sÍntese e caracterizaÇÃo de uma classe de hidrogÉis...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Engenharia Mecânica

DANIEL VINÍCIUS MISTURA

SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE UMA CLASSE DE

HIDROGÉIS INJETÁVEIS, TERMOSSENSÍVEIS E

BIODEGRADÁVEIS COMO SUBSTRATO PARA

DIFERENCIAÇÃO CELULAR

CAMPINAS

2018

DANIEL VINÍCIUS MISTURA





Orientador: Profa. Dra. Eliana Aparecida de Rezende Duek

CAMPINAS

2018

Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de

Engenharia Mecânica da Universidade Estadual de

Campinas como parte dos requisitos exigidos para

obtenção do título de Doutor em Engenharia

Mecânica, na Área de Materiais e Processos de

Fabricação.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO

DANIEL VINÍCIUS MISTURA, E ORIENTADA PELA

PROFA. DRA ELIANA APARECIDA DE REZENDE

DUEK

............................................................................................

Dra. Eliana Aparecida de Rezende Duek

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA MECÂNICA

COMISSÃO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA MECÂNICA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE MANUFATURA E

MATERIAIS

TESE DE DOUTORADO





Autor: Daniel Vinícius Mistura

Orientadora: Dra. Eliana Aparecida de Rezende Duek

A Banca Examinadora composta pelos membros abaixo aprovou esta Tese:

Prof. Dra. Eliana Aparecida de Rezende Duek, Presidente

Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP

Prof. Dr. Marcos Akira D’Àvila


Prof. Dr. João Sinézio Carvalho Campos


Prof. Dr. Arnaldo Rodrigues dos Santos Júnior

Universidade Federal do ABC - UFABC

Prof. Dra. Márcia Adriana Tomaz Duarte

Universidade Sociedade Educacional de Santa Catarina - UNISOCIESC

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida

acadêmica do aluno.

Campinas, 06 de dezembro de 2018.

DEDICATÓRIA

À minha mãe Margaret, por todo

carinho, bons conselhos, força, auxílio em

todos os momentos, suporte e ombro amigo em

todos estes anos; ao meu pai Wilson por

acreditar em minha capacidade; ao meu irmão

Rafael, por acreditar em mim, me dar forças e

apoiar em todos os momentos; a minha amada

avó Maria in memoriam, que se mantém

comigo em todos os momentos e a minha amada

Ana Paula me dando todo o suporte e força nos

momentos difíceis, apoiando minhas escolhas e

estando comigo com amor em todos os

momentos da minha caminhada.

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, professora, mestra e amiga Eliana Aparecida de Rezende Duek, pela

confiança depositada em mim ao longo dos anos, pela paciência com um aluno que não era

fácil, pela oportunidade de integrar seu time, e pelos mais valiosos conselhos e ensinamento

que levarei para a vida, à senhora minha mestra OBRIGADO!!!!

Aos amigos de laboratório, os que por lá passaram e os que lá ainda estão, tornaram todo o

tempo que estive lá muito prazeroso e de um valor grandioso para meu aprendizado.

Ao Vinícius e ao Newton, grandes amigos que mantive ao longo dos anos em Sorocaba que

estavam sempre nos momentos de risadas e cervejas para contarmos causos da vida.

Aos amigos de república, todas as que passei que deixaram meus anos mais felizes e com o

fígado um pouco prejudicado.

Aos grandes amigos, Sandro, Roni, Angelo, FeliPPe e todos os que tenho no coração como

grandes mestres e excelentes conselheiros.

Ao professor L’Hocine, que me acolheu em seu laboratório no Canadá, confiou em mim e me

deu a oportunidade para ampliar meus conhecimentos científicos e vivenciar novas

oportunidades merci a vous.

Aos colegas de laboratório, especialmente ao amigo Vinícius Melo, que me ajudou de

maneira imprescindível na análise biológica do trabalho.

Aos ICs, pessoas importantes que além de aprender, nos ensinam com sua simplicidade e

sede de saber.

À FAPESP e a CAPES, processo nº 2014/12428-8, Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado de São Paulo (FAPESP) pelo aporte financeiro no decorrer deste doutorado.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processo nº

2015/20933-7, pela concessão da bolsa de estágio e pesquisa no exterior BEPE.

À todos que de todas as formas auxiliaram e torceram por este trabalho, me ensinando que

além da ciência devemos ter a humildade de aprender coisas novas.

Meu MUITO OBRIGADO!!!!!!!

Talvez não tenha conseguido fazer o melhor,

mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou

o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou

o que era antes.

Martin Luther King

RESUMO

A classe de hidrogéis vem sendo amplamente estudada, principalmente como materiais

injetáveis com aplicações minimamente invasivas para biomateriais. Esse material pode

apresentar características de termossensibilidade próximo a temperatura corporal (LCST –

Lower Critical Solution Temperature – em torno de 37ºC) além de rápida gelificação, o que

permite seu emprego como carreador de fármacos, células ou fatores de crescimento celular

quando injetado. O desafio atual é tornar esses hidrogéis biodegradáveis e com propriedades

mecânicas adequadas à sua utilização. O objetivo deste trabalho foi sintetizar hidrogéis de

poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm) a partir de uma nova classe de macrômero composto

por 2-hidróxietil metacrilato (HEMA), poli(L-co-D,L ácido lático), trimetileno carbonato

(TMC) e Ácido Acrílico (AAc), de forma que fosse inerente ao material sintetizado

características como: biodegradação e propriedades mecânicas compatíveis àquelas requeridas

em aplicações no campo da engenharia tecidual. Além disso, vislumbrou-se a avaliação do

hidrogel como substrato no processo de diferenciação de células tronco embrionárias em células

do tipo cardiomiócitos, visando futuras aplicações na terapia tecidual de regeneração cardíaca.

Sendo assim, a síntese ocorrou em duas etapas, a primeira via abertura de anel de ésteres cíclicos

a fim de sintetizar o macrômero, a segunda em sintetizar os hidrogéis por polimerização via

radical livre. Com as rotas apresentadas nove sínteses foram feitas, estas com 2, 4 e 6% de ácido

acrílico e 10, 15 e 20% de macrômero, formando assim as combinações (constituídas de

NIPAAm, Macrômero e AAc, respectivamente) 88/10/2, 83/15/2, 78/20/2, 86/10/4, 81/15/4,

76/20/4, 84/10/6, 79/15/6 e 74/20/6. Desta forma, após a síntese caracterizou-se os hidrogéis e

macrômeros por via química, térmica e reologicamente; avaliou-se a degradação in vitro e

viabilidade celular; determinou-se a melhor característica do material para induzir a

diferenciação de células tronco em cardiomiócitos. Em termos de resultados sintetizou-se e

caracterizou-se via RMN (1H e 13C) caracterizando as principais intensidade de ligações

químicas dos constituintes polimerizados, comprovando assim a polimerização do macrômero

e posterior copolimerização do hidrogel, FTIR evidenciando as bandas característica das

ligações químicas dos constituintes e formações dos produtos esperados na polimerização, DSC

dos hidrogéis apresentando temperaturas de transição vítrea (Tg) acima dos 100ºC para todas as

composições e comportamento LCST via calorimentria indicando valores bem abaixo dos 37ºC

indicado para aplicações biológicas, grau de intumescimento demonstrando todas as

composições com capacidade de absorção de água entre 36 e 171%, ensaios reológicos

evidenviando primeiramente a transição de fase (gelificação) rápida e consistente para todas as

composições, bem como corroborando os dados obtidos via DSC para o comportamento LCST,

ensaios de viscosidade apresentando nas proporções contendo 2 e 6% de ácido acrílico

viscosidades superiores a da água (1 Pa.s) e nas composições com 4% de ácido acrílico com

viscosidades inferiores, sendos estas as selecionadas para os ensaios in vivo , degradação in

vitro dos hidrogéis, evidenciando a perda acentuada de massa em todas as composições,

diferenciação de células embrionárias (ratos) em cardiomiócitos com caracterização via qPCR

evidenciando a manutenção dos genes alvo na diferenciação e imunofluorescência,

demonstrando a manutenção do fenótipo celular, finalmente os estudos in vivo nas composições

com 86/10/4 e 81/15/4, ambos os materiais demonstraram fraca reação inflamatória, com

redução gradual indicando uma inflamação aguda e de rápida resolução. A reorganização

tecidual induzida pela compartimentalização do hidrogel indica integração do material ao tecido

original sugere que a aplicação do hidrogel como biomaterial é indicada.

Palavras-chave: Biomateriais, Hidrogel, Biodegradável, Injetável, Polímero.

ABSTRACT

The class of hydrogels has been extensively studied, mainly as injectable materials with

minimally invasive applications for biomaterials. This material can present characteristics of

thermosensitivity close to the body temperature (LCST) in addition to rapid gelation, which

allows its use as carrier of drugs, cells or cell growth factors when injected. The current

challenge is to make these hydrogels biodegradable and with mechanical properties suitable for

their use. The main objective of this work was to synthesize poly (N-isopropylacrylamide)

hydrogels (PNIPAAm) from a new class of macromer composed of 2-hydroxyethyl

methacrylate (HEMA), poly (L-co-D, L lactic acid), trimethylene carbonate (TMC) and Acrylic

Acid (AAc), so that it is inherent to the synthesized material characteristics such as:

biodegradation and mechanical properties compatible with those required in tissue engineering

applications. In addition, another goal for the hydrogel was to evaluate its role as a substrate in

the process of differentiating embryonic stem cells into cardiomyocyte-like cells, with potential

applications in cardiac tissue regeneration. Thus, the synthesis occurs in two steps, first step,

open ring polymerization of cyclic esters and cyclic carbonate to synthesize de macromere, in

a second step, synthesize the hydrogels by free radical polymerization. By this routes, nine

syntheses were made, with 2, 4 and 6% of acrylic acid and 10,15 and 20% of macromere,

forming the combinations (constituted by NIPAAm, Macromer and AAc, respectively) 88/10/2,

83/15/2, 78/20/2, 86/10/4, 81/15/4, 76/20/4, 84/10/6, 79/15/6 e 74/20/6. After synthesis the

material was characterized the hydrogels and macromes by chemical, thermical and rheological;

was evaluated in vitro degradation and cell viability and was determined best material

characteristics to induce embryonic stem cells into cardiomyocyties. NMR (1H and 13C) showed

chemical bonds intensities of polymerized monomers, verifying macromer polymerization and

posterior hydrogel copolymerization, FTIR results showed characteristics bands for the

chemical bonds, and formation of expected products for polymerization. DSC showed

hydrogels with glass transition temperatures (Tg) above 100ºC for all compositions and LCST

behavior by calorimetry indicating values below 37ºC, indication for biological applications.

Swelling studies evidenced all compositions with water absorption between 36 and 171%,

rheological tests showed firstly quickly gelation for all compositions, and LCST behavior

corroborating DSC, secondly, viscosity in 2 and 6% of acrylic acid superior of water (1 Pa.s)

and with 4% composition below than water, this composition was used for in vivo tests. In vitro

degradation showed marker loss of polymeric mass in all compositions, cell differentiation with

qPCR confirming gene maintenance and immunofluorescence showing the maintenance of cell

phenotype. Finally, in vivo studies in 86/10/4 and 81/15/4 compositions, showed low

inflammatory response with gradual reduction and quickly resolution. The induced tissue

reorganization showed an acute inflammation. This reorganization was inducing by hydrogel

compartmentalization indicating material integration to the tissue, suggesting application as a

biomaterial.

Keywords: Biomaterials, Hydrogels, Biodegradable, Injectable, Polymer.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Representação esquemática da rota metabólica e processo de reabsorção dos poli (α-

hidroxi ácidos) (BARBANTI et al., 2005). .............................................................................. 34

Figura 2 - Esquema dos métodos de formação dos hidrogéis químicos e físicos (adaptado de

Hoffman, 2012). ....................................................................................................................... 35

Figura 3 - Aplicações clínicas de hidrogéis (adaptado de KIRSCHNER & ANSETH, 2013) 36

Figura 4 - Diagrama de fases do sistema LCST e UCST (ALMEIDA, 2010). ....................... 37

Figura 5 - Estrutura da PNIPAAm (DIMITROV et al., 2007) ................................................ 39

Figura 6 - Transição de fase induzida por temperatura da PNIPAAm (DIMITROV et al., 2007)

.................................................................................................................................................. 39

Figura 7 – Representação da evolução do IM. Depois da oclusão da artéria coronária, o coração

perde sua função gradualmente e passa por um remodelamento negativo, culminando com a

total falha cardíaca. Adaptado de Pascual-gil et al., 2015 e Melo, 2015. ................................. 43

Figura 8 - Organograma da metodologia empregada na síntese e caracterização dos hidrogéis.

.................................................................................................................................................. 48

Figura 9 - Representação esquemática para o HEMAPLDLA-co-TMC e o copolímero

poli(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPLDLA-co-TMC) .............................................................. 50

Figura 10 - Propriedades de gelificação do hidrogel de Poli(NIPAAm-co-AAc-co-

HEMAPLDLA-co-TMC) 10% w/w. (a) Solução a 4ºC; (b) Hidrogel após 10 s em banho termo

estabilizado a 37ºC; (c) Hidrogel formado após 15 minutos; (d) alongamento do hidrogel após

15 minutos ................................................................................................................................ 58

Figura 11 – Esquema da estrutura do macrômero composto de HEMAPLDLA-co-TMC ..... 60

Figura 12 - Espectro de RMN de 1H para o macrômero obtido na literatura ......................... 60

Figura 13 – Estrutura química do fragmento I do macrômero ................................................ 61

Figura 14 - Comparação entre o espectro do macrômero (sintetizado no trabalho) (A) e do

macrômero (HEMA-PLDLA) (B) ............................................................................................ 61

Figura 15 – Estrutura química do fragmento II do macrômero ............................................... 62

Figura 16 - Comparação entre o espectro de RMN de 1H “H” referente ao copolímero PLDLA

(Motta, 2007) e o espectro “I” referente à síntese do terpolímero PLDLA-TMC, com as regiões

ampliadas que são características dos prótons do TMC. .......................................................... 63

Figura 17 - Comparação entre o espectro de RMN 1H J referente ao copolímero PLDLA-TMC

e o espectro K referente à síntese do macrômero HEMAPLDLA-co-TMC. ........................... 64

Figura 18 - Representação estrutural do hidrogel sintetizado ................................................. 65

Figura 19 - Comparação entre o espectro de RMN de 13C “e” referente ao macrômero

HEMAPLDLA-co-TMC e “f” referente ao espectro do hidrogel de poli(NIPAAm-co-AAc-co-

HEMAPLDLA-co-TMC). ........................................................................................................ 65

Figura 20 - Estrutura do monômero NIPAAm com os carbonos correspondentes a 131 ppm (a)

e 126 ppm (b). ........................................................................................................................... 66

Figura 21 - Espectro de RMN C13 do polímero PNIPAN “b” e “a” do monômero NIPAM onde

se nota a ausência dos picos situados em 131 e 126 ppm no polímero PNIPAM (ZHOU et

al.,1994). ................................................................................................................................... 66

Figura 22 – Comparação entre os espectros de RMN de 13C com 2% de ácido acrílico. ...... 68



Figura 25 – Representação estrutural do hidrogel, em destaque segmento N-

isopropilacrilamida ................................................................................................................... 71

Figura 26 - Comparação entre o espectro “a” referente ao PNIPAAM (GONZALEZ, 2008) e

ao espectro “b” referente ao poli(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPLDLA-co-TMC). ............... 72

Figura 27 - Representação das estruturas dos monômeros NIPAAm e AAC. ........................ 73

Figura 28 - Comparação entre o espectro “a” referente ao macrômero HEMAPLDLA-co-TMC

e “b” referente ao espectro do hidrogel de poli(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPLDLA-co-TMC).

.................................................................................................................................................. 74

Figura 29 - Comparação entre os espectros de RMN de 1H com 2% de ácido acrílico. ........ 75



Figura 32 - Espectro de absorção no infravermelho para o macrômero sintetizado. .............. 81

Figura 33 - Espectro de absorção na região do infravermelho para os hidrogéis 10, 15 e 20%

de macrômero com 2% de ácido acrílico.................................................................................. 83





Figura 36 - Termogramas indicando as Tg's dos hidrogéis com 10, 15 e 20% de macrômero e

2% de ácido acrílico ................................................................................................................. 85





Figura 39 – Comportamento reológico dos géis contendo 2% de ácido acrílico .................... 89

Figura 40 – Comportamento reológico dos géis contendo 4% de ácido acrílico. ................... 90

Figura 41 – Comportamento reológico dos géis contendo 6% de ácido acrílico. ................... 90

Figura 42 – Perfil de viscosidade dos géis contendo 2% de ácido acrílico. ............................ 92



Figura 45 – Variação da perda de massa em função do tempo de degradação para as amostras

dos hidrogéis contendo 2% de ácido acrílico. .......................................................................... 94





Figura 48 – Níveis de expressão do transcrito de Brachyury-T. n=5. *p<0,05 ....................... 97

Figura 49 – Níveis de expressão para os transcritos de Isl-1 e Nkx2.5. n=5 .......................... 99

Figura 50 – Níveis de expressão para os transcritos de MHC6. n=5 .................................... 100

Figura 51 – Análise de imunofluorescência realizado no dia 9 de diferenciação com os

marcadores para a MHC (vermelho) e Hoechst (azul) para o núcleo, para diferenciação das

mESC em cardiomiócitos ....................................................................................................... 102

Figura 52 - Hidrogel e nanquim. (a) Implante de hidrogel com Nanquim via injetável; (b) Local

do implante após redução do intumescimento; (c) Local do implante na retirada do material; (d)

Retirada do material com nanquim. ........................................................................................ 103

Figura 53 - Presença de hidrogel encapsulado por fibras colágenas (cabeça de seta), mas sem

sinais de células inflamatórias. Na vizinhança grande quantidade de eritrócitos, mostrando a

presença de hemorragia. Aumento de 100x. 5 dias. ............................................................... 104

Figura 54 - Implante de hidrogel. (a) Presença de hidrogel no espaço provocado pelo implante

do material (cabeça de seta); (b) Presença de remanescente do hidrogel. Aumento de 40x. 7dias.

................................................................................................................................................ 105

Figura 55 - Implante de hidrogel após 10 dias. (a) Espaços na fáscia muscular provocados pela

injeção do hidrogel (asteriscos); (b) Espaços na fáscia muscular provocados pela injeção do

hidrogel (asterisco). Aumento de 20x..................................................................................... 105

Figura 56 - Implante de hidrogel com nanquim após 10 dias. (a) Região da hipoderme

preenchida com o hidrogel corado em preto. Aumento de 10x. (b) Interação entre as fibras

colágenas e o hidrogel (cabeça de seta) na margem. Aumento de 100x. ............................... 106

Figura 57 - Implante de hidrogel após 15 dias. Espaço deixado pelo polímero na região da

hipoderme (asterisco). Notar ausência de processo inflamatório na margem do espaço. Aumento

de 10 x. ................................................................................................................................... 106

Figura 58 - Implante de hidrogel com nanquim após 21 dias. (a) Região da fáscia muscular,

entre a hipoderme e o tecido muscular. Tecido conjuntivo (2) entre as fibras musculares

esqueléticas (1 e 3 respectivamente). Nota-se a presença do polímero com nanquim (corado em

preto) entre as fibras colágenas no tecido conjuntivo (2). Aumento de 20x. (b) Hidrogel corado

mostrando-se presente entre as fibras colágenas (setas) e com ausência de resposta inflamatória.

Aumento de 40x. (c) Hidrogel corado presente entre as fibras colágenas (seta), na margem dos

espaços deixados pelo material (asterisco). Ausência de resposta inflamatória. Aumento de

40x. (d) Hidrogel corado depositado entre as fibras colágenas. Aumento de 100x. .............. 107

Figura 59 - Implante de hidrogel com nanquim após 30 dias. (a) Panorâmica da relação do

hidrogel com as fibras colágenas. Ampliação 20x. (b) Espaços deixados pelo hidrogel (cabeça

de seta) entre as fibras colágenas e remanescentes da coloração com nanquim. Ampliação de

100x ........................................................................................................................................ 108

Figura 60 - Cavidades (C) contendo fragmento de hidrogel (H) no subcutâneo e região de

infiltrado inflamatório (I) perilesional em implante de 1 dia (coloração HE). ....................... 110

Figura 61 - Implante de 1 dia contendo fragmento de hidrogel (H) entre a lâmina muscular

(LM) e o tecido conjuntivo submuscular (TCS) (coloração HE). .......................................... 111

Figura 62 - Matriz do fragmento de hidrogel (H) com monócitos (Mo) em diferenciação para

macrófagos iniciando sua biodegradação (coloração HE). .................................................... 111

Figura 63 - Monócitos (Mo) em diferenciação internos à matriz do hidrogel (H) (coloração

HE) (utilizado óleo de imersão).............................................................................................. 112

Figura 64 - Matriz de hidrogel (H) gelificado pigmentada em alguns pontos por nanquim (N)

contendo poros (P) e monócitos (Mo) em diferenciação em seu interior (coloração HE)

(utilizado óleo de imersão). .................................................................................................... 112

Figura 65 - Cavidade (C) do implante com fragmentos periféricos de hidrogel (H) entre a

lâmina muscular (LM) e o tecido conjuntivo submuscular (TCS) contendo infiltrado

inflamatório (I) perilesional (coloração HE). ......................................................................... 113

Figura 66 - Cavidade (C) formada entre a lâmina muscular (LM) e o tecido conjuntivo

submuscular (TCS) contendo macrófagos (M) perilesionais e monócitos (Mo) em diferenciação

(coloração HE). ....................................................................................................................... 114

Figura 67 - Macrófagos (M), contendo vesículas de pigmento negro em seu citoplasma,

localizados perifericamente à cavidade (C) de implante do hidrogel (coloração HE) (utilizado

óleo de imersão)...................................................................................................................... 114

Figura 68 - Cavidades septadas (Cs), septos (S) internos em formação, localizadas entre a

lâmina muscular (LM) e o tecido conjuntivo submuscular (TCS) contendo infiltrado

inflamatório (I) perilesional (coloração HE). ......................................................................... 115

Figura 69 - Cavidades septadas (Cs) com início de septos (S) em seu interior contendo

pigmentação negra e macrófagos (M) no tecido conjuntivo submuscular (TCS) adjacente

(coloração HE). ....................................................................................................................... 116

Figura 70 - Cavidade septada (Cs), contendo grande número de septos (S) internos, formada

entre a lâmina muscular (LM) e o tecido conjuntivo submuscular (TCS) pelo implante de

hidrogel. Presença de infiltrado inflamatório (I) perilesional (coloração HE). ...................... 117

Figura 71 - Cavidades septadas (Cs) do tecido conjuntivo submuscular (TCS), contendo

pequenos septos (S) em seus interiores, periféricas ao fragmento de hidrogel (H) em interação

com macrófagos (M) contendo grânulos negros em seu citoplasma (coloração HE). ........... 118

Figura 72 - Cavidades septadas (Cs) localizadas no tecido conjuntivo submuscular (TCS)

contendo filamentos de hidrogel (H) e macrófagos (M) com grânulos negros em seu citoplasma

(coloração HE). ....................................................................................................................... 118

Figura 73 - Cavidades septadas (Cs) formadas entre a lâmina muscular (LM) e o tecido

conjuntivo submuscular (TCS), tecido perilesional com reduzido infiltrado inflamatório (I)

(coloração HE). ....................................................................................................................... 119

Figura 74 - Regiões de neovascularização (Nv) localizadas no tecido conjuntivo submuscular

(TCS) e periféricas às cavidades septadas (Cs), há macrófagos (M) contendo grânulos negros

em seu citoplasma adjacentes à região (coloração HE). ......................................................... 120

Figura 75 - Cavidades (Cs) formadas no tecido conjuntivo submuscular (TCS) contendo

septações internas (S) (coloração HE). ................................................................................... 121

Figura 76 - Cavidades perilesionais (Cs) com septações (S) contendo macrófagos (M) em seu

interior (coloração HE). .......................................................................................................... 121

Figura 77 - Lâmina inflamatório-cicatricial (LIC) contendo macrófagos (M) com grânulos

negros em seu interior (coloração HE). .................................................................................. 122

Figura 78 - Swelling in response to pH change. Blue = PBS Solution; Orange = pH 5 ....... 142

Figura 79 – Swelling of Hydrogel S5 in different pH solutions. Blue = PBS (pH 7.4); Red =

pH 3; Green = pH 5 ................................................................................................................ 142

Figura 80 – Scheme of Hydrogel Detection of NTBI and release chelator........................... 144

Figura 81 - schematic representation of the copolymer of poli(NIPAAm-co-AAc-co¬-

HEMAPLDLA-co¬-TMC) ..................................................................................................... 147

Figura 82 – XPS spectra for hydrogels with 10% of macromer .......................................... 148

Figura 83 – XPS spectra for hydrogels with 15% of macromer ........................................... 149

Figura 84 – XPS spectra for hydrogels with 15% of macromer ........................................... 150

Figura 85 – TGA Curves for Hydrogel with 10% of macromer ........................................... 153



LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Sequência de “primers” para o experimento de qPCR ........................................... 53

Tabela 2 - Grau de intumescimento dos hidrogéis sintetizados .............................................. 59

Tabela 3 – Composições com 2% de ácido acrílico ................................................................ 76



Tabela 6 - Temperatura de Transição Vítrea para os Hidrogéis sintetizados. ......................... 86

Tabela 7 – Temperaturas de LCST para os Hidrogéis ............................................................. 88

Tabela 8 – Comportamento Reológico dos Hidrogéis ............................................................. 91

Tabela 9 – Compositions of Hydrogels were used in this work ............................................ 141

Tabela 10 – Atomic percentage of elements and chemical bond comparison between hydrogels

with 10% of macromer ........................................................................................................... 147

Tabela 11 - Atomic percentage of elements and chemical bond comparison between hydrogels

with 15% of macromer ........................................................................................................... 147

Tabela 12 – Atomic percentage of elements and chemical bond comparison between hydrogels

with 20% of macromer ........................................................................................................... 147

Tabela 13 – TGA results of hydrogels ................................................................................... 152

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AAc Ácido Acrílico

CM Cardiomiócito

CPC Célula progenitora cardíaca

DMEM Meio Eagle modificado por Dulbeco

DMSO Dimetil Sulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucleico

DSC Calorimetria Exploratória Diferencial

ESC Célula-tronco embrionária

FTIR Espectroscopia do Infravermelho por Transformada de Fourier

HEMA 2-hidroxietil metacrilato

IP Índice de Polidispersão

IAM Infarto agudo do miocárdio

IFN-ɣ Interferon-gama

IGF Insulin-like growth factor

LCST Lower Critical Solution Temperature

MEV Microscopia Eletrônica de Varredura

Mn Massa molar média

MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil brometo de tetrazólio

Mw Massa molar ponderal média

NIPAAm N-ispropilacrilamida

PBS Solução Tampão de Fosfato

PLDLA-co-TMC Poli(L-co-D,L ácido lático)-co-trimetileno carbonato

RMN Ressonância Magnética Nuclear

Tg Temperatura de Transição Vítrea

THF Tetrahidrofurano

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 24

2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 26

2.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 26

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 26

3. BIOMATERIAIS ................................................................................................................ 27

4. ENGENHARIA TECIDUAL ............................................................................................ 28

5. POLÍMEROS BIORREABSORVÍVEIS E HIDROLITICAMENTE DEGRADÁVEIS

.................................................................................................................................................. 31

6. HIDROGEIS ....................................................................................................................... 34

6.1 HIDROGÉIS INTELIGENTES ......................................................................................... 36

6.1.1 Poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm) .................................................................... 38

6.1.2 PLDLA-co-TMC ............................................................................................................ 40

7. EPIDEMIOLOGIA DO INFARTO DO MIOCÁRDIO ................................................. 40

7.1 FISIOPATOLOGIA DO INFARTO DO MIOCÁRDIO ................................................... 41

7.2 CÉLULAS-TRONCO ........................................................................................................ 44

8. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 48

8.1 MATERIAIS ...................................................................................................................... 48

8.2 SÍNTESE DO MACRÔMERO HEMA-POLI(L-CO-D,L ÁCIDO LÁTICO –CO–

TRIMETILENO CARBONATO) (HEMAPLDLA-CO-TMC) ............................................... 49

8.3 SÍNTESE DO POLI(NIPAAM-CO-AAC-CO-HEMAPLDLA-CO-TMC) ....................... 49

8.4 GRAU DE INTUMESCIMENTO ..................................................................................... 50

8.5 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 1H E 13C (RMN)........................................ 51

8.6 ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO COM

TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR) ............................................................................ 51

8.7 CALORIMETRIA DIFERENCIAL DE VARREDURA (DSC) ....................................... 51

8.8 ENSAIOS REOLÓGICOS ................................................................................................. 52

8.9 DEGRADAÇÃO DOS HIDROGÉIS ................................................................................. 52

8.10 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE QUANTITATIVA (QPCR) .................... 52

8.11 IMUNOFLUORESCÊNCIA ............................................................................................ 53

8.12 ENSAIOS IN VIVO .......................................................................................................... 54

8.12.1 Animais ......................................................................................................................... 54

8.12.2 Procedimento Cirúrgico .............................................................................................. 54

8.12.3 Processamento Do Material Para Análise Histológica ............................................. 55

8.12.4 Preparação Das Lâminas E Coloração ...................................................................... 55

8.12.5 Análise Histológica Dos Implantes ............................................................................. 56

9. RESULTADOS E DISCUSSÕES ..................................................................................... 57

9.1 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA .................................................................................... 57

9.2 GRAU DE INTUMESCIMENTO ..................................................................................... 58

9.3 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN DE 1H) DO MACRÔMERO

HEMAPLDLA-CO-TMC ......................................................................................................... 60

9.4 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN DE 13C) DO HIDROGEL

POLI(NIPAAM-CO-AAC-CO-HEMAPLDLA-CO-TMC) .................................................... 64

9.4.2 Comparativo entre as Sínteses com Diferentes Quantidades de Ácido Acrílico...... 67

9.5 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN DE 1H) DO HIDROGEL

POLI(NIPAAM-CO-AAC-CO-HEMAPLDLA-CO-TMC) .................................................... 71

9.5.1 Comparativo Entre as Sínteses do Grupo Com 2% De Ácido Acrílico .................... 74




TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR) ............................................................................ 81

9.6.1 Análise do Macrômero .................................................................................................. 81

9.6.2 Análise dos Hidrogéis .................................................................................................... 82

9.7 CALORIMETRIA DIFERENCIAL DE VARREDURA (DSC) ....................................... 84

9.7.1Comportamento LCST .................................................................................................. 87

9.8 ANÁLISE REOLÓGICA ................................................................................................... 89

9.9 DEGRADAÇÃO DOS HIDROGÉIS ................................................................................. 94

9.10 ANÁLISE DE QPCR DA DIFERENCIAÇÃO CELULAR ............................................ 96

9.11 ANÁLISE DE IMUNOFLUORESCÊNCIA DA DIFERENCIAÇÃO CELULAR ...... 100

9.12 ESTUDO IN VIVO DO HIDROGEL 86/10/4 ................................................................ 103

9.12.1 Grupo com Implantes de 5 dias ................................................................................ 104

9.12.2 Grupo com Implantes de 7 dias ................................................................................ 105

9.12.3 Grupo com Implantes de 10 dias .............................................................................. 105




9.13 ESTUDO IN VIVO DO HIDROGEL 81/15/4 ................................................................ 110

9.13.1 Grupo com implantes de 1 dia .................................................................................. 110

9.13.2 Grupo com Implante de 3 dias ................................................................................. 114

9.13.3 Grupo com implante de 5 dias .................................................................................. 117

9.13.5 Grupo com Implante de 14 dias ............................................................................... 120

CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 124

REFERENCIAS ................................................................................................................... 126

APÊNDICE A - RESULTADOS LIBERAÇÃO CONTROLADA BEPE FAPESP

2015/20933-7 .......................................................................................................................... 139

1 INTRODUCTION ............................................................................................................. 139

2 DEVELOPMENTS ............................................................................................................ 140

3 RESULTS AND DISCUSSIONS ...................................................................................... 140

3.1 PH-SENSITIVE HYDROGELS ...................................................................................... 140

3.2 MOLECULAR WEIGHT CUTOFF ................................................................................ 143

3.3 DETECTION OF LABILE PLASMA IRON .................................................................. 143

3.4 RELEASE OF CHELATOR ............................................................................................ 144

3.5 IN VITRO TESTING ....................................................................................................... 144

4 DISCUSSION ..................................................................................................................... 145

5. PRELIMINARY RESULTS ............................................................................................ 145

APÊNDICE B – RESULTADOS XPS E TGA BEPE FAPESP 2015/20933-7 ................ 146

INTRODUCTION ................................................................................................................ 146

2. RESULTS AND DISCUSSIONS ..................................................................................... 146

2.1 X-RAY PHOTOELECTRON SPECTROSCOPY (XPS) ................................................ 146

2.2 THERMOGRAVIMETRIC ANALYSIS (TGA) ............................................................. 151

24

1. INTRODUÇÃO

Hidrogéis são definidos como redes tridimensionais de homopolímeros ou

copolímeros reticulados por vias químicas ou físicas que incham na presença de água

(OVERSTREET et al., 2012). São materiais atrativos para aplicações minimamente invasivas

de liberação local de fármacos, tendo propriedades mutáveis, alta quantidade de soluções

encapsuladas e muitas vezes biocompatíveis (ARTZI et al, 2017). Hidrogéis reticulados

quimicamente possuem ligações covalentes entre as cadeias poliméricas para formar as

reticulações, já hidrogéis reticulados fisicamente possuem ligações não covalentes entre as

cadeias poliméricas, são ligados por forças intermoleculares, tais como forças eletrostáticas,

hidrofóbicas ou ligações de hidrogênio (BAE; WANG; KURISAWA, 2013).

Hidrogéis injetáveis são candidatos promissores na área dos biomateriais,

principalmente visando aplicações na engenharia tecidual, dadas suas características de

absorção de quantidades de água e propriedades mecânicas semelhantes aos tecidos, capacidade

de encapsulamento de drogas e células, propriedades físicas facilmente mutáveis, além de

aplicações minimamente invasivas (TAN & MARRA, 2010; WANG et al., 2010). Várias

pesquisas apontam a utilização desta classe de hidrogéis em diversas aplicações, tais como,

associação com fármacos, proteínas, fatores de crescimento e células, para auxiliarem na

neoformação do tecido onde é implantado (PARK et al., 2009; NGUYEN & LEE, 2010;

MACAYA & SPECTOR, 2012).

A gelificação dos hidrogéis injetáveis (gelation) pode ser obtida envolvendo

polimerização química, fotopolimerização e reticulação por vias térmicas (WANG et al., 2010).

No âmbito deste estudo, foi empregada a reticulação por vias térmicas, produzindo um hidrogel

com características termo sensíveis.

Na classe de hidrogéis termo sensíveis a poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm) tem

sido amplamente estudada, porém, as maiores desvantagens destes hidrogéis residem nos

seguintes aspectos: o fato de não apresentarem biodegradação, de possuírem baixas

propriedades mecânicas além do fato de não poderem ser injetados (LI et al., 2009). A fim de

sanar tais deficiências, autores apontam a copolimerização de PNIPAAm com poliésteres

biodegradáveis (GUAN et al., 2008; NI et al., 2014; WANG et al., 2010) como uma das

alternativas para esta classe de hidrogéis.

Neste trabalho foram sintetizados hidrogéis de poli(N-isopropilacrilamida)

(PNIPAAm) a partir de uma nova classe de macrômero composto por 2-hidróxietil metacrilato

(HEMA), L-lactide, D,L-lactide e trimetileno carbonato (TMC) via abertura de anel. Não foram

25

encontrados dados reportados na literatura, sendo este material o responsável pelo aumento das

propriedades mecânicas e características de degradação (segmentos ésteres) aos hidrogéis de

PNIPAAm.

O novo hidrogel sintetizado (via radical livre) também possui comportamento LCST

(Lower Critical Solution Temperature) onde, em temperaturas baixas se apresenta na forma de

hidrogel em solução, passível de ser injetado em agulhas de 26 gauge, e quando há aumento na

temperatura (valores próximos à temperatura corporal) o gel é formado.

Diante disso o trabalho teve como objetivo sintetizar um novo hidrogel injetável, termo

sensível e com características biodegradáveis que possua propriedades mecânicas e reológicas

otimizadas, visando aplicações futuras na engenharia tecidual cardíaca. Para tanto, os hidrogéis

foram caracterizados química, física, térmica e reologicamente, bem como através da avaliação

de biocompatibilidade via RT-PCR e imunofluorescência utilizando-se células tronco

embrionárias de rato diferenciadas em cardiomiócitos. As interações com os tecidos também

foram avaliadas in vivo com a injeção dos hidrogéis no dorso de ratos Wistar e sendo feita a

posterior análise histológica dos materiais.

26

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Desenvolvimento de um novo hidrogel termosensível, injetável e biodegradável com

potencial aplicação em engenharia tecidual cardíaca.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Sintetizar um novo macrômero com segmentos ésteres hidrolisáveis composto de

HEMAPLDLA-co-TMC por polimerização por abertura de anel éster, para modificação de

propriedades nos hidrogéis de PNIPAAm.

Sintetizar e caracterizar o hidrogel injetável, termo sensível e biodegradável composto

de poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm), ácido acrílico (AAc) e o macrômero composto por

2-hidróxietil metacrilato (HEMA) e poli(L-co-D,L ácido lático)-co-trimetileno carbonato

(HEMAPLDLA-co-TMC).

Sintetizar um novo hidrogel com características injetáveis, termo sensíveis e com

característica biodegradável.

Caracterizar os hidrogéis química, térmica, física e reologicamente.

Determinar a melhor característica mecânica para utilização dos hidrogéis in vivo.

Avaliar a degradação in vitro e viabilidade celular do hidrogel.

Avaliar a interação in vivo dos materiais sintetizados.

27

3. BIOMATERIAIS

A Ciência dos Biomateriais compreende o estudo dos materiais e suas interações com

o sistema biológico. Isso envolve temas relacionados à ciência dos materiais, incluindo

propriedades mecânicas dos materiais, modificação de superfícies dos implantes bem como

tópicos biológicos como imunologia, toxicologia e processos de cicatrização.

A definição de mais aceita de biomateriais estabelecida na American National Institute

of Health é a de que “qualquer substância ou combinação de substâncias, outras que não drogas,

de origem sintética ou natural, que possa ser utilizada em qualquer período de tempo, que

aumente ou repare, parcial ou totalmente qualquer tecido, órgão ou função do corpo, a fim de

manter ou promover a qualidade de vida de um indivíduo” (BERGMANN & STUMPF, 2013).

O critério para seleção de um biomaterial deve levar em consideração sua eficiência

que é determinada principalmente por duas características: “biocompatibilidade” e

“biofuncionalidade”.

A medida que a área de pesquida em Biomateriais foi crescendo, surgiu a necessidade

de se redefinir os termos, buscando interação com as áreas aplicadas. Dessa forma, a redefinição

de biocompatibilidade conforme Vert et al, 2012, ampliou-se como “habilidade (do

biomaterial) estar em contato com um sistema vivo sem produzir efeitos adversos”.

Essa definição englobou também o termo biofuncionalidade que segundo Vert et al

(1992) é definido como a habilidade do material desempenhar uma função específica e

apropriada dentro do organismo dependente das propriedades físicas, mecânicas e biológicas.

Embora o sucesso clínico e aplicação dos mais diversos tipos de dispositivos médicos

atualmente disponíveis, tenha proporcionado a melhora da qualidade de vida de milhões de

pessoas em todo o mundo, existem ainda consideráveis melhorias a serem realizadas. Ratner,

(2007) ressalta que o desenvolvimento e aprimoramento de novos dispositivos deve estar

fundamentado no princípio de que a natureza biológica é altamente específica, reativa,

degradativa, cinética e dinâmica. Diante desta pespectiva, o autor propõe uma lista de idéias

centrais “causa/efeito” na qual a nova geração de biomateriais deve buscar atender a

especificidade e funcionamento biológico dos tecidos, visando o desenvolvimento de

biomateriais que proporcionem uma melhora satisfatória na forma de atuação com o organismo

dos pacientes que necessitam desses dispositivos. (RATNER, 2007).

Entretanto, alguns fatores para a escolha e utilização dos biomateriais utilizados em

dispositivos temporários devem ser levados em consideração como, por exemplo, remoção dos

28

produtos da degradação destes materiais, tempo desta degradação no sistema e absorção dos

produtos de degradação por rotas metabólicas convencionais. Estas análises são importantes

para que não ocorra nenhum dano ao organismo receptor deste material.

O critério para seleção de um polímero para uso com biomaterial envolve dois fatores:

as propriedades mecânicas e o tempo de degradação em função das necessidades de aplicação

(MIDDLETON & TIPTON, 2000). O polímero ideal para o uso em biomaterial

biorreabsorvível pelo organismo deve levar em consideração fatores como: não provocar

respostas inflamatórias nos tecidos onde foi implantado, sofrer degradação no organismo

somado ao fator bioabsorção, ou seja, o material ser metabolizado pelo organismo ao fim da

utilização; ser processado facilmente no produto destinado ao tratamento e por último deve ser

facilmente esterilizável (MOURA, 2007).

Polímeros biorreabsorvíveis baseados em rotas sintéticas de obtenção, geralmente

mimetizam as moléculas naturais do organismo, como proteínas e polissacarídeos, pois, estes

polímeros contêm ligações hidrolisáveis ao longo da cadeia, estas ligações são suscetíveis a

biodegradação.

Dentre os principais grupos de polímeros biorreabsorvíveis destacam-se os poli(α-

hidróxi ácidos) devido aos excelentes resultados mecânicos e fisiológicos. Neste grupo o PLLA

(poli(L-ácido lático)) e do PGA (poli(Ácido Glicólico)), o produto final da degradação destes

polímeros são monômeros ácidos (ácido lático e acido glicólico) que são convertidos

enzimaticamente e cujos produtos participam do ciclo do ácidos tricarboxílicos. O produto

final são ATP (adenosina trifosfato), água e CO2 que são excretados pelos pulmões e rins

(PEZZIN, 2001).

4. ENGENHARIA TECIDUAL

A engenharia tecidual constitui uma área de pesquisa interdisciplinar cuja abordagem

mais ampla de seus objetivos inclui o desenvolvimento e manipulação de implantes artificiais,

de tecidos gerados em laboratório ou células e moléculas capazes de substituir ou estimular

funcionalmente partes defeituosas ou lesadas do organismo (PLACE et al., 2008; LENAS et

al., 2009; CARVALHO et al., 2010). Para tanto, existem três fatores fundamentais a serem

considerados no sucesso do desenvolvimento tecidual: (i) a escolha apropriada do tipo celular,

29

(ii) a escolha das propriedades físico-químicas e estrutural do material o qual desempenhará a

função de suporte celular, (iii) a compreensão das interações célula/material (HASIRCI &

YUCEL, 2007; MURUGAN & RAMAKRISHNA, 2007).

Células, naturalmente, estão inseridas no tecido nativo em um microambiente

tridimensional complexo cuja composição consiste de biomoléculas solúveis (citocinas,

hormônios e fatores de crescimento) e fatores não solúveis (matriz extracelular - MEC). O

microambiente fornece não apenas, a integridade estrutural do tecido como também, controla e

viabiliza inúmeros processos de transdução de sinais, progressão do ciclo celular e expressão

de diferentes fenótipos (SHIN et al., 2007).

A escolha do tipo celular, compreensão do mecanismo biológico de atuação no

organismo a nível celular e molecular e exigências nutricionais e fisiológicas exercem

influência direta sobre o grau de sucesso obtido na criação de novos tecidos biomiméticos

funcionais e desenvolvimento de novos biomateriais (SALTZMAN et al., 2000;

KIRKPATRICK et al., 2007; SABIR et al., 2009).

Scaffolds são definidos como estruturas tridimensionais que desempenham a função

de atuarem como suporte temporário no processo de cultivo de células e tecidos e, portanto,

devem sumarizar as características de uma matriz extracelular (MEC) nativa bem como,

atuarem de forma semelhante sob condições fisiológicas viabilizando a formação de um tecido

específico com funções apropriadas, semelhantes às encontradas no organismo (MURUGAN

& RAMAKRISHNA,2007).

Sabe-se que a escolha do material a ser empregado como arcabouço (“scaffold”) na

engenharia tecidual depende, primeiramente, do tipo de tecido a ser reconstruído e fatores

relacionados ao local de aplicação, tais como, viscosidade, tensão/deformação, desgaste

mecânico e cisalhamento (MURUGAN & RAMAKRISHNA,2007; SABIR et al.,2009). Por

exemplo, cerâmicas e compósitos são amplamente usados como arcabouços voltados a

reconstrução de tecidos duros, enquanto que, polímeros são empregados na reconstrução de

tecidos moles (MURUGAN & RAMAKRISHNA,2007; SABIR et al.,2009; LI &

GUAN,2011).

Hidrogéis, polímeros hidrofílicos reticulados, representam uma importante classe de

biomateriais poliméricos nos campos da biotecnologia e medicina regenerativa por,

inicialmente, apresentar excelente biocompatibilidade, provocando respostas inflamatórias

mínimas, trombose e danos nos tecidos. Os hidrogéis também podem inchar, absorvendo

grandes quantidades de água sem a dissolução do polímero devido à sua estrutura hidrofílica,

mas reticulada estrutura, dando-lhes, assim, características físicas semelhantes às dos tecidos

30

moles. Além disso, os hidrogéis possuem elevada permeabilidade para o oxigênio, nutrientes e

outros metabolitos solúveis em água. (NAIR et al., 2010).

Dentro dos princípios que regem a engenharia tecidual, a estratégias de aplicação dessa

classe de materiais na forma injetável combinada ao pré cultivo de celulas têm sido amplamente

investigadas, proporcionando a obtenção de resultados bastante promissores. A principal

vantagem dessa estratégia de aplicação do ponto de vista biológico deve-se à possibilidade de

implantação do material na área do tecido lesionado através de procedimentos cirúrgicos

minimamente invasivos (TAN et al., 2010; LI & GUAN, 2011).

FUJIMOTO et al. (2009), demonstraram que a injeção de hidrogéis produzidos a

partir da copolimerização de N-isopropilacrilamida (NIPAAm), ácido acrílico (AAc) e

hidroxietil metacrilato e poli(trimetileno carbonato) (HEMAPTMC), previamente cultivados

com células vasculares de músculo liso e implantados em corações infartados de ratos,

proporcionaram uma melhora satisfatória da regeneração do tecido lesionado e, portanto, o

melhoramento das funções do coração (FUJIMOTO et al., 2009)

Outros autores ainda têm ressaltado o potencial de aplicação de hidrogéis injetáveis na

reparação tecidual da cartilagem e defeitos osteocondrais, o que revela a versatilidade e

benefícios do emprego desses materiais (SPILLER et al., 2011; WENNINK et al., 2013).

O estudo das interações biológicas célula-célula, bem como a influência e viabilidade

do emprego do biomaterial sobre o desempenho celular são, freqüentemente, avaliados através

de técnicas de cultivo celular. Embora experimentos in vitro não reproduzam uma completa

gama de respostas celulares observadas in vivo, os mesmos proporcionam uma considerável

compreensão sobre os mecanismos básicos de reconhecimento e interação célula-substrato

(SALTZMAN et al., 2000).

O processo de interação célula-biomaterial é altamente dinâmico e depende de vários

parâmetros que influenciarão a neoformação tecidual (ANSELME et al.,2000; BAKAKOVÁ

et al., 2004; MEYER et al., 2005; von der MARK et al., 2010). Todo o processo de

bioreconhecimento pode ser dividido em dois eventos distintos: acelular (evento físico) e

celular (evento biológico). A adsorção de proteínas é tida como o primeiro evento que ocorre

após o contato de fluídos corpóreos à superfície do material e é governada por forças

eletrostáticas não específicas tais como Van der Waals e formação passiva de ligações ligante-

receptor. O segundo evento caracteriza-se pela ativa reorganização celular no qual o

recrutamento de receptores e sítios específicos viabilizam o processo de adesão celular e

subseqüente processo de proliferação, migração e diferenciação celular (BAKAKOVÁ et al.,

2004; MEYER et al., 2005; von der MARK et al., 2010).

31

Por se tratarem de materiais hidrofílicos, com presença de muitos grupos funcionais

passíveis de interagirem com o meio aquoso e assim, permitirem a adsorção de proteínas e

reconhecimento biológico, a citocompatibilidade e capacidade de materiais hidrogéis

estimularem os eventos biológicos acima citados frequentemente é observado (TAN et al.,

2010). Contudo, o grau de afinidade celular é modulado pelas características físico-químicas e

mecânicas intrínsecas da composição de cada material desenvolvido (LAVIK & LANGER,

2004; MURUGAN et al., 2007).

5. POLÍMEROS BIORREABSORVÍVEIS E HIDROLITICAMENTE DEGRADÁVEIS

Materiais poliméricos biorreabsorvíveis e hidroliticamente degradáveis aplicados na

Engenharia Tecidual podem ser definidos como sendo estruturas macromoleculares, que ao

entrarem em contato com o fluído corpóreo são passíveis de sofrerem hidrólise e os produtos

gerados, absorvidos e eliminados pelas vias metabólicas naturais do organismo (VERT, 2005;

HUTMACHER, 2000).

Convencionalmente, todas as classes de polímeros sintéticos aplicados na Engenharia

Tecidual e suscetíveis a sofrerem quebra de ligações primárias da cadeia principal, redução da

massa molar e consequentemente uma mudança das propriedades físico-químicas resultantes

tão somente por fenômenos mediados por células são denominados polímeros biodegradáveis,

No entanto, a nomenclatura amplamente empregada, não reflete os reais mecanismos de

degradação nos sistemas biológicos, pois sugere que o processo de degradação dos materiais é

promovido por células e não por hidrólise, quando a hidrólise ocorre tão somente pela água

presente nos tecidos e órgãos não ocorre o processo de biodegradação, somente o de degradação

hidrolítica (VERT et al, 2012). Os poli(hidroxialcanoatos) e a Policaprolactona são

naturalmente biodegradados no meio ambiente, enquanto que no organismo, a degradação

ocorre apenas pelo processo de hidrólise (VERT, 2005).

O emprego de materiais poliméricos hidroliticamente degradáveis visando aplicações

terapêuticas deve-se às inúmeras vantagens inerentes da própria natureza química dos mesmos,

dentre elas: apresentam adequada interação biológica, são fáceis de serem processados e

moldados de acordo com o modelo de dispositivo e aplicação almejada, apresentam

comportamento viscoelástico e valores de módulo de elasticidade próximos aos dos tecidos em

questão, são resistentes a corrosão e, principalmente, são passíveis de sofrerem degradação, o

32

que viabiliza o processo de reconstrução tecidual (GUNATILLAKE & ADHIKARI, 2003;

SABIR et al., 2009).

Poliésteres alifáticos são membros de uma grande família de polímeros os quais podem

ser obtidos naturalmente em processo de síntese bacteriana tais como os poli (hidroxi

alcanoatos) (PHAs), ou via síntese química, pela policondensação de hidroxí ácidos, diácidos e

diálcools ou/bem como, polimerização de heterodímeros do tipo lactonas e glicolídeos. Os

últimos representam uma versátil classe de materiais poliméricos, denominada de Poli (-

hidroxi ácidos), que possuem estrutura química linear com assimetria quiral do átomo de

carbono em cada unidade de repetição. (Vert, 2005; Motta et al.,2007). Conforme a escolha da

proporção e tipo do monômero e ainda, a configuração espacial da estrutura molecular, estes

polímeros exibem diferentes formas químicas estéreo-isoméricas que proporcionam a obtenção

de materiais com diversas propriedades físicas e mecânicas as quais são fundamentais, na

resposta biológica quando aplicados a dispositivos biomédicos (YI et al., 2009).

Dentre os principais polímeros biorreabsorvíveis e hidroliticamente degradáveis,

atualmente estudados e utilizados na área biomédica, encontram-se os poli(ácido lático)-PLA,

poli(ácido glicólico)-PGA, poli(ácido lático-co-ácido glicólico)-PLGA, poli(ε-caprolactona)-

PCL e seus copolímeros (BARBANTI et al., 2004; WAN et al., 2005; KARAGEORGIOU E

KAPLAN, 2005, MOTTA et al., 2007; ESPOSITO et al., 2008). Sendo os poliésteres

produzidos a partir dos monômeros do ácido lático e glicólico mais amplamente utilizados

devido à superior biocompatibilidade, maior controle sobre a taxa de degradação e histórico de

aprovação pela Food and Drug Administration (FDA) (WAN et al., 2005; YU et al., 2010).

O processo de degradação polimérica pode ser descrito como: em ambiente aquoso, a

água penetra na amostra e ataca preferencialmente as ligações químicas da fase amorfa,

diminuindo a cadeia polimérica. Regiões cristalinas permanecem e suportam temporariamente

as propriedades físicas do dispositivo até serem atingido pela água. Quando tais polímeros,

sintetizados à base de ácido lático, entram em contato com o fluído corpóreo, a água penetra na

amostra e inicia-se a cisão hidrolítica de ligações ésteres bem como autocatálise de regiões

amorfas da cadeia polimérica, originando, portanto, produtos na forma de oligômeros (ou

monômeros) solúveis e não tóxicos (BARBANTI et al.,2005; VERT, 2005; HASIRCI &

YUCEL, 2007).

A presença de terminais ácidos catalisa a reação de degradação. Inicialmente, o

processo é homogêneo, gerando oligômeros solúveis em água em toda a extensão do material.

Os produtos presentes na superfície da matriz são difundidos para o meio, entretanto, a baixa

taxa de difusão dos produtos da reação no interior do material gera um acúmulo de ácidos,

33

fazendo com que estruturas densas tenham uma erosão inicial na superfície, mas apresentando

uma degradação mais acentuada no centro. É o chamado efeito autocatalítico dos poli (α-hidróxi

ácidos). A degradação pode prosseguir por um processo biologicamente ativo (por enzimas dos

fluidos orgânicos) ou pela simples clivagem hidrolítica passiva (BARBANTI, 2008).

Hidrofilicidade e as regiões amorfas permitem o melhor acesso das moléculas de água

e com isso, uma degradação mais rápida, como por exemplo, o grupo metil do PLLA faz com

que ele seja hidrofóbico e mais resistente a hidrólise, se degradando mais lentamente quando

comparado ao PGA, onde o grupo metil está ausente, fazendo com que este polímero seja

hidrofílico e assim mais susceptível a hidrólise.

A taxa da degradação hidrolítica de biomateriais poliméricos é influenciada por

múltiplos fatores, entre eles: local de implante, solicitação mecânica, massa molar, distribuição

da massa molar, composição química/estereoisomérica, cristalinidade, morfologia, geometria

do dispositivo desenvolvido, porosidade, rugosidade da superfície, energia livre de superfície,

carga da superfície, pH e presença de aditivos na composição do material (BARBANTI et

al.,2005).

Há uma excelente biocompatibilidade dos poliésteres, pois os produtos da

biodegradação metabólica do poli (ácido láctico) (CO2 e H2O) são reabsorvidos pelo organismo.

Neste caso, a degradação metabólica do PLA segue o processo de oxidação do ácido láctico,

que por sua vez é convertido em ácido pirúvico. Na presença da acetil-coenzima A (CoA),

ocorrerá liberação de CO2 e consequentemente a decomposição em citrato. Este citrato será

então incorporado no ciclo dos ácidos tricarboxílicos, que no final eliminará novamente CO2 e

H2O, conforme o esquema mostrado na Figura 1 (BOSTMAN, 1991).

O grau de cristalinidade determina a taxa de absorção de água pelo polímero, o que

conseqüentemente irá influenciar na velocidade de degradação do material (VERT et al, 1992).

34

Figura 1 - Representação esquemática da rota metabólica e processo de reabsorção dos poli (α- hidroxi ácidos)

(BARBANTI et al., 2005).

6. HIDROGEIS

Hidrogéis podem ser definidos como estruturas poliméricas tridimensionais,

hidrofílicas, cuja principal propriedade é absorver determinadas quantidades de água ou fluídos

biológicos (PEPPAS et al., 2000). Podem ser quimicamente estáveis ou se degradarem, com o

tempo podendo eventualmente desintegrar-se (HOFFMAN, 2012).

Estruturalmente são constituídos por uma ou mais redes poliméricas

tridimensionalmente estruturadas, formadas por cadeias macromoleculares interligadas por

ligações covalentes (reticulações) ou interações físicas (OVIEDO et al, 2008) os quais

intumescem na presença de água ou de fluídos corporais (CORTÉS et al, 2011). Quando as

reticulações são produzidas por ligações covalentes entre as cadeias poliméricas são chamados

hidrogéis químicos (BAE; WANG; KURISAWA, 2013) e quando são formadas por interações

físicas ou ligações secundárias são chamados hidrogéis físicos. Estas estruturas poliméricas

reticuladas incham em presença de água com ligações covalentes produzidas pela reação de um

ou mais co-monômeros, ligações reticuladas por emaranhamento de cadeias, associação de

ligações moleculares incluindo pontes de hidrogênio ou fortes interações de van der Waals entre

35

cadeias e cristalitos reunindo duas ou mais cadeias macromoleculares (Figura 2) (PEPPAS et

al, 2000).

Figura 2 - Esquema dos métodos de formação dos hidrogéis químicos e físicos (adaptado de Hoffman, 2012).

O método de absorção de água num hidrogel foi estudado por diversos cientistas e

pode ser facilmente descrito do seguinte modo: quando um hidrogel seco inicia o seu processo

de absorção de água, as primeiras moléculas por ele absorvidas irão hidratar as moléculas mais

polares da estrutura polimérica, levando a um primeiro tipo de ligação da água com as

moléculas do polímero. À medida que estes grupos vão sendo hidratados, ocorre o aumento

físico da estrutura polimérica, levando à exposição das moléculas mais hidrofóbicas, até então

mais resguardadas no interior da matriz polimérica. Estas interagem com as moléculas de água,

levando ao aparecimento de um segundo tipo de ligação das moléculas de água com os

componentes mais hidrofóbicos do polímero (ALMEIDA, 2010).

Devido a essas características, os hidrogéis apresentam alta hidrofilicidade e

consequentemente maior grau de intumescimento e insolubilidade. A hidrofilicidade dos

hidrogéis pode ser controlada pela natureza dos grupamentos presentes em suas cadeias, tais

como: - OH, -COOH, -CONH, -NH, -SOH (WATAYA, 2012).

A pesquisa dos hidrogéis como biomateriais remonta da década de 60, quando

pesquisadores liderados por Otto Wichterle sintetizaram hidrogéis de poli(2-hidróxietil

metacrilato) pHEMA com aplicação em lentes de contato hidrofílicas (BAVARESCO et al.,

36

2002). Desde então os hidrogéis tem se tornado alvo de estudo nas diferentes áreas relacionadas

à biomateriais como, por exemplo, liberação de insulina (PENG et al, 2013), carregamento de

células tronco e fatores de crescimento (WANG et al, 2010), liberação controlada de fármacos

(ALMEIDA et al, 2011), dispositivos ortopédicos (GAHARWAR et al, 2011), regeneração de

áreas infartadas (FUJIMOTO et al., 2009), entre outros. A Figura 3 ilustra várias aplicações dos

hidrogéis no corpo humano.

Figura 3 - Aplicações clínicas de hidrogéis (adaptado de KIRSCHNER & ANSETH, 2013)

6.1 HIDROGÉIS INTELIGENTES

Os hidrogéis podem ser divididos em duas classes: os hidrogéis convencionais e os

hidrogéis responsivos, chamados de hidrogéis inteligentes. Os hidrogéis inteligentes possuem

todas as características descritas para os hidrogéis convencionais, mas apresentam propriedade

adicional de exibir variações em suas propriedades quando submetido à estímulos externos, tais

como pH, variações de temperatura, variações de força iônica do meio, entre outros (QIU &

PARK, 2001).

Uma das principais vantagens desta classe de hidrogéis é de que é possível controlar

várias características adequando o material ao meio onde será aplicado (ALMEIDA, 2010).

37

Hidrogéis termossensíveis (alvo deste estudo), necessitam que pelo menos um de seus

componentes possua esta característica, sendo, portanto, insolúvel ou solúvel acima de uma

determinada temperatura, ou seja, apresentar uma temperatura de solução crítica inferior (LCST

– low critical solution temperature) ou uma temperatura de solução crítica superior (UCST –

ultra critical solution temperature). Para os hidrogéis com comportamento LCST, o volume é

reduzido com o aumento da temperatura, onde ocorre a separação de fases. Já para o

comportamento oposto, conforme a temperatura aumenta ocorre a contração do material. A

Figura 4 apresenta os diagramas de fase para os sistemas LCST e UCST.

Figura 4 - Diagrama de fases do sistema LCST e UCST (ALMEIDA, 2010).

Nos hidrogéis termossensíveis com comportamento LCST, para temperaturas

inferiores à temperatura crítica a solução apresenta apenas uma fase, tendo predominantemente

ligações de hidrogênio formadas pelos segmentos hidrofílicos da rede polimérica e as moléculas

de água. Conforme a temperatura se eleva as interações hidrofóbicas do sistema se tornam mais

fortes e consequentemente as ligações de hidrogênio se enfraquecem resultando na contração

do gel prevalecendo interações polímero-polímero e solvente-solvente. O comportamento

LCST pode ser modificado ajustando-se a razão entre segmentos hidrofóbicos e hidrofílicos no

polímero (balanço anfifílico) (QIU & PARK, 2001). Esse comportamento é de extrema

importância para aplicações com liberação de fármacos ou carreamento celular onde polímeros

38

mais células podem ser injetados na forma de uma solução fluída (sol), após a injeção o material

solidifica na temperatura corporal (gel) (PEPPAS et al., 2000).

Existem algumas vantagens consideráveis na utilização destes materiais. Como por

exemplo:

• a facilidade com a qual são introduzidos no organismo, não necessitando de

procedimento cirúrgico, sendo que uma simples injeção é suficiente para administrar

o material no corpo humano de maneira minimamente invasiva;

• a versatilidade de escolha de agentes terapêuticos podem ser incorporados neste

material somente misturando na forma de solução;

• a facilidade com que os hidrogéis se adaptam às cavidades ou defeitos quando

injetados, tendo em vista que tomarão a forma destes locais, diferentemente dos

materiais com forma já definida (RUEL-GARIÉPY & LEROUX, 2004).

6.1.1 Poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm)

Dentre os polímeros termossensíveis um material que vem ganhando ênfase nos

estudos é a poli(N-isopropilacrilamida) (EECKMAN; MOËS; AMIGHI, 2004) doravante

apresentada como PNIPAAm (Figura 5), possui LCST de entre 30 e 34ºC (SCHMALJOHANN,

2006), ou seja, abaixo desta temperatura o hidrogel está em estado expandido com a água. Com

a aproximação do LCST o gel sofre uma contração repentina expulsando água de seu interior.

Este material pode ser modificado quando copolimerizado com monômeros mais hidrofílicos

ou hidrofóbicos permitindo modificar a temperatura de transição para próximo da temperatura

corporal (SCHILD, 1992). Sendo assim com a redução de temperatura o caráter hidrofílico se

sobrepõe ao hidrofóbico, já com o aumento da temperatura o caráter hidrofóbico sobrepõe-se

ao hidrofílico (LIU et al., 2007) Para fins de ilustração um esquema da transição de fase da

PNIPAAm será apresentado na Figura 6.

39

Figura 5 - Estrutura da PNIPAAm (DIMITROV et al., 2007)

Figura 6 - Transição de fase induzida por temperatura da PNIPAAm (DIMITROV et al., 2007)

A transição de fases da PNIPAAm se deve ao balanço entre os grupos hidrofóbicos e

hidrofílicos presente nas cadeias poliméricas, assim sendo, estruturas e propriedades podem ser

alterados, bastando somente modificar a quantidade destes grupos na cadeia principal do

hidrogel (QIU & PARK, 2001; ALMEIDA, 2010). A PNIPAAm gelifica em temperaturas em

torno de 32 ºC, muito próximo à temperatura do organismo, graças a isso pode ser utilizada na

forma de injeções em temperaturas baixas (líquida), criando um gel quando implantado no

corpo humano (FEIL et al., 1993).

A PNIPAAm é alvo de diversas pesquisas, desde liberação de fármacos (CHILKOTI

et al, 2002) até aplicação em área de infarto do miocárdio (FUJIMOTO et al, 2009). As

principais desvantagens deste material são o fato de não haver biodegradabilidade,

biorreabsorção, ser altamente hidrofóbico e possuir baixíssimas propriedades mecânicas (WU

et al. 2010), desta forma a incorporação de outros monômeros como ácido acrílico (aumento de

hidrofilicidade), poli(ácido lático) (GUAN et al, 2008), poli(trimetileno carbonato)

(FUJIMOTO et al., 2009) podem ser alternativas para tornar os hidrogéis de PNIPAAm

degradáveis e otimizar suas propriedades químicas, térmicas e mecânicas.

40

6.1.2 PLDLA-co-TMC

Literaturas recentes reportam a necessidade de se utilizar polímeros do tipo

elastoméricos biorreabsorvíveis, voltados para aplicação na área médica, como implantes ou

como arcabouços porosos empregados na engenharia tecidual (PÊGO, 2003) (STOCK, 2001;

WANG, 2002).

É válido informar que a eficiência na preparação de implantes biomédicos empregando

TMC já foi previamente confirmada por estudos (WATANABE, 2008), validando assim sua

escolha para fazer parte da cadeia do copolímero PLDLA.

A presença simultânea, na cadeia polimérica, de segmentos de L lactide, D,L lactide e

TMC são novos na literatura, atualmente o que existe são cadeias poliméricas formadas por L-

lactide/ TMC ou DL lactide/ TMC. A principal diferença do terpolímero proposto neste projeto

para os copolímeros mencionados anteriormente é que, para o terpolímero o efeito que a

incorporação das unidades de TMC terá numa cadeia polimérica já contendo em sua

composição tanto o L-lactide quanto o D,L lactide, ou seja, que já tem sanado alguns problemas

como alta cristalinidade e longo tempo de degradação (situação corrente quando somente o L-

lactide faz parte da cadeia polimérica) poderá ser muito mais expressivo, em termos de

melhorias nas propriedades mecânicas e de biorreabsorção.

7. EPIDEMIOLOGIA DO INFARTO DO MIOCÁRDIO

Doenças cardiovasculares, dentre elas o infarto do miocárdio (IM) são as principais causas

de mortalidade global. Em 2008, dados da Organização Mudial da Saúde estimam que 17,3 milhões

de pessoas morreram por doenças cardiovasculares. Destes óbitos, estima-se que 7,3 milhões foram

devido a doenças coronárias e 6,2 milhões a infartos (Organização Mundial da Saúde - OMS, 2011).

Já no Brasil, doenças cardiovasculares apresentam um aumento no número de óbitos inde são as

causas número 1 de fatalidade, responsáveis por 53,8 mortes para cada 100 mil habitantes no ano

de 2011, este fato se dá possivelmente ao envelhecimento da poupulação e à diminuição de doenças

infecto-parasitárias (Ministério da Saúde/SVS - DATASUS/IDB 2012; DUNCAN et al., 1992).

Dentro dos próximos anos, a tendência a prevalência de falhas cardíacas irá aumentar devido ao

envelhecimento populacional e a melhoria de sobrevivência e prevenção dos eventos coronarianos

(DICKSTEIN et al., 2008). Não obstante, as terapias atuais demandam uma grande quantidade de

recursos e isso foi mensurado num estudo realizado no Reino Unido em 2002, demonstrando que a

41

falha cardíaca foi responsável por 5% de todas as internações hospitalares no país, consumindo

cerca de 2% do orçamento do serviço nacional de saúde (STEWART et al., 2002). Dessa maneira,

o IM representa para o sistema de saúde uma das principais patologias dado o elevado custo

financeiro decorrente da abrangência dessa doença (FUSTER et al., 1992; GOLDBERG;

KONSTAM, 1999).

Dado o crescimento dos casos de IM acometendo cada vez mais as faixas etárias

produtivas, se tornam necessários investimentos em programas preventivos assim como o

acréscimo de novos estudos sobre o desenvolvimento e o tratamento das doenças cardiovasculares.

Atualmente a terapêutica da doença isquêmica cardíaca abrange a maior parte dos pacientes,

baseando-se na utilização de medicamentos e técnicas de revascularização cirúrgica ou por

angioplastia. Porém, pacientes crônicos não se beneficiam totalmente dessas técnicas (GREGG,

1985; TUNIS; BASS; STEINBERG, 1991), pois mesmo com os avançados tratamentos atuais que

incluem dispositivos externos de assistência ventricular (funcionando como uma paliativo para o

transplante cardíaco), o transplante cardíaco total (limitado pela escassez de doadores) (STOPPEL;

KAPLAN; BLACK, 2015), drogas paliativas e “stents”, não conseguem compensar a perda de

cardiomiócitos e/ou são restringidos por drogas imunossupressoras (GERBIN; MURRY, 2015; SHI

et al., 2011) .

Para esse grupo de pacientes, terapias alternativas como a utilização de terapia com

células-tronco para recuperação de cardiomiócitos perdidos durante um evento isquêmico, seria

uma alternativa à terapêutica atual (ASSMUS et al., 2002; CHEN et al., 2007).

7.1 FISIOPATOLOGIA DO INFARTO DO MIOCÁRDIO

O IM é considerado a patologia mais comum na doença arterial coronariana e a principal

causa de morte no âmbito das doenças cardiovasculares. O IM decorre da isquemia causada pela

interrupção do fluxo sanguíneo coronariano (JAFFE, 2013; MOHAN; NARULA, 2012), ou seja, a

interrupção do suprimento ou fluxo sanguíneo para o coração, que é feito através das artérias

coronárias, que por sua vez, são ramificações da artéria aorta. São duas as principais artérias

coronárias: a artéria coronária direita e a artéria coronária esquerda que logo se bifurca em duas

grandes artérias, a artéria descendente anterior e artéria circunflexa (WHITAKER, 2014).

A causa de obstrução mais frequente ocorre devido a formação de um trombo – coagulação

do sangue no interior do vaso, ocorre pela agregação plaquetária – sanguíneo sobre uma placa

aterosclerótica no interior de uma das artérias coronárias. Quando ocorre o infarto espontâneo do

42

miocárdio relacionado a isquemia devido a um evento primário da coronária, este é chamado de

infarto do miocárdio tipo 1, e o infarto do miocárdio devido a isquemia secundária da

incompatibilidade entre a oferta e demanda de oxigênio é chamada de infarto do miocárdio tipo 2

(CADEMARTIRI et al., 2008; FRANCO et al., 2011).

A oclusão parcial ou total de uma artéria coronária caracteriza o infarto agudo do

miocárdio (IAM), quando os vasos principais são atingidos, ou crônico, quando a isquemia ocorre

em vasos periféricos. O aparecimento e a evolução da necrose isquêmica depende basicamente da

extensão e duração da isquemia, da intensidade de circulação colateral e do estado do miocárdio.

Alterações nas fibras cardíacas decorrentes de eventos isquêmicos podem ser reversíveis, desde que

ocorra a desobstrução rápida para recuperação do fluxo sanguíneo (entre 15 e 20 minutos em

humanos) (ANVERSA OLIVETTI, G., 2001).

A deficiência sanguínea para o coração traduz-se principalmente em um déficit de

nutrientes e oxigênio para as células cardíacas. Sob tais circunstâncias inicia-se uma resposta

inflamatória tornando os cardiomiócitos (CMs) necróticos ou fazendo com que eles entrem em

apoptose e aproximadamente 1 bilhão de cardiomiócitos morrem como resultado (BUJA;

ENTMAN, 1998; GEPSTEIN, 2002; HAUNSTETTER; IZUMO, 1998; LAFLAMME; MURRY,

2011).

Os CMs são células musculares estriadas com batimento espontâneo e morfologia de

bastonete cilíndrico. Os CMs são interconectados via discos intercalares, que se constituem de

junções comunicantes, para manter a integridade eletromecânica do coração e são altamente

dependentes de metabolismo aeróbico (LI et al., 2014a).

Após a incidencia do infarto, ocorre a liberação de uma série de proteínas que podem ser

usadas para detecção da condição do IM. A principal função dos leucócitos é a liberação de fatores,

como as interleucinas e anticorpos, e de recrutamento de células efetoras. A reparação se inicia com

a invasão de miofibroblastos e capilares, levando a formação de tecido fibroso, não contrátil, e rico

em colágeno e consequentemente perda maciça de cardiomiócitos. Após a formação da cicatriz, a

área infartada não mais participa do desempenho cardíaco, contribuindo de maneira negativa para

a função cardiovascular (ERIKSSON, 1995; FRASER et al., 2004).

O coração que sobrevive a um infarto agudo do miocárdio irá experimentar uma série de

mudanças chamado remodelamento cardíaco e essas mudanças podem levar a falha cardíaca,

exemplificado na Figura 7, adaptada de PASCUAL-GIL (2015) e MELO (2015). Apesar dos

consideráveis avanços no diagnostico e tratamento de doenças do coração, a disfunção cárdica após

o IM ainda é a maior preocupação da desordem cardiovascular, e recentes métodos para tratamento

de dano severo ao coração tem se limitado a medidas paliativas ou ao transplante cardíaco (MIN et

43

al., 2002; STEVENSON, 1994; YAĞDI; NALBANTGIL; ÖZBARAN, 2015). No entanto,

pesquisas vêm sendo realizadas para que se consiga reparar o tecido cardíaco. Alguns estudos

incluem o recrutamento de células-tronco adultas ao tecido danificado (TAKANO et al., 2006). Um

estudo realizado por Goldman e colaboradores, mostrou que a proliferação de cardiomiócitos

derivados de células-tronco circulantes pode contribuir para o aumento da massa muscular a área

infartada em humanos (GOLDMAN; WURZEL, 2001). Portanto, encontrar novas abordagens para

melhorar a disfunção cardíaca após IM permanece um grande desafio terapêutico.

Figura 7 – Representação da evolução do IM. Depois da oclusão da artéria coronária, o coração perde sua

função gradualmente e passa por um remodelamento negativo, culminando com a total falha cardíaca.

Adaptado de Pascual-gil et al., 2015 e Melo, 2015.

A terapia celular é considerada um dos mais efetivos tratamentos para o tecido

cardíaco danificado. O transplante direto de células em suspensão já vem sendo pesquisado

desde o começo da década de 1990 (EGASHIRA; FUKUDA, 2010; PERL et al., 2010). Em

2001, dois grupos de pesquisadores, Jackson e Orlic, demonstraram que injeções

intramiocárdicas de células-tronco da medula óssea podiam melhorar a função cardíaca

(JACKSON et al., 2001; ORLIC et al., 2001).

44

Recentes progressos na biologia das células-tronco, na medicina regenerativa e

engenharia de tecidos despertaram o interesse no uso destas para o reparo do miocárdio lesado

(FUJITA, 2004; LI et al., 2014b; ZHANG; KOHN, 2012).

7.2 CÉLULAS-TRONCO

Uma célula-tronco é definida como uma célula capaz de auto-renovar-se

indefinidamente e de dar origem a qualquer tipo celular, como ossos, nervos, musculo e sangue.

As células-tronco se dividem com baixa frequência, com exceção em casos de lesão tecidual

ou para manter a população de células do microambiente (auto-renovação). Nesses casos, a

célula-tronco, origina duas células-filhas que podem se diferenciar ou não (LASLETT;

FILIPCZYK; PERA, 2003; ZHANG; MIGNONE; MACLELLAN, 2015).

As ESCs são células derivadas da massa interna do blastocisto, podem se proliferar

indefinidamente no seu estado de indiferenciação e são capazes de se diferenciar em qualquer

célula adulta do organismo (LASLETT; FILIPCZYK; PERA, 2003), por isso elas são

consideradas células-tronco pluripotentes (NICHOLS; SMITH, 2009).

As células-tronco adultas são células indiferenciadas que se encontram entre as células

diferenciadas de tecidos ou órgãos. Estas células-tronco adultas podem se auto-renovar e

diferenciar em tipos celulares específicos ao seu tecido de origem, por isso elas são

consideradas células-tronco multipotentes ou unipotentes, mais comunmente derivadas de

células progenitoras. A função principal das células-tronco adulta é manter e reparar o tecido

no qual elas residem. As células-tronco adultas não são abundantes, porem, podem ser

encontradas em vários tecidos do organismo adulto (PROCHAZKOVA et al., 2015).

Desde a publicação, por Thomson e colaboradores em 1998, sobre o primeiro sucesso

em isolar e cultivar linhagens imortais de células-tronco a partir de embriões humanos

(THOMSON et al., 1998), se desencadeou uma discussão ética e social sobre o uso destas

células-tronco embrionárias humanas. Entretanto, com o surgimento dessas linhagens de

células-tronco também veio a promessa terapêutica de pluripotencialidade e aplicações na

medicina regenerativa (RUBIN, 2008). Essa promessa atraiu extrema atenção, recursos e

investimentos financeiros, mas com ela, problemas éticos e sociais.

Apesar do assunto de como e se estas células devem ser usadas e regulamentadas

permanecerem como uma questão politica e bioética importante, a questão em si não permaneceu

45

estável, ela vem sendo ampla e constantemente debatida na sociedade. Os debates sobre o uso destas

células vem evoluindo e foram reclassificados como um problema social, ético, técnico, religioso,

institucional, politico e econômico, que interagem e constantemente impactam um sobre os outro.

Tanto que atualmente alguns países liberaram e até mesmo financiam a pesquisa com célulatronco

embrionária humana (STEPHENS, 2015).

A engenharia tecidual, pode, algum dia, gerar os chamados órgãos “off-the-shelf”, ou seja,

órgão construídos artificialmente para uso em transplantes. Porém, um dos maiores obstáculos para

se alcançar esse enorme potencial é a falta de uma fonte de células renováveis. As células tronco

embrionárias (ESCs) apresentam o potencial para servir como fonte de células devido a sua

habilidade de se diferenciar em qualquer célula somática e a capacidade de proliferação ilimitada

(KHADEMHOSSEINI et al., 2007).

O objetivo de maior desafio no campo da terapia de tecidos cardiovasculares é a criação

de músculo cardíaco. Hoje, diferente de válvulas cardíacas ou vasos sanguíneos, o músculo cardíaco

não possui alternativas para substituição além do transplante (LEOR; AMSALEM; COHEN, 2005).

Terapias atuais para recuperação cardíaca pós IM são limitadas.

Recentemente, o campo da regeneração cardíaca surge a partir de uma ideia pouco

provável para a vanguarda da pesquisa cardíaca. A regeneração cardíaca é um campo

interdisciplinar com o objetivo de restaurar a função do miocárdio após infarto (GERBIN; MURRY,

2015). Sendo assim, o transplante de células exógenas visa reparar o tecido danificado do miocárdio

tanto com a reposição de células que agem por efeitos mediadores parácrinos, como por fornecer

novos cardiomiócitos que contribuem diretamente ao miocárdio. Vários estudos clínicos tem sido

desenvolvido com esse objetivo, utilizando diferentes linhagens de células, tais como, mioblastos

esqueléticos, células-tronco hematopoiéticas provindas da medula óssea, células-tronco

mesenquimais, células-tronco adiposas, células progenitoras endoteliais e células derivadas

cardíacas (BEHFAR et al., 2014; HANSSON; LENDAHL, 2013; MALLIARAS; MARBÁN, 2011;

SCHULMAN; HARE, 2012).

Até o momento não está claro se existe a célula-tronco ideal, contudo, o que se tem

atualmente é que alguns tipos celulares são mais promissores que outros. Por isso, embora vários

investigadores tenham descrito células-tronco/progenitoras com suposto potencial

cardiomiogênico, foi confirmado através de acoplamento funcional direto que a regeneração

cardíaca é limitada a alguns tipos celulares (RUBART; FIELD, 2006a, 2006b). Dentre esses tipos

celulares, as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e as células-tronco embrionárias

(ESCs), representam a melhor opção como fonte celular viável adequada para regeneração tecidual

cardíaca por enxerto de células (BOHELER, 2010; BOHELER et al., 2011).

46

Os cardiomiócitos, assim como outros tipos celulares, têm um limite de vida. Sabe-se que

existem cardiomiócitos de diferentes idades, como células jovens que mantêm a capacidade de

replicação, embora seja em número reduzido (15-20%), e células mais velhas, mais predispostas a

morte (KAJSTURA et al., 2000; TORELLA et al., 2004). Assim, os cardiomiócitos respondem de

maneira diferente a estímulos patológicos, os mais velhos tendem a hipertrofia enquanto que os

mais jovens podem replicar-se para recompor a área afetada durante um evento isquêmico. As

células-tronco cardíacas expressam IGF-1 (insulin grow fator – fator de crescimento semelhante à

insulina tipo 1) que induz a divisão celular, atrasa a senescência e preserva a funcionalidade das

células, consequentemente aumentando a sobrevida dos cardiomiócitos após o infarto evitando a

apoptose (MCDEVITT; LAFLAMME; MURRY, 2005; TORELLA et al., 2004).

Contudo, está claro que o coração adulto perde a capacidade de regeneração

gradativamente, prejudicando gravemente o desempenho cardíaco, podendo levar o indivíduo a

óbito. Por isso, acidentes cardiovasculares que ocorrem com indivíduos em idade avançada,

resultam em danos graves onde o remodelamento é inevitável.

A multiplicação celular de cardiomiócitos funcionais e saudáveis, a formação neovascular,

o controle da apoptose e fibrose e a modulação da resposta inflamatória seriam potencialmente

benéficos na terapia com células-tronco em cardiologia. A integração funcional, elétrica e mecânica

na arquitetura do órgão deve resultar numa melhora da função do miocárdio danificado

(ZIMMERMANN; MELNYCHENKO; ESCHENHAGEN, 2004).

As ESCs são uma fonte potencial de cardiomiócitos para enxerto. Estas células possuem

a habilidade de se diferenciarem em células das três camadas germinativas, e diferente das células

adultas diferenciadas, estas células pluripotentes podem se auto-renovar (EVANS; KAUFMAN,

1981; MARTIN, 1981; TAKAHASHI et al., 1995). Sendo assim, as células-tronco oferecem a

possibilidade de reparo, não somente ao miocárdio mas a outros órgãos danificados e há um intenso

esforço para desenvolver estratégias baseadas em células-tronco para o reparo cardíaco

(LAFLAMME et al., 2007).

Os primeiros estudos demonstrando potencial terapêutico para a terapia celular em doença

cardiovascular empregavam injeção direta de células-tronco da medula óssea diretamente no

ventrículo esquerdo após crio-injúria (lesão por resfriamento). Apesar de tratar as células-tronco

com 5-azacitidina como agente de desmetilação do DNA para propelir as células ao longo da via

dos cardiomiócitos e de ser um modelo de lesão não fisiológica, mesmo em uma população

heterogênea de células-tronco, é possível induzir melhoria cardíaca limitada. Desde então, os

pesquisadores têm dirigido seu foco para populações mais homogêneas e bem definidas de células

47

progenitoras para melhor compreender os mecanismos de ação e de otimização da recuperação

cardíaca (GOJO et al., 2003; SANGANALMATH; BOLLI, 2013; TOMITA et al., 1999).

Uma fonte de células seria o próprio paciente, podendo ser coletado células-tronco

autólogas. No entanto, a terapia com células-tronco autólogas traz uma série de desvantagens.

Primeiro, a fonte de células é um paciente doente. Esse paciente pode apresentar-se instável demais

para extração das células e um número maior de células comprometidas em decorrência da idade

avançada. Segundo, as etapas de imunosseleção restringem o número de células disponíveis para o

uso imediato (WERNER et al., 2005).

Pesquisas nessa área focam, em sua maioria, em ciência básica, no entanto, várias

linhagens de ESCs humanas já foram estabelecidas e estão disponíveis à comunidade científica

(KORSGREN; NILSSON, 2009). Estudos iniciais com células-tronco embrionárias humanas

(hESCs) nos quais elas derivam cardiomiócitos, tem mostrado capacidade de formar um novo

miocárdio em corações não danificados (CHONG et al., 2014; KEHAT et al., 2004; LAFLAMME

et al., 2005).

As ESCs pluripotentes surgem como uma nova alternativa, porém, até o momento seu uso

potencial em humanos tem sido dificultado por motivos de segurança pela possível formação de

teratomas in vivo, quando células não diferenciadas são implantadas (POULY et al., 2008). Uma

forma de contornar esse problema seria o uso de células progenitoras cardíacas, derivadas das ESCs,

que mantêm sua capacidade de divisão enquanto se diferenciam (BLIN et al., 2010). Vários grupos

de pesquisa usaram células-tronco embrionárias humanas pré-diferenciadas em corações infartados

de ratos, sendo que, as células enxertadas resultaram na formação de novos cardiomiócitos sem que

ocorresse a formação de teratomas (CASPI et al., 2007; LAFLAMME et al., 2007; VAN LAAKE

et al., 2008).

Sendo assim, uma das alternativas é a criação de materiais capazes de suportar o

crescimento de células ESC, bem como manter o ambiente viável para a diferenciação celular em

cardiomiócitos, neste caso, um hidrogel com propriedades suficientes para este crescimento e

diferenciação.

48

8. MATERIAIS E MÉTODOS

Este capítulo irá abordar a metodologia utilizada na síntese e caracterização

macroscópica, química, física, reológica e biológica in vitro e in vivo dos hidrogéis sintetizados.

A Figura 8 mostra um organograma resumido para melhor esclarecimento das etapas

realizadas.

Figura 8 - Organograma da metodologia empregada na síntese e caracterização dos hidrogéis.

8.1 MATERIAIS

Os materiais utilizados para a síntese do macrômero foram os monômeros de L-lactide

(Purac), D,L-lactide (Purac), o trimetileno carbonato (TMC) (Boehringer Ingelheim), o 2-

etilexanoato de estanho (SnOct2) (Aldrich), o 2-hidróxietil metacrilato (HEMA – 99+%)

(Aldrich). O macrômero foi purificado na presença dos reagentes tetrahidrofurano (THF –

99,9%) (Aldrich), Acetato de Etila – 99,8% (Aldrich) e Sulfato de Magnésio seco (Dinâmica).

Para a síntese dos hidrogéis foram utilizados o monômeros de poli(N-

isopropilacrilamida) (PNIPAAm) – 97% (Aldrich), Ácido Acrílico (AAc) (Aldrich) catalisados

com peróxido de benzoíla (BPO – 75%) (Aldrich), sendo purificado com os reagentes 1,4

Síntese dos macrômeros de HEMAPLDLA-co-TMC

Síntese dos hidrogéis de poli(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPLDLA-co-TMC com 5, 10 e 15% de macrômero e 2, 4 e 6% de ácido

acrílico

Avaliação Macroscópica;

Grau de Intumescimento;

RMN ¹H e ¹³C;

FTIR do Macrômero e dos Hidrogéis;

DSC;

Comportamento LCST;

Análise reológica;

Degradação dos Hidrogéis;

Diferenciação celular;

qPCR;

Imunofluorescência;

Ensaios In vivo;

49

dioxano (99,8%) (Aldrich), Hexano (95%) (Aldrich), tetrahidrofurano (THF – 99,9%) (Aldrich)

e di-etil éter (99,7%) (Aldrich).

8.2 SÍNTESE DO MACRÔMERO HEMA-POLI(L-CO-D,L ÁCIDO LÁTICO –CO–

TRIMETILENO CARBONATO) (HEMAPLDLA-CO-TMC)

O macrômero foi sintetizado via polimerização por abertura de anel do L-lactide, D,L

lactide e TMC na presença de 2-etilexanoato de estanho como catalisador (WU et al, 2010) de

acordo com a (Figura 9). Quantidades estequiométricas dos monômeros e HEMA (razão molar

2:1) foram misturadas em um balão de três bocas com passagem de nitrogênio. A quantidade

de catalisador utilizada foi de 1% em mol relacionado à quantidade de HEMA. A reação foi

conduzida por 1 hora e meia à 130 ºC, baseados em estudos prévios do autor. O macrômero

resultante foi dissolvido em THF e precipitado em água gelada na relação 1:10. O precipitado

foi liofilizado até total remoção da água residual, dissolvido em acetato de etila e seco à

temperatura ambiente na presença de sulfato de magnésio em dessecador à temperatura

ambiente overnight. A síntese do macrômero apresentou rendimento de 65% em massa dos

reagentes inicialmente adicionados.

8.3 SÍNTESE DO POLI(NIPAAM-CO-AAC-CO-HEMAPLDLA-CO-TMC)

Os copolímeros foram sintetizados via polimerização por radical livre, utilizando

peróxido de benzoíla como catalisador, conforme representação esquemática (Figura 8). A

copolimerização foi conduzida em balão de três bocas com passagem de nitrogênio.

Quantidades estequiométricas dos monômeros NIPAAm, AAc (ácido acrílico) e

HEMAPLDLA-co-TMC foram dissolvidos em 1,4-dioxano até formar uma solução de 10% em

massa de monômeros. O peróxido de benzoíla em quantidade de 1 mol/mol de monômero

também dissolvido em 1,4-dioxano foi adicionado ao balão, a reação foi conduzida em

atmosfera de nitrogênio à 70 ºC por 24 horas (FUJIMOTO et al., 2009). A solução polimérica

foi então resfriada a temperatura ambiente, precipitada em hexano e o material resultante foi

dissolvido em THF e precipitado em di-etil éter. Em seguida o polímero foi seco à vácuo em

temperatura ambiente por 24 horas.

A quantidade de macrômero utilizada foi variada em 10, 15 e 20% em massa, já o

ácido acrílico foi adicionado em quantidade de 2, 4 e 6% verificando-se qual porcentagem

confere melhor balanço de propriedades ao hidrogel.

50

Figura 9 - Representação esquemática para o HEMAPLDLA-co-TMC e o copolímero poli(NIPAAm-co-

AAc-co-HEMAPLDLA-co-TMC)

8.4 GRAU DE INTUMESCIMENTO

Soluções de hidrogel em PBS com 12% (m/v) foram colocados em banho termo

estabilizado à 37ºC durante 24 horas, os géis foram então retirados e secos com papel toalha a

fim de retirar o excesso de água da superfície. O conteúdo de água dentro dos hidrogéis foi

obtido pela diferença entre os hidrogéis molhados (P2) e os hidrogéis secos (P1) conforme a

equação:

Grau de intumescimento (%) = 100 x (P2 – P1)/P1

Ao menos quatro amostras de cada tipo de hidrogel foram intumescidas e pesadas

(KLOUDA et al., 2011; LI et al., 2009; WANG et al., 2010)

51

8.5 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 1H E 13C (RMN)

Os espectros de RMN para o macrômero e para os copolímeros foram obtidos em um

espectrofotômetro GEMINI 300BB operando a 75 MHz para RMN 13C e 300 MHz para RMN

1H. Foram utilizados tubos de vidro 5mm de diâmetro e clorofórmio deuterado (CDCl3) como

solvente. As analises foram realizadas com os hidrogéis liofilizados nos espectofotômetros do

Instituto de Química – IQ/UNICAMP.


TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR)

A técnica de infravermelho com transformada de Fourier é utilizada na caracterização

de hidrogéis, para caracterizar a presença de grupos específicos no material (MANSUR et al.,

2008). O macrômero foi sintetizado e avaliado após a síntese, já os hidrogéis contendo 10%,

15% e 20% (massa de macrômero) e 2%, 4% e 6% de ácido acrílico já polimerizados e

intumescidos em solução (12% m/v) tiveram as medições de transmitância realizadas através

do equipamento Spectrum 65 (Perkin Elmer) no Laboratório de Biomateriais da PUC-SP. Os

espectros de absorção foram analisados na faixa de 4000 a 400 cmˉ¹ (TAN et al., 2009).

8.7 CALORIMETRIA DIFERENCIAL DE VARREDURA (DSC)

As análises de DSC foram realizadas em um equipamento modelo 2920 da TA

Instruments. Amostras pesando aproximadamente 7-10 mg foram seladas em porta amostras de

alumínio e aquecidas de 25°C a 200 °C a uma taxa de aquecimento de 10°C.min-1 (primeiro

aquecimento), e mantidas a esta temperatura por 5 min. Subsequentemente foram resfriadas a -

100°C a uma taxa de 10°C.min-1 e mantidas nessa temperatura por 5 min. Após, foram

aquecidas novamente até 200°C a uma taxa de 10°C.min-1 sob atmosfera de nitrogênio.

Para a análise de LCST a técnica de DSC também foi utilizada, porém, utilizada uma

solução de 12% w/v de copolímero com taxa de aquecimento de 5 ºC.min-1 num range de 0 –

60 ºC. A temperatura do máximo pico endotérmico pode ser considerada como o comportament

LCST, temperature nas quais ocorre a gelificação da PNIPAAm (FEIL et al, 1993).

52

8.8 ENSAIOS REOLÓGICOS

As análises reológicas foram obtidas com parceria da empresa TA Instruments, que

gentilmente nos cedeu horas para o uso de seu reômetro DHR-3, com placas paralelas no modo

oscilatório para verificarmos a influência das composições do copolímeros no que diz respeito

à sua propriedade de módulo de perda (G”), viscosidade (η) e temperatura de gelificação dos

materiais. As análises foram efetuadas no modo de varredura de temperatura iniciando em 15ºC,

nesta temperatura o material ainda apresentava comportamento de líquido viscoso, até 50ºC

onde o material já se encontrava completamente gelificado com formação do gel.

8.9 DEGRADAÇÃO DOS HIDROGÉIS

As amostras dos hidrogéis foram submetidas ao ensaio de degradação in vitro.

O ensaio foi conduzido de modo que as soluções (12% wt) de hidrogel em solução

tampão de fosfato (PBS – pH 7.4) foram colocadas em banho termo estabilizado à 37 ºC para

solidificar e formar o gel, e foram assim mantidos por 24 horas, a água remanescente foi retirada

e a degradação continuou a ser conduzida nas condições anteriores, as amostras permaneceram

no banho termo estabilizado durante 20 semanas, sendo retiradas e pesadas semanalmente, as

amoastras foram posteriormente lavadas com água destilada quente (50 ºC) por três vezes e

secas em estufa a vácuo sob temperatura de 60 ºC durante dois dias, sendo pesadas em seguida

(p2). A perda de massa (%) foi calculada pela fórmula:

Perda de massa (%) = 100 x p2/p1

Onde p1 é a massa da amostra antes da degradação (WANG et al, 2010).

DIFERENCIAÇÃO

8.10 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE QUANTITATIVA (QPCR)

O RNA total foi extraído nos dias 0, 2, 4, 6 e 9 de um mínimo de 1x105 células

utilizando-se o RNeasy Kit (QIAGEN). Foi utilizado 1 µg do RNA total de cada amostra para

transcrição reversa (TR) utilizando o QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN). O

qPCR foi realizado utilizando-se o Mastercycler Realplex e analisado com o Realplex software

(Eppendorf). Para a detecção em tempo real da expressão do mRNA, a quadragésima parte da

reação de TR foi utilizada como padrão para a análise de amplificação do PCR utilizando o

53

Kapa SYBR Fast qPCR kit (Kapa Biosystems). Os pares de “primers” (Tabela 1) foram

selecionados do PrimerBank (WANG; SEED, 2003) ou gerados por Primer-Blast

(ALTSCHUL et al. 1990) e testados para eficiência equivalente. Cada reação foi realizada em

duplicata e a amplificação foi calculada usando o método comparative de Ct (limite mínimo de

expressão) (LIVAK; SCHIMITTGEN, 2001). Os valores resultantes foram normalizados para

beta-actina. Os níveis de expressão foram posteriormente normalizados aos níveis de expressão

do dia 0 da ESC (controle) e apresentados como porcentagem da maior expressão transcricional

para cada respective gene. As barras de erro representam o desvio padrão da media de expressão

de mRNA de quarto experimentos independentes.

Tabela 1 - Sequência de “primers” para o experimento de qPCR

8.11 IMUNOFLUORESCÊNCIA

No final da diferenciação das ESC de ratos em cardiomiócitos (dia 9), as células foram

fixadas para imunofluorescência em methanol -20ºC por 5 min, re-hidratadas e lavadas com

solução salina de sódio fosfato (PBS). As cadeias pesadas da miosina (MyHC) foram detectadas

incubando-se o anticorpo primário MF20 (Developmental Studies Hybridoma Bank) overnight

a 4ºC (BADER; MASAKI; FISCHMAN, 1982; GONZALEZ-SANCHEZ; BADER, 1990).

Após três lavagens com sPBS as amostras foram incubadas com Cy3-conjugado

(Jackosn Immuno Research Laboratories, USA) 1:100 em sPBS por 1 hora em temperature

ambiente. As lamínulas foram montadas em solução de montagem contendo 50 partes de sPBS,

50 partes de glycerol e 1 parte de corante Hoechst para detecção do núcleo.

54

A imunofluorescência indireta do MyHC foi visualizada utilizando-se o microscópio

de fluorescência invertido DMI6000B (Leica Microsystems GmbH, Alemanha) e capturadas

com a camera Hamamatsu Orca AG (Hamamatsu Photonics, Alemanha). As imagens foram

processadas com o software Velocity 4.3.2 (Perkin Elmer, Canadá).

As analises estatísticas dos experimentos foram efetuadas pelo teste t de Student. O

Grau de Significância foi considerado para valores de p≤0,05.

8.12 ENSAIOS IN VIVO

Este tópico apresenta os detalhes do procedimento cirúrgico e de análise dos hidrogéis

injetados in vivo. Os trabalhos foram efetuados dentro das diretrizes de boas práticas e ética no

uso de animais, registrados no comitê de ética: CEUA FCMS/PUC-SP 2015/39.

8.12.1 Animais

Foram utilizados 30 ratos Wistar de ambos os sexos, com idade aproximada de dois

meses e pesando entre 250 e 300 g. Os animais foram obtidos no Biotério da Faculdade de

Ciências Médicas e da Saúde da Pontifícia Universidade Católica de São Paulo

(FCMS/PUCSP). Eles permaneceram em gaiolas (41x36x16cm) contendo no máximo 5

animais, recebendo ração comercial e água ad libitum, mantidos em regime de claro-escuro

correspondente a 12 horas e temperatura controlada de cerca de 23 ºC ± 2 ºC. Os animais foram

anestesiados e o implante foi feito no dorso anterior dos animas via injetável e o controle foi

realizado com a retirada de tecido subcutâneo do dorso posterior dos mesmos animais. Após o

procedimento cirúrgico, os animais foram mantidos em gaiolas até que o efeito da anestesia

termine e todos apresentem adequada recuperação (DAMY et al., 2010).

Os ratos Wistar foram divididos em 5 grupos de 6 animais quanto ao tempo de

implante de 1, 3, 5, 7 e 14 dias.

8.12.2 Procedimento Cirúrgico

Para o procedimento cirúrgico, os animais foram pesados e submetidos à anestesia

geral administrada via intramuscular com uma solução de cloridrato de cetamina 10% (40

mg/kg) mais cloridrato de xilazina 2% (5 mg/kg) por peso corporal (DAMY et al., 2010). A fim

55

de se evitar complicações na administração do anestésico, os animais foram colocados em jejum

6 horas antes do procedimento cirúrgico. Esse tempo foi estipulado de acordo com o horário de

funcionamento e acesso ao biotério, bem como o horário previsto para a realização do

experimento.

Posteriormente, foi realizada tricotomia do dorso dos ratos Wistar, seguida pela

implantação via injetável de 3 mL do hidrogel de Poli(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPLDLA-

co-TMC) (12% m/v) divididos em grupos 4 animais nos tempos de implante de 1, 3, 5, 7, 14 e

21 dias, assim totalizando 30 animais.

Paralelamente, a recuperação dos animais foi monitorada diarimente durante uma

semana, na qual possíveis alterações clínicas e relacionadas ao local do implante, como

presença de edema e cicatrização em função do tempo de implantação, foram registradas para

posterior avaliação biológica do potencial de uso do material.

Após 1, 3, 5, 7, 14 e 21 dias de implante, os ratos foram sacrificados em sistema

fechado, por overdose de Halotano embebido em algodão (LEMOS, 2006).

8.12.3 Processamento Do Material Para Análise Histológica

As amostras retiradas das embalagens foram preparadas para análise histológica de

acordo com as técnicas utilizadas para Microscopia de Luz, utilizando-se parafina como meio

de inclusão. Assim, elas foram colocadas em uma sequência de três cubas, contendo etanol 80,

90 e 100%, onde permaneceram por 30 minutos em cada cuba. A seguir foram transferidas para

o Xilol I e II onde permanecerão por mais 30 minutos em cada solução. Os materiais foram

banhados em parafina (Histosec-Merck®) I e II pelo período de 30 minutos. Em seguida, os

fragmentos foram incluídos em formas com parafina. Depois de gelados e devidamente

identificados, os blocos foram colocados em micrótomo (Leica RM 2245®) devidamente

regulado, para efetuação de cortes de espessura de 3 m. As fitas obtidas foram introduzidas

no banho histológico e “pescadas” com uma lâmina de vidro. As lâminas, a seguir, foram

colocadas em estufa, à 60°C para retirada do excesso de parafina contida nos cortes

histológicos. Finalizando, as lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina (H.E.).

8.12.4 Preparação Das Lâminas E Coloração

Os cortes histológicos foram obtidos em micrótomo Leica® RM2245 com espessura

de 3 μm, prosseguindo-se com a técnica de coloração das lâminas por hematoxilina e eosina

(HE). As lâminas foram fotografadas em um microscópio óptico (NIKON® – E 800).

56

8.12.5 Análise Histológica Dos Implantes

A região de cada implante foi objeto de análise histológica, as regiões implantadas

foram divididas em seis seções seguindo o plano sagital e cobrindo o comprimento da região

implantada. Com o auxílio de um microscópio óptico (Nikon E800), foram realizadas

observações da reação tecidual ao redor do implante e da degradação do mesmo.

57

9. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Neste capítulo apresentamos os resultados e suas comprovações experimentais da

síntese do macrômero e dos hidrogéis injetáveis, termossensíveis e biodegradáveis, visando

aplicações na engenharia tecidual. As principais características deste material são: ser insolúvel

acima de uma determinada temperatura, ou seja, apresentar uma temperatura de solução crítica

inferior (LCST – Lower Critical Solution Temperature) e a capacidade de ser injetável e

modulável conforme diferenças nas sínteses propostas.

9.1 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA

A Figura 10 mostra as imagens macroscópicas dos hidrogéis, a fim de exemplificar a

transformação de fase presente nas amostras, com o intuito de exemplificar as características

macroscópicas a concentração de 10% m/m foi escolhida.

Através das imagens é possível verificar o comportamento LCST do material, como já

apresentado anteriormente a transição de fase dos polímeros com comportamento LCST pode

ser alterada sensivelmente devido ao balanço hidrofóbico/hidrofílico dos materiais que compõe

o polímero (QIU & PARK, 2001). Neste caso, percebe-se que o hidrogel obtido é um material

com o comportamento citado acima, pois, em baixas temperaturas (4ºC) encontra-se em solução

e próximo aos 37ºC tem sua transformação em gel, este comportamento foi melhor abordado

na seção 9.7.1 e 9.8.

A característica injetável do gel foi verificada com a injeção da solução 12% (m/v) a

4ºC em uma agulha de 26 gauge (Figura 10e), Verifica-se que o hidrogel flui pela agulha,

podendo ser considerado injetável. O critério utilizado para demonstrar que o hidrogel é

injetável se baseia na necessidade de injetar o material da maneira menos invasiva, com agulhas

de pequeno calibre (26 gauge) (FUJIMOTO et al., 2009; WANG et al., 2010).

58

Figura 10 - Propriedades de gelificação do hidrogel de Poli(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPLDLA-co-TMC)

10% m/m. (a) Solução a 4ºC; (b) Hidrogel após 10 s em banho termo estabilizado a 37ºC; (c) Hidrogel

formado após 15 minutos; (d) alongamento do hidrogel após 15 minutos

9.2 GRAU DE INTUMESCIMENTO

O grau de intumescimento dos hidrogéis, ou seja, a capacidade dos mesmos de

absorver água foi calculada conforme descrito de acordo com a equação (%) = 100 x (P2 –

P1)/P1, onde (%) é o grau de intumescimento, P1 e P2 são os pesos dos hidrogéis secos e

intumescidos respectivamente. As análises foram feitas utilizando-se 5 amostras de cada

síntese. A Tabela 2 sumariza os valores calculados para as composições dos hidrogéis.

59

Tabela 2 - Grau de intumescimento dos hidrogéis sintetizados

Composição Hidrogel Grau de Intumescimento (%) Desvio Padrão

88/10/2 93,33 0,0045

83/15/2 96,67 0,0167

78/20/2 171,67 0,0241

86/10/4 78,33 0,0702

81/15/4 93,33 0,0130

76/20/4 95,83 0,0394

84/10/6 36,67 0,0513

79/15/6 68,33 0,0192

74/20/6 76,67 0,0192

Verifica-se que o grau de intumescimento dos hidrogéis no primeiro momento varia

em função do aumento da quantidade de macrômero. Este efeito pode ser explicado

considerando as ramificações produzidas durante a copolimerização do macrômero no hidrogel,

as quais podem se enovelar no momento da transição sol-gel e esse enovelamento de segmentos

extremamente longos tende a aprisionar moléculas de água no interior do hidrogel. Quando as

ligações de hidrogênio (formando reticulações) são formadas no gel, a água que está no interior

do material é repelida, aumentando dessa forma a concentração de macrômero,

consequentemente aumentam-se as ramificações em número e tamanho. Sendo assim, ocorre

uma maior dificuldade na formação de ligações de hidrogênio e, consequentemente retém mais

água no interior do hidrogel fazendo com que o grau de intumescimento do material aumente.

Esse evento é corroborado se avaliarmos a quantidade de ácido acrílico nas

composições do hidrogel, percebe-se que com o aumento do ácido acrílico temos uma maior

hidrofilicidade no material, avaliando este efeito podemos criar a hipótese de que quando temos

maiores quantidades de ácido acrílico na cadeia principal da macromolécula, temos maiores

formações de ligações de hidrogênio entre as cadeias de N-isopropil acrilamida não tendo a

formação de volumes livres e ramificações no hidrogel, gerando esse efeito hidrofílico. Assim

sendo os dois efeitos: quantidade de macrômero – quanto maior a quantidade maior absorção

de água, e quantidade de ácido acrílico – quanto menor a quantidade maior absorção de água,

são extremamente relevantes para se avaliar a quantidade de solução absorvida pelo hidrogel.

60

9.3 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN DE 1H) DO MACRÔMERO

HEMAPLDLA-CO-TMC

Uma das principais análises na caracterização de um polímero é fornecida pela técnica

de RMN, pois é essa análise que irá auxiliar no entendimento das unidades formadoras da cadeia

do material, confirmando o êxito da síntese quanto à obtenção do polímero de interesse.

O esquema apresentado a seguir (Figura 11), refere-se a obtenção do macrômero

HEMAPLDLA-co-TMC, o qual identifica os fragmentos de HEMA (fragmento I) e de PLDLA-

co-TMC (fragmento II), portanto a análise apresentada a seguir foi efetuada analisando-se cada

fragmento individualmente.

Figura 11 – Esquema da estrutura do macrômero composto de HEMAPLDLA-co-TMC

A Figura 12 mostra o espectro de RMN de H1 para o macrômero obtido na 1º etapa de

síntese e será analisado por fragmentos (numerados como I e II, Figuras 13 e 15,

respectivamente).

Figura 12 - Espectro de RMN de 1H para o macrômero obtido na literatura

61

O fragmento I do macrômero está representado a seguir:

Figura 13 – Estrutura química do fragmento I do macrômero

De acordo com Lim et al (2000) e Atazeven (2006), os sinais que caracterizam a parte

da estrutura referente ao HEMA são: 1,9 ppm (-CH3) ; 4,2-4,4 ppm (O-CH2); 5,6-6,2

ppm (CH2=C). A Figura 14 mostra uma comparação entre espectro obtido para o macrômero

sintetizado neste trabalho (HEMA-PLDLA-TMC) (A) e o espectro de um macrômero da

literatura constituído por HEMA-PLDLA (B) (LIM et al, 2000).

Figura 14 - Comparação entre o espectro do macrômero (sintetizado no trabalho) (A) e do macrômero

(HEMA-PLDLA) (B)

A

B

62

É interessante para efeito de constatação da incorporação das unidades de HEMA na

cadeia polimérica do macrômero que sejam comparados os RMN de 1H do PLDLA-TMC com

o RMN 1H do HEMAPLDLA-TMC, o que será feito quando da análise do Fragmento II do

macrômero (Figura 15).

Figura 15 – Estrutura química do fragmento II do macrômero

Os sinais encontrados no RMN de 1H para uma parte do macrômero são praticamente

os mesmos encontrados para o copolímero poli (L-co-D,L-ácido láctico), diferindo apenas em

dois deslocamentos que são característicos da presença do TMC, os quais de acordo com a

literatura (POSPIECH, 2005) devem ser verificados em 2,05 ppm (CH2 – TMC) e 4,24 ppm

(OCH2 – TMC). Para efeito de comparação serão mostrados tanto o espectro do copolímero

PLDLA como o do terpolímero PLDLA-TMC (Figura 16). No espectro do copolímero, o

multípleto em 5,12-5,24 ppm é atribuído aos prótons CH (b), enquanto o quarteto em 1,55-1,59

ppm é atribuído aos prótons CH3 (a).

No caso do segmento PLDLA-TMC, o tripleto em 2,05 ppm é atribuído aos prótons

CH2 (c), enquanto o tripleto em 4,24 é atribuído ao OCH2 (d).

63

Figura 16 - Comparação entre o espectro de RMN de 1H “H” referente ao copolímero PLDLA (Motta,

2007) e o espectro “I” referente à síntese do terpolímero PLDLA-TMC, com as regiões ampliadas que são

características dos prótons do TMC.

É importante esta “construção” passo a passo da cadeia polimérica, para poder

entender os sinais encontrados no RMN. A região do espectro que evidencia a presença do

TMC na cadeia são duas: em 2,05 ppm ( CH2- TMC) e 4,24 ppm (OCH2-TMC), os quais

devem ser verificados no fragmento II do macrômero. A Figura 17 compara o espectro do

PLDLA-TMC com o do monômero do trabalho em questão (HEMA-PLDLA-TMC).

a

b

H

b

c

d

a

I

64

Figura 17 - Comparação entre o espectro de RMN 1H J referente ao copolímero PLDLA-TMC e o

espectro K referente à síntese do macrômero HEMAPLDLA-co-TMC.

9.4 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN DE 13C) DO HIDROGEL

POLI(NIPAAM-CO-AAC-CO-HEMAPLDLA-CO-TMC)

Após a copolimerização para obtenção do hidrogel foram realizadas as análises de

RMN de 13C para comprovar a inserção do segmento de N-isopropilacrilamida e ácido acrílico

ao macrômero HEMAPLDLA-co-TMC.

A Figura 18 refere-se à estrutura do hidrogel obtido, sendo que a parte em destaque

diz respeito ao segmento N-isopropilacrilamida.

J

K

65

Figura 18 - Representação estrutural do hidrogel sintetizado

Assim como executado na analise de RMN de 1H para o macrômerol, o fragmento que

nos interessa é aquele em destaque na Figura 10, o qual será comparado com os dados da

literatura. A Figura 19 traz uma comparação entre o macrômero e o hidrogel sintetizado.

Figura 19 - Comparação entre o espectro de RMN de 13C “e” referente ao macrômero HEMAPLDLA-co-

TMC e “f” referente ao espectro do hidrogel de poli(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPLDLA-co-TMC).

Pode-se verificar que alguns sinais deixam de existir quando no espectro do hidrogel,

como por exemplo, os sinais na região de 131 ppm e 126 ppm, que se referem respectivamente

aos carbonos a e b da do fragmento vinílico do NIPAAm, cuja estrutura esta representada na

66

Figura 20. Dessa forma, evidencia-se a polimerização desse fragmento na inserção do

macrômero HEMAPLDLA-co-TMC.

Figura 20 - Estrutura do monômero NIPAAm com os carbonos correspondentes a 131 ppm (a) e 126 ppm

(b).

Essa mesma situação foi relatada por Zhou et al (1994), como pode ser verificado pelos

espectros obtidos no trabalho destes autores (Figura 21).

Figura 21 - Espectro de RMN C13 do polímero PNIPAN “b” e “a” do monômero NIPAM onde se nota a

ausência dos picos situados em 131 e 126 ppm no polímero PNIPAM (ZHOU et al.,1994).

Assim sendo, diante desta análise, comprova-se que as estruturas poliméricas foram

obtidas tanto para o macrômero quanto para o hidrogel que era proposto.

Em seguida será realizada uma comparação entre os espectros nas concentrações de

10, 15 e 20% de macromero, para 2, 4 e 6% de ácido acrílico.

67

9.4.2 Comparativo entre as Sínteses com Diferentes Quantidades de Ácido Acrílico

A Figura 22 mostra os espectros juntos onde foram utilizados 2% de acido acrílico nas

diferentes composições do macrômero (10, 15 e 20%) para verificar se houve alguma diferença

entre as composições. Percebe-se que independente da quantidade de macrômero empregada,

na situação de 2 % de acido acrílico, não nota-se a presença de sinais na região de 131 ppm e

126 ppm, que se referem a fragmentos vinílico do NIPAAm (ZHOU et al, 1994), demonstrando

que a ligação foi dupla entre os carbonos foi quebrada na polimerização. Os demais sinais que

o espectro apresenta já foram caracterizados anteriormente, e não trazem alteração com as

mudanças nas concentrações de macromero, como já mencionado.

88/10/2

83/15/2

68

Figura 22 – Comparação entre os espectros de RMN de 13C com 2% de ácido acrílico.

Este mesmo tipo de analise foi feita com 4% e 6% de acido acrílico, nas três

composições de macromero, e estão demonstradas na Figura 23 e Figura 24, respectivamente.

78/20/2

69


86/10/4

86/10/4

76/20/4

70


84/10/6

79/15/6

74/20/6

71

Percebe-se que em todas as situações apresentadas as únicas diferenças apresentadas

são na intensidade dos picos, na próxima seção será detalhado a influencia das intensidades,

mas é importante ressaltar que com as análises de RMN consegue-se verificar a

copolimerização correta de todos os monômeros empregados na síntese do hidrogel.

9.5 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN DE 1H) DO HIDROGEL

POLI(NIPAAM-CO-AAC-CO-HEMAPLDLA-CO-TMC)

Este trabalho foi finalizado com as proporções de 2, 4 e 6% de ácido acrílico nas

composições com 10, 15 e 20% de macrômero.

Foi realizada uma comparação, com vista a influencia que a diferença na quantidade

de macrômero no hidrogel, para as determinadas concentrações de acido acrílico descrito acima.

E posteriormente será realizada uma comparação sobre a influência da diferença de ácido

acrílico entre os grupos.

Apesar de constar no relatório passado, o passo a passo da análise de RMN de 1H e

13C do hidrogel, é interessante que se repita neste relatório, para facilitar a compreensão. Após

a copolimerização para obtenção do hidrogel foram realizadas as análises de RMN de 1H e 13C,

onde a análise de carbono foi apresentada na seção 2.4, para comprovar a inserção do segmento

de N-isopropilacrilamida e ácido acrílico ao macrômero HEMAPLDLA-co-TMC.

A Figura 25 refere-se à estrutura do hidrogel obtido, sendo que a parte em destaque

diz respeito ao segmento N-isopropilacrilamida.

Figura 25 – Representação estrutural do hidrogel, em destaque segmento N-isopropilacrilamida

72

Segundo a literatura são esperados os seguintes sinais para o segmento n-

isopropilacrilamida: (CH3)-CH em 0.9 ppm; ( CH2)-CH em 1,4 ppm; (CH2)-CH em 1,9 ppm ;

(CH3)-CH em 3,8 ppm. (Gonzalez, 2008).

A Figura 26 ilustra os espectros do segmento Poli (N-isopropilacrilamida) da literatura

(a) e o espectro do hidrogel sintetizado no trabalho em questão (b).

Figura 26 - Comparação entre o espectro “a” referente ao PNIPAAM (GONZALEZ, 2008) e ao espectro

“b” referente ao poli(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPLDLA-co-TMC).

Assim como relatado por GONZALEZ (2008), não se observou no hidrogel sinais de

deslocamento para os 1H correspondentes a duplas (5,5 a 6,4 ppm) as quais estão presentes nos

monômeros NIPAAm e AAc, o que comprova a polimerização desses segmentos. As estruturas

(Figura 27) desses monômeros (NIPAAm e AAc) estão representadas a seguir para visualização

das duplas ligações mencionadas anteriormente.

73

Figura 27 - Representação das estruturas dos monômeros NIPAAm e AAC.

Por fim, o espectro da Figura 28, traz uma comparação entre o espectro (a) referente

ao macrômero HEMAPLDLA-co-TMC e (b) referente ao espectro do hidrogel de

poli(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPLDLA-co-TMC), completando assim a analise do hidrogel

sintetizado quanto ao RMN de prótons.

74

Figura 28 - Comparação entre o espectro “a” referente ao macrômero HEMAPLDLA-co-TMC e “b”

referente ao espectro do hidrogel de poli(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPLDLA-co-TMC).

9.5.1 Comparativo Entre as Sínteses do Grupo Com 2% De Ácido Acrílico

A seguir serão apresentadas as analises dos espectros de RMN de 1H para 2 % de acido

acrílico, nas diferentes porcentagens de macrômero (10, 15 e 20%), assim sendo a Figura 29

agrupa os espectros com 2% de ácido acrílico com 10, 15 e 20% de macrômero,

respectivamente.

75

Figura 29 - Comparação entre os espectros de RMN de 1H com 2% de ácido acrílico.

88/10/2

83/15/2

78/20/2

76

Analisando-se a Figura 29, que contém os espectros de hidrogel, com 10, 15 e 20% de

macrômero, é possível verificar somente variações nas intensidades dos picos, como esperado

para as sínteses em diferentes composições

É válido ressaltar que ao se fixar a quantidade de ácido acrílico e variar a quantidade

de macrômero, forçosamente a quantidade de NIPAAm varia em função dos 100% de

rendimento. Desta forma a Tabela 3 sumariza os picos que são característicos para os

componentes do hidrogel sintetizado.

Tabela 3 – Composições com 2% de ácido acrílico

Composição

Hidrogel

Deslocamento

Químico

Atribuição das

Ligações

Intensidade

88/10/2

7,28 N-H

666733

83/15/2 563885

78/20/2 648859

88/10/2

4,24 -O-C-H2

247709

83/15/2 395974

78/20/2 544921

88/10/2

3,98 CH3-CH

812533

83/15/2 796756

78/20/2 806332

Pela análise da Tabela 3, pode-se verificar uma diminuição da intensidade das ligações

N-H (7,28 ppm) (Lin, 2013) quando se aumenta a concentração de macrômero (10 para 20%),

consequência indireta da redução da concentração de NIPAAm (86-76%), estrutura que possui

esse tipo de ligação.

No caso das ligações -OCH2 (presentes no segmento TMC) em 4,24 ppm (Pospiech,

2005), conforme se aumenta a concentração de macrômero (10-20%), aumenta-se a intensidade

relativa a esse tipo de ligação.

Na região de 3,97 ppm, que esta relacionada ao CH3-CH (próton referente ao CH do

grupo isopropil) do NIPAAm (Kessin, 2003) , é verificado uma maior intensidade quando a

relação de NIPAAm é maior (86%), o que ocorre na situação em que a concentração de

macromero é de 10%.

77


Da mesma forma que se deu a discussão na seção anterior continuaremos a explanar

sobre as diferenças entre os grupos com 4% de ácido acrílico.




respectivamente.

86/10/4

81/15/4

78


A Tabela 4 relaciona os picos observados, com suas respectivas atribuições, para as

diferentes relações de macrômero.


Composição

Hidrogel

Deslocamento

Químico

Atribuição das

Ligações

Intensidade

86/10/4

7,28 N-H

684458

81/15/4 662151

76/20/4 607854

86/10/4

4,24 -O-C-H2

197277

81/15/4 248869

76/20/4 318432

86/10/4

3,98 CH3-CH

840292

81/15/4 731267

76/20/4 731643

O espectro com 4% de acido acrílico, mostrou diferenças somente na intensidade dos

picos, assim como ocorreu com 2% de acido acrílico, as considerações sobre os picos e

respectivas intensidades são as mesmas comparadas ao de 2% de ácido acrílico em sua

composição.

76/20/4

79


Da mesma forma que se deu a discussão nas duas seções anteriores continuaremos a

explanar sobre as diferenças entre os grupos com 6% de ácido acrílico, finalizando a análise.




respectivamente.

84/10/6

79/15/6

80


A Tabela 5 relaciona os picos observados, com suas respectivas atribuições, para as

diferentes relações de macrômero.


Composição

Hidrogel

Deslocamento

Químico

Atribuição das

Ligações

Intensidade

84/10/6

7,28 N-H

643811

79/15/6 682598

74/20/6 353037

84/10/6

4,24 -O-C-H2

243212

79/15/6 448861

74/20/6 308750

84/10/6

3,98 CH3-CH

486850

79/15/6 658489

74/20/6 431318

O espectro com 6% de acido acrílico, mostrou diferenças somente na intensidade dos

picos, assim como ocorreu com 2 e 4% de acido acrílico, as considerações sobre os picos e

respectivas intensidades são as mesmas comparadas aos espectros encontrados em 2 e 4% de

ácido acrílico em sua composição.

Para as três variações na concentração de macromero investigada (10, 15 e 20%) ficam

claras somente alterações nas intensidades dos picos. Vale ressaltar que, em função das

74/20/6

81

concentrações 15 e 20% serem próximas, as alterações nas intensidades dos picos referenciados

nas Tabelas 3, 4 e 5 tornam-se mais evidentes se compararmos 10 e 20% de macromero, tanto

para 2, 4 e 6% de acido acrílico.


TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR)

9.6.1 Análise do Macrômero

A análise de FTIR tem extrema importância na caracterização da amostra e certificação

da presença dos grupos funcionais existentes no hidrogel sintetizado. Desta forma, foram

obtidos espectros de absorção na região do Infravermelho tanto para o macrômero sintetizado

(HEMA-PLDLA-co-TMC), como também para os hidrogéis obtidos com diferentes

quantidades de macrômero empregado (10, 15 e 20% m/m).

Figura 32 - Espectro de absorção no infravermelho para o macrômero sintetizado.

Na avaliação da estrutura do macrômero (Figura 32) foram encontradas as seguintes

bandas: 1745 cm-1 é atribuída ao estiramento C=O das unidades de PLDLA, TMC e HEMA,

1185 cm-1 é atribuída a ligação –C-C-O das unidades PLDLA, 1247 cm-1 referente ao

estiramento assimétrico O-C-O (TMC). A banda localizada em 2991 cm-1 é referente ao

82

estiramento CH2 alifático. A presença do HEMA no macrômero é confirmada pelas seguintes

bandas: a banda em 3500 cm-1 é referente ao estiramento OH, em 2917 cm-1 ao estiramento

simétrico CH2 (stretching); 1635 cm-1 a ligação C=C, em 1454 cm-1 é referente à vibração da

ligação =CH2, e a banda em 1381 cm-1 é referente à vibração simétrica das ligações CH3 e CH2

cm-1 (SULTAN, 2003; WANG, 2010).

9.6.2 Análise dos Hidrogéis

A Figura 33, 34 e 35 apresentam os comparativos entre os espectros de infravermelho

para os hidrogéis, contendo 10, 15 e 20% de macrômero para 2, 4 e 6% de ácido acrílico,

respectivamente. Em todos os casos pode-se avaliar uma banda bem pronunciada em 1630 cm

-1 é referente a ligação C=O da amida do PNIPAAm e se sobrepõem sobre a banda da AAc na

faixa de 1610 – 1670 cm -1 (SILVA, 2007). A banda em 1550 cm-1 pode ser atribuída a vibração

da ligação N-H do PNIPAAm, assim como a banda larga na faixa entre 3600-3200 cm-1

corresponde a vibração da ligação N-H (JIANG, 2010), a largura desta banda também está

associada à água, tendo em vista que as análises das composições do hidrogel são feitas em

solução.

Apesar de não ser possível observar nos espectros dos hidrogéis todas as bandas

correspondentes ao macrômero, em função das sobreposições das bandas do hidrogel, pode ser

notado que o aumento da concentração do macrômero (10, 15 e 20%), causando um ligeiro

aumento da banda em 1461 cm-1 que é referente à ligação =CH2, uma das ligações que

caracterizam um dos componentes do macrômero (HEMA), e que não está numa região de

interferência das composições dos hidrogéis copolimerizados.

A análise de espectroscopia de absorção no infravermelho tanto para o macrômero

quanto para o hidrogel apresentaram as bandas características dos segmentos, denotando a

presença dos grupos esperados e da formação tanto do macrômero quanto dos copolímeros

sintetizados.

83

Figura 33 - Espectro de absorção na região do infravermelho para os hidrogéis 10, 15 e 20% de

macrômero com 2% de ácido acrílico.



84



Pode-se verificar que conforme o aumento da quantidade de ácido acrílico aumentam-

se a evidencia das bandas em 2970 cm-1, as bandas em 1454 cm-1 também são levemente

ampliadas, devido a incidência de maior potencial de ligações entre o ácido acrílico e o

macrômero, conforme discutido na sessão anterior – Análise do Macrômero.

9.7 CALORIMETRIA DIFERENCIAL DE VARREDURA (DSC)

Os termogramas referentes ao segundo aquecimento dos hidrogéis contendo 10, 15 e

20% de macrômero com 2, 4 e 6% de ácido acrílico estão representados nas Figuras 36, 37 e

38 respectivamente, nos quais podem ser verificadas as temperaturas de transição vítrea e cujos

valores são sumarizados na Tabela 6.

85

Figura 36 - Termogramas indicando as Tg's dos hidrogéis com 10, 15 e 20% de macrômero e 2% de ácido

acrílico


acrílico

86


acrílico

Tabela 6 - Temperatura de Transição Vítrea para os Hidrogéis sintetizados.

Composições (NIPAAm-Macrômero-AAc) Tg (ºC)

88/10/2 107

83/15/2 116

78/20/2 104

86/10/4 101

81/15/4 103

76/20/4 90

84/10/6 115

79/15/6 109

74/20/6 110

Os valores para Tg encontrados nos hidrogéis estão de acordo com a literatura, que

reporta valores de Tg para PNIPAAm entre 85-145ºC dependendo da composição do polímero

(RIBEIRO, 2012).

As avaliações serão feitas com base nos grupo contendo as mesmas quantidades de

ácido acrílico, no primeiro grupo, contendo 2% de ácido acrílico na síntese, verificamos a maior

temperatura de transição vítrea (Tg) com 15% de macrômero, neste grupo a hipótese que pode

87

explicar este fato, é um limite ótimo na composição do material, gerando maiores ligações entre

o macrômero e a cadeia principal, necessitando de mais energia para a mobilidade molecular,

isso pode ser observado com o pequeno evento térmico no termograma da Figura 36.

Na composição contendo 4% de ácido acrílico temos uma queda na Tg na composição

com 20% de macrômero. Uma possível hipótese para esse comportamento é que essa

quantidade de macrômero produza grupos laterais tão grandes na cadeia que chegam a impedir

a formação de ligações de hidrogênio responsáveis pelas reticulações no hidrogel intumescido,

assim sendo reduzindo o intumescimento, necessitando assim de menos energia para a

movimentação molecular, em função da presença de menos ligações de hidrogênio geradas

presente nesta composição. De acordo com Canevarolo (2002) “quaisquer fatores que levem à

um aumento ou redução das forças intermoleculares secundárias levará ao aumento ou redução

das Tm e Tg”.

Já nas análises de 6% de ácido acrílico, verificam-se um equilíbrio nas temperaturas

de transição vítrea dos materiais, isso nos leva a crer que quando possuímos 6% de ácido acrílico

na composição, temos maior probabilidade de ligações entre o macrômero e a cadeia principal

do material, elevando as temperaturas de transição (maior necessidade de energia para

movimentação molecular) e consequentemente maior equilíbrio nas médias das temperaturas.

Outro fato que deve ser considerado é a presença de somente uma transição vítrea o

que indica a miscibilidade dos monômeros e consequentemente a copolimerização dos

polímeros na síntese.

9.7.1 Comportamento LCST

As temperaturas de transição LCST estão sumarizadas na Tabela 7.

O comportamento LCST é tido como a endoterma máxima obtido durante o

aquecimento na técnica de DSC (FEIL et al., 1993; JEONG; KIM; BAE, 2002). Conforme

discutido anteriormente, para géis com este comportamento, em temperaturas inferiores a

critica, apresentam somente uma fase onde as ligações de hidrogênio entre o polímero e o

solvente (água) são predominantes, já em temperaturas superiores, as interações hidrofóbicas

do sistema prevalecem e as ligações de hidrogênio entre o polímero e a água enfraquecem,

originando uma contração do material, expulsando água de seu interior e consequentemente

originando ligações de hidrogênio entre polímero-polímero (ALMEIDA, 2010).

88

Tabela 7 – Temperaturas de LCST para os Hidrogéis

Composições (NIPAAm-Macrômero-

AAc)

Temperatura LCST (ºC)

88/10/2 26

83/15/2 20

78/20/2 22

86/10/4 25

81/15/4 23

76/20/4 24

84/10/6 25

79/15/6 22

74/20/6 16

A presença de grupos hidrofílicos faz com que o comportamento LCST seja

aumentado, ou seja, as temperaturas para a separação de fase são maiores, consequentemente

conforme grupos hidrofóbicos são adicionados ao copolímero a temperatura de separação de

fase torna-se menor (SCHILD, 1992; QIU & PARK, 2001).

O efeito de redução da temperatura LCST é verificado na tabela 7, tendo em vista a

característica altamente hidrofóbica dos poliésteres empregados na síntese gera uma redução

nas temperaturas de transição LCST (GUAN,2008), tendo em vista que a temperatura LCST da

PNIPAAm é de aproximadamente 32ºC (KLOUDA & MIKOS, 2008), já as temperaturas

encontradas para todas as composições apresentam-se abaixo da LCST da PNIPAAm pura.

Estas mudanças não são totalmente reversíveis, ou seja, a transição entre sol/gel e

gel/sol pode ser repetida definidamente durante o tempo útil do gel (sem degradação), autores

apontam um número próximo a 500 reversões, número este que representa quanto o hidrogel

pode executar a transição de fases mantendo as propriedades estáveis (ALMEIDA, 2010).

Todas as composições apresentam temperaturas muito próximas com exceção da

composição 74/20/6, isso mais uma vez corrobora a afirmação feita acima, onde quaisquer

grupos hidrofílicos reduzem a temperatura característica da N-isopropil acrilamida pura,

consequentemente um aumento no componente ácido acrílico (altamente hidrofílico) é

responsável por uma queda mais expressiva na temperatura de LCST.

É importante salientar que todas as temperaturas LCST dos hidrogéis estão abaixo dos

37ºC (temperatura do organismo), sendo assim, estes hidrogéis podem ser utilizados in vivo,

89

pois, na temperatura corporal já estarão gelificados, com estruturas e propriedades adequadas à

utilização necessária.

9.8 ANÁLISE REOLÓGICA

As análises reológicas foram obtidas com parceria da empresa TA Instruments, que

gentilmente nos cedeu horas para o uso de seu reômetro DHR-3, com placas paralelas no modo

oscilatório para verificarmos a influência das composições do copolímeros no que diz respeito

à sua propriedade de módulo de perda (G”), viscosidade (n) e temperatura de gelificação dos

materiais. As análises foram efetuadas no modo de varredura de temperatura iniciando em 15ºC,

nesta temperatura o material ainda apresentava comportamento de líquido viscoso, até 50ºC

onde o material já se encontrava completamente gelificado com formação do gel.

As figuras 39,40 e 41 ilustram o comportamento reológico dos géis, com módulo de

perda (G”) versus temperatura (ºC).

Figura 39 – Comportamento reológico dos géis contendo 2% de ácido acrílico

90

Figura 40 – Comportamento reológico dos géis contendo 4% de ácido acrílico.

Figura 41 – Comportamento reológico dos géis contendo 6% de ácido acrílico.

91

Pode-se avaliar a formação de vales em todas as figuras onde os menores valores

encontrados em temperatura são os valores de transformação LCST para os materiais, a tabela

8 sumariza os valores das transições de fase e módulo de perda (G”) para as composições dos

hidrogéis.

Tabela 8 – Comportamento Reológico dos Hidrogéis

Composições (NIPAAm-

Macrômero-AAc)

Temperatura LCST (ºC) Módulo de Perda (G”)

(Pa)

88/10/2 26,5 6,25

83/15/2 24,2 32,06

78/20/2 23,7 41,13

86/10/4 22,5 0,28

81/15/4 23,3 0,21

76/20/4 22,7 0,41

84/10/6 24,7 2,13

79/15/6 24,9 0,14

74/20/6 22,8 14,98

Todas as temperaturas encontradas nos ensaios reológicos corroboram com os ensaios

de calorimetria apresentados na seção anterior, onde verificamos novamente que todas as

temperaturas para a transformação de fase estão abaixo dos 37ºC, sendo assim pode ser

utilizados na temperatura corporal sem comprometer sua estrutura.

Os valores de G” indicam que a característica mecânica de rigidez não é fator

preponderante para a transformação de fase, onde percebe-se todos os valores com no máximo

algumas dezenas de pascal, assim sendo, a temperatura sim é o que de fato importa para a

transformação de fases deste tipo de hidrogel.

Com a completa gelificação do material – platô constante após a elevação no módulo

de armazenamento – aponta um material com elevadas propriedades deste material, onde

verificamos todos muito próximos à 105 Pa, autores apontam valores para hidrogéis distintos

entre eles: PCL-g-PEG ~ 104 Pa (LIN et al., 2013), alginato-amido ~10³ Pa (VALLÉE et al.,

2009), agarose ~ 10³ Pa, colágeno ~10² Pa, fibrina ~10² Pa, matrigel ~10² Pa e metilcelulose ~

10² Pa (ZUIDEMA et al., 2014). Já para géis de PNIPAAm encontram-se valores que variam

entre 105 Pa (ADRUS; ULBRICHT, 2013) e 104 Pa (PULEO et al., 2013), porém em ambos

os estudos os géis são reticulados por vias químicas, ou seja, na presença de agentes de

reticulação muitas vezes tóxicos às células ou que inibem a biodegradação do material. Neste

92

trabalho os géis são formados via interações físicas entre as cadeias, conferindo as propriedades

de biodegradação ao material, sendo assim, nossa hipótese é de que a copolimerização dos

polímeros baseados em L, D,L – lactídeo e TMC conferem a estabilidade mecânica necessária

ao hidrogel sintetizado.

A estabilidade deste hidrogel além de visualizada na seção “Análise Macroscópica”

foram mensuradas pelos ensaios reológicos, demonstrando que além de sua transformação de

fase em baixas temperaturas, as ligações formadas via física entre as cadeias de PNIPAAm

copolimerizadas com os polímeros bioabsorvíveis são extremamente estáveis e resistentes

quando comparadas à outros hidrogéis, sejam físicos ou quimicamente reticulados.

Já as figuras 42, 43 e 44 apresentam o perfil de viscosidade dinâmica dos hidrogéis

estudados quando submetidos à força de cisalhamento.

Figura 42 – Perfil de viscosidade dos géis contendo 2% de ácido acrílico.


93


Os estudos de viscosidade dinâmica em função da taxa de cisalhamento muitas vezes

é negligenciado nos géis injetáveis, mas esta é uma característica bastante relevante tendo em

vista que a viscosidade é fator de risco no momento da injeção dos materiais.

Analisando-se os resultados percebe-se que em todos os casos quanto maior a

quantidade de macrômero presente nos materiais maior as viscosidades dos materiais, o que faz

sentido tendo em vista que possuímos maiores quantidades de segmentos poliméricos de ésteres

copolimerizados ao hidrogel, elevando sua viscosidade. Verifica-se entre as sínteses variações

na propriedade de viscosidade, sendo que com 6% de ácido acrílico encontramos a maior

viscosidade, isso provavelmente se deve ao fato de termos maiores numero de ligações cruzadas

formadas entra a PNIPAAm e o ácido acrílico, já na condição 4% percebe-se claramente as

menores viscosidades, atribuímos este fenômeno a um limite ótimo na copolimerização das

cadeias dos poliésteres e a NIPAAm, assim sendo possuímos o melhor resultado advindo desta

composição. Para esta composição os valores são bastante baixo, muito próximos da água,

sendo assim as injeções são facilitadas e por consequência este material será testado na cultura

e diferenciação celular.

94

9.9 DEGRADAÇÃO DOS HIDROGÉIS

As Figuras 45, 46 e 47 apresentam a massa remanescente dos hidrogéis contendo 2, 4

e 6% de ácido acrílico, respectivamente, quando em degradação in vitro durante um período de

20 semanas.

Figura 45 – Variação da perda de massa em função do tempo de degradação para as amostras dos

hidrogéis contendo 2% de ácido acrílico.



95



Todos os hidrogéis apresentam uma perda de massa progressiva durante a degradação,

além deste fato, separando pelos grupos com ácido acrílico, verifica-se que em 2, 4 e 6% de

ácido acrílico percebe-se que quantidades menores de macrômero possuem a característica de

degradarem mais conforme o aumento dos tempos, esse fato pode ser corroborado com os

resultados apresentados na seção de DSC, que nos mostra que conforme temos maiores

quantidades de elementos ésteres (hidroliticamente degradáveis) a água fica mais aprisionada

no seu interior, devido ao emaranhamento da molécula, além disso a degradação hidrolítica é

mais facilmente iniciada nos segmentos amorfos, já os cristais demoram mais para serem

degradados, assim sendo maiores quantidades de segmentos ésteres necessitarão de maior

tempo para a completa degradação . Wang (2010) reporta tempos de degradação superiores à 5

meses para perdas de massa superiores à 85% em hidrogéis com macrômeros compostos por

HEMAPTMC, já Guan (2008) aponta tempos inferiores à 20 dias para a degradação (perda de

massa em torno de 85%) de hidrogéis compostos por macrômeros de HEMAPLA, tendo em

vista estes estudos, os valores de degradação encontrados nos macrômeros de HEMAPLDLA-

co-TMC estão dentro da faixa de valores encontrados na literatura, onde seriam necessários um

maior tempo de degradação para a verificação da completa dissolução destes hidrogéis. É

possível perceber que as amostras começam sua variação, ou seja, iniciam a degradação a partir

das quatro semanas, esse fato se deve às grandes ramificações dos segmentos ésteres que levam

mais tempo para hidrolisar, iniciando a degradação em tempos mais tardios. O fato da

estabilidade inicial é bastante importante para quando desejamos utilizar este material como

96

scaffold para carrear células, maiores tempos de estabilidade do sistema propiciam melhor

ancoragem para as células e consequentemente novos tecidos.

9.10 ANÁLISE DE QPCR DA DIFERENCIAÇÃO CELULAR

No presente estudo, mESC foram cultivadas nas condições de controle (placa de

poliestireno) e Hidrogel, e a expressão gênica foi analisada via PCR quantitativo (qPCR) até 9º

dia após o cultura, assim como para as imagens de imunofluorescência. Foram usadas mESC

pré-diferenciadas, ou seja, as células foram colocadas sobre os materiais a partir do dia 4 de

diferenciação, pois, células não diferenciadas apresentam crescimento e sobrevivência,

menores se comparados a células pré-diferenciadas (LEVENBERG et al., 2003).

O qPCR foi utilizado para identificar os níveis de expressão do transcrito de genes

precursores cardíacos. Estes genes precursores cardíacos foram usados como marcadores

temporais da diferenciação em cardiomiócitos das mESCs. A β-actina foi usada como gene

padrão constitutivo servindo como um normalizador das expressões especificas dos genes.

Vários estudos tem demonstrado que o coração é formado essencialmente por duas

populações de células progenitoras (ou campos cardíacos) que se originam de progenitores

mesodérmicos a partir do estágio de gastrulação. Na mesoderme anterior, células pré-cardíacas

do campo cardíaco primário formam o crescente cardíaco. As células do crescente cardíaco

migram para formar o tubo cardíaco. Este ciclo, acompanhado pela rápida expansão do

miocárdio, desenvolve as quatro câmaras do coração (BUCKINGHAM; MEILHAC;

ZAFFRAN, 2005; GONZALES; PEDRAZZINI, 2009; MEILHAC et al., 2004).

Basicamente, quatro etapas principais são necessárias para geração de cardiomiócitos

a partir de células-tronco pluripotentes: (1) formação de mesoderme, (2) a padronizaçãoo da

mesoderme em direção mesoderme anterior ou mesoderme cardiogênica, (3) formação da

mesoderme cardíaca, e (4) maturação de cardiomiócitos primários (RAJALA; PEKKANEN-

MATTILA; AALTO-SETÄLÄ, 2011). A indução de células-tronco pluripotentes a se

diferenciarem em células cardíacas seguindo estes passos, podem ser caracterizadas pela

expressão de fatores de transcrição, como Brachyury-T para mesoderme primitiva, Isl-1 para

mesoderme cardiogênica, Nkx2.5 para mesoderme cardíaca (células progenitoras cardíacas) e

MHC 6 para cardiomiócitos (HIROI et al., 2001; PLAGEMAN; YUTZEY, 2004).

O primeiro passo na geração de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes

é a formação de mesoderme. No desenvolvimento da mesoderme, também expresso durante a

97

gastrulação, pode, universalmente aumentar os níveis de transcritos em linhagens

mesodérmicas.

Portanto, a diferenciação em cardiomiócitos é iniciada com a expressão de marcadores

de mesoderme como por exemplo o Brachyury-T (RABIEE et al., 2014). O fator T de

transcrição T-box (Brachyury-T), por sua vez, é um alvo bem caracterizado de marcadores

mesodérmicos (DENANS; IIMURA; POURQUIÉ, 2015; YAMAGUCHI et al., 1999). Para

investigar o inicio dessa diferenciação, foi realizado um qPCR para avaliar a expressão desse

gene, o resultado dessa análise está apresentado na Figura 48.

Figura 48 – Níveis de expressão do transcrito de Brachyury-T. n=5. *p<0,05

Os dados obtidos mostram que a expressão de Brachyury-T apresenta seu pico no

quarto dia, sendo que a expressão do dia 4 é significativamente maior em relação aos dias

subsequentes, sendo assim, pode-se dizer que a expressão se manteve máxima durante o período

recente de diferenciação e reduziu drasticamente ao decorrer do tempo de caracterização

(ABBEY; SESHAGIRI, 2013). Estes resultados são compatíveis com os resultados

apresentados em outros trabalhos (RABIEE et al., 2014; RAJALA; PEKKANEN-MATTILA;

AALTO-SETÄLÄ, 2011).

O próximo passo em direção a cardiomiogênese é a formação de células progenitoras

cardíacas (CPCs). Nesse estágio, estas células expressam, por exemplo, Isl-1 e Nkx2.5

(MCCULLEY; BLACK, 2012).

O Isl-1 (fator de transcrição do homeodomínio LIM) é um marcador de células

progenitoras cardíacas do campo secundário do coração (secondary heart field – SHF) o qual

inclui o ventrículo direito e o trato de saída de fluxo (ABBEY; SESHAGIRI, 2013;

98

LAUGWITZ et al., 2008). Outros estudos mostram o Isl-1 como um marcador para células de

linhagem progenitora cardíacas que são capazes de se diferenciar nos três principais tipos

celulares do coração: linhagens de cardiomiócitos, músculo liso e endotelial (LAUGWITZ et

al., 2005; MORETTI et al., 2006).

O Nkx2.5 (fator de transcrição do homeodomínio Nkx2) é um fator de transcrição que

regula o desenvolvimento do coração, interagindo com outros fatores de transcrição, como por

exemplo fatores GATA, promovendo a formação de cardiomiócitos (MCCULLEY; BLACK,

2012; ZHOU; LIAO; TU, 2015). O fator de transcrição específico cardíaco Nkx2.5 desempenha

um papel importante na especificação de progenitores de cardiomiócitos em ratos, assim como,

o fator transcricional GATA, mais especificamente o GATA-4, que também desempenha um

papel no desenvolvimento muscular cardíaco (KUMAR; KAMP; LEWINTER, 2005).

Ambos os fatores de transcrição, Isl-1 e Nkx2.5, foram utilizados como marcadores

intermediários de diferenciação e, segundo a literatura, estes fatores são observados nos tempos

de 7 e 8 dias de diferenciação, respectivamente (SCOTT, 2012), assim com os resultados

adquiridos em qPCR e apresentados na Figura 49.

99

Figura 49 – Níveis de expressão para os transcritos de Isl-1 e Nkx2.5. n=5

Finalmente, cardiomiócitos maduros emergem e podem ser identificados pelo aumento

da expressão de proteínas estruturais cardíacas, tal como a MHC (Myosin Heavy Chain).

Treze genes já foram descritos para o MHC6 de mamíferos, incluindo nove genes de

sarcômeros musculares, três genes não musculares e um gene de musculo liso. Os outros três

genes são de MHC cardíaco, como por exemplo o MHC6. Cuja a expressão é observada durante

o desenvolvimento cardíaco e no coração adulto. Em conjunto, as proteínas estruturais de

miosina são expressas de uma maneira restrita no desenvolvimento do coração, contudo,

100

apresentam papéis vitais na cardiomiogênese inicial (BEKETAEV et al., 2015; ENGLAND;

LOUGHNA, 2013).

Figura 50 – Níveis de expressão para os transcritos de MHC6. n=5

Como previsto na literatura, os níveis de expressão do MHC6 foram observados no

dia 9 (Figura 50) de desenvolvimento dos cardiomiócitos (AGAH et al., 1997).

De acordo com os dados de qPCR adquiridos e apresentados nas figuras acima, por

não exibirem significâncias relativas entre as condições do mesmo tempo de diferenciação,

pode-se aferir que não há altercações, na via de cardiomiogênese, entre o controle e o Hidrogel.

9.11 ANÁLISE DE IMUNOFLUORESCÊNCIA DA DIFERENCIAÇÃO CELULAR

Os efeitos da diferenciação final (dia 9) das mESCs, foram quantificadas através da

análise de qPCR e corroborados pelos resultados obtidos por imunofluorescência com o

marcador final de diferenciação MHC6 (MF20). Mostrando que, o Hidrogel, suporta o cultivo

de células-tronco embrionárias, assim como, o processo de diferenciação em cardiomiócitos

utilizado neste estudo, isso pode ser conferido pela presença de células viáveis, que foram

cultivadas sobre os materiais.

As células apresentaram uma morfologia arredondada ou alongada com um núcleo

grande, este resultado é compatível com outros trabalhos onde se utilizou substratos poliméricos

para diferenciação de mESC (DAWSON et al., 2011; KURAITIS et al., 2012). Pra confirmar

101

o fenótipo da população celular, foi realizado uma imunofluorescência onde a marcação revelou

a presença de proteínas cardíacas especificas (MHC). A Figura 51 ilustra o padrão positivo para

a marcação destas células sobre a placa de cultura (controle) e Hidrogel, onde são observados

alguns padrões de organização celular, como por exemplo, grumos celulares, células orientadas

com fibras alongadas ou células isoladas (ALPERIN; ZANDSTRA; WOODHOUSE, 2005).

Mostrando que ambos os biopolímeros podem ser utilizados na engenharia de tecidos ou

regeneração tecidual em combinação com células-tronco embrionárias para diferenciação de

cardiomiócitos.

Talvez, a comprovação mais marcante na diferenciação destes cardiomiócitos é

observada na cultura assim que os cardiomiócitos formam camadas de células com batimento

espontâneo, com ondas de contração sincronizadas, propagando através da cultura. De acordo

com a literatura, cardiomiócitos batem sincronicamente quando há contato direto entre as

células, exercendo maior força contrátil quando comparado a células individuais, sendo assim,

após alguns dias em cultura, a frequência de batimento se torna mais uniforme, devido ao

crescimento celular e maior contato entre as células (TALLAWI et al., 2014).

102

CONTROLE

HIDROGEL

Figura 51 – Análise de imunofluorescência realizado no dia 9 de diferenciação com os marcadores para a

MF20 (vermelho) e Hoechst (azul) para o núcleo, para diferenciação das mESC em cardiomiócitos

200µm 20 µm

200µm 20 µm

10 µm

103

9.12 ESTUDO IN VIVO DO HIDROGEL 86/10/4

A fim de verificar o comportamento do hidrogel termossensível e biodegradável

Poli(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPLDLA-co-TMC) – na proporção 84/10/6 – foram

realizados testes in vivo em ratos Wistar para avaliação do potencial inflamatório do material.

Foi realizado o implante de 2 mL do hidrogel de Poli(NIPAAm-co-AAc-co-

HEMAPLDLA-co-TMC) (12% m/v) na região dorsal posterior dos animais, próximo à base da

cauda dos mesmos. Com isso, foi feito o implante do hidrogel com o corante a base de uma

solução de negro-de-fumo coloidal (nanquim) a fim de localizar o material implantado, e o seu

comportamento após ser injetado.

O implante do hidrogel com o corante nanquim foi feito inicialmente para verificar a

localização do material (Figura 52).

Figura 52 - Hidrogel e nanquim. (a) Implante de hidrogel com Nanquim via injetável; (b) Local do

implante após redução do intumescimento; (c) Local do implante na retirada do material; (d) Retirada do

material com nanquim.

O nanquim podia ser evidenciado no local da aplicação mesmo após a redução do

intumescimento no local (Figura 52b). Sendo que na retirada do material com o nanquim foi

visto que o hidrogel atingia regiões mais profundas, muitas vezes alcançando o tecido muscular

subjacente (Figura 52c), além do tecido subcutâneo do animal - local onde foi feito o implante.

Dessa forma, foi evidenciado que o material realmente se dissipava do local da aplicação após

o hidrogel ser injetado no tecido subcutâneo. Assim, os outros implantes também ocorreram

com o corante Nanquim, sendo nos tempos de 5, 7, 10, 15, 21 e 30 dias, com a finalidade de

a b

c d

104

confirmar a localização do hidrogel e verificar se houve resposta inflamatória decorrente do

material.

As injeções do hidrogel foram feitas no tecido subcutâneo dos animais, mas por muitas

vezes alcançaram o tecido muscular subjacente, esse fato é corroborado no tópico de analise

macroscópica, onde os géis formavam-se completamente após 10 minutos à 37ºC.

Aqui são descritos somente os resultados dos grupos experimentais, visto que, os grupos

controles correspondentes são de pele normal de ratos e devido ao seu amplo conhecimento,

não necessitam de descrição.

Desse modo, segue a descrição por grupo estudado. Em algumas amostras foi colocado

o corante nanquim para delimitar a localização do hidrogel, nestas foi verificado que apesar da

remoção material pelo processamento, o corante permaneceu nos tecidos.

9.12.1 Grupo com Implantes de 5 dias

Nesse grupo inicial notamos a ausência de processo inflamatório significativo, mas

com a presença de grande quantidade de eritrócitos na região onde foi realizada a perfuração

da agulha de injeção do gel. Nessa região em questão, foi notado o rompimento da epiderme e

de fibras da derme subjacente. Em algumas regiões foram vistos remanescentes do hidrogel

(Fig. 53).

Figura 53 - Presença de hidrogel encapsulado por fibras colágenas (cabeça de seta), mas sem sinais de

células inflamatórias. Na vizinhança grande quantidade de eritrócitos, mostrando a presença de

hemorragia. Aumento de 100x. 5 dias.

105


A presença do hidrogel tornou-se cada vez mais escassa, devido ao processamento

histológico, mas ficou evidenciada sua presença anterior devido ao espaço que ele deixou entre

as fibras colágenas do tecido conjuntivo (Fig. 54).

Figura 54 - Implante de hidrogel. (a) Presença de hidrogel no espaço provocado pelo implante do material

(cabeça de seta); (b) Presença de remanescente do hidrogel. Aumento de 40x. 7dias.


A biocompatibilidade do hidrogel foi notada devido a permanente ausência de

processos inflamatórios. Além disso, notou-se sua deposição entre os amplos espaços entre as

fibras na região da hipoderme. Em algumas dessas regiões, restos de hidrogel estavam ao redor

das fibras. (Fig. 55 e 56).

Figura 55 - Implante de hidrogel após 10 dias. (a) Espaços na fáscia muscular provocados pela injeção do

hidrogel (asteriscos); (b) Espaços na fáscia muscular provocados pela injeção do hidrogel (asterisco).

Aumento de 20x.

a b

a b

106

Figura 56 - Implante de hidrogel com nanquim após 10 dias. (a) Região da hipoderme preenchida com o

hidrogel corado em preto. Aumento de 10x. (b) Interação entre as fibras colágenas e o hidrogel (cabeça de

seta) na margem. Aumento de 100x.


Resultados semelhantes ao do grupo anterior, com presença de grandes espaços na

região da hipoderme onde foi injetado o material (Fig 57).

Figura 57 - Implante de hidrogel após 15 dias. Espaço deixado pelo polímero na região da hipoderme

(asterisco). Notar ausência de processo inflamatório na margem do espaço. Aumento de 10 x.

a b

107


Na região da fáscia muscular, entre a hipoderme e o tecido muscular, notou-se a

presença do hidrogel carregado com nanquim, entre as fibras colágenas no tecido conjuntivo.

Aqui também o hidrogel corado mostrou-se presente intimamente entre as fibras colágenas e

com ausência de resposta inflamatória. (Fig 58).

Figura 58 Implante de hidrogel com nanquim após 21 dias. (a) Região da fáscia muscular, entre a

hipoderme e o tecido muscular. Tecido conjuntivo (2) entre as fibras musculares esqueléticas (1 e 3

respectivamente). Nota-se a presença do polímero com nanquim (corado em preto) entre as fibras

colágenas no tecido conjuntivo (2). Aumento de 20x. (b) Hidrogel corado mostrando-se presente entre as

fibras colágenas (setas) e com ausência de resposta inflamatória. Aumento de 40x. (c) Hidrogel corado

presente entre as fibras colágenas (seta), na margem dos espaços deixados pelo material (asterisco).

Ausência de resposta inflamatória. Aumento de 40x. (d) Hidrogel corado depositado entre as fibras

colágenas. Aumento de 100x.

1

2

3 a b

d

c

108


No último tempo do experimento, ficou evidente os espaços ocupados pelo hidrogel

antes do processamento histológico. Notavelmente, pode se ver o corante, que estava junto com

o hidrogel, entre os amplos espaços na hipoderme. (Fig 59).

Figura 59 - Implante de hidrogel com nanquim após 30 dias. (a) Panorâmica da relação do hidrogel com

as fibras colágenas. Ampliação 20x. (b) Espaços deixados pelo hidrogel (cabeça de seta) entre as fibras

colágenas e remanescentes da coloração com nanquim. Ampliação de 100x

Devido à dissipação do hidrogel do local do implante e ausência de intumescimento

no local da aplicação, indica-se que esse material não apresentou solidificação, como previsto,

após ser injetado in vivo. Não sofrendo, portanto, alteração na sua conformação e posterior

solidificação (transição sol-gel) após a mudança na temperatura no meio implantado. A

dissipação desse material pode decorrer da composição do hidrogel de Poli(NIPAAm-co-AAc-

co-HEMAPLDLA-co-TMC), que foi associado à outras substâncias além do PNIPAAm,

modificando, portanto, a sua característica de termossensibilidade. Ou então, o local do

implante não foi propício para a sua solidificação.

c

b a

d

109

Para determinar a biocompatibilidade in vivo de uma variedade de biomateriais um dos

métodos mais utilizados é baseado na análise histológica ou morfológica do tecido adjacente

e/ou das respostas celulares ao implante (KIM et al., 2010).

A análise histológica do hidrogel implantado foi investigada por coloração HE, a

intervalos de tempo diferentes (5, 7, 10, 15, 21 e 30 dias). De modo que as células inflamatórias

não foram localizadas no material retirado do local do implante. Além disso, durante o

procedimento experimental, não foi evidenciada reação inflamatória em torno do local da

injeção do hidrogel.

Como o hidrogel e nanquim não manifestaram sinais inflamatórios – macro e

microscopicamente. Dessa forma, o hidrogel Poli(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPLDLA-co-

TMC) pode ser considerado biocompatível, devido à ausência de resposta inflamatória no local

do implante do material.

A tinta nanquim é um corante composto por negro-de-fumo coloidal (SAADE et al.,

2011). O negro-de-fumo é um pigmento inorgânico não colorido, além de ser um dos aditivos

mais utilizados em polímeros. Considerado um material policristalino, sua interação com a

matriz do polímero depende muito da natureza dos grupos de superfície, tais como quinonas,

fenóis, carboxifenóis e lactonas (SARON; FELISBERTI, 2006). A coloração de nanquim

permaneceu após o processamento histológico do material e não interferiu na visualização

microscópica (DUEK et al., 2014).

A degradação dos biomateriais é outro aspecto importante a ser considerado quando

eles são usados na área médica, uma vez que o funcionamento para uma determinada aplicação

depende do período de tempo que é necessário mantê-lo no organismo. O taxa de biodegradação

in vivo de um biomaterial está relacionada com as caracteristicas do polímero e com o local

implantado (TAMARIZ; RAMÍREZ, 2013).

Também pôde ser vizualizada, na análise histológica, redução do hidrogel injetado,

microscopicamente de modo qualitativo, de acordo com o avançar dos tempos analisados.

Entretanto, esse hidrogel apresentou dificuldade na sua localização, quando não foi utilizado

nanquim para tal finalidade. Pois, macroscopicamente não era possível localizar esse material,

não evidenciando solidificação e nem mesmo a presença dele. Diante da falta de sinais de reação

inflamatória, pode-se demonstrar o potencial biocompatível do polímero (MARTINS, et al.,

2014).

Além da biocompatibilidade, na análise histológica também foi evidenciada a presença

de espaçamentos deixados após o processamento do material, devido ao implante do hidrogel.

110

Dessa forma, pode ser considerada a utilização desse biomaterial como material de

preenchimento.

Diante dos resultados apresentados, o hidrogel Poli(NIPAAm-co-AAc-co-

HEMAPLDLA-co-TMC) – usado nesse projeto – apresenta biocompatibilidade e potencial

como material de preenchimento, sendo uma alternativa aos hidrogéis atuais. Entretanto, são

necessários maiores estudos desse hidrogel para uma melhor definição da transição sol-gel,

entendendo assim a sua termossensibilidade, além de poder localizá-lo sem a presença de

corante.

9.13 ESTUDO IN VIVO DO HIDROGEL 81/15/4

Tanto as formas de aplicação, utilização de nanquim, retirada e processamento do

material, foram idênticos às apresentadas na seção anterior, portanto, somente apresentaremos

resultados e discussões neste novo ensaio in vivo.

9.13.1 Grupo com implantes de 1 dia

Para o tempo de 1 dia de implante, pela análise histológica observou-se a formação de

cavidades (C) no tecido conjuntivo submuscular (TCS) contendo pigmentação negra e infiltrado

inflamatório (I) em sua periferia contendo alguns fragmentos de hidrogel (H) sofrendo

degradação em seu interior (figura 60)

Figura 60 - Cavidades (C) contendo fragmento de hidrogel (H) no subcutâneo e região de infiltrado

inflamatório (I) perilesional em implante de 1 dia (coloração HE).

Houve pequenos traumas focais na lâmina muscular (LM) situada entre a derme

reticular e o tecido conjuntivo submuscular (TCS) do animal, cavidades artificiais geradas pelo

implante do material ocorrendo afastamento do tecido conjuntivo local, grande celularidade de

macrófagos e monócitos em diferenciação na região perilesional e fragmento de hidrogel (H)

gelificado no interior dessa cavidade contendo células em seu interior (figura 61).

111

Figura 61 - Implante de 1 dia contendo fragmento de hidrogel (H) entre a lâmina muscular (LM) e o

tecido conjuntivo submuscular (TCS) (coloração HE).

Em maior aumento (Figuras 62 e 63, respectivamente) observa-se a entrada de

monócitos (Mo) em diferenciação e poucos macrófagos diferenciados para o interior da matriz

do fragmento de hidrogel (H).

Figura 62 - Matriz do fragmento de hidrogel (H) com monócitos (Mo) em diferenciação para macrófagos

iniciando sua biodegradação (coloração HE).

112

Figura 63 - Monócitos (Mo) em diferenciação internos à matriz do hidrogel (H) (coloração HE) (utilizado

óleo de imersão).

Observa-se o pigmento negro (nanquim – N) impregnado focalmente na matriz

polimérica formada pela gelificação do hidrogel (H) e o início da atividade fagocítica,

predominantemente monócitos (Mo) em diferenciação, formando poros (P) irregulares em seu

interior (figura 64).

Figura 64 - Matriz de hidrogel (H) gelificado pigmentada em alguns pontos por nanquim (N) contendo

poros (P) e monócitos (Mo) em diferenciação em seu interior (coloração HE) (utilizado óleo de imersão).

113

Observam-se vários fragmentos de hidrogel (H) na periferia da cavidade (C) do

implante entre a lâmina muscular (LM) e o tecido conjuntivo submuscular (TCS) com intenso

infiltrado inflamatório (I) perilesional (figura 65)

Figura 65 - Cavidade (C) do implante com fragmentos periféricos de hidrogel (H) entre a lâmina muscular

(LM) e o tecido conjuntivo submuscular (TCS) contendo infiltrado inflamatório (I) perilesional (coloração

HE).

Houve grande quantidade de macrófagos (M) contendo grânulos negros em seu

citoplasma e monócitos (Mo) em diferenciação realizando a degradação do hidrogel (figura 66

e figura 67).

114

Figura 66 - Cavidade (C) formada entre a lâmina muscular (LM) e o tecido conjuntivo submuscular

(TCS) contendo macrófagos (M) perilesionais e monócitos (Mo) em diferenciação (coloração HE).

Figura 67 - Macrófagos (M), contendo vesículas de pigmento negro em seu citoplasma, localizados

perifericamente à cavidade (C) de implante do hidrogel (coloração HE) (utilizado óleo de imersão).

9.13.2 Grupo com Implante de 3 dias

O grupo que permaneceu com 3 dias de implante do hidrogel em tecido subcutâneo

apresentou lâmina muscular (LM), encontrada nesse modelo animal entre o tecido subcutâneo

de implante e a derme reticular, com traumas focais de fibras. O tecido conjuntivo submuscular

(tecido conjuntivo localizado abaixo da lâmina muscular) (TCS) apresentou cavidades (Cs)

115

formadas pelo implante do hidrogel com septações (S) internas contendo pigmento negro,

iniciando um processo de compartimentalização do sítio de implante (Figura 68).

Figura 68 - Cavidades septadas (Cs), septos (S) internos em formação, localizadas entre a lâmina

muscular (LM) e o tecido conjuntivo submuscular (TCS) contendo infiltrado inflamatório (I) perilesional

(coloração HE).

Não foram observados fragmentos de hidrogel como nas lâminas do grupo de 1 dia de

implante, contudo houve a fragmentação das grandes cavidades formadas no grupo anterior

(grupo de implante de 1 dia). A região perilesional apresentou grande celularidade de

macrófagos (M) contendo grânulos negros em seu citoplasma e menor visualização de

monócitos em relação ao grupo anterior, contudo mantendo diapedese de monócitos nos

capilares da região.

Podem-se observar os septos (S) supramencionados pigmentados pelo nanquim, com

dispersão pela matriz extracelular, e o conteúdo da degradação interno aos macrófagos (M)

perilesionais (figura 69).

116

Figura 69 - - Cavidades septadas (Cs) com início de septos (S) em seu interior contendo pigmentação

negra e macrófagos (M) no tecido conjuntivo submuscular (TCS) adjacente (coloração HE).

117

9.13.3 Grupo com implante de 5 dias

O grupo de 5 dias de implante do hidrogel apresentou (figura 70) aglomerado intenso

de macrófagos (M) contendo grânulos negros em citoplasma, essas células formaram uma

lâmina de infiltrado inflamatório (I) pigmentado pelo pigmento negro localizada ao longo do

tecido subcutâneo com regiões de visualização do pigmento na matriz extracelular envolvendo

as células do tecido conjuntivo.

Figura 70 - Cavidade septada (Cs), contendo grande número de septos (S) internos, formada entre a

lâmina muscular (LM) e o tecido conjuntivo submuscular (TCS) pelo implante de hidrogel. Presença de

infiltrado inflamatório (I) perilesional (coloração HE).

O aspecto de cavidade (Cs) formado pelo implante de hidrogel apresentou-se com

septações (S) assim como o grupo de 3 dias, contudo essa compartimentalização ocorrida no

local de implante é observada em maior número e em menor volume, mantendo a pigmentação

negra sugerindo a formação de uma rede polimérica pelo biomaterial inserido no tecido

subcutâneo.

Foram encontrados alguns pequenos fragmentos de hidrogel (H) ainda em degradação

por macrófagos repletos de grânulos negro em seu citoplasma e infiltrado inflamatório (I)

dessas células no tecido conjuntivo submuscular (TCS) adjacente ao implante (Figura 71).

118

Figura 71 - Cavidades septadas (Cs) do tecido conjuntivo submuscular (TCS), contendo pequenos septos

(S) em seus interiores, periféricas ao fragmento de hidrogel (H) em interação com macrófagos (M)

contendo grânulos negros em seu citoplasma (coloração HE).

Observa-se filamentos de hidrogel (H) pigmentados por nanquins dispersos na matriz

extracelular do tecido conjuntivo submuscular (TCS) e presença de macrófagos (M) contendo

grânulos negros em seu citoplasma (Figura 72).

Figura 72 - Cavidades septadas (Cs) localizadas no tecido conjuntivo submuscular (TCS) contendo

filamentos de hidrogel (H) e macrófagos (M) com grânulos negros em seu citoplasma (coloração HE).

119


O grupo de animais com implante de 7 dias, ao método histológico, apresentou

significativa diminuição da celularidade de macrófagos (M), logo reduzido infiltrado

inflamatório (I), quando comparado aos grupos anteriores, manutenção das formações

compartimentalizadas observadas nos grupos anteriores. As cavidades (Cs), formadas pelo

hidrogel entre a lâmina muscular (LM) e o tecido conjuntivo submuscular (TCS), no período

analisado mostraram-se menores e mais integradas ao tecido conjuntivo adjacente ao implante

(figura 73).

Figura 73 - Cavidades septadas (Cs) formadas entre a lâmina muscular (LM) e o tecido conjuntivo

submuscular (TCS), tecido perilesional com reduzido infiltrado inflamatório (I) (coloração HE).

Esse grupo apresentou focos de concentração de macrófagos contendo grânulos negros

em seu citoplasma, vistos principalmente em aglomerados circundando fragmentos raros de

hidrogel. As regiões adjacