anti-receptor de progesterona (AB-
52), anti-β-receptor de estrógeno (L-20) e anti-Ki-67 (M-19) da Santa Cruz
Biotech, USA. Anticorpo policlonal anti-HER-2 (A0485) da DAKO, USA. Kit
biotina-estreptavidina-peroxidase (ADVANCETM HRP KIT) e a diaminobenzidina
(DAB) da DAKO, USA. Todos os demais reagentes foram obtidos em grau
analítico.
4.2 Amostras
As biópsias (n=98) de tecido mamário fixadas em formalina e embebidas
em parafina, diagnosticadas como carcinoma ductal invasivo (CDI), oriundas do
Serviço de Anatomia patológica do Hospital das Clínicas (HC/UFPE) foram
obtidas respeitando o intervalo temporal de janeiro de 2009 a dezembro de
2013. Foram selecionadas para o presente estudo as amostras (n=73) que
obedeceram aos seguintes critérios de inclusão: a) disponibilização dos dados
clinico-patológicos (idade, tamanho do tumor, estadiamento, grau histológico,
grau nuclear e status linfonodal); b) liberação dos blocos com tecido
parafinizado pelo setor de Anatomia patológica e; c) quantidade de massa
tumoral representativa para estudos histológicos. Para análise comparativa do
padrão de glicosilação foram selecionados, a partir destas amostras, 43 casos
de CDI com significativo comprometimento linfonodal (presença de metástase
em pelo menos 2 linfonodos axilares correspondentes). Foram excluídas do
estudo as amostras que não obedeceram aos critérios de inclusão. Todas as
amostras foram submetidas a uma segunda análise por patologista para
confirmação do diagnóstico. Posteriormente foram encaminhados ao Setor de
Patologia do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) para serem
submetidas a cortes histológicos. Os controles normais negativos para
42
neoplasias (n=11) foram selecionados a partir de blocos embebidos em
parafina resultantes de casos de mastoplastia redutora realizadas no Hospital
das Clínicas.
4.3 Aspectos éticos
O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética do Centro de
Ciências da Saúde (CCS) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) e
possui n° CAEE: 06586612.9.0000.5208 — No. 140.876 (Anexo I).
4.4 Histoquímica com Lectinas
De acordo com o protocolo de Beltrão et al., (2001), cortes histológicos
(4µm), montados em lâminas albuminizadas, foram desparafinizados em xilol e
hidratados em álcool etílico (100% e 70%). Em seguida foram tratados com
uma solução de tripsina 0,1% (p/v) a 37°C por 2 minutos e incubados com as
lectinas Sambucus nigra agglutinin (SNA) ou Maackia amurensis lectin II (MAL
II) conjugadas a biotina (na concentração de 20µg/mL e 40µg/mL,
respectivamente) por 2 horas a 4°C. A revelação da ligação lectina-carboidrato
foi visualizada com o kit estreptavidina-biotina-peroxidase e revelada com uma
solução de diaminobenzidina e peróxido de hidrogênio (H2O2). Os cortes foram
contra-corados com hematoxilina. Todas as lavagens entre as etapas descritas,
foram realizadas com tampão fosfato de sódio 100mM, pH 7,2, suplementado
com NaCl 150mM (PBS). Para o controle negativo da histoquímica, foi
realizado um ensaio de inibição das lectinas com ácido siálico (100 a 300 mM)
bem como substituição das lectinas por tampão PBS.
4.5 Imunohistoquímica
De acordo com Ferreira et al. (2013b), cortes histológicos (4µm),
montados em lâminas albuminizadas, foram desparafinizados em xilol e
hidratados em álcool etílico (100% e 70%). Em seguida foi realizada incubação
em hidróxido de amônio (NH4OH) por 10 minutos com posterior etapa de
43
recuperação antigênica em tampão citrato à 10mM, pH 6.0 em câmara de
vapor de água (STIMER) por 30 minutos. Após o resfriamento, os cortes foram
incubados com solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) em metanol (1:1) por
30 minutos a 25ºC seguido de incubação com solução de albumina sérica
bovina (bovine serum albumin - BSA) a 1% em PBS por 45 minutos a 25°C. Na
etapa seguinte, os tecidos foram incubados com os anticorpos anti-receptor β
de estrógeno (L-20, 1:50), anti-receptor de progesterona (AB-52, 1:50), anti-Ki-
67 (1:50), anti-HER-2 (1:100), anti-ST3Gal 1 (1:200) e anti-ST6Gal 1 (1:200)
por 16 horas a 4°C. A localização do anticorpo foi feita com polímero sem
biotina (ADVANCETM HRP KIT). De acordo com as instruções do fabricante, as
amostras foram incubadas com o ADVANCETM HRP Link (contendo anticorpos
secundários) durante 45 minutos a 25°C e, em seguida, com ADVANCETM HRP
Enzima (contendo anticorpos conjugados com peroxidase) durante 45 minutos
a 25°C. Finalmente a reação foi revelada com 3,3’-Diaminobenzidina (DAB)-
H2O2 e os tecidos contra-corados com hematoxilina. As lavagens entre as
etapas descritas foram realizadas com tampão fosfato de sódio 100mM, pH 7,2
suplementado com NaCl 150mM (PBS). Para o controle negativo as lâminas
foram incubadas sem a adição do anticorpo primário, sendo este substituído
pelo tampão PBS. Lâminas de tecido normal (mastoplastia) foram utilizadas
como controle positivo para Ki-67 e HER-2, casos de câncer de mama
sabidamente positivos para receptores hormonais (estrógeno e progesterona)
foram usados como controle positivo.
4.6 Hibridização in situ cromógena (CISH)
Os casos positivos para HER-2 com intensidade de marcação 1+ ou 2+ na
imunohistoquímica foram submetidos à técnica de hibridização in situ
cromogênica (CISH). Foi utilizado o ZytoDot CISH Implementation Kit (C-3018-
40) da ZytoVision (USA). Todos os procedimentos foram realizados de acordo
com as instruções do fornecedor. Foi considerado HER-2 positivo quando mais
de 50% dos núcleos apresentavam número de cópias do gene maior do que
dez ou quando se observava nos núcleos região homogênea de coloração em
mais de 50% dos mesmos, como descrito por Tanner et al. (2000) ou quando a
imunohistoquímica utilizando o anticorpo anti-HER2 (DAKO, USA) revelou uma
44
marcação com intensidade de 3+ de acordo com a diretriz ASCO/CAP HER-2
(2013).
