sÍntesis y caracterizaciÓn de mono-β-lactamas…ntesis y... · pudiera alcanzar esta meta tan...

CICATA-LEGARIA-IPN

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERÍA QUÍMICA E

INDUSTRIAS EXTRACTIVAS

SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE

MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE

β-AMINOACIDOS

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE

ING. QUÍMICO INDUSTRIAL

P R E S E N T A :

JOSÉ ALBERTO MIRANDA GONZÁLEZ

DIRECTOR DE TESIS: DRA. DELIA QUINTANA ZAVALA

México, D.F. Noviembre de 2010.

En el Laboratorio de Química Orgánica del Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología Avanzada del Instituto Politécnico Nacional, unidad Legaría (CICATA-IPN, Legaria) es el lugar donde

se desarrolló la presente Tesis bajo la dirección de la Dra. Delia Quintana Zavala, con el apoyo de los proyectos SIP-20090322

y SIP-20100084

Los resultados de este trabajo se presentaron en el 44 Congreso Mexicano de Química y 28 Congreso Nacional de Educación

Química, que se celebró en la Ciudad de Puebla, Puebla, del 26 al 30 de septiembre del 2009.

AGRADECIMIENTOS

Mis mas grandes agradecimientos a el Instituto Politécnico Nacional (IPN) por haber sido el responsable de haberme formado como un

profesionista de calidad, permitiéndome así realizar una de mis mas grandes metas en la vida.

A mi Escuela Superior de Ingeniería Química e Industrias Extractivas (ESIQIE) por que en sus aulas y laboratorios, aprendí los

conocimientos y valores que son la herramienta principal para mi formación profesional convirtiéndome en una persona que busca

lograr la superación personal.

Al Dr. Hugo A. Jiménez Vázquez de la ENCB por la determinación de las estructuras de difracción de rayos X.

A mis padres, con todo el amor, admiración mi mas grandes agradecimientos por todo el apoyo incondicional que me brindaron a lo largo de la carrera. Por todos los sacrificios y esfuerzos que realizaron para que yo me superara. Por todos sus consejos, regaños, castigos, premios que me hicieron, cuando yo estaba en lo correcto o incorrecto. Gracias mami, gracias papi, ¡¡¡gracias por todo!!! Porque yo sé que soy el espejo de todos sus esfuerzos, y lo que me dieron es la mejor de las herencias.

A mi hermana Máyela porque siempre estuvo conmigo en las buenas y en las malas, por todo su cariño y admiración que hacen que fortalezca mi carácter. Por todas sus preguntas, por sus chistes, comentarios graciosos, que hacían olvidarme de todos mis problemas. Porque al igual que yo deseo que ella se desarrolle profesionalmente para poder realizar sus metas.

A mi directora de tesis la Dra. Delia Quintana Zavala por todos conocimientos que me brindo para poder realizar el desarrollo de mi tesis, así como los instrumentos y el uso de sus recursos para que pudiera alcanzar esta meta tan deseada. Por su comprensión en todas las veces que no podía llegar, y todo el tiempo que me tarde en terminar este trabajo. Muchas Gracias Doc.

A mis más grandes compañeros y amigos que siempre me ayudaron y me alentaron para poder salir adelante. Por todos esos momentos de alegría, tristeza, preocupación, risas, por compartir conmigo sus problemas, por permitirme entra en sus vidas dándome su más sincera amistad. Gracias Michelle, Armando, Daniel, Felipe, Leticia, Adriana, Jessica, Luis Héctor, Mireya y Adai.

A mi Jefa la Ing. Flor Arellano, Gerente de Control de Calidad de PEPSI-Iztacalco, por haberme permitido poder culminar esta última etapa de mi formación profesional.

i

INDICE GENERAL

CAPÍTULO PAG

Índice de figuras ii

Índice de compuestos sintetizados iii

RESUMEN

INTRODUCCIÓN 1

I ANTECEDENTES

I.1 Antibióticos 4

I.2 Aldehídos y Cetonas 8

I.3Aminas 11

I.4 Iminas 13

I.5 Lactamas 15

Capítulo II. PARTE EXPERIMENTAL

II.1 Material y equipo 20

II.2 Procedimientos y metodología 22

II.2.1Sintesis de Compuestos 22

II.2.2 Pruebas Microbiológicas 30

Capítulo III. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

III.1 Síntesis de Benciliminas (iminas 1a-1c) 32

III.2 Síntesis de las N-aril-mono-β-lactamas 2a y 2c 38

III.3 Pruebas Microbiológicas. 48

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 52

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 54

ANEXOS 57

ii

Índice de Figuras

Figura 1 Alexander Fleming.

Figura 2 Prototipo de una célula bacteriana.

Figura 3 Tipos de bacterias de acuerdo a su membrana celular.

Figura 4. Representación de la síntesis de una imina y b) concentración del producto

Figura 5. Reacción a -78°C, en condiciones anhidras.

Figura 6. Esquema de purificación por cromatografía en columna.

Figura 7. Disposición de las microplacas para estudiar la actividad antibiótica de la -

lactama 2a, con ampicilina trihidratada (AMP 3H2O).

Figura 8. Estructura obtenida por difracción de rayos X de la 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-

fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2a)

Figura 9. Celda unitaria de la estructura de 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-fenilazetidin-2-ona

(β-lactama 2a)

Figura 10. Estructura obtenida por difracción de rayos X de la 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-

fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2b)

Figura 11. Celda unitaria de la estructura de 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-fenilazetidin-2-ona

(β-lactama 2b)

iii

Índice de compuestos

N

NO2

N

F

4-nitro-N[(E)-fenilmetilideno]anilina 4-fluoro-N [(E)-fenilmetilideno] anilina

(Imina 1a) (Imina 1b)

CH3

N

O

N

Cl

O

O2N

4-metoxi-N [(E)-fenilmetilideno] anilina 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-fenilazetidin-2-

(Imina 1c) ona (β-lactama 2a)

N

CH3

O

F

3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-fenilazetidin-2-ona

(β-lactama 2b)

RESUMEN

Las monobactamas (nombre genérico de las β-lactamas) desarrolladas en los inicios de los años

ochenta, simultáneamente por Sykes1, Imada

2 y colaboradores son antibióticos estructuralmente

relacionados con los β-lactámicos pero con configuración monocíclica. El descubrimiento de la

nocardicina y otras monobactamas con actividad antibiótica demostró que no se requiere una

estructura bicíclica conformacionalmente forzada para tener propiedades antibacterianas, lo cual

sugiere que la actividad biológica esta estrictamente correlacionada a la presencia del anillo de la

2-azetidinona adecuadamente funcionalizado. En este trabajo de investigación se tiene la

finalidad de aportar conocimiento en este campo mediante la síntesis y caracterización de dos

nuevas mono-β-lactamas, las cuales pudieran tener actividad como antibióticos, por otro lado, la

hidrólisis de estas mono-β-lactamas nos proporcionaría -aminoácidos.

La síntesis de estas mono-β-lactamas es la que involucra la reacción de Staudinger3, que es una

reacción de ciclo adición [2+2] entre una cetena y una imina, la cual incluye la inserción de un

carbenoide. Esta reacción es reconocida como un método fundamental, y versátil para la síntesis

de derivados β-lactámicos, en un solo paso, además de que se obtuvieron rendimientos

favorables.

Para la formación de las iminas o bases de Schiff llamadas así en honor a Hugo Schiff, químico

alemán que describió su formación en 1864, consiste en la reacción de aldehídos y cetonas con

aminas primarias. Como aldehído se uso el benzaldehído y se hizo reaccionar con 3 diferentes

aminas; p-nitro anilina, p-metoxi anilina y p-fluoroanilina, usando como disolvente tolueno y a

reflujo constante durante doce horas. La adición nucleofílica de la amina al grupo carbonilo da

como resultado hemiaminales (o carbinolamina), los cuales se deshidratan fácilmente dando lugar

a las iminas. Su mecanismo de formación es un proceso que está en equilibrio, por lo que es

necesario eliminar el agua para desplazar la reacción hacia el producto, esta reacción es

catalizada por ácidos, en este caso particular se utilizó, ácido clorhídrico.

La obtención de nuevas mono-β-lactamas tiene gran importancia tanto en síntesis orgánica, por

su versatilidad estructural, como a nivel medicinal por sus propiedades farmacológicas como

agente antimicrobiano, en este trabajo se logra sintetizar dos de estos compuestos: la mono-β-

lactama [3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-fenilazetidin-2-ona] y la mono-β-lactama derivada [3-metil-

1-(4-fluorofenil)-4-fenilazetidin-2-ona], sintetizadas por el método de Staudinger usando las

iminas obtenidas anteriormente y una cetena que se formo in situ con cloruro de cloro acetilo y

cloruro de propionilo respectivamente, como base se utilizó trietilamina para extraer el hidrógeno

ácido, alfa al grupo carbonilo; se empleó un baño de acetona con hielo seco para alcanzar una

temperatura de -78°C. La reacción se mantuvo a esta temperatura por un tiempo de 2 horas y

posteriormente 48 horas con agitación a temperatura ambiente.

Las N-aril-mono-β-lactamas sintetizadas se purificaron por cromatografía flash y fueron

caracterizadas por métodos espectroscópicos de RMN de 1H y

13C, mediante un estudio de

Difracción de Rayos X, se confirmo su estructura, y se determinó la configuración relativa de los

hidrógenos de los carbonos 3 y 4 del anillo de la mono-β-lactama, los cuales se encuentran en

posición trans uno respecto del otro.

Se realizaron estudios microbiológicos preliminares para el compuesto p-NO2--lactama 2a, y se

trabajó con las siguientes cepas: Aeromona hidrophila ATCC 7966, Klebsiella pnuemoniae

ATCC 700603, Pseudomonas aeruginosas ATCC 27852, Escherichia coli ATCC25922,

Escherichia coli ATCC35218, Escherichia coli DH10b sensible (DH10bs) y Staphylococcus

aureus ATCC 29213. Las cuales pertenecen al cepario del grupo de investigación del Laboratorio

de Bacteriología Médica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del I.P.N.

En cuanto a los resultados microbiológicos para la β-lactama 2a se concluyo que la inhibición del

crecimiento bacteriano, fue muy poco a pesar de que esta prueba se repitió 6 veces, y en cuanto a

la sensibilización de las bacterias productoras de β-lactamasa (K.pneumoniae), también los

resultados obtenidos no fueron concluyentes.

MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 1

INTRODUCCIÓN

Los compuestos con actividad biológica existentes en la naturaleza generalmente incluyen

heterociclos, y por este motivo se intenta reproducirlos en forma sintética con fines

farmacológicos, y en algunos casos, resulta de interés incorporar modificaciones

estructurales que posibiliten una mayor actividad biológica y biodisponibilidad. Uno de los

mayores desafíos para los químicos orgánicos es la síntesis de compuestos o fragmentos

moleculares (naturales o artificiales), con propiedades y características que puedan mejorar

a las de los compuestos ya existentes. La síntesis de compuestos nuevos utilizados en la

medicina ha logrado éxitos notables en los últimos 60 años y sobre todo en las últimas

cuatro décadas. La síntesis química también produce compuestos nuevos que se usan en

campos tan diversos como los cosméticos, la tecnología electrónica y los materiales de

construcción.

Las monobactamas desarrolladas en los inicios de los años ochenta, simultáneamente por

Sykes1 e Imada

2 y colaboradores son antibióticos estructuralmente relacionados con los -

lactámicos pero con configuración monocíclica. El descubrimiento de la Nocardicina A y

otras monobactamas con actividad antibiótica demostró que no se requiere una estructura

bicíclica conformacionalmente forzada para tener propiedades antibacterianas, lo cual

sugiere que la actividad biológica, de estos compuestos, está estrictamente correlacionada a

la presencia del anillo de la 2-azetidinona adecuadamente funcionalizado.

N

COOH

NH

N

O

OH

OHOOC

NH2

O

OH

H

Nocardicina A

SINTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO- -LACTAMAS…


En esta dirección, la síntesis de nuevas mono-β-lactamas tiene gran importancia tanto en

síntesis orgánica, por su versatilidad estructural, como a nivel medicinal por sus

propiedades farmacológicas como agente antimicrobiano.