4.7 Análise digital de imagem
Foi utilizado um sistema de vídeo-câmera acoplado a um microscópio
óptico Eclipse 50i (Nikon,USA). Foram analisadas três áreas aleatórias (µm2)
levando em consideração o número de células marcadas por área. A análise
semi-quantitativa das células marcadas foi aferida utilizando sistema
automático, avaliando-se três áreas em cada caso. A intensidade da marcação
foi determinada de acordo com Dornelas (2009) como: (1+) para marcação de
até 1/3 das células tumorais; (2+) para marcação de até 2/3 de células
tumorais; e (3+) marcação acima de 2/3 células tumorais, com observação de
três campos microscópicos, com aumento de 100x. Às lâminas que não
apresentaram marcação foi atribuído (0). A avaliação imunohistoquímica para
receptores hormonais (estrógeno e progesterona) utilizou as recomendações
das diretrizes ER/PR ASCO/CAP (2010). O biomarcador Ki67 foi avaliado de
acordo com protocolo de Fountzilas e colaboradores (2012) onde os casos
foram considerados positivos quando mais de 14% dos núcleos das células
neoplásicas foram marcados. A marcação para HER-2 foi avaliada de acordo
com a diretriz ASCO/CAP HER-2 (2013).
4.8 Análise estatística
A análise estatística dos dados obtidos experimentalmente foi realizada
através do software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA,
USA). Para a comparação entre os grupos, foram consideradas positivas as
amostras com intensidade de marcação +2 e +3 sendo consideradas negativas
as amostras com intensidade de marcação +1 e 0. As diferenças estatísticas
foram analisadas pelo teste Qui-quadrado ou o teste exato de Fisher. Um valor
de P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
45
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61
6 ARTIGOS CIENTÍFICOS
6.1 Artigo 1
Artigo a ser submetido à revista Acta Histochemica et Cytochemica
IMMUNOHISTOCHEMISTRY, LECTIN HISTOCHEMISTRY AND
CLINICOPATHOLOGICAL INVESTIGATION OF SIALIC ACID IN
PROGRESSION OF INVASIVE BREAST CANCER
Ferreira, S. A.1; Nascimento, J. C. F.1; Vasconcelos, J.L.A.1, Barbosa, B. T.1,
Brandão, J.M1; Cavalcanti, I.T.1; Silva-Filho, J.L.Q.1; Cavalcanti, C. L. B.1;
Beltrão, E. I. C.*1,2
1Biomarkers in Cancer (BmC) Research Group. Federal University of
Pernambuco (UFPE), Recife, Pernambuco, Brazil.
2Department of Biochemistry, Biological Sciences Center, Federal University of
Pernambuco (UFPE), Recife, Pernambuco, Brazil.
* Corresponding author: [email protected]. +55 81 991529499.
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA), Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE), 50670-901, Recife, Pernambuco, Brasil.
62
Abstract
Invasive ductal carcinoma (IDC) is the most common breast malignancy in
world. Aberrant sialylation is closely associated with malignant phenotype of
tumor cells, including invasiveness and metastasis. The pattern of sialylation in
IDC has been long-term investigated; however, little is known regarding sialic
acid (Sia) distribution in breast tumor related axillary lymph node metastasis
(LNM). Thus, we aimed to compare the α2,3 and α2,6 Sia expression as well as
the expression of β-galactoside α2,3 (ST3Gal 1) and α2,6 (ST6Gal 1)
sialyltransferase in IDC and LNM and evaluate the relationship between
sialylation and clinicopathological features of prognostic significance. The
expression of α2,3 and α2,6 Sia was detected by lectin histochemistry. The
expression of sialyltranferases was detected by immunohistochemistry. IDC
(73) primary and LNM (n=43) relative were tested for α2,3 and α2,6 Sia
expression by lectin MAL II and SNA lectin, respectively. A low expression of
α2,3 sialic acid was observed in IDC and LNM. However, a significant
expression of α2,6 sialic acid was observed between IDC and LNM (p=0.0321).
Moderate expression of ST3Gal 1 in relation to ST6Gal 1 in IDC. Statistically,
there was no significant difference in sialyltransferase between the primary
tumor and lymph node metastasis. Our results indicated that sialic acid was
maintained throughout the succeeding steps metastasis, which allows us to
think about the possibility that cells in LNM could to be clones of the original
tumor in breast tissue. Therefore, further studies are necessary to evaluate the
contribution of Sia like a key factor in breast cancer metastasis.
Keywords: sialic acid, breast cancer invasive, lymph node metastasis, lectin
histochemistry, β-galactoside α2,3 and α2,6 sialyltransferase.
63
Introduction
Invasive ductal carcinoma (IDC) is the most common breast malignant
tumor and one of the main causes of death related to cancer in women
worldwide [1]. IDC corresponds to 75-80% of breast invasive carcinomas,
characterized as a heterogeneous group of tumors without specific histological
characteristics [2]. Therefore, patients with IDC normally present a major
lymphatic involvement and a poor prognostic [3]. Breast cancer preferentially
disseminates through the lymphatic vessels rather than through the
hematogenous route [4]. The initial sites of metastasis in breast cancer are the
regional lymph nodes. Tumor spreading via lymphatic vessels has advantages
compared to that via blood vessels, including the presence of discontinuous
basement membrane and loose cell–cell junctions, a much lower fluid flow rate
that increases survival by minimizing vessels walls shear stress and a 1,000-
fold higher lymph concentration of hyaluronic acid, a molecule with potent cell-
protecting and pro-survival features [5]. One of the major challenges in the
management of patients with breast cancer is the tumor sub-classification for its
correct treatment. Nowadays, this subtyping is based on the expression status
of estrogen and progesterone receptors, human epidermal growth factor type 2
(HER-2) and celular proliferation protein (Ki-67) [6]. However, the search for
new biomarkers which could additionally contribute for the best stratification of
patients resulting in a more individualized and effective therapy is a growing
field in proteomics [7], glycomics [8] and metabolomics [9]. Glycomics assess
functional and structural properties of glycoconjugates and their changes in
many diseases through the glycosylation mechanism [10].
64
It is widely known that aberrant glycosylation has been implicated in
many different diseases due to changes associated with biological function and
protein folding [11, 12]. Alterations of normal glycosylation patterns are among
the strongest features in tumor phenotype [13]. In fact, there are increasing
evidences regarding the role of glycosylation in tumor formation and metastasis.
Altered glycosylation in cell surface glycoconjugates, particularly in terminal
motifs, can promote invasive behaviour of tumor cells that ultimately lead to
cancer progression [12]. As an example aberrant sialylation is closely
associated with malignant phenotype of tumor cells, including invasiveness and
metastasis [14]. The correlation between sialic acids (Sia) content and tumor
metastatic potential has been reported in many tumors and has received much
attention recently [15].
Sia are widely distributed in nature as terminal oligosaccharides linked to
galactose via α2,3 or α2,6-linkage or linked via α2,6-linkage to galactosamine or
N-acetylgalactosamine in glycoconjugates [11, 16] where play important roles in
biological, pathological, and immunological processes [17]. In this regard, the
terminal position occupied by Sia in membrane and extracellular glycans
position them on the frontline during leukocyte communication and overall
immune response. Sia, on an immune perspective, can function in two major
ways: as biological masks and as recognizable cell patterns [18]. In the former
Sia helps shield host cells from pathogen recognition. It also prevents
autoimmune responses, by preventing complement deposition over cell surface
[19].
Tumor metastasis is the most important process for tumor spreading,
which involves multistep series of adhesive and signaling events where tumor
65
cells utilize the leukocytes mechanism to adhere in vascular wall and leave the
bloodstream to other tissues [20], contributing so to metastasis to remain the
cause of 90% of deaths from solid tumors [21].
Abnormally high levels of sialylated tumor associated carbohydrate
antigens are frequently described at the surface of cancer cells and/or secreted
in biological fluids [30]. Studies reveal that the general increase in sialylation
has been detected both in clinical settings and experimental models that is
associated with a metastatic cell phenotype [20, 28]. The identification of how
tumor glycans mechanisms contribute to metastasis may help to improve
diagnosis, prognosis, and aid to develop clinical strategies to prevent
metastasis [20]. The altered expression of sialylation residues in breast cancer
has been reported [15, 35] but there are limited studies about this phenomena
in lymph node metastases. In this study, we aimed to compare the α2,3 and
α2,6 Sia expression and their corresponding sialytransferases (ST3Gal 1 and
anti-ST6Gal 1) in human invasive ductal carcinoma (IDC) and axillary lymph
nodes metastasis (LNM) and correlate to routine biomarkers and
clinicopathological features of prognostic significance.
66
Materials and Methods
Samples
Formalin-fixed, paraffin-embedded samples of breast invasive ductal
carcinoma (IDC - n=73) and axillary lymph node metastasis (LNM - n=43), from
patients diagnosed from 2009 to 2013, were randomly chosen from the Tissue
Bank of the Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco
(HC/UFPE). Control samples included 11 normal breast tissues obtained from
cosmetic surgery. Diagnoses of breast cancer were based on haematoxylin and
eosin (H&E) staining for histopathology evaluation. All histologic sections were
re-reviewed and diagnoses confirmed by an independent pathologist. Patients’
clinical data were retrieved from medical files and included age at surgery,
primary tumor size, histological and nuclear grades, and metastasis to regional
lymph nodes. This project was approved by the Health Science Center Ethical
Committee CCS-UFPE (CAAE 06586612.9.0000.5208 — No. 140.876).
Lectin histochemistry
Formalin-fixed, paraffin-embedded samples from IDC breast tumors (73),
axillary LNM (43) and healthy breast tissues from cosmetic surgery (11 -
controls) were analyzed according to Ferreira et al. [11]. Paraffin sections (4
μm) were deparaffinized in xylene and rehydrated in graded ethanol (3 x 100%
and 1 x 70 %). Slices were treated with 0.1 % (w/v) trypsin solution at 37 °C for
2 min followed by incubation in a 0.3 % H2O2 in methanol solution for 15 min.
Tissues were then incubated, respectively, with biotin conjugated lectins
Sambucus nigra agglutinin (SNA, 20 µg/mL - Vector Lab, USA) and Maackia
amurensis agglutinin (MAA, 40 µg/mL - Vector Lab, USA) for 2 h at 4 °C. After
67
this, sections were incubated with horseradish peroxidase-conjugated
streptavidin (Sigma Aldrich, USA) for 45 min at 25 °C. Staining was visualized
with a 0.01 % 3,3’-diaminobenzidine (DAB)-H2O2 solution (DAKO, USA). After
each step sections were washed twice (10 min each) with a 100 mM Phosphate
Buffered Solution (PBS), pH 7.2, containing 150mM NaCl. Negative staining
controls were performed replacing lectins solutions with PBS. Epithelial cells
from basal layer of healthy samples were used as positive staining.
Immunohistochemistry
Samples were assayed according Ferreira et al. [30]. Sections (4 μm)
were deparaffinized in xylene, hydrated in graded ethanol (3 x 100% and 1 x 70
%) and incubated with a 10mM citrate buffer solution, pH 6.0, in a steamer
chamber for 30 min. Afterwards samples were treated with an endogenous
peroxidase blocking solution (1:1 H2O2 in Methanol) for 15 min at 25 ºC followed
by an incubation with a 1% BSA-PBS solution for 1 hour at 25 ºC. Slices were
then incubated, separately, with monoclonal primary antibodies anti-ST3Gal 1
(1:200, Sigma, USA) and anti-ST6Gal 1 (1:200, Sigma, USA), anti-Estrogen
Receptor (anti-ER, clone L-20; 1:50 - Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA),
anti-Progesterone Receptor (anti-PR, clone AB-52; 1:50 - Santa Cruz
Biotechnology, Inc, USA), anti- celular proliferation protein (Ki-67, 1:50 - Santa
Cruz Biotechnology, Inc, USA) and anti-human epidermal growth factor type 2
(antiHER-2, 1:100 - DAKO, USA) overnight at 4 ºC. Sections were incubated
with biotin-free polymer (ADVANCETM HRP LINK - DAKO, USA) containg the
secondary antibody for 45 min at room temperature and then with ADVANCETM
HRP Enzyme (containing antibodies conjugated to horseradish peroxidase,
68
HRP) for 45 min at room temperature. Finally the reaction was reveled with 3,3’-
Diaminobenzidine-(DAB)-H2O2 solution (DAKO, USA) and counterstained with
haematoxylin solution. All washes (2x 10 min each) between steps were
performed with a 100 mM Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.2,
containing 150mM NaCl. Normal breast samples were used as tissue control.
Staining negative controls were prepared omitting primary antibodies.
Image analysis
Tissue images (three different areas - 1 µm2 - magnification 100x) were
acquired using a video camera system coupled to an Eclipse 50i microscope
(Nikon, Melville, USA) and analyzed using the NIS-Elements F software version
2.30 (Nikon, USA). ER and PR immunohistochemistry staining classification
followed ASCO/CAP ER/PR guidelines (2010). Ki67 was evaluated according to
Fountzilas and collegues (2012) and cases were considered highly proliferative
when more than 14% of neoplastic cells nuclei were positive. HER-2 was
evaluated according to the ASCO/CAP HER2 guideline (2013). Lectin
histochemistry staining was scored based on the intensity of staining and
classified according to Dornelas (2009) as: 0, negative staining; 1+, weak
staining for up to 1/3 of cells; 2+, moderate staining for up to 2/3 of cells ; and
3+, intense staining for more than 2/3 of cells.
Statistical analysis
Statistical association (p value) was analyzed using the nonparametric X2
test or Fisher's Exact test. For lectin histochemistry was calculated p value,
odds ratio (OR) and its 95% confidence interval (CI). p <0.05 was considered
69
statistically significant. All analysis was performed using the software GraphPad
Prism version 6 (GraphPad, USA).
70
Results
Lectin histochemistry results of primary IDC and LNM expression of α2,3
sialic acid and α2,6 sialic acid are presented in Table 1.
Representative lectin histochemistry stainings are shown in Figure 1. A
similar expression (1+ staining pattern) of α2,3 sialic acid in IDC and LNM was
observed in 30,1% (22/73) and 44,2% (19/43) of samples, respectively.
However, moderate expression (3+ staining pattern) of α2,6 sialic acid was
observed in 34,2% (25/73) of IDC and 55,8% (24/43) in LNM (p=0,0321) (Table
1).
Sialyltransferase expression by immunohistochemistry showed of
ST3Gal 1 and ST6Gal 1 results are depicted in Table 2. Low expression of
ST3Gal 1 (17,8%) in relation to ST6Gal 1 (27,3%) in IDC (figure 2). In axillary
LNM, ST3Gal 1 expression (20,9% ) was Similar to ST6Gal 1 (18,6%).
Statistically, there was no significant difference in sialyltransferase between the
primary tumor and lymph node metastasis. Tumor cells presented a staining
pattern membrane and cytoplasmic (figure 2).
Lectin histochemistry results for the expression of α2,3 Sia and α2,6 Sia
were evaluated for possible association with clinic-pathological data and routine
markers (Tables 3 and 4). Patients aged between 31–90 years old (mean 53
age). Altogether, sialic acid expression was no significantly correlated with any
clinicopathological data (p > 0.05 by Fisher’s exact test or X2 test).
71
Discussion
Aberrant sialylation is closely associated with malignant phenotype of
tumor cells, including invasiveness and metastasis [14].Here we investigated
the pattern of sialylation presented in tumor cells of primary breast cancer,
invasive ductal carcinoma (IDC), and tumor cells in axillary lymph node
metastases (LNM). Our results showed a similar sialylation pattern both IDC
and LNM.
We observed a moderate expression of α2,3 Sia both IDC as LNM. In
disagreement with previous reports where aberrant expression of terminal sialic
acids, in particular α2,3-sialic acids, are related to tumor adhesion and invasion
[37]. Badr and colleges [31] observed an intense Maackia amurensis agglutinin
I (MAL-I) staining on the membrane of sialic acid-treated T47D cells, indicating
an increase of α2,3 Sia on the cell surface after sialic acid treatment under
nutrient deprivation. Beside this, few studies on the relationship between the
expression of α2,3-sialic acid residues in breast cancer and invasion and
metastasis have been reported [15].
According to Cui and colleges [15] the overall survival rate considerably
drops for patient expressing different levels of α2,3-sialic acid residues and
changes in the glycocode of cell surface glycoconjugates stimulates/modulates
adhesion, migration and invasion of breast cancer cells. The authors used 50
primary tumor samples, 50 pair-matched lymph node metastasis tumor samples
and concluded that lymph node metastasis tumor samples exhibited higher
levels of expression of α2,3-sialic acid residues compared to those of primary
tumors. Differently, our study was designed with IDC (n=73) and LNM (n=43)
72
matching samples and we found that the expression of the α2,6-sialic acid
residues was greater than α2,3 Sia ones.
In agreement with our results, dos Santos and colleges [24] noted that
MAL II was positive in only 31.1% of samples and did not show correlation with
any survival parameters. However, patients who died or presented local
recurrence or metastasis had the expression of α2,6-linked sialic acid affecting
the survival curves. Besides they observed that the α2,6-sialylation was
associated with poor prognosis in tumorigenesis. In this study was observed a
moderate positivity for α2,6 Sia expression in cells of LNM. Previous findings
indicate that proteins on the cell surface undergo extensive α2,6-linked
sialylation during tumor progression [38, 39] and others [40, 41, 42] suggest that
α2,6-sialylation alters the conformation and function of β1 integrin, thereby
regulating cell adhesion and migration.
In according with Häuselmann and Borsig [20], an increase in α2,6-
sialylation in tumors is usually attributed to the up-regulation of ST6Gal1 that is
primarily active on N-linked glycans. ST6GAL1 are associated with increased
metastasis and poor patient prognosis [14, 43] and mediate the invasive
properties of murine HCC cell lines to lymph nodes lymph [14, 44].
Controversially, our study did not show an increase in the expression of
sialyltransferase that justifies the observed α2,3 and α2,6 sialic acid
expression, mainly in LNM. This discrepancy may be due to the fact that tumor
cells present in the LNM be derived from the primary tumor, where they
acquired this standard sialylation, keeping it on the secondary site. Another
possibility would be to leave a result of the action of other members of the
sialyltransferases family, not covered in this study.
73
Twenty different human sialyltransferases preside to the sialylation of
glycoconjugates, either glycolipids or glycoproteins [45]. Previous studies of
ST3Gal 3, ST3Gal 4 and ST3Gal 6 have focused primarily on overexpression of
these genes to enhance the sialylation and examine the biological
consequences in cancer metastasis [46]. Furthermore, sialic acids at position
α2,6 can be linked to subterminal sugars through an α2-6-bond to N-
acetylgalactosamine (GalNAc) by the action of ST6GalNAc 1 [47].
Oaks and co-workers [29] found that a substantial fraction of auto-
antibodies specific for NY-ESO-1 and HER-2 are sialylated, as demonstrated
via their recognition by Sambucus nigra agglutinin (SNA). Lu and colleges [48]
report that α2,6-sialylated N-glycans are up-regulated during TGF-β-induced
epithelial-mesenchymal transition (EMT) in GE11 cells. Epithelial to
mesenchymal transition (EMT), a driver of invasion and metastasis of cancer,
may play a pivotal role in multiple types of tumor cell metastatic dissemination
by endowing cells with a more motile toward the blood or lymphatic circulation
[49].
Studies [48, 50, 51, 52] presented the importance of cellular glycosylation
pattern in both the transition to and the maintenance of the mesenchymal state.
Given the essentiality of phenotypic changes in cell adhesion, motility, and
growth in EMT, Lu and colleges [48] considered the possible involvement of
sialylation in control of EMT.
In our results, ST6Gal 1 showed a higher expression than ST3 Gal 1 in
primary breast tumor samples. Lu and colleges [48] observed that ST6Gal1
promotes TGF-β-dependent EMT and that the maintenance of the
74
mesenchymal state by growth signaling, providing a plausible mechanism
whereby up-regulated ST6Gal 1, may be involved or promote initial step of
malignant progression.
Breast cancer development and progression are regulated by estrogen
and its receptor (ER) along others predictive markers such as progesterone
receptor (PR) and human epidermal growth factor receptor 2 (HER-2) [24, 53].
In this way, we investigated whether there was an association between the
expression of these molecular markers and sialylation profile. Our results
showed a tendency to correlation in α2,3 Sia expression to age and HER-2 in
LNM. Our study pioneered the comparison of the sialylation profile found in
lymph node metastasis and clinic-pathological features, not being possible
comparisons with others studies.
The α2,6 Sia expression showed a tendency with respect to PR.
Studies [24] showed that patients positive to PR were negative to SNA staining
with PR negatively correlating with the expression α2,6-linked sialic acid
(p=0.029). Even on hormone receptors, Semaan and colleges [54] studied
glycoproteins in human breast cancer positive ER tissues and in negative ER
tissues found that some proteins were more glycosylated at the negative ER
tissues. In this study there was a high negativity for ER (90.7%) in LNM. It is
known that the loss of the hormonal receptor has been correlated with a more
aggressive stage of the disease and this loss may affect the levels of sialic
acids on tumor cells [24]. Moreover, Van Aweger [55] suggested that biological
activities of estrogen receptors in target cells may be regulated by the extent of
sialylation of the receptor molecule itself. This posttranslational alteration may
represent a new type of control mechanism for estrogen action.
75
Studies have shown that changes in glycans associated with cancer
progression deeply define the phenotype of cancer cells depending on
interactions with endogenous molecules, both in tumor and metastatic
environment [20]. In this study was observed that there was a expression of Sia,
mainly α2,6 Sia, both in IDC as LNM, indicating that this sugar was maintained
throughout the succeeding steps metastasis. Thus, monitoring the sialylation
profile would be important in the diagnosis of tumor metastasis [14].
The alterations associated with sialylation aids in early diagnosis,
prognosis and post treatment monitoring in various cancers. Recently newer
drugs targeting different interplays of sialylation have been developed, which
might have profound effect in inhibiting sialylation and thus cancer metastasis
and infiltration [56]. The observation that sialic acid was kept in lymph node
metastasis, allows us to think about the influence of this sugar in the
maintenance of tumor cells in this secondary site.
Further verification of the utility of sialic acid in cancer progression
associated with the investigation of molecules related to a more aggressive
tumor behavior can significantly contribute to understanding the role of
sialylated glycoprotein involved in this stage of mammary carcinogenesis.
Acknowledgments
Authors thank to Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de
Pernambuco (FACEPE), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES) for research grants and schollarship.
76
Declaration of Interest
Authors have no conflict of interest that might harm the impartiality of this
research.
Disclosure Statement
Authors have nothing to declare.
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82
Tables
Table 1. Lectin histochemistry of sialic acid (Sia) expression using MAL II and SNA lectins in breast invasive ductal carcinoma (IDC) and axillary lymph node metastasis (LNM).
Samples MAL II (40µg/mL) SNA (20µg/mL)
Positive
(%)
Negative
(%)
p* Positive
(%)
Negative
(%)
p*
IDC 22 (30.1) 51 (69.9) 0.1599
25 (34.2) 48 (65.8) 0.0321
LNM 19 (44.2) 24 (55.8) 24 (55.8) 19 (44.2)
*Fisher’s exact test;
Table 2. Immunohistochemistry of β-galactoside α-2,3 sialyltransferase (ST3Gal.I) and β-galactoside α-2,6 sialyltransferase (ST6Gal.I) in breast invasive ductal carcinoma and axillary lymph node metastasis (LNM).
Group ST3Gal I ST6 Gal I
(+) % (-) % p* (+) % (-) % p*
IDC 13 (17.8) 60 (82.2) 0.8069
20 (27.3) 53 (72.7) 0.4955
LNM 9 (20.9) 34 (79.1) 8 (18.6) 35 (81.4)
*Fisher’s exact test;
83
Table 3. Evaluation of α2,3 Sia expression, clinicopathologic features and
routine markers in breast invasive ductal carcinoma (IDC) and axillary
lymph node metastasis (LNM).
α2,3 Sia in IDC α2,3 Sia in LNM
+ (%) - (%) P-value + (%) - (%) P-value Clinicopathologic Features
Age (years)
≤50 11 27
0.2328a
11 11
0.0535b
>50 15 20 8 13
Size (cm)
<2 4 12
0.3747b
4 3
0.2328 b 2-5 13 25 11 10
>5 9 10 4 11
Histological grade
I 2 3
0.8176b
1 0
0.4891 b II 7 16 7 8
III 17 28 11 16
Nuclear grade
1-2 9 17
0.8943b
9 6
0.1021a
3 17 30 10 18
Routine Markers
ER
+ 12 18
0.6210a
3 1
0.1926b
- 14 29 16 23
PR
+ 8 16
0.7756b
4 4
0.7136b
- 18 31 15 20
Ki-67
+ 2 3
0.8320b
1 0
0.4419a
- 24 44 18 24
HER-2
+ 15 16
0.0503b
9 5
0.0535b
- 11 31 10 19
aFisher’s exact test; bChi-square test.
84
Table 4. Evaluation of α2,6 Sia expression, clinicopathologic features and
routine markers in breast invasive ductal carcinoma (IDC) and axillary
lymph node metastasis (LNM).
α2,6 Sia in IDC α2,6 Sia in LNM
+ (%) - (%) P-value + (%) - (%) P-value Clinic-pathologic Features
Age (years)
≤50 18 20
0.4784a
12 10
0.8639b
>50 13 22 12 9
Size (cm)
<2 6 10
0.8857b
4 3
2-5 17 21 12 9 0.9717b
>5 8 11 8 7
Histological grade
I 3 2
0.5334b
0 1
II 8 15 8 7 0.4891b
III 20 25 16 11
Nuclear grade
1-2 14 12
0.4564a
9 6
0.6858b
3 17 30 15 13
Routine markers
ER
+ 14 16
0.5442b
1 3
0.1926 b
- 17 26 23 16
PR
+ 14 10
0.0549b
4 4
0.7136 b
- 17 32 20 15
Ki-67
+ 2 3
0.9080b
1 0
0.3680b
- 29 39 23 19
HER-2
+ 14 17
0.6889b
10 4
0.1520b
- 17 25 14 15
aFisher’s exact test; bChi-square test.
85
Figures
Figure 1. Staining pattern of MAL II and SNA lectin. A: breast invasive ductal
carcinoma with positive α2,3 sialic acid expression (magnification x 100). B:
cytoplasmic staining pattern of MAL II (magnification x 400).C: breast invasive ductal
carcinoma with positive α2,6 sialic acid expression (magnification x 100), D:
cytoplasmic staining pattern of SNA (magnification x 400).
86
Figure 2. Sialyltransferase immunohistochemistry. A: Axillary lymph node metastasis
with positive ST3 Gal 1 expression (magnification x 100). B: cytoplasmic staining
pattern of ST3GAL 1 with lymphocytic infiltrate surrounding (magnification x 400).C:
Breast invasive ductal carcinoma with positive ST6Gal 1 expression (magnification x
100), D: cytoplasmic and membrane staining pattern of ST6Gal 1 (magnification x 400).
87
6.2 Artigo 2
Artigo 2 a ser submetido a revista Folia Histochemica et Cytobiologica
COMPARATIVE ANALYSIS OF NON SIALYLATED TRUNCATED GLYCAN
TUMOUR-ASSOCIATED EXPRESSION IN INVASIVE DUCTAL CARCINOMA
AND METASTASES IN THE AXILLARY LYMPH NODES
Ferreira, S. A1; Nascimento, J. C. F.1; Vasconcelos, J.L.A.1, Barbosa, B. T1,
Brandão, J.M1; Cavalcanti, I.T.1; Silva-Filho, J.L.Q.1; Cavalcanti, C. L. B.1;
Beltrão, E. I. C*1,2.
1Biomarkers in Cancer (BmC) Research Group. Federal University of
Pernambuco (UFPE), Recife, Pernambuco, Brazil.
2Department of Biochemistry, Biological Sciences Center, Federal University of
Pernambuco (UFPE), Recife, Pernambuco, Brazil.
* Corresponding author: [email protected]. +55 81 991529499.
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA), Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE), 50670-901, Recife, Pernambuco, Brasil.
88
ABSTRACT
Introduction: Aberrant glycosylation has been found in all tumor cells and the
expression of tumor-associated carbohydrate antigens (TACA) constitutes part
of the cell events for metastasis and invasiveness. The present study evaluated
the differential expression of T and Tn antigens in breast invasive ductal
carcinoma (IDC) and axillary lymph node metastases (LNM) using lectin
histochemistry.
Material and methods: Formalin-fixed and paraffin-embedded tissues of breast
invasive ductal carcinoma (n= 71) and axillary lymph node metastasis (n=41)
were assayed with lectin histochemistry using Vicia vilosa agglutinin (VVA),
specific for Tn antigen, and Peanut agglutinin (PNA), specific for T antigen.
Immunohistochemistry assay was used to evaluate the routine molecular
markers (PR, ER, HER2, Ki67) for breast cancer.
Results: The Tn antigen expression was different in IDC and LNM (p=0.0338)
(figure 1A), with positive staining with VVA being higher in LNM (65.8%). A
tendency to significance was observed in T antigen expression both IDC
(40.8%) and LNM (58.5%). No correlation was found between lectin
histochemistry, breast markers routine by immunohistochemistry and clinic-
histopathological data.
Conclusions: Tn and T antigen are frequently overexpressed in breast cancer,
suggesting that the changes in O-glycosylation provide some advantage to the
tumor development. Our results allow us to think about the possibility of a
rescue of expression of this antigen in LNM cells to facilitate their attachment in
the new microenvironment. Besides this result suggest that Tn antigen too may
play a role in the mechanism involved in lymph node metastases.
Key words: T and Tn antigens, VVA, PNA, O-glicosylation, metastases.
89
INTRODUCTION
Increased life expectancy, nowadays epidemiological transition,
associated with industrialization and urbanization and with exposure to a range
of agents with mutagenic and carcinogenic potential, provides an increasing
incidence of cancer in Brazil and worldwide [1]. Among all cancers, breast
cancer is the most prevalent tumor among women worldwide [2]. Although early
diagnosis and new therapies increases the chance of cure for many breast
cancer patients, oncology is not close to understand what trigger and rule the
disease development [3].
Altered structures of oligosaccharides on cell surface glycoproteins and
glycolipids are frequently associated with tumorigenesis and metastasis [4].
Modifications in cellular glycosylation pathways are common phenotypic
outcome in cancer cells affecting mainly the outer moiety of glycans and leading
to the expression of tumor-associated carbohydrate antigens (TACAs) [5].
Aberrant glycosylation has been found in all tumor cells and the expression of
TACA influences cancer patients’ prognosis and survival so greatly that seems
to be proportional to the degree of expression [6].
Several cellular models have been developed to study implication of
TACAs in breast cancer progression, aggressiveness, adhesion, migration,
proliferation and tumor growth [5, 7, 8]. TACA are not only tumor markers, but
also constitute part of the machinery that is essential for inducing metastasis
and invasiveness [6, 9]. Tn antigen is one of the most common tumor-
associated carbohydrate antigens expressed in approximately 90% of
90
carcinomas, and its expression is strongly associated with poor prognosis and
overall low survival [10]. T antigen is other glycopeptide epitope, among the
TACA, associated with different types of tumors and represent attractive
candidate for the development of anticancer immune stimulation [11].
As ubiquitous saccharide recognizing (glyco)proteins, lectins have been
used as an useful tool in histochemistry to investigate carbohydrates in cell
surface glycoconjugates in normal and transformed tissues [12-14]. In this
sense, the present study evaluated the differential expression of T and Tn
antigen in breast invasive ductal carcinoma (IDC) and axillary lymph node
metastases (LNM) using lectin histochemistry and also investigated a
correlation between these antigens, breast markers routine by
immunohistochemistry and clinicohistopathologic features in IDC and LNM
samples.
MATERIALS AND METHODS
Samples
This study was approved by Health Science Center Ethical Committee
CCS-UFPE (CAAE 06586612.9.0000.5208 — No. 140.876). Formalin-fixed,
paraffin-embedded (FFPE) samples of invasive ductal carcinoma (IDC) (n=71)
and axillary lymph node metastasis (LNM) (n=41) from patients, diagnosed from
2009 to 2013, were randomly chosen from the Tissue Bank of the Hospital das
Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco (HC/UFPE). Diagnoses of
breast cancer were based on haematoxylin and eosin (H&E) staining for
histopathology evaluation. The histologic sections of all cases were re-reviewed
and the diagnoses confirmed by an independent pathologist. Patients’ clinical
91
data were retrieved from medical files, and included age, tumor size and staging
and metastasis to regional lymph nodes. Control samples included 11 normal
breast tissues obtained from cosmetic surgery.
Lectin histochemistry
Paraffin sections (4 μm) were cut and placed on glass slides. Sections
were deparaffinized in xylene and rehydrated in graded alcohols (3 x 100% and
1 x 70 %). Slides were treated with 0.1 % (w/v) trypsin solution at 37 °C for 2
min according to published method [15]. Afterwards samples were incubated in
0.3 % H2O2 in methanol solution for 15 min. Tissue slices were incubated,
respectively, with biotin conjugated lectins Vicia Vilosa agglutinin (VVA, 20
μg/mL - Vector Lab, USA;), specific for antigen Tn, and Peanut agglutinin (PNA,
20 μg/mL - Vector Lab, USA), specific for antigen T, for 2 h at 4 °C. After this,
sections were incubated with horseradish peroxidase-conjugated streptavidin
(Sigma Aldrich, USA) for 45 min at 25 °C. Staining was visualized with a 0.01 %
3,3’-diaminobenzidine (DAB)-H2O2 solution (DAKO, USA). After each step
sections were washed twice (10 min each) with a 100 mM Phosphate Buffered
Solution (PBS), pH 7.2, containing 150mM NaCl. Negative staining controls
were performed replacing lectins solutions with PBS. Epithelial cells from basal
layer of healthy samples were used as positive staining.
Immunohistochemistry
FFPE tissue samples from 71 IDC patients, 41 LNM and 11 healthy
controls were sliced in sections of 4 μm and immunohistochemistry assay was
performed according to Ferreira et al. [16]. Sections were deparaffinized in
92
xylene and hydrated with decreasing ethanol concentration. Tissues were
antigen retrieved with 10 mM citrate buffer (pH6.0), followed by endogenous
peroxidase blocking with methanolic H2O2 solution for 30 min and finally
incubated with 1% bovine serum albumin dissolved in phosphate buffered
saline (PBS-BSA) for 1 hour at room temperature. Slices were incubated with
antibody primary overnight at 4ºC. The molecular markers ER, PR and Ki-67
were detected using clone L-20 (1:50), AB-52 (1:50) and Ki-67 (1:50),
respectively, from Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA. The HER2 (1:100) are
from DAKO, Carpinteria, CA, USA. After washing with Phosphate Buffered
Saline (PBS), sections were incubated with biotin-free polymer (ADVANCETM
HRP KIT, DAKO, Carpinteria, CA, USA). According manufacture instructions,
samples were incubated with ADVANCETM HRP LINK (containg secondary
antibodies) for 45 min at room temperature and then with ADVANCETM HRP
Enzyme (containing antibodies conjugated to horseradish peroxidase, HRP) for
45 min. Finally the reaction was reveled with 3,3’-Diaminobenzidine (DAKO)
and counterstaining with hematoxylin. All washes (2x 10 min each) between the
steps were performed with a 100 mM Phosphate Buffered Solution (PBS), pH
7.2, containing 150mM NaCl.. Normal breast samples were used as control.
Negative controls were prepared omitting the primary antibody.
Image analysis, histochemistry and Immunohistochemistry evaluation
Tissue images were acquired using a video camera system coupled to
an Eclipse 50i microscope (Nikon, Melville, NY, USA) and analyzed using the
NIS-Elements F software version 2.30 (Nikon, USA). Random areas (1 µm2)
were analyzed taking into account the number of stained cells per area. Semi-
93
quantitative analysis of stained cells of lectin histochemistry was measured
using the automatic system (three areas in each case). Staining intensity was
scored based on the intensity of signal (0, 1+, 2+ 3+) and measured according
to Dornelas [17] as: 0, negative staining; 1+, low staining for up to 1/3 of cells
stained; 2+, moderate staining for up to 2/3 of cells stained; and 3+, intense
staining for more than 2/3 of cells stained. Three different areas (1 cm2) per
tissue were analyzed (magnification 100x).
2.3. Immunohistochemistry analyzes
The estrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PR) expression
analyzes were conducted following the recommendations of the ASCO/CAP
ER/PR guidelines (2010) [18] and HER-2 expression was evaluated according
to the ASCO/CAP HER2 guideline (2013) [19]. Ki67 expression was evaluated
according to Fountzilas and colleagues [20] and cases were considered positive
when more than 14% of neoplastic cells nuclei expressed this protein.
Statistical analysis
Statistical association (p value) was analyzed using the nonparametric X2
test or Fisher's Exact test. For lectin histochemistry was calculated p value,
odds ratio (OR) and its 95% confidence interval (CI). p <0.05 was considered
statistically significant. All analysis was performed using the software GraphPad
Prism version 6 (GraphPad, USA).
94
RESULTS
FFPE tissue samples of IDC (n=71) and LNM (n=41) were assayed for
Tn and T antigen expression by lectin histochemistry with VVA and PNA lectin,
respectively, correlating with clinicopathological features (Table 1). Patients
ages ranged between 31–90 years (mean 53). Only four samples showed
histological grade I and 1 sample was nuclear grade 1 (Table 1).
Tn and T antigen expression was correlated with breast markers routine
(Table 2 and 3, respectively). There was only a significant association
(p=0.0250) between Tn antigen expression and molecular HER2 biomarker in
the IDC. No association between other breast markers routine by
immunohistochemistry with T and Tn antigen expression both the primary tumor
and in the corresponding lymph node metastasis was not observed.
The Tn antigen expression was different in IDC and LNM (p=0.0338)
(Figure 1A), with positive staining with VVA being higher in LNM (65.8%). A
tendency to significance was observed in T antigen expression both IDC
(40.8%) and LNM (58.5%) (Figure 1B).
The staining pattern of VVA was mainly in cell membrane and cytoplasm
in IDC and LNM (figure 2). PNA presented a cytoplasm staining in both groups
(figure 3). All healthy controls (n=11) were negative for both VVA and PNA.
95
DISCUSSION
A defect in glycosyltransferases (GTs), involved in the biosynthesis of the
O-glycan cores, may lead to the incomplete synthesis of the glycans, allowing
the expression of O-linked carbohydrate antigens known as Thomsen–
Friedenreich (T or TF) antigen (unsialylated Core1) and Thomsen-nouvelle (Tn)
antigen (initial unsubstituted GalNAc) [5]. Both T and Tn have been used as
prognostic indicators of cancer and have been detected immunologically in
breast primary cancer tissues, lymph nodes, and distant metastases [21-26].
Lectins are interesting diagnostic tools in immunohistochemical
differentiation for surface and intracellular glycoconjugates of transformed cells
[11] that can be used to assess the glycosylation pattern of normal and tumor
cells. In fact, a range of lectins specific for N-Acetyl-galactosamine (GalNAc),
including Helix pomiata lectin (HPA), Dolichos biflorus agglutinin (DBA),
Griffonia simplicifolia agglutinin (GSA), Wistaria floribundia (WFA), soybean
(Glycine max) agglutinin (SBA), Vicia villosa isolectin B4 (VVA) and Salvia
sclarea agglutinin (SSA), can be used to detect Tn antigen [5, 27, 28].
Tn antigen may be expressed in almost 90% of breast cancers [5, 29].
Some authors [30,31] reported that Tn expression was observed in lymph node
metastatic cells using either monoclonal antibodies (mAb) in almost 100% of
Tn-positive metastatic cells, while primary tumours could exhibit various
percentages of cell positivity [32]. Our results for lectin histochemistry for Tn
antigen showed greater positivity in LNM than IDC, in agreement with literature
data for immunohistochemistry.
96
Lectins such as Arachis hypogea agglutinin (peanut lectin - PNA),
Amaranthus caudatus agglutinin (ACA) or Artocarpus integrifolia agglutinin
(jacalin – AIA) have been extensively used to detect T antigen [5]. PNA is the
unique lectin specific for unsubstituted Gal residues. Because of its high
reactivity with asialo-glycophorin, PNA has been tagged as the anti-T lectin [5,
33].
There is strong evidences that T antigen is frequently overexpressed in
breast cancer, suggesting that changes in O-glycosylation provide some
advantage to the tumour development [5]. Our results allowed us to speculate
the possibility of a rescue of expression of this antigen in LNM cells to facilitate
their attachment in the new microenvironment as an event of mesenchimal-
epithelia transition (MET). A study showed that 98% of the disseminated tumour
cells in the bone marrow were positively stained by a new anti-T antibody [34],
suggesting a role for T antigen in the metastasis process. Such studies are
costly and require time to be carried out, not being suitable for use as a routine
diagnostic aids.
On the other hand, Tn expression was associated with increased risks of
recurrence using VVA [30] and its expression in primary tumours seems to be
associated with lymph node involvement using mAbs [31, 32], HPA [35] or VVA
[32], and even with invasion of lymphatic vessels also within the primary tumour
[32]. We observed an increase in Tn antigen expression on the secondary site,
this observation strongly suggests that Tn antigen can also play a role in the
mechanism involved in lymph node metastasis. A trend toward significance was
also found for the T antigen using PNA lectin.
97
We did not find any correlation between lectin histochemiatry and
clinicopathological data for both lectins and tissues, IDC and LNM. Authors
have reported a lost of Tn expression in grade III tumors [31] we find a higher
Tn antigen expression in histological grade III cases indicating that this antigen
may be involved in the malignant phenotype.
Different studies were performed with breast cancer patients and agree
with the observation that there is a correlation between the high extent of Tn
epitope expression in the primary tumours and poor prognosis [25]. Springer
[29] reported a 5-year shortened disease free period, while Tsuchiya and
colleges [36] observed that Tn correlated with overall survival, in addition to
nodal status and tumour size, although Tn was not an independent prognostic
factor. There was a significant association between Tn antigen expression and
molecular HER2 biomarker in the IDC, however, no record in the literature
indicating association between these two variables. No association between
other breast markers routine by immunohistochemistry with T and Tn antigen
expression both the primary tumor and in the corresponding lymph node
metastasis was not observed indicating that these markers did not affect the
expression of these antigens.
All normal samples were negative for VVA and PNA in accordance with
the fact that T antigen and its precursor, Tn antigen, are exclusively expressed
in carcinomas but not in normal tissues [6, 37, 38].
Our study showed that lectin histochemistry, using specific lectins for
tumor-associated carbohydrate antigens ( TACA ) , such as T and Tn antigen,
provides similar results to those found using immunohistochemistry or
molecular biology. Moreover, it was possible to observe a differential expression
98
of both antigens, particularly Tn antigen, between primary breast tumor
(invasive ductal carcinoma) and axillary lymph node metastases , reinforcing
the hypothesis that these antigens influence the process of metastasis.
ACKNOWLEDGEMENT
Authors thank to Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de
Pernambuco (FACEPE), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES) for research grants and schollarship.
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37. Springer JF. T and Tn, general carcinoma autoantigens. Science 1984;
224:1198- 206.
38. Cao Y, Stosiek P, Springer GF. Thomsen-Friedenreich-related
carbohydrate antigens in normal adult tissues: A systemic and
comparative study. Histochem. Cell Biol 1996;106:197–207.
102
Tables
Table 1. Relationship between Tn and T antigen expression with clinicopathologic features in breast invasive ductal carcinoma (IDC)
Clinicopathologic
Features
Tn antigen expression T antigen expression
+ (%) - (%) p + (%) - (%) p
Age (years)
≤50 13 23
0.1554a
14 22
0.4678a
>50 19 16 15 20
Size (cm) <2 6 8
0.9656b
6 8
0.9980 b 2-5 17 21 16 22
>5 9 10 7 12
Histological grade
I 0 4
0.1037b
1 3
0.4418 b II 9 14 8 15
III 23 21 20 24
Nuclear grade
1 0 1
0.4010b
1 0
2 9 15 9 15 0.4576b
3 23 23 19 27
Lymph node status
Positive 9 21
0.7972a
3 1
0.8422a Negative 23 26 20 29
Negative 9 13 9 13
aFisher’s exact test; bChi-square test.
103
Table 2. Evaluation of Tn antigen expression by lectin histochemistry (VVA) with routine markers in breast invasive ductal carcinoma (IDC) and axillary lymph node metastasis (LNM).
VVA in IDC VVA in LNM
+ (%) - (%) P-value + (%) - (%) P-value Routine markers
PR Positive 11 13
0.4418a 6 2
0.5431 b Negative 21 26 21 12
ER Positive 12 18
0.4626b 1 2
0.2173 b Negative 20 21 26 12
Ki-67 Positive 2 3
0.8132b 1 3
0.0697b Negative 30 36 26 11
HER-2 Positive 17 14
0.1589a 11 1
0.0250a Negative 15 25 16 13
aFisher’s exact test;
bChi-square test.
Table 3. Evaluation of T antigen expression by lectin histochemistry (PNA) with routine markers in breast invasive ductal carcinoma (IDC) and axillary lymph node metastasis (LNM).
PNA in IDC PNA in LNM
+ (%) - (%) P-value + (%) - (%) P-value Routine markers
PR Positive 10 14
0.9198b 5 3
0.1998 b Negative 19 28 19 14
ER Positive 10 20
0.2707a 2 2
0.7153 b Negative 19 22 22 15
Ki-67 Positive 3 2
0.3661b 1 1
0.8016b Negative 26 40 23 16
HER-2 Positive 16 15
0.1042b 10 4
0.2276a Negative 13 27 14 13
aFisher’s exact test;
bChi-square test.
104
Figures
Figure 1. Lectin histochemistry results. A: Tn antigen staining with VVA presented significant difference between breast invasive ductal carcinoma (IDC) and axillary lymph node metastases (LNM), p=0.0338. B: T antigen staining with PNA was not significant in both IDC and LNM (p>0,05).
45,1% 65,8%
40,8% 58,5%
105
Figure 2. Evaluation of antigen Tn expression by VVA lectin. A: Invasive ductal carcinoma with positive antigen Tn expression (Scale bar: 100μm). B: In Detail, cytoplasmic staining pattern of VVA (Scale bar: 50μm). C: lymph node metastases with positive antigen Tn expression (Scale bar: 100μm). D: In Detail, cytoplasmic and membrane staining pattern of VVA (Scale bar: 50μm).
106
Figure 3. Positive PNA staining for T antigen in breast invasive ductal carcinoma (IDC) (A - scale bar: 100μm) characterized by cytoplasmic staining pattern (B - scale bar: 50μm).
107
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Houve uma expressão moderada de Sia, principalmente α2,6 Sia tanto no
IDC quanto no LNM, indicando que este açúcar foi mantido durante todas
as etapas sucessivas na metástases;
A expressão das enzimas analisadas, ST3Gal 1 e ST6Gal 1, não justificam
o perfil de sialilação encontrado tanto no carcinoma mamário invasivo
quanto na metástase linfonodal;
A Sialilação está ocorrendo ao longo das etapas ou outras sialiltransferases
são responsáveis pelo padrão de sialilação encontrado;
A sialilação estava presente no sítio primário e foi aumentada no sítio
secundário;
O papel do ácido siálico no LNM pode estar relacionado à fixação e
adaptação celular no sítio secundário;
A monitorização do perfil de sialilação seria importante para o diagnóstico
de metástases de tumores;
As lectinas são interessantes ferramentas no diagnóstico na diferenciação
histoquímica para glicoconjugados de superfície e intracelulares de células
transformadas
As lectinas VVA e PNA foram ferramentas úteis para a determinação da
expressão de antígenos T e Tn.
Resgate da expressão de antígenos carboidratos não sialilados associados
ao tumor nas células tumorais do LNM parece facilitar a sua fixação na novo
microambiente.
O antígeno Tn pode desempenhar um papel no mecanismo envolvido na
metástases linfáticas.
Foi possível observar uma expressão diferencial de antígeno Tn no IDC e
LNM usando VVA;
108
APÊNDICE A
109
110
111
112
113
APÊNDICE B
114
115
116
117
118
ANEXO I
119
120