En este trabajo de investigación se tiene la finalidad de aportar conocimiento en este campo

mediante la síntesis de nuevas mono-β-lactamas, las cuales pudieran tener actividad como

antibióticos, o por otro lado, la hidrólisis de estas mono -lactamas nos proporcionaría -

aminoácidos libres, los cuales están también presentes en la naturaleza, como componentes

de péptidos activos biológicamente,4 estos péptidos son de interés farmacológico que

presentan ventajas en términos de actividad biológica y estabilidad metabólica.5 La

Bastatina y el Taxol son dos moléculas activas biológicamente que contienen una cadena de

-aminoácido en su estructura, el Taxol es un compuesto líder que se aplica en la

quimioterapia del cáncer y la Bastatina es un inhibidor enzimático.6 Para lograr el objetivo

de este proyecto será necesario llevar a cabo los siguientes objetivos particulares.

Sintetizar tres iminas, haciendo reaccionar un aldehído aromático, el benzaldehído, con tres

aminas primarias aromáticas p-sustituidas diferentes.

Sintetizar dos mono-β-lactamas, mediante la “Reacción de Staudinger” utilizando para ello,

los cloruros de ácido adecuados para la formación in situ de la correspondiente cetena.

Purificar, todos los productos obtenidos mediante diferentes métodos: por cromatografía en

placa, y tipo flash, por destilación, por sublimación, y por cristalización según se requiera.

Caracterizar las iminas, así como, las β-lactamas sintetizadas mediante diferentes técnicas

espectroscópicas como resonancia magnética nuclear de protón (1H) y carbono trece (

13C),

e infrarrojo.

SINTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO- -LACTAMAS…


Mediante difracción de rayos X realizar un estudio cristalográfico de las dos mono β-

lactamas obtenidas para además de corroborar la estructura propuesta determinar la

configuración relativa de los sustituyentes en el anillo de la mono β-lactama.

Determinar (mediante la prueba de Cefinasa), si las cepas Aeromona hidrophila ATCC

7966, Klebsiella pnuemoniae ATCC 700603, Pseudomonas aeruginosas ATCC 27852,

Escherichia coli ATCC25922, Escherichia coli ATCC35218, Escherichia coli DH10b

sensible (DH10bs) y Staphylococcus aureus ATCC 29213 son productoras de β-lactamasas.

Realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana, para la p-NO2-β-lactama 2a, según

lo indica las normas internacionales, ”The Clinical and Laboratory Standards Institute”

mejor conocida como la CLSI.

La contribución de este trabajo radica principalmente en la aportación de la síntesis de 2

nuevos compuestos mono-β-lactámicos, caracterizados estructuralmente, así como un

estudio microbiológico preliminar.

Capítulo I

SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…

MIRANDA GONZÁLEZ JOSE ALBERTO Página 4

I. ANTECEDENTES

I.1.- Antibióticos

En la actualidad uno de los antibióticos más utilizados e importantes es la penicilina

obtenida del hongo “Penicillium notatum” este antibiótico fue descubierto de manera

fortuita por el bacteriólogo escocés Alexander Fleming7 en el año de 1928. Posteriormente,

en 1938, Howard Walter Florey (1908-1968), patólogo australiano estudió sus aspectos

químicos y farmacológicos, y junto con Ernest Boris Chain (1906-1979) realizaron la

elucidación de su estructura mediante difracción de Rayos X, así como su uso. A pesar de

que su uso terapéutico fué puesto en práctica durante la segunda guerra mundial, hasta 1945

fué cuando se galardonó con el premio Nobel de Medicina a estos tres investigadores.

Figura1. Alexander Fleming

El continúo interés y descubrimiento de nuevos antibióticos8 como se muestra en la Tabla

1, se debe principalmente a la evolución de los microorganismos, específicamente las

bacterias que presentan una mayor resistencia a los antibióticos tradicionales, debido al uso

indiscriminado de estos.



Tabla1. Antibióticos descubiertos entre 1928-2003

Año de introducción Tipo de Droga

1928 Penicilinas

1935 Sulfonamidas

1945,1971,1984 Cefalosporinas

1944 Aminoglicósidos

1949 Cloranfenicol

1050 Tetraciclinas

1952 Macrolidos y lincosámidos

1956 Glicopéptidos

1957 Rifamicinas

1959 Nitromidazoles

1962 Quinolonas

1968 Trimpetoprim

1976 Nocardicinas

1981 Monobactamas

2000 Oxazolidinonas

2003 Lipopéptidos

Mecanismo de Acción. Algunos antibióticos actúan sobre la membrana de las

bacterias, unos a nivel de síntesis de proteínas como las tetraciclinas, otros sobre el

metabolismo como sulfamidas o en el proceso de réplica del ADN. En el caso de las β-

lactamas estas atacan principalmente la membrana o la pared celular de las bacterias. En la

Figura 2, se muestra la estructura de una célula bacteriana.

Figura 2. Prototipo de una célula bacteriana.

Inclusión Granular Ribosomas

Hilos Núcleo

Capsula Membrana

Citoplasmatica Mesosomas

Citoplasma

Flagelo

Membrana

Celular



Se han descrito dos mecanismos que intervienen de una manera más o menos directa en la

acción antibiótica de los β-lactámicos. El primero, es la inhibición directa de las proteínas

fijadoras de penicilina (PBPs) de la membrana citoplásmica. El segundo mecanismo, que es

inductor de la lisis celular, está determinado por la acción concomitante de las autolisinas.

La pared celular de las bacterias, es la responsable de la forma y rigidez de la célula. Las

diferencias que existen en la estructura de la pared celular permiten distinguir a las

bacterias como Gram positivas (Gram+) o Gram negativas (Gram

-) mediante una tinción

diferencial denominada “tinción de Gram” que es una técnica desarrollada por el

bacteriólogo Christian Gram en 1884. La clasificación de estos dos tipos de bacterias se

debe a la complejidad de la estructura de las bacterias Gram negativas las cuales presentan

3 capas principales a) la membrana citoplasmática (20-30Å), la cual contiene proteínas y

fosfolipidos, b) el peptidoglicano, que es un polímero compuesto de ácido N-acetil

murámico y N-acetil glucosamida entrelazados, y c) la capa externa o capa L,

lipopolisacarido (60-180Å) la cual contiene además de fosfolípidos, polisacáridos y

proteínas.

Por otro lado las bacterias Gram positivas son menos complejas debido a que contienen

solo dos capas: la membrana citoplasmática y la capa de peptidoglicano, esta capa es

mucho más gruesa que la de las bacterias Gram negativas Figura 3.

Figura 3. Tipos de bacterias de acuerdo a su membrana celular.

Membrana externa

PEPTIDOGLICANO

Membrana

celular

GRAM-NEGATIVA GRAM-POSITIVA



Tipos de antibióticos. Los antibióticos tradicionalmente se definen como compuestos

de bajo peso molecular, producidos por microorganismos que matan o inhiben el desarrollo

de otros microorganismos y pueden ser ingeridos o inyectados dentro del cuerpo humano.

Se han descubierto un gran número de antibióticos; sin embargo algunos han sufrido

modificaciones químicas para ser más efectivos en los tratamientos estos son llamados

antibióticos semisintéticos, y cuando se sintetizan completamente se les llama antibióticos

sintéticos. En términos generales y de acuerdo a su forma de actuar sobre los micro-

organismos los antibióticos se dividen en dos grandes grupos:

a) Los antibióticos Bactericidas: Inhiben el crecimiento bacteriano sino que además

desencadenan mecanismos dentro de la célula que conducen a la muerte celular, su

acción, por lo tanto es letal e irreversible sobre las bacterias (ejemplo: vancomicina,

β-lactámicos, aminoglucosidos, etc).

b) Los antibióticos Bacteriostáticos: Inhiben el crecimiento y multiplicación de las

bacterias, pero no matan al microorganismo, sin embargo si el agente es retirado, las

células vuelven a multiplicarse (ejemplo, tetraciclina, cloranfenicol, sulfonamidas,

clindamicida, macrolidos, etc).9

Para la síntesis de los compuestos β-lactámicos obtenidos en este trabajo, se utilizaron

como materias primas aldehídos, y aminas con los cuales se obtuvieron iminas, además de

las β-lactamas; por lo que a continuación se presenta un resumen de las propiedades más

importantes de cada uno de estos grupos funcionales.



I.2 Aldehídos y Cetonas

El grupo carbonilo (C=O), es un grupo funcional muy importante en la química orgánica

sintética, una característica muy especial es el hecho de que este grupo activa a grupos que

están sobre carbonos adyacentes. El grupo carbonilo determina la mayoría de las

propiedades físicas y químicas de los aldehídos y las cetonas. En los aldehídos, el grupo

carbonilo está unido a un sustituyente orgánico por un lado y a un átomo de hidrógeno por

el otro. En las cetonas dicho grupo siempre está unido a dos sustituyentes orgánicos. El

átomo del carbono del grupo carbonilo presenta hibridación sp2 y en consecuencia, este

grupo y los dos átomos unidos al mismo quedan en un mismo plano.

Reacciones de aldehídos y cetonas. La reactividad del enlace carbonílico se debe

fundamentalmente a la diferencia en electronegatividad entre el carbono y el oxigeno, lo

cual conduce a una considerable contribución de la forma resonante dipolar con el oxígeno

negativo y el carbono positivo como se muestra a continuación.

R1

R

C O

R1

R

C O:+ ..

..

La mayoría de las reacciones de los aldehídos y cetonas sobre el grupo carbonílico implican

procesos de adición. Estos, generalmente, se efectúan más fácilmente con los aldehídos o

cetonas cíclicas que con las cetonas de cadena abierta, especialmente con aquellas que

contienen grupos voluminosos.

Caracterización química de aldehídos y cetonas. Los aldehídos y las cetonas,

tienen espectros característicos de infrarrojos, ultravioleta y de resonancia magnética

nuclear. La fuerte absorción en el infrarrojo justamente por encima de los 1700 cm-1

se

debe al alargamiento C=O. La absorción más débil en el ultravioleta cercana a 270 nm se

debe a una transición electrónica n* en los aldehídos o cetonas saturados. La difracción



de rayos X proporciona información relativa a las distancias y a los ángulos de enlace. Para

los químicos orgánicos, la espectroscopia es sin duda la técnica física de mayor utilidad

Espectroscopía de resonancia magnética nuclear: Los núcleos de algunos

átomos, tales como los del hidrógeno (1H) y del carbono trece (

13C) se comportan como

pequeños imanes. Si una muestra de un compuesto que contenga estos elementos se coloca

en un campo magnético intenso, algo más de la mitad de los núcleos se alinean con el

campo. Los núcleos en este estado absorben radiación en la zona de las radiofrecuencias del

espectro y pasan a un estado de mayor energía, en el que se alinean contra el campo

magnético externo. El registro de estas transiciones es un espectro de resonancia magnética

nuclear.

Un espectro de resonancia magnética nuclear de protón (RMN 1H) tiene un número de

señales equivalente a los diferentes tipos de átomos de hidrógeno de la molécula. El

desplazamiento para el hidrógeno del grupo aldehído (HC=O) aparece entre 9 y 10 ppm,

mientras que, los hidrógenos que están sobre el carbono alfa al grupo carbonilo aparecen

entre 2.0 y 2.5 ppm.

Por otro lado, un espectro de resonancia magnética nuclear de carbono (RMN 13

C) nos

proporciona información también sobre los diferentes tipos de átomos de carbono de la

molécula. En el espectro de RMN 13

C, la señal del carbono (C=O) en aldehídos y cetonas

aparece a campo muy bajo, es decir tiene desplazamientos entre 190 a 220 ppm, y para los

átomos del carbono en posición alfa al grupo carbonilo estos aparecen entre 20 y 40 ppm.

Aldehídos y cetonas de uso común: En la naturaleza existen muchos compuestos de

importancia biológica que tienen en su estructura aldehídos o cetonas, en las plantas y en

los animales se han encontrado también una gran variedad de compuestos con estos grupos

funcionales, algunas veces con azúcares, pero más comúnmente como el compuesto

carbonílico libre. Muchas de estas sustancias naturales son importantes como saborizantes e

ingredientes de perfumes. A continuación se muestra una tabla con algunas cetonas y

aldehídos con olores y sabores bien conocidos10

.



Tabla 2 Nombres comunes y usos de algunos aldehídos y cetonas.

Compuesto

HCH3

O

OH

CH3

OH

O

O

CH3

H

O

Nombre Butiraldehído Vainillina Acetofenona trans-

cinamaldehido

Olor Mantequilla Vainilla Pistacho Canela

Uso

Margarina,

alimentos

Alimentos,

perfumes.

Helados Dulces,

alimentos,

medicamentos.

Compuesto

CH3

CH3

O

CH3

O

CH3

CH3

O

O

CH3

CH2

H

H

H

CH3

CH3

O

CH3

CH2 CH3

O CH3

Nombre Alcanfor Piretrina Carvona Muscona

Olor

Alcanforado

Floral

Enantiómero

(S)-(-): menta

verde

Enantiómero

(R)-(+):

semilla de

alcaravea.

Aroma

almizclado

Uso Linimentos,

inhalante.

En jardinería como

insecticida.

Dulces, pastas

de dientes.

Perfumes



I.3 Aminas

Este tipo de compuestos son derivados orgánicos del amoniaco (NH3), mejor conocidos

como compuestos orgánicos nitrogenados. Las alquilaminas tienen su nitrógeno unido a un

carbono con hibridación sp3; mientras que las arilaminas tienen su nitrógeno unido a un

carbono con hibridación sp2, de un anillo bencénico o bencenoide como se muestra en las

siguientes estructuras:

alquilamina

R = grupo alquilo

arilamina

Ar = grupo arilo

CH3

R

NCH3 CH3

Ar N

CH3

Las alquilaminas al igual que el amoniaco tienen un arreglo piramidal de los enlaces con el

nitrógeno, en la metilamina el nitrógeno y el carbono tiene hibridación sp3 y están unidas

por un enlace sigma (). El par electrónico del nitrógeno ocupa un orbital hibrido sp3. Ese

par no compartido interviene en las reacciones en las que las aminas se comportan como

bases o nucleófilos. En la anilina, la arilamina más sencilla, al igual que las alquilaminas,

se tiene un arreglo piramidal de enlaces en torno al nitrógeno, pero esa pirámide es algo

más plana, a pesar de tener un enlace con un carbono de hibridación sp2.

Las aminas que tienen menos de seis o siete átomos de carbono son solubles en agua. Todas

las aminas, hasta las terciarias, pueden comportarse como receptoras de un protón en

puentes de hidrógeno con moléculas de agua.

Las aminas al igual que el amoniaco, son bases débiles. Sin embargo, son las bases sin

carga más fuertes que se encuentran en cantidades importantes bajo condiciones

fisiológicas. Las aminas ocupan un lugar fundamental en los procesos biológicos, en



general, las aminas son las bases que participan en las reacciones biológicas ácido-base;

con frecuencia son los nucleófilos en las sustituciones nucleofílicas biológicas.

La facilidad con que las aminas se extraen con los ácidos acuosos aunado a su regeneración

al tratarlas con bases, simplifica la tarea de separar las aminas de otros materiales vegetales.

Por sus propiedades básicas (alcalinas) a las aminas vegetales se le llamo alcaloides11

. Los

alcaloides son compuestos biológicamente activos usados y sintetizados por las plantas para

protegerse de los insectos, la mayoría de estos alcaloides se usan en medicina, ya que se

caracterizan por un alto grado de actividad biológica, principalmente como sedantes,

aunque también la mayoría de estos son tóxicos y letales en grandes cantidades, un ejemplo

de ellos son la morfina, la nicotina o la cocaína, sus estructuras se presentan a continuación.

CH3N

N

Nicotina

Presente en el tabaco; muy tóxico a veces se usa como insecticida.

NCH3

O OCH3

O C6H5

O

Cocaína

Estimulante del sistema nervioso central

O

OH

H O

H

N CH3

Morfina

Excelente analgésico, genera adicción



I.4 Iminas

Las aminas primarias y otros compuestos relacionados con el amoniaco, son una clase de

reactivos importantes que se comportan como nucleófilos frente a los grupos carbonilos. La

reacción de estos compuestos con aldehídos y cetonas da productos con un doble enlace

entre el átomo de carbono del grupo carbonilo y el átomo de nitrógeno, estos compuestos

son llamados iminas12

, también conocida como bases de Schiff en honor a Hugo Schiff,

químico alemán que describió su formación en 1864. En esta reacción se forma una especie

neutra llamada hemiaminal o carbinolamina, algunas de estas especies se han observado

espectroscópicamente13

, la cual después de una protonación se deshidrata y forma el doble

enlace C=N. De forma parecida a los alquenos, la iminas presentan isomería cis/trans

(Z/E), en la cual la estabilidad de las moléculas esta regida por el impedimento estérico que

presenten los sustituyentes.

Por otro lado, la adición de aminas secundarias (R2NH) sobre compuestos carbonílicos,

proporciona enaminas, R2N-CR=CR2, en (de alqueno) + amina, el cual significa una

amina insaturada, ya que en este tipo de aminas el nitrógeno carece de otro hidrógeno que

se pueda perder para dar lugar al producto neutro la imina. En cambio se pierde el protón

del carbono α, obteniéndose así un doble enlace carbono-carbono (C=C), dando lugar a la

enamina, como se muestra a continuación.

H

H

O

CC

R

H

H

N

C

C

R R1

N

C

C

+ OH2OH2 +

RNH2 RR1NH

Enamina

Aldehido

o

Cetona

Imina



Mecanismo de formación de una imina. Esta reacción requiere catálisis ácida. En

términos generales, esta reacción se puede visualizar primero como una adición al doble

enlace carbono-oxigeno seguida de una reacción de eliminación de una molécula de agua,

en la que se forma un doble enlace (N=C), mediante una etapa de adición y una de

eliminación las cuales se muestran a continuación.

OC + RNH2

H

OHCNR

Etapa de adición

H

OHCNR CNR + OH2

Etapa de eliminación

Debido a que el proceso es reversible es necesaria la eliminación de agua para desplazar el

equilibrio hacia la formación de la imina. Las iminas derivadas de aminas y compuestos

carbonilicos aromáticos son más estables que las derivadas de precursores no aromáticos.

Algunas iminas son importantes biológicamente. Así por ejemplo una imina derivada de un

aldehído relacionado con la vitamina A (o retinol) y una proteína de la retina del ojo, (H2N-

Lisina-proteina) la opsina, juega un papel importante en la química de la visión, ya que la

molécula compleja que resulta llamada rodopsina, absorbe luz en la región visible del

espectro, a continuación se presenta su estructura.

proteínal isinaH N

Rodopsina



Hay otra vitamina importante la B6, que actúa como una coenzima (cofactor) formando una

imina con el grupo amino de la enzima, este cofactor está relacionado con las reacciones de

transaminación, es decir la transferencia de grupos amino de un aminoácido a otro,

mediante una serie de reacciones que involucran la formación de distintas iminas, que son

importantes en el metabolismo y la biosíntesis de aminoácidos. Las vitaminas también se

denominan coenzimas, que son las grandes proteínas que catalizan los cambios químicos

que tienen lugar en el interior de la célula, a continuación se muestran su estructura.

Enzima

O

O

PO

N+

CH3

H

OH

N

CH

O

Cofactor (B6-enzima) unido

mediante un enlace imina.

_

I.5 Lactamas

Las lactamas son amidas cíclicas y son análogas de las lactonas que son ésteres cíclicos.

Así como las amidas son más estables que los ésteres las lactamas son más estables que las

lactonas. En la naturaleza existen muchas lactonas, casi todas son o lactonas, es

decir, casi todas contienen anillos de cinco y seis miembros, que son anillos estables.

O

O

CH3

OO

NO

H

- lactona - lactoma - lactama



En algunas reacciones se han detectados –lactonas o sea, lactonas con anillos de cuatro

miembros, como productos intermediarios. Sin embargo, estas son muy reactivas. Por otro

lado, las –lactamas son inesperadamente estables.

βlactamas: Las βlactamas se encuentran entre los productos mejor conocidos de la

industria farmacéutica. Como ya se mencionó al principio, los antibióticos del tipo de las

penicilinas y las cefalosporinas que son tan útiles para tratar las infecciones bacterianas, son

βlactamas unidos a otro anillo; a los cuales se les llama antibióticos β-lactámicos, su

estructura es la siguiente:

CO2H

CH3

CH3

O

N

ON

H5C6

S

H

X

N

ON

S

CO2H

H

O

R

Penicilina G Cefalosporinas

Los compuestos heterocíclicos juegan un papel farmacológico y bioquímico importante, las

bases púricas y pirimidínicas, que son las unidades estructurales de los ácidos nucleicos;

desoxirribonucleico (ADN), y ribonucleico (ARN), son compuestos heterocíclicos, al igual

que muchas drogas como la morfina, la heroína y la cocaína. Las β-lactamas son

heterociclos de cuatro miembros, mejor conocidos como 2-azetidinonas; azetidin debido al

nombre genérico que corresponde a un anillo de cuatro miembros con nitrógeno como

heteroátomo, 2- y la terminación ona corresponden a la posición de la cetona.

La reactividad del grupo carbonilo de la 2-azetidinona, que es una amida cíclica de cuatro

miembros, tensionada, es la responsable de la actividad biológica de estos antibióticos.

Estos compuestos actúan como agentes acilantes e impiden la síntesis de la pared celular de

las bacterias.



La comprensión del mecanismo de acción de los antibióticos β-lactámicos en las bacterias

por inhibición específica de la enzima transpeptidasa, ha promovido el desarrollo de nuevos

inhibidores β-lactámicos que tienen como blanco a las enzimas serina-proteasa, las β-

lactamasas y las elastasas14

. Como consecuencia se han desarrollado, un gran número de

métodos químicos para la producción de compuestos β-lactámicos los cuales han sido

ampliamente documentados y revisados en más de una ocasión15

: 1.- La ciclación de

hydroxamato16

, 2.- La condensación de metaloester con enolatos de iminas17

, 3.- La

reacción entre complejos de cromo con carbeno-iminas18

, 4.- La cicloadición entre

isocianatos y alquenos19

y 5.- La cicloadición cetena-imina3, también conocida como la

reacción de Staudinger son los métodos más frecuentemente utilizados para la construcción

del anillo de la 2-azetidinona. En particular, este último método ha proporcionado una

opción muy útil y económica para la síntesis de los compuestos β-lactámicos,

principalmente debido a la fácil disponibilidad para obtener tanto las bases de Schiff, así

como de las cetenas.

Se ha reportado la síntesis de -lactamas quirales; como por ejemplo la obtención

enantioselectiva de la -lactama D con un exceso enantiomerico del 82% y con un

rendimiento aislado del 75%, mediante una condensación utilizando el enolato A, la imina

B, y en donde el agente auxiliar quiral C es recuperado de manera cuantitativa17

.

CH3

OLiO

CH3 CH3

CH3

+ LDA +

R

Ph

N

OMe

PhPh

MeO

Tolueno O R

CH3

CH3

CH3

N

A B D

ee = 82%

C



La obtención de -lactamas , -disustituidas como la estructura E, se obtienen mediante

una cicloadición [2+2] de isocianatos sustituidos y alquenos19

.

RO C N

+ [2+2]

CH3

CH3

CH2

CH3

OR

N

CH3

Isocianato Olefina E

La cicloadición de cetenas e iminas, (reacción de Staudinger) es probablemente la más

general y útil de las aproximaciones al núcleo de 2-azetidinona, si se tienen en cuenta

factores tales como versatilidad y control estereoquímico. Por ejemplo se ha reportado20

,

que la reacción del cloruro de ácido F, con la imina G, y la trietilamina producen la -

lactama H, como un solo producto diastereoisomérico.

O Cl

SO2

CH3 CH3

N+

R

N

Ar Et3N,CH2Cl2,

-23°C, t.a, 15h.

RO

H H

SO2

CH3 CH3

N

N

Ar

F G H

Como consecuencia de la amplia investigación de compuestos β-lactámicos, se ha

descubierto que estos compuestos pueden ser precursores no solo de penicilinas y

cefalosporinas, sino que también son precursores de β-aminoácidos y péptidos, entre otras

sustancias21

.

Por otro lado, los recientes descubrimientos de compuestos -lactámicos con nueva y

diferente actividad biológica; tales como el inhibidor trombina22

, el inhibidor del

antígeno prostático especifico23

, el inhibidor de la enzima proteasa del citomegalovirus

humano24

, o los inhibidores de absorción de colesterol25

, garantizan un interés renovado en

la síntesis de azetidinonas y por lo tanto, en la reacción de Staudinger. Las estructuras de

dichos inhibidores son:



O

O

H O

H

CONMe2

O

H

NN

N

H

NO

OMe

OMe

O

H H

N

OH

F

F

OH

O

H H

N

NH

CO2Me

O

H H

N

O

OS

NNH2

H

Me

Inhibidor Trombina BnO2C

OH

H

OHO

O

N

O

CO2H

Inhibidor antígeno prostático especifico

Inhibidor de la proteasa del citomegalovirus humano

Inhibidores de absorción del colesterol

Finalmente, tomando en cuenta el hecho de que –lactamas derivadas estratégicamente

funcionalizadas son también excelentes bloques de construcción para la síntesis de y -

aminoácidos derivados26 y 27

. Se debe esperar que mejoras en la reacción de Staudinger

contribuyan a ser los intermediarios sintéticos de elección para muchos químicos que

trabajan en el campo de la química heterocíclica y en la síntesis de péptidos.

Capítulo II



II PARTE EXPERIMENTAL

II.1 Material y equipo

En la síntesis de los compuestos reportados en este trabajo, el material e instrumentación

utilizado es de fácil acceso y se puede encontrar en un laboratorio de química orgánica, los

materiales empleados fueron los siguientes; tubos de ensayo, vasos de precipitado,

embudos de separación, embudos, matraces aforados, pipetas, probetas, pizetas, balanza

analítica, soportes, cánulas, cristalizadores, capilares, sistemas de destilación, barras

magnéticas de agitación, parrillas de agitación y calentamiento, mantas de calentamiento,

refrigerantes, termómetros, jeringas desechables, algodón, estufa, parafilm, guantes de

látex, guantes de asbesto, bomba de recirculación de agua, bomba de vacío, variador de

corriente, gafas de protección, pinzas, papel filtro, papel aluminio, entre otros. Todo el

material de vidrio se lava y se seca en una estufa a una temperatura de 150 °C durante 24

horas antes de utilizarse. Para concentrar los productos obtenidos se empleó un evaporador

rotatorio Büchi RE50 unido a una bomba de vacío.

Los puntos de fusión de los productos sintetizados fueron determinados en un aparato de

punto de fusión Electrothermal 9300 usando láminas de vidrio, y no están corregidos. Los

espectros de infrarrojo (IR) se determinaron en pastillas de KBr y fueron obtenidos en un

espectrofotómetro “Spectrum One FT-IR” de Perkin Elmer. Las frecuencias de absorción se

reportan en cm-1

.

Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) se determinaron en dos

espectrómetros; JEOL modelo FX-270Q (a 270 MHz para 1H y a 67.89 MHz para

13C), y

otro de Varian modelo VNMRS-500 (a 500 MHz para 1H y 125.787 MHz para

13C).

Las estructuras de rayos X de un monocristal se obtuvieron en un difractómetro Xcalibur-S

de la compañía Oxford Diffraction, empleando radiación de molibdeno y un detector de

área.



Disolventes y reactivos: El cloruro de metileno (CH2Cl2) se destilo y se secó

usando como indicador sulfato de calcio, mejor conocido como dierita, el cual se agitó

durante 8 hrs a reflujo, en un medio libre de oxígeno, para lo cual se burbujea un gas inerte

nitrógeno (N2). Los disolventes utilizados en las purificaciones de los compuestos; el

hexano y el acetato de etilo son grado reactivo, por lo que fueron destilados antes de

utilizarse. Los reactivos se compraron de Sigma-Aldrich y a continuación se tabulan

algunas de sus propiedades químicas:

Tabla 3.- Propiedades químicas de disolventes y reactivos utilizados.

Reactivo Formula P.M.(g/gmol) (g/ml) p.f. (°C ) p.eb. (°C )

Benzaldehído C6H5CHO 106.12 1.045 -26 178-179

4-Nitroanilina C6H6N2O2 138.12 1.402 146-149 360

4-Fluoroanilina C6H6FN 111.12 1.173 56 74

4-Metoxianilina C7H9NO 123.16 1.071 56 122

Trietilamina (C2H5) 3N 101.19 0.726 -115 89

Cloruro de

Cloroacetilo

C2H2Cl2O 112.94 1.418 -22°C 105-106

Cloruro de

propionilo

C3H5ClO 92.52 1.065 -94°C 77-79

Cloruro de

metileno

CH2Cl2 84.93 1.325 -97°C 39-40

Tolueno C7H8 92.14 0.865 -93 110-111

Acetato de etilo CH3COOC2H5 88.11 0.902 -84 77-78

Hexano C6H14 86.18 0.659 -95 69

Reactivos Microbiológicos. Para las pruebas de sensibilidad, se usaron los siguientes

reactivos: medio de culivo BBLTM

Mueller Hinton Broth (Becton Dickinson and

Company), medio de cultivo LB Miller broth (Sigma), sensidiscos con cefinasa BBL

Cefinace (Becton Dickinson and company), medio de cultivo BD Broxon Muller hinton

agar (Becton Dickinson and company), sensidiscos con cefotaxima BD BBL™ (CTX) 30



N

H

NO2

µg (Becton Dickinson and company), sensidiscos con ceftazidima BD BBL™. (CAZ) 30

µg (Becton Dickinson and company), antibacteriano antibenzil concetrado rojo

(Farmacéuticas Altamirano), DMSO (Sigma). Los antibióticos de referencia: ampicilina

trihidratada y amoxicilina trihidratada, fueron amablemente otorgados por los Laboratorios

Sinbiotik International S.A. de C.V., y el inhibidor de referencia: clavulanato de potasio fue

amablemente otorgado por los Laboratorios Fermic. S.A. de C.V.

En relación al ajuste del inóculo se realizó en un espectrofotómetro de UV-VIS Varian

Cary–win conc. 50%

II.2 Procedimiento y metodología

II.2.1.- Síntesis de compuestos

Síntesis de la 4-nitro-[(E)- fenilmetilideno]-anilina (Imina 1a)

En un matraz balón de 100 mL, se agregaron 9.56 ml (0.0942mol) de benzaldehído, 13.15

gr (0.09423mol) de p-nitroanilina, y 0.5 mL ácido clorhídrico como catalizador, en 75 mL

de tolueno como medio de reacción, se utilizo una trampa de Dean-Stark para separar el

agua producida en la reacción y esta se mantuvo a reflujo y con agitación magnética, por un

tiempo de 12 horas (Figura 4), la solución resultante se filtró a vacío y el precipitado se

lavó con hexano. Al líquido obtenido se le evapora el disolvente hasta la mitad en el

rotavapor y se deja cristalizar, obteniéndose 17.907g de cristales anaranjados de punto de

fusión 110oC, que corresponde a un rendimiento del 84%. Su estructura es la siguiente:

Peso molecular: 226.23 g/mol.

Punto de Fusión: 110 °C.



a) b)

Figura 4. Representación; a) de la síntesis de una imina y b) concentración del producto

Caracterización: En la purificación de los productos sintetizados, primero se realiza

una prueba preliminar en cromatografía de placa fina sobre placas de Merck-DC-F254, la

cual se revela usando una lámpara de luz ultravioleta (UV) a 254nm, modelo UVS-18, con

luz de onda corta y luz blanca, para determinar cuál es el producto principal de la mezcla de

productos obtenidos en la reacción, así como las proporciones adecuadas de los disolventes,

para obtener una buena separación de ellos, una vez obtenidas estas condiciones, la

separación del compuesto principal se hace por medio una cromatografía en columna tipo

flash28

, la cual se realiza con aire y la sílica utilizada es sílica gel Merck de 230-240 mallas

(0.040-0.063mm). Para la purificación de los disolventes se utilizó destilación fraccionada,

y los productos sólidos obtenidos se purifican por recristalización.

Para la caracterización por RMN de 1H y

13C las determinaciones se llevaron a cabo

utilizando en todos los casos como disolvente cloroformo deuterado (CDCl3) y

tetrametilsilano (TMS) como referencia interna. Para indicar la multiplicidad de las señales

en 1H se utilizaron las siguientes abreviaturas: (s) simple, (d) doble, (t) triple, (c) cuarteto

(m) múltiple. Los valores de los desplazamientos químicos (δ) se presentan en partes por

millón (ppm) y las constantes de acoplamiento (J) se describen en Hertz (Hz). En los casos

en que no se pudo determinar la multiplicidad de una señal, se reporta el intervalo de

desplazamiento químico en el que aparecen.



N

H

F

Bandas de absorción de IR (pastilla de KBr, v; cm-1

); 2893.70 (C-H aromático), 1627.85

(C=N), 1510.97 (Caromático-NO2), 1478.42 y 1333.15 (-NO2),1107.01 (C-Haromático), 857.83 y

527.58 (C-NO2), 842.42 (C=Caromático), y 444.97 (C-N-C).

Señales de 1H-RMN (500 MHz; CDCl3), (ppm); 7.22 (2H, d, J=8.54, =C-H aromático), 7.50

(2H, d, J=7.58, =C-H aromático), 7.53 (1H, d, J=8.07, =C-H aromático), 7.91 (2H, d, J=7.09, =C-

H aromático), 8.22 (2H, d, J=7.09, =C-H aromático), y 8.41 (1H, s, CH=N-C=).

Señales de 13

C-RMN (125 MHz; CDCl3), (ppm); 121.2 (=CHorto), 125.0 (=CHmeta), 128.8

(=CHmeta), 129.2 (=CHorto), 132.4 (=CHpara), 135.3 (=CHipso), 145.4 (=CHpara), 157.8

(=CHipso), y 162.6 (CH=N),

Síntesis de la 4-fluoro-[(E)-fenilmetilideno]-anilina (Imina 1b)

En un matraz balón de 100 mL, se agregaron 9.56 mL (0.0942mol) de benzaldehído,

10.470 gr (0.09423mol) de p-Fluoroanilina, y 0.5 ml ácido clorhídrico como catalizador, en

50 mL de tolueno como medio de reacción, se utilizo una trampa de Dean-Stark para

separar el agua producida en la reacción y esta se mantuvo a reflujo y con agitación

magnética, por un tiempo de 12 horas, la solución resultante se filtro a vacío y el

precipitado se lavó con hexano. Al líquido obtenido se le evapora el disolvente hasta la

mitad en el rotavapor y se deja cristalizar, obteniéndose 15.956g de cristales blancos muy

ligeros de punto de fusión 51oC, que corresponde a un rendimiento del 85%.


Punto de Fusión: 51 °C.



N

H

OMe


); 2875.73 y 2855.16 (C-H

aromático), 1627.88 (-C=N-), 1499.60 (Caromát), 1237.53 (C=C-F), 1217.43 y 1188.43 (F-CH),

832.34 y 771.04 (C-Catomaticodi-sustituido), y 690.08 (C-N-C).

Señales de 1H-RMN (500 MHz; CDCl3), (ppm); 7.04 –7.1 (2H, m, =C-H aromático), 7.16-

7.20 (2H, m, =C-H aromático), 7.44-7.48 (3H, m, =C-H aromático), 7.85-7.90 (2H, m, =C-H

aromático), y 8.41 (1H, s, CH=N-C=).

Señales de 13

C-RMN (125 MHz; CDCl3), (ppm); 115.81 (d J2C-F=22.37Hz, =CHmeta),

122.27 (d J3C-F=8.42Hz, =CHorto), 128.73 (=CHorto), 128.76 (=CHmeta), 131.40 (=CHpara),

136.05 (=CHipso), 148.02(d J4C-F=3.27Hz, =CHipso), 160.09 (CH=N), 161.21 (d, J

1=

244.21Hz, =C-Fpara).

Síntesis de la 4-metoxi-[(E)fenilmetilideno]-anilina (1c) En un matraz balón de 100 mL, se agregaron 9.56 mL (0.0942 mol) de benzaldehído,

11.605gr (0.0942 mol) de p-metoxianilina y 0.5 mL ácido clorhídrico como catalizador, en

50 mL de tolueno como medio de reacción, se utilizo una trampa de Dean-Stark para

separar el agua producida en la reacción y esta se mantuvo a reflujo y con agitación

magnética, por un tiempo de 12 horas, la solución resultante fue filtrada con vacío y el

precipitado se lavó con hexano. Al líquido obtenido se le evapora el disolvente hasta la

mitad en el rotavapor y se deja cristalizar, obteniéndose 13.930g de cristales blancos muy

ligeros de punto de fusión 64-66oC, que corresponde a un rendimiento del 70%.


Punto de Fusión: 64- 66°C.



Banda de absorción de IR (pastilla de KBr, v; cm-1

); 2975.61 (C-H aromático), 1623.10 (-

C=N-), 1510.97 (Caromát), 1248.52 (O-CH3), 1030.23 (O-Caromático), 834.64 y 761.56 (C-

Catomaticodi-sustituido), y 688.48 (C-N-C).

Señales de 1H-RMN (500 MHz; CDCl3), (ppm); 3.84 (-OCH3), 6.97 (2H, d, J=8.8 Hz,

=C-H aromático), 7.28 (2H, d, J=8.88 Hz, =C-H aromático), 7.49 (3H, =C-H aromático), 7.94 (2H,

=C-H aromático), y 8.50 (1H, s, CH=N-C=).

Señales de 13

C-RMN (125 MHz; CDCl3), (ppm); 55.74 (-OCH3), 114.66 (=CHmeta),

122.52 (=CHorto), 128.86 (=CHmeta), 129.00 (=CHorto), 131.32 (=CHpara), 136.73 (=CHipso),

145.15(=CHipso), 158.57 ( =C-Fpara), 158.64 (CH=N).

Síntesis de la 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2a)

En un matraz balón de fondo plano de 100mL, que contenía 1.5 g (0.0066 mol) de la imina

1a se agregaron 30 mL de cloruro de metileno anhidro, esta solución se mantuvo en

agitación magnética en atmosfera de nitrógeno y en un baño de hielo seco/acetona, para

alcanzar una temperatura de -78°C. A esta mezcla se le adicionó vía cánula en condiciones

inertes (N2) y gota a gota una la solución de 1.32mL de cloruro de cloroacetilo

(0.01657 mol) en 30 mL de cloruro de metileno. Después se agregó, también, vía cánula en

condiciones inertes y gota a gota una solución que contenía 2.39mL (0.01657 mol) de

trietilamina en 25mL de cloruro de metileno. Terminada la adición se mantuvo por dos

horas a esta temperatura (-78°C) y posteriormente se mantuvo en agitación a temperatura

ambiente durante 48 horas (Figura 5).



Figura 5. Reacción a -78°C, en condiciones anhidras.

Finalizado este tiempo de reacción la solución resultante se filtró a vacio, para quitar el

clorhidrato de la trietilamina formado, el cual se lavó con diclorometano; el líquido

obtenido del filtrado se trató con una solución de bicarbonato de sodio (NaHCO3) al 10%.

Después se hicieron 3 extracciones con esta solución y 3 más con agua destilada. La fase

orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro (Na2SO4), se filtró y se concentró en el

rotavapor para eliminar todo el disolvente. El producto obtenido se purificó por

cromatografía en columna tipo flash (Figura 6), empleando una mezcla de disolventes 9:1

de hexano-acetato de etilo. Se obtuvo un sólido transparente con punto de fusión 139°C, y

con un rendimiento de 56%.

Figura 6. Esquema de purificación por cromatografía en columna.



N

Cl

O

O2N


Punto de Fusión: 139° - 140°C.


); 3050.18(C-H), 2991.12 (C-H

aromático), 1765.13 (O=C-N-), 1518.01 (Caromático-NO2), 1498.62 y 1339.33 (-NO2), 1372.00

(C-N) 1109.79 (C-Haromático), 1061.29, 834.75 y 748.26 (C-Cl) 858.07 y 703.93 (C-NO2),

846.41 y 788.66 (C-Catomaticodi-sustituido), y 471.12(C-N-C).

Señales de 1H-RMN (500 MHz; CDCl3), (ppm); 4.78 (H, d, J=2.2 Hz, Ph-CH-CH-Cl),

5.17 (H, d, J=2.20 Hz, Ph-CH-CH-Cl), 7.33-7.46 (2H, m, =C-H aromático), 7.48 (2H, d, J

=9.04Hz, =C-H aromático), 7.49-7.53 (3H, m, =C-H), 8.23 (2H, d, J =9.07Hz, =C-H aromático)

Señales de 13

C-RMN (125 MHz; CDCl3), (ppm); 63.78 (COCHCl-), 66.96 (Ph-CH-CH),

117.84 (=CHorto), 125.52 (=CHmeta), 126.38 (=CHorto), 130.13 (=CHmeta), 130.39 (=CHpara),

134.24 (=CHipso), 142.08 (=Cipso), 144.33 (=C-NO2) y 161.58 (Cl-CH-C=O).

Síntesis de la 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2b)

En un matraz balón de fondo plano de 100mL, que contenía 2g (0.0101 mol) de la imina

1b, se agregaron 30 mL de cloruro de metileno anhidro, esta solución se mantuvo en

agitación magnética en atmosfera de nitrógeno y en un baño de hielo seco/acetona, para

alcanzar una temperatura de -78°C. A esta mezcla se le adicionó vía cánula en condiciones

inertes y gota a gota una la solución que contenía 2.19 mL (0.0251 mol) de cloruro de



N

CH3

O

F

propionilo en 30 mL de cloruro de metileno. Después se agregó, también, vía cánula, es

decir, en condiciones inertes y gota a gota una solución que contenía 3.48 mL (0.0251 mol)

de trietilamina en 25mL de cloruro de metileno. Terminada la adición se mantuvo por dos

horas a esta temperatura (-78°C) y posteriormente se mantuvo en agitación a temperatura

ambiente durante 48 horas. Finalizado este tiempo de reacción la solución resultante se

filtro a vacio, para quitar el clorhidrato de la trietilamina formado, el cual se lavó con

diclorometano; el líquido obtenido del filtrado se trato con una solución de bicarbonato de

sodio (NaHCO3) al 10%. Después se hicieron 3 extracciones con esta solución y 3 más con

agua destilada, la fase orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro (Na2SO4), se filtró y se

concentró en el rotavapor para quitar todo el disolvente. El producto obtenido se purificó

por cromatografía en columna tipo flash, empleando una mezcla de disolventes 9:1 de

hexano-acetato de etilo. Se obtuvo un sólido blanco con punto de fusión 90°C, y con un

rendimiento de 50%.


Punto de Fusión: 90°C.

Señales de 1H-RMN (500 MHz; CDCl3), (ppm); 1.49 (3H, d, J=8.58 Hz, CH3-CH-), 3.15

(H, c, Ph-CH-CH-CH3), 4.58 (H, d, J=2.20 Hz, Ph-CH-CH-CH3), 6.93 (2H, t, J3

H-H=9.0

Hz, J3

H-F=8.31 Hz, =C-Haromático), 7.28(2H, dd, J3

H-H=9.07 Hz y J4

H-F=5.1 Hz, =C-Haromático),

7.34-7.40 (5H, m, =C-H aromático).

Señales de 13

C-RMN (125 MHz; CDCl3), (ppm); 13.29 (CH3-CH-), 55.79(CO-CHCH3-),

63.17 (Ph-CH-CH-), 116.0 (d J2

C-F=22.10Hz, =CHmeta), 118.58 (d J3C-F=8.14Hz, =CHorto),

126.08 (=CHorto), 128.94 (=CHpara), 129.45 (=CHmeta), 134.34(d J4

C-F=2.78Hz, =CHipso),

137.89 (=CHipso), 159.37 (d, J1= 245.58 Hz, =C-Fpara), 168.28 (CH3-CH-C=O).



II.2.2.-Pruebas Microbiológicas

Obtención y recuperación de cepas. Se recuperaron 7 cepas, Aeromona hidrophila

ATCC 7966, Klebsiella pnuemoniae ATCC 700603, Pseudomonas aeruginosas ATCC 27852,

Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 35218, Escherichia coli DH10 sensible

(DH10s) y Staphylococcus aureus ATCC 29213; las cuales pertenecen al cepario del grupo de

investigación del laboratorio de Bacteriología médica de la Escuela Nacional de Ciencias

Biológicas del I.P.N.

Manejo y conservación de cepas. Estas cepas se conservaron por congelación a

-80ºC en caldo Mueller-Hinton con glicerol al 40 % como crioprotector y fueron

resembradas en agar Mueller-Hinton. Después de la incubación se comprobó su pureza por

tinción de Gram. Se tomó un inóculo y se sembró en una caja de agar Mueller-Hinton por

estría cruzada. El vial empleado se regresó al congelador inmediatamente después de

utilizarlo. Las cajas se incubaron a 28ºC durante 24 horas. Las cepas recuperadas se

conservaron a corto plazo en microtubos conteniendo medio de mantenimiento.

Evaluación de la producción de β-lactamasas. Fundamento de la prueba. La

prueba de Cefinasa, consta de varios discos impregnados con nitrocefina (estos discos se

impregnan con 0.5 mL de Nitrocefina previamente disuelta en un buffer de fosfatos y

dimetil sulfóxido). Procedimiento de la prueba. La prueba de cefinasa se realizó usando el

kit BD BBL, bajo los estándares del fabricante. (Beckton Dickinson). Se tomó de 2 a 3

colonias de cada cepa y se depositaron en los discos previamente rehidratados con agua

estéril. El desarrollo de una coloración roja al cabo de 1 a 5 minutos indica la producción de

β-lactamasas.

Determinación de la potencial actividad antibiótica de la β-lactama 2a:

Prueba de susceptibilidad antimicrobiana. Procedimiento de la prueba. Se

trabajó de acuerdo a los lineamientos de la Clinical and Laboaratory Standadrs (CLSI),

utilizando la técnica de dilución en medio líquido (microplaca). Se utilizó Ampicilina

trihidratada como antibiótico de referencia; así mismo, las cepas con las que se trabajó

fueron: Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia



coli ATCC 35218, y Escherichia coli DH10s. El intervalo de concentración usado fue de

0.5-256 µg/mL (4.9x10-6

- 2.5x10

-5 M) para la ampicilina trihidratada (AMP

.3H2O), y para

las β-lactamas, se tomó en cuenta la relación molar de la AMP.3H2O, trabajando en el

mismo intervalo de concentraciones. Se adicionaron 100 µL del posillo No 1 al 10 de cada

una de las concentraciones, empezando de mayor a menor concentración, en el posillo No.

11 se adicionó 50 µL del disolvente y 50 µL de medio Mueller Hinton Caldo (MHB*),

como control positivo del crecimiento bacteriano, y en el posillo No. 12 se adicionaron 200

µL de MHB, como control negativo del crecimiento bacteriano. Véase Figura 7.

Figura 7. Disposición de las microplacas para estudiar la actividad antibiótica de la β-

lactama 2a, con ampicilina trihidratada (AMP.3H2O).

Una vez que a las microplacas se les colocó la β-lactama 2a y la ampicilina, se dejaron a

prueba de esterilidad por 24 h. Posteriormente, cada una de las cepas bacterianas se

ajustaron partir de un cultivo de 18 horas en solución salina fisiológica (ssf) hasta 0.5

unidades Mc Farland**

. Del inóculo estandarizado se realizó una dilución 1:10000 con

caldo Mueller-Hinton, y del cual se adicionaron 100 µL a cada posillo, exceptuando el

posillo No. 12. Finalmente se incubaron las microplacas a 28 ºC por 18 h. Esta técnica se

realizó por triplicado.

* Del inglés Muelle Hinton Broth

** Lo que equivale a 1.5x10

4 células/mL

Capítulo III



III. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Como resultado del gran interés de los compuestos β-lactámicos, tanto en medicina y en

biología, como en química orgánica existe una gran variedad de métodos químicos

reportados para la obtención de estos compuestos, la metodología que se estableció, en este

trabajo, para la síntesis de estas mono β-lactamas es la que involucra la reacción de

Staudinger, que es una reacción de cicloadición [2+2] entre una cetena y una imina, la cual

incluye la inserción de un carbenoide. Esta reacción es un método fundamental que se lleva

a cabo en un solo paso. Para lo cual primeramente se obtienen y se caracterizan tres iminas

(o benziliminas) derivadas del benzaldehído con tres aminas aromáticas para sustituidas y

posteriormente la obtención de las β-lactamas monocíclicas. La síntesis general de las mono

β-lactamas podemos representarla como sigue:

N

R2

O

R1

NH2 R1

O

H

R1 = -NO2 , -F, y -OMe R1 = -NO2 , R

2 = Cl 2a

R1 = -F , R2 = CH3 2b

+

III.1 Síntesis de benciliminas (Iminas 1a-1c)

Las benciliminas son iminas o bases de Schiff, obtenidas específicamente de benzaldehido

y como amina primaria tres anilinas para-sustituidas. La adición nucleofílica de la amina

aromática al grupo carbonilo da como resultado hemiaminales, los cuales se deshidratan

fácilmente dando lugar a las iminas correspondientes. Su mecanismo de formación es un

proceso que está en equilibrio, por lo que es necesario eliminar el agua para desplazar la

reacción hacia el producto; esta reacción generalmente es catalizada por ácidos.



Síntesis de la 4-nitro-[(E)- fenilmetilideno]-anilina (Imina 1a): Se hizo

reaccionar al benzaldehído con un equivalente de la p-nitro-anilina utilizando tolueno como

disolvente y ácido clorhídrico como catalizador. La mezcla se mantuvo a reflujo durante

doce horas, usando una trampa de Dean-Stark, para separar el agua producida en la

reacción, obteniéndose la 4-nitro-[(E)- fenilmetilideno]-anilina, referida como la Imina 1a,

que es un sólido anaranjado el cual se caracterizó espectroscópicamente por RMN de 1H,

RMN de 13

C y espectroscopia de infrarrojo. A continuación se representa la síntesis de la

Imina 1a:

NH2

NO2

+Tolueno

N

NO2O

H

+ H

2O

1 aBenzaldehido p-NO2-anilina

En la asignación de los desplazamientos químicos para las señales de hidrógeno de este

compuesto, se observa que en el espectro de RMN de 1H, el desplazamiento del hidrógeno

que esta sobre el carbono de la imina (CH=N-) aparece en campos bajos, es este caso a 8.41

ppm, y que el desplazamiento químico para los dos hidrógenos alfa al grupo nitro esta en

8.22 ppm, es decir, son los hidrógenos aromáticos que se desplazan más a campos bajos. En

la estructura siguiente se muestran la asignación de las señales de 1H en ppm para el

compuesto 1a:

N

NO2

H

H

H

H

H

H

8.41

8.22

7.91

7.22

7.50

7.53



Como puede observarse en la estructura de este compuesto, todos los carbonos tienen

hibridación sp2, por lo que en la caracterización por RMN

13C, todas las señales de los

carbonos salen en la región de 120 a 165 ppm, observándose que las señales mas

desplazados aparecen en 157.8 y 162.6 las cuales corresponden al carbono ipso con el

nitrógeno de la imina (C=N-C-) y al carbono de la propia imina (CH=N-) respectivamente.

Se muestra la asignación de las señales de RMN13

C, en ppm para el compuesto 1a.

N

NO2

157.8132.4

135.3

145.4128.8

125.0

129.2

162.6

121.2

Síntesis de la 4-fluor-[(E)-fenilmetilideno]-anilina (Imina 1b): Para la síntesis

de esta benzilimina se hizo reaccionar al benzaldehído con un equivalente en este caso de

la p-fluoro-anilina, bajo las mismas condiciones de reacción, y usando una trampa de Dean-

Stark, para separar el agua producida en la reacción, obteniéndose la 4-fluor-[(E)-

fenilmetilideno]-anilina, representada como la Imina 1b, que es un sólido blanco muy

ligero, tipo escamas, con un punto de fusión muy bajo de 51oC. La síntesis de la esta Imina

se representa a continuación:

NH2

F

+Tolueno

N

FO

H

+ H

2O

1 bBenzaldehido p-fluor-anilina



La caracterización espectroscópicamente de este compuesto se realizó usando RMN de 1H,

RMN de 13

C y espectroscopia de infrarrojo. En relación a la asignación de los

desplazamientos químicos para las señales de hidrógeno del compuesto 1b, se observa que

en el espectro de RMN de 1H, el desplazamiento del hidrógeno que esta sobre el carbono de

la imina (CH=N-) aparece, es este caso también a 8.41 ppm, y debido a que el átomo de

flúor presenta una frecuencia de resonancia característica (470.47 MHz) y diferente a la del

hidrógeno (500 MHz) es decir, es magnéticamente activo y además como tiene un spin de

½ (I=1/2), se observa el acoplamiento heteronuclear (F-H) de este con los hidrógenos

aromáticos vecinos, generando una señal múltiple con un desplazamiento químico para los

dos hidrógenos α a este halógeno entre 7.04 y 7.1 ppm, e incluso para los hidrógenos que se

encuentran a cuatro enlaces con el átomo de flúor también se acopla y aparece como una

señal múltiple entre 7.16 y 7.20 ppm. La asignación de las señales de RMN1H, en ppm de

la Imina 1b se muestra en la estructura siguiente:

N

F

H

H

H

H

H

H

8.41

7.04 - 7.1

7.16 - 7.20

7.86 - 7.9

7.44 - 7.48

En la asignación de los desplazamientos químicos para las señales de los carbonos de este

compuesto, en el espectro de RMN de 13

C se observa también que el átomo de flúor es

magnéticamente activo, y como una consecuencia de la presencia de este átomo sobre los

átomos de carbono del anillo aromático, se genera un acoplamiento heteronuclear (C-F) con

estos, y los valores de las constantes de acoplamiento son muy grandes e inusuales; para el

carbono que está unido directamente al átomo de flúor se tiene un desplazamiento químico

de 161.21 ppm y una constante de acoplamiento carbono-flúor de J1

C-F = 244.21Hz, para el

carbono α al carbono que soporta al átomo de flúor este aparece en 115.81 ppm y su



constante de acoplamiento carbono-flúor es ahora a dos enlaces J2C-F=22.37Hz, para el

carbono que se encuentra unido a tres enlaces con el átomo de flúor su desplazamiento es

de 122.27 ppm y su constante de acoplamiento es menor J3

C-F=8.42Hz, y finalmente la

constante de acoplamiento a cuatro enlaces también se observa, aunque su magnitud es muy

pequeña J4

C-F=3.27Hz. La asignación de las señales de RMN13

C, en ppm de la Imina 1b es

la siguiente:

N

F

148.019

131.41

136.05

161.21128.76

115.81

128.73

160.09

122.27

J2

C-F

= 22.37Hz

J3

C-F

= 8.42HzJ4

C-F

= 3.27Hz

J1

C-F

= 244.21

Síntesis de la 4-metoxi-[(E)-fenilmetilideno]-anilina (Imina 1c): Las mismas

condiciones fueron utilizadas para la obtención de la 4-metoxi-[(E)- fenilmetilideno]-

anilina, citada como la Imina 1c. En este caso se utilizó como amina primaria a la p-metoxi-

anilina.

NH2

OMe

+Tolueno

N

OMeO

H

+ H

2O

1 cBenzaldehido p-metoxi-anilina

En el espectro de RMN de 1H, de este compuesto, se observa el desplazamiento de los

hidrógenos del grupo metoxi (CH3O-) como una señal simple que aparece en 3.84 ppm, el



hidrógeno característico de la imina (CH=N-) aparece a campos bajos, es este caso a 8.50

ppm, y el desplazamiento químico para los dos hidrógenos α al carbono que tiene el grupo

metoxi aparece como una señal doble en 7.28 ppm, y con un a constante de acoplamiento

hidrógeno-hidrógeno a tres enlaces de J3

H-H=8.8 Hz; mientras que los hidrógenos α al

carbono que tiene el nitrógeno de la imina aparecen en 6.97 ppm y con la misma constante

de acoplamiento aromática de 8.8 Hz. La asignación de las señales de RMN1H, en ppm de

1c son las siguientes:

N

OCH3

H

H

H

H

H

H

8.50

7.28

6.97

7.49

7.49

7.94

3.84

J3

H-H= 8.88Hz

J3

H-H= 8.88Hz

En la caracterización del compuesto 1c por RMN13

C, aparecen las diez señales

correspondientes a los diez átomos de Carbono magnéticamente diferentes que conforman

la estructura de este compuesto. En 55.57 ppm aparece la señal del carbono del metilo del

grupo metoxi (CH3O-), y las dos señales mas desplazadas aparecen en 158.64 y 158.57 que

corresponden al carbono de la imina (CH=N-) y el carbono aromático que soporta al grupo

metoxi (=C-OCH3) respectivamente. La Asignación de las señales de RMN13

C, en ppm de

1c son las siguientes:

N

OCH3

145.15131.32

136.73

158.57128.86

114.66

129.00

158.64

122.52

55.57



III.2 Síntesis de las N-aril-mono--lactamas 2a y 2b

La síntesis de las dos N-aril-mono-β-lactamas se llevó a cabo mediante una reacción de

cicloadición [2 + 2] entre una cetena y las benziliminas 1a y 1b. Para la formación in situ,

de la cetena se utilizo el cloruro de ácido correspondiente, una base que nos permitió

extraer el hidrógeno ácido alfa al grupo carbonilo del cloruro de ácido, para formar el doble

enlace sobre el carbono carbonílico, y esta reacción tiene muy buenos resultados si se

realiza la formación de la cetena a bajas temperaturas.

Síntesis de la 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2a)

Se hizo reaccionar la imina 1a, con 2.5 equivalentes de cloruro de cloroacetilo, utilizando la

trietilamnia como base, para obtener la cetena y usando cloruro de metileno anhidro como

disolvente, la reacción se mantuvo en agitación magnética, con atmósfera de nitrógeno y a

una temperatura de -78°C durante dos horas y posteriormente se mantuvo en agitación a

temperatura ambiente durante 48 horas. Se muestra a continuación la síntesis de la

β-lactama 2a:

N

Cl

O

O2N

N

NO2

CH2Cl2, NEt3Cl

Cl

O

+

-78 º C

Cloruro de cloroacetilo1 a2 a

En esta reacción se obtuvieron varios subproductos, además de la N-aril-mono--lactama

deseada, por lo que, después de purificar el crudo de la reacción por cromatografía en

columna tipo flash, empleando una mezcla de disolventes hexano-acetato de etilo, se

obtuvo un sólido cristalino amarillo claro, con un punto de fusión de 139 a 140 oC, con un

rendimiento del 56%. El cual además de ser caracterizado por las técnicas espectroscópicas

convencionales, se le realizó un estudio de difracción de rayos X.



La asignación de las señales en el espectro de RMN de 1H para la N-aril-mono--lactama

2a se presenta en la estructura siguiente. En donde a 4.78 ppm aparece una señal doble con

una constante de acoplamiento homonuclear Hidrógeno-Hidrógeno de 2.2 Hertz (J2

H-H=2.2

Hz), que corresponde al desplazamiento químico del hidrógeno del metino al grupo

carbonilo de la -lactama (CH-CH(Cl)C=O), y a campos más bajos (5.17 ppm) aparece

también una señal doble con una constante de acoplamiento homonuclear a tres enlaces con

una magnitud de 2.2 Hertz, que corresponde al desplazamiento químico del hidrogeno del

carbono que tiene unido un átomo de cloro y está en posición al grupo carbonilo de la

-lactama (CH-CH(Cl)C=O), mientras que las demás señales corresponden al resto de los

hidrógenos y todos son aromáticos.

8.23

7.48

5.17

4.78

7.53 - 7.49

H

N

Cl

O

O2N

H

H

H

H

H

H

J3

H-H = 2.2 Hz

J3

H-H = 2.2 Hz

J3

H-H = 9.07 Hz

J3

H-H = 9-07 Hz

Como puede observarse en la estructura de este compuesto, solo dos de los once carbonos

magnéticamente diferentes tienen hibridación sp3, y estos corresponden a los carbonos que

se encuentran en la posición α y del grupo carbonilo de la 2-azetidinona y aparecen en el

espectro de RMN13

C, en 63.78 y 66.96 ppm respectivamente. De los nueve carbonos

restantes, ocho de ellos son aromáticos y todos las señales de estos carbonos salen en la

región correspondiente a carbonos con hibridación sp2, específicamente aquí aparecen de

118 a 145 ppm, mientras que la señal del carbono carbonilo de la -lactama aparece en



164.58 ppm. En la estructura siguiente se muestra Asignación de las señales de RMN13

C,

en ppm de 2a:

N

Cl

O

O2N

144.33126.38

134.24

161.58

63.78

66.96

142.08130.13

130.39

117.84

125.52

Estudio de difracción de rayos X, 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-fenilazetidin-

2-ona (β-lactama 2a). La caracterización de este compuesto se corroboró mediante la

obtención de su estructura por un estudio de difracción de rayos X, obteniéndose de esta

forma la estructura en estado sólido del compuesto 2a. En la siguiente figura se muestra la

estructura obtenida de la molécula en la cual podemos observar; primeramente que se

formó el anillo de cuatro miembros de la -lactama, así mismo, que los dos anillos

aromáticos que contiene la molécula se encuentran perpendiculares uno respecto del otro, y

finalmente que los hidrógenos de los carbonos α y β, respecto al grupo carbonilo del anillo

de la -lactama, se encuentran en posición trans y estos poseen un ángulo dihedro de

123.90°. Figura 8.



Figura 8. Estructura obtenida por difracción de rayos X de la 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-

fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2a)

La estructura del cristal comprende una celda unitaria monoclínica con un grupo espacial

(P1 21/n1), con las siguientes dimensiones: a = 8.6785(2) Å, b = 16.1155(4) Å, c =

10.2348(2) Å; α = 90°, β = 93.6526(19)°, γ = 90°. El volumen de la celda unitaria es de

1428 (6) Å3 y se encuentran 4 moléculas con un peso molecular de 302.71g /gmol, cada

una, en cada celda unitaria. Figura 9.



Figura 9. Celda unitaria de la estructura de 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-fenilazetidin-2-ona

(β-lactama 2a)

En la figura de la celda unitaria de este compuesto se observa que en la estructura cristalina

se forman enlaces por puente de hidrógeno de manera intramolecular, es decir, dentro de la

misma molécula entre el oxígeno del carbonilo de la 2-azetidinona (H…O=C) y el

hidrógeno orto del anillo aromático del sustituyente 4-nitrofenil.



Síntesis de la 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2b)

Para la obtención de esta N-Aril-mono--lactama, se hizo reaccionar la imina 1b, pero

ahora con cloruro de propionilo (2.5 equivalentes). Para obtener la cetena de este cloruro de

ácido, se uso como base la trietilamnia, en cloruro de metileno anhidro como disolvente, y

bajo las mismas condiciones descritas para la obtención de la -lactama derivada 2a.

Como se muestra en la siguiente estructura:

N

CH3

O

F

N

F

CH2Cl2, NEt3CH3

Cl

O

+

-78 º C

Cloruro de propionilo1 b 2 b

La mezcla de productos obtenidos de esta reacción también se purificó, por cromatografía

en columna tipo flash. Se obtuvo un sólido cristalino blanco, con un punto de fusión de 90 a

91oC, y con un rendimiento del 50%, el cual además de ser caracterizado por las técnicas

espectroscópicas convencionales, se recristalizó hasta obtener cristales adecuados para

realizar un estudio de difracción de rayos X.

Para este compuesto podemos observar en el espectro de RMN de 1H; que a 1.49 ppm

aparece una señal doble con una constante de acoplamiento Hidrógeno-Hidrógeno de 8.58

Hertz (J3

H-H=8.58 Hz), que corresponde al desplazamiento químico de los hidrógenos del

metilo al grupo carbonilo de la -lactama (-CH(CH3)-C=O), y el valor de la constante

de acoplamiento se debe al acoplamiento del metilo con el hidrógeno de ese mismo carbono

a tres enlaces.



A campos más bajos (4.58 ppm) aparece una señal doble con una constante de

acoplamiento a tres enlaces con una magnitud de 2.2 Hertz, que corresponde al

desplazamiento químico del hidrogeno del carbono en posición al grupo carbonilo de la

-lactama [-CH(N)CH(CH3)-], y la constante de acoplamiento entre los hidrógenos de los

carbonos y y finalmente para los hidrógenos aromáticos unidos a tres y cuatro enlaces

con el átomo de flúor aparecen señales múltiples centradas en 6.93 y 7.28 ppm

respectivamente. En la siguiente estructura se muestra la asignación de las señales de

RMN1H, en ppm, para la β -lactama 2b:

6.93

7.28

3.15

4.58

7.34 - 7.4

H

N

CH3

O

F

H

H

H

H

H

H

1.49

J3

H-H =2.2 Hz

J3

H-H = 8.58 Hz

La asignación de las señales en el espectro de RMN de 13

C para la 3-metil-1-(4-fluoro-

fenil)-4-fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2b) se presenta en la siguiente estructura. En donde

puede observarse que el desplazamiento a 55.79 ppm corresponde al carbono que se

encuentran en la posición α del grupo carbonilo de la 2-azetidinona. La presencia del átomo

de flúor aquí también genera un acoplamiento con los carbonos que se encuentran unidos a

uno, dos, tres y cuatro enlaces con él, dando lugar a señales dobles con constantes de

acoplamiento grandes las cuales van disminuyendo conforme a la distancia; a un enlace



J1

C-F = 245.48Hz, a dos enlaces J2C-F = 22.10Hz, a tres enlaces J

3C-F = 8.14Hz, y la más

pequeña es a cuatro enlaces J4

C-F = 2.78Hz, mientras que la señal del carbono carbonilo de

la -lactama aparece en 168.28 ppm.

N

CH3

O

F

159.37118.58

134.34

168.28

55.79

63.17

137.89129.45

128.84

126.08

116.0

13.29

J2

C-F = 22.10Hz

J3

C-F = 8.14 HzJ1

C-F = 245.48 Hz

J4

C-F = 2.78 Hz

Estudio de difracción de rayos X para la 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-fenil-

azetidin-2-ona (β-lactama 2b). La estructura propuesta para esta β-lactama se

corroboró por medio de la difracción del en rayos X, obtenida a partir de un mono cristal de

este compuesto, ver Figura 10. En la estructura se observa claramente la posición trans que

guardan los hidrógenos de los carbonos α y β, respecto al grupo carbonilo del anillo de la

-lactama, y estos poseen un ángulo diedro de 118.9°



Figura 10. Estructura obtenida por difracción de rayos X de la 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-

fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2b)

La estructura del cristal comprende una celda unitaria monoclínica con un grupo espacial

(P1 21/c1), con las siguientes dimensiones: a = 20.4231(7) Å, b = 8.6399(3) Å, c =

16.9215(5) Å; α = 90°, β = 114.097(4)°, γ = 90°. El volumen de la celda unitaria es de

2725.661(18) Å3 y se encuentran 8 moléculas con un peso molecular de 255.28 g /gmol,

cada una, en cada celda unitaria. Figura 11.



Figura 11. Celda unitaria de la estructura de 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-fenilazetidin-2-ona

(β-lactama 2b)

Por otro lado en la estructura cristalina de este compuesto se observa que se forman enlaces

por puente de hidrógeno; tanto con el oxígeno del carbonilo (H…O=C), como con el átomo

de flúor del anillo aromático (H…F-C=). En la figura de la celda unitaria se puede

distinguir que estos enlaces por puente de hidrogeno se forman tanto dentro de la misma

molécula como entre otra molécula. En la Tabla 4 se presentan los valores de las longitudes

de enlace.



Tabla 4. Longitud de enlaces por puente de hidrógeno en Amstrons(Å)

D-H…A d(D-H) d(D…A)

C(6)-H(6)…O(12) 0.93 2.47

C(6A)-H(6A)…O(12A) 0.93 2.49

C(4a)-H(4A)…O(12A)#1 0.98 2.55

C(7)-H(7)…F(11A)#2 0.93 2.47

C(7A)-H(7A)…F(11)#3 0.93 2.42

C(9)-H(9)…O(12)#4 0.93 2.47

C(9A)-H(9A)…O(12A)#4 0.93 2.48

Transformaciones de simetría usadas para generar átomos equivalentes.

#1 –x+1,y-1/2,-z+3/2 #2 x+1,-y+1/2,z+1/2 #3 x-1,y,z-1 #4 x,-y+1/2,z+1/2

III.3 Pruebas Microbiológicas

Evaluación de la producción de β-lactamasas. Se han desarrollado diversas

pruebas clínicas para la detección de β-lactamasas. La Nitrocefina; es la cefalosporina

utilizada en la metodología para la detección de las β-lactamasas conocidas, incluidas las

penicilinasas estafilococócicas29

. Una reacción positiva de la prueba de sefinasa da un

cambio de color amarillo a rojo en el área en la que se aplicó el cultivo. Un resultado

negativo de esta prueba, se observa cuando no hay cambio de color en el disco. En la

mayoría de las cepas, el resultado positivo apareció en menos de 5 min. A continuación en la

Tabla 5 se muestran los resultados.



Tabla 5. Prueba Cefinasa: identificación de microorganismos productores de

β-lactamasa.

Microorganismo Bacteria

Gram

Desarrollo de

color

Staphylococcus aureus

(ATCC 25923) Positiva -

Escherichia coli

(ATCC 25923) Negativa -

Escherichia coli

(DH10S) Negativa -

Escherichia coli

(ATCC 25923) Negativa -

Aeromonas hydrophila

(ATCC 25923) Negativa +

Pseudomonas aeruginosa


Klebsiella pneumoniae


El resultado de la reacción de esta prueba se obtuvo dentro de los primeros 10 minutos, lo

cual está de acuerdo con la norma, ya que puede dar falsos positivos si la respuesta se

obtiene después de ese tiempo. Se observó el desarrollo del color en el disco para K.

pneumoniae, P. aeruginosa y A. hydrophila indicando su resistencia a penicilinas y

cefalosporinas principalmente. En cuanto a las cepas de E. coli y S. aureus desarrollaron un

color rojizo muy claro por lo que la prueba para estas cepas no es confiable; sin embargo,

debido a que las cepas que se usaron en este trabajo son de control de calidad, se sabe que

no son productoras de β-lactamasas.

Cabe mencionar que las cepas que se utilizaron para la siguiente prueba microbiológica

fueron K. pneumoniae ATTCC700603, E.coli ATCC25922, ATCC35218, y DH10sensible

(DH10s) y S. aureus ATCC25923, ya que son las que recomienda la CLSI con el

conocimiento de que estas cepas su principal mecanismo de resistencia es la producción de

β-lactamasas.



Evaluación de la potencial actividad antibiótica de la β-lactama 2a. Dentro

del área de investigación se requiere evaluar la actividad antimicrobiana de nuevas

moléculas o de las ya existentes frente a patógenos y determinar su capacidad bactericida.

Es necesario utilizar el inóculo en la fase logarítmica de crecimiento ya que los antibióticos

β-lactámicos, sólo son bactericidas durante este periodo, y el valor de la prueba se determina

por el éxito de su aplicación en el laboratorio30

.

Las condiciones que se usaron para evaluar la actividad antimicrobiana de las espiro

β-lactamas sintetizadas se tomaron de la CLSI; así mismo, el antibiótico de referencia usado

(ampicilina trihidratada) se trabajó bajo estas mismas condiciones y la técnica empleada fue

la de difusión en medio líquido.

Debido a la naturaleza química de la β-lactama 2a sintetizada, esta no es solubles en

soluciones acuosas, por lo que las soluciones stock se disolvieron en DMSO puro, y

conforme se hicieron las diluciones necesarias con el medio de cultivo Mueller Hinton caldo

(MHB), quedando el DMSO a una concentración final del 1%. Por otro lado, la solución

stock de la ampicilina trihidritada se realizó con un buffer de fosfatos 0.1M a pH= 7.5 y

posteriormente las diluciones se realizaron con el medio de cultivo MHB. El uso del

disolvente DMSO, lo cual está permitido por los estándares clínicos internacionales CLSI.

Tomando como referencia a la ampicilina, el intervalo de concentración que se trabajó fue

de 0.1-258 µg/mL (5.73x10-2

M), y su relación molar se tomó como base para trabajar con

las respectivas β-lactamas. Para establecer la actividad de los compuestos sobre las cepas

bacterianas, se consideró la concentración mínima inhibitoria (CMI) establecida por los

estándares clínicos internacional CLSI lo que se muestra, en la Tabla 6.



Tabla 6. Criterios establecidos por la CLSI para las pruebas de

susceptibilidad en medio líquido.

CMI*

(µg/mL) Interpretación de la prueba

≥32 Cepa resistente

16 Intermedio (se repite la prueba)

≤8 Cepa sensible

*CMI= Concentración mínima inhibitoria para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana realizadas en

caldo Mueller Hinton.

La CMI de la ampicilina observada en las microplacas, para las tres cepas de E. coli, fue de

4 µg/mL y para la cepa de K. pneumoniae fue de 32 µg/mL. Con estos resultados se

concluyen dos aspectos importantes, el primero es que la ampicilina inhibe a las PBP´s en

las cepas de E. coli y por otro lado las cepas de K. pneumoniae producen β-lactamasa, las

cuales abren al anillo β-lactámico de la ampicilina impidiendo su acción sobre las PBP´s,

por lo que se requiere mayor concentración del antibiótico para inhibir el crecimiento

bacteriano.

En cuanto al β-lactama 2a sintetizada la inhibición del crecimiento bacteriano, fue muy

poco a pesar de que esta prueba se repitió 6 veces y se reprodujo 3 veces, y en cuanto a la

sensibilización de las bacterias productoras de β-lactamasa (K.pneumoniae), también los

resultados no fueron concluyentes.



CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Se sintetizaron y caracterizaron espectroscópicamente tres benziliminas; la 4-nitro-

N[(E)-fenilmetilideno] anilina (1a), la 4-fluoro-N[(E)-fenilmetilideno] anilina (1b),

y la 4-metoxi-N[(E)-fenilmetilideno] anilina (1c), mediante la reacción de benzal-

dehído con la correspondiente anilina aromática.

Los rendimientos obtenidos en la síntesis de las tres benziliminas fueron buenos;

para la ( p-NO2 Imina 1a) fue del 84%, la ( p-F Imina 1b) se obtuvo con un 85% y

para la ( p-OMe Imina 1c), fue del 70%.

Se sintetizaron dos nuevos compuestos mono--lactámicos; la 3-cloro-1-(4-nitro-

fenil)-4-fenilazetidin-2-ona (-lactama 2a), y la 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-fenil-

azetidin-2-ona (-lactama 2b) mediante la reacción de Staudinger, utilizando

cloruro de cloroacetilo en la síntesis de la -lactama 2a y cloruro de propionilo para

la síntesis de la -lactama 2b, obteniéndose rendimientos moderados: para la p-

NO2--lactama 2a fue del 56%, y para la p-F--lactama 2b del 50%.

La caracterización por espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protón y

carbono trece (RMN 1H y

13C), así como la espectroscopia de infrarrojo, de todos

los compuestos sintetizados estuvo de acuerdo con las estructuras propuestas.

Mediante un estudio de difracción de rayos X se determino la estructura cristalina

de las dos nuevas -lactamas obtenidas; y se precisó que la configuración relativa

que guardan los hidrógenos y en el anillo de la 2-azetidinona es trans, como se

había predicho.



En la figura de la celda unitaria del compuesto ((-lactama 2a), se observa que se

forman enlaces por puente de hidrógeno de manera intramolecular, entre el oxígeno

del carbonilo de la 2-azetidinona (H…O=C) y el hidrógeno orto del anillo

aromático del sustituyente 4-nitrofenil.

En la celda unitaria de la estructura cristalina de la (-lactama 2b), se observa la

formación de enlaces por puente de hidrógeno, de forma tanto intramolecular con el

oxígeno del carbonilo (H…O=C), es decir dentro de la misma molécula, como de

manera intermolecular entre el átomo de flúor del anillo aromático de una molécula

(H…F-C=) con un hidrógeno aromático de otra molécula.

Se hicieron estudios microbiológicos preliminares para el compuesto p-NO2--

lactama 2a, se trabajó con las siguientes cepas: Klebsiella pneumoniae ATCC

700603, Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 35218, y

Escherichia coli DH10s las cuales son productoras de -lactamasas.

Se recomienda realizar una prueba de sinergismo adicional para poder concluir

sobre la actividad biológica de este compuesto.



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http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jm970104t

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jm970104t




Anexos

SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS


ANEXOS

1.- Espectro de IR del compuesto 1a.

2.-Espectro de IR del compuesto 1b.

3.-Espectro de RMN1H a 500 MHz del compuesto 1b

4.-Espectro de RMN13

C a 500 MHz del compuesto 1b

5.- Espectro de IR del compuesto 1c

6.-Espectro de RMN1H a 500 MHz del compuesto 1c


C a 500 MHz del compuesto 1c

8.-Espectro de IR del compuesto 2a

9.-Espectro de RMN1H a 500 MHz del compuesto 2a


C a 500 MHz del compuesto 2a




13.- Coordenadas de la β-lactama 2b, (x104).

14.- Coordenadas de la β-lactama 2a, (x104).

15.-Pruebas de Sensibilidad Antimicrobiana: Evaluación de la potencial actividad

antibiótica de la mono-β-lactama 2a



NO2

N

1.- Espectro de IR del compuesto 1a



N

F

2.-Espectro de IR del compuesto 1b.



N

F

H

H

H

H

H

HC

A

B

E

D

C


A

B

C

D

E



N

F

H

A

C

E

I

G

B

DF



A

B C

D

E

F

G

H

I



CH3

N

O

5.- Espectro de IR del compuesto 1c



N

OCH3

H

H

H

H

H

H

A

CE

GBD

F

6.-Espectro de RMN1H a 500 MHz del compuesto 1c

B

C

D E

F

A

G



N

OCH3

A

C

EG

B

D

F

H

I

J


C a 500 MHz del compuesto 1c

A

B

C

D

E

F

G

H

J

I



NO

Cl

O2N

8.-Espectro de IR del compuesto 2a

1765.13

846.21



NO

Cl

O2N

H

H

H

H

H

H

HA

B

C

D

E

F

G

9.-Espectro de RMN1H a 500 MHz del compuesto 2a

A

B

C D

E

F

G



NO

Cl

O2N B

A

C

D

E

F

G

H

I

J

K


C a 500 MHz del compuesto 2a

B

A

C

D E

F G

H

I J

K



N

CH3

O

F

H

H

H

H

H

H

HA

B

C

DE

F

G

H


A

B

C

D

E

F

G

G



N

CH3

O

FA

DC

B

E

F

G

H

I

J

L

K



A

B

C

D

E

F G H

I

J

K

L



13.- Coordenadas de la β-lactama 2b, (x104).

x y z U(eq)

C(2) 10074(2) 2921(3) 11914(2) 48(1)

C(2A) 4902(2) 2837(3) 6881(2) 48(1)

C(3) 9287(2) 2603(4) 11372(2) 55(1)

C(3A) 5697(2) 2551(4) 7115(2) 55(1)

C(4) 9263(1) 1944(3) 12217(2) 48(1)

C(4A) 5723(1) 1891(3) 7991(2) 47(1)

C(5) 10536(1) 2175(3) 13504(2) 41(1)

C(5A) 4440(1) 2043(3) 8008(1) 40(1)

C(6) 11253(1) 2494(4) 13727(2) 54(1)

C(6A) 3716(1) 2245(4) 7502(2) 53(1)

C(7) 11745(2) 2306(5) 14571(2) 64(1)

C(7A) 3220(2) 1994(4) 7845(2) 64(1)

C(8) 11510(2) 1776(4) 15174(2) 61(1)

C(8A) 3457(2) 1552(4) 8693(2) 58(1)

C(9) 10811(2) 1435(4) 14978(2) 60(1)

C(9A) 4166(2) 1349(4) 9215(2) 57(1)

C(10) 10311(1) 1639(3) 14132(2) 48(1)

C(10A) 4662(1) 1596(3) 8865(2) 50(1)

C(13) 9127(2) 1528(5) 10607(2) 83(1)

C(13A) 5860(2) 1463(5) 6515(2) 81(1)

C(14) 8780(1) 2683(3) 12578(2) 49(1)

C(14A) 6202(1) 2638(4) 8824(2) 49(1)

C(15) 8829(2) 4242(4) 12771(2) 61(1)

C(15A) 6154(2) 4205(4) 8962(2) 64(1)

C(16) 8394(2) 4949(5) 13110(3) 76(1)

C(16A) 6585(2) 4879(5) 9736(2) 81(1)

C(17) 7899(2) 4057(6) 13270(3) 82(1)

C(17A) 7076(2) 3992(6) 10389(2) 85(1)

C(18) 7846(2) 2501(6) 13090(3) 86(1)

C(18A) 7124(2) 2437(6) 10259(2) 81(1)

C(19) 8279(2) 1808(4) 12746(2) 63(1)

C(19A) 6693(2) 1750(4) 9487(2) 62(1)

N(1) 10029(1) 2351(3) 12651(1) 45(1)

N(1A) 4953(1) 2290(3) 7665(1) 46(1)

O(12) 10583(1) 3401(3) 11794(1) 62(1)

O(12A) 4396(1) 3312(3) 6258(1) 60(1)

F(11) 12000(1) 1581(3) 15999(1) 99(1)

F(11A) 2964(1) 1306(3) 9034(1) 90(1)



14.- Coordenadas de la β-lactama 2a, (x104).

x y z U(eq)

C(2) 6913(2) 2575(1) 9921(1) 56(1)

C(3) 7924(2) 2039(1) 8891(1) 56(1)

C(4) 6367(1) 2391(1) 7897(1) 47(1)

C(5) 4771(1) 3532(1) 9048(1) 45(1)

C(6) 4412(2) 3875(1) 10247(1) 49(1)

C(7) 3290(2) 4470(1) 10283(1) 51(1)

C(8) 2522(1) 4722(1) 9125(1) 48(1)

C(9) 2846(2) 4383(1) 7937(1) 58(1)

C(10) 3969(2) 3788(1) 7900(1) 55(1)

C(16)

C(17)

6914(2)

6414(2)

2822(1)

2534(1)

6714(1)

5485(1)

47(1)

58(1)

C(18)

C(19)

C(20)

C(21)

6495(2)

7960(2)

8467(2)

7939(2)

2906(1)

3556(1)

3842(1)

3480(1)

4380(1)

45008(2)

5718(2)

6821(2)

85(1)

96(1)

93(1)

71(1)

N(1) 5909(1) 2926(1) 8995(2) 47(1)

N(11) 1352(1) 5372(1) 9147(2) 59(1)

O(12) 1185(1) 5732(1) 10186(2) 75(1)

O(13) 574(1) 5526(1) 8133(2) 79(1)

O(14)

O(15)

7126(1)

7629(1)

2672(1)

963(1)

11078(2)

9172(2)

80(1)

87(1)



A. Microplaca con el antibiótico testigo (AMP)

B. Microplaca con DMSO al 1%

C. Microplaca con la mono-β-lactama 2a

15.-Pruebas de Sensibilidad Antimicrobiana: Evaluación de la potencial actividad

antibiótica de la mono-β-lactama 2a.

sÍntesis y caracterizaciÓn de mono-β-lactamas…ntesis y... · pudiera alcanzar esta meta tan...

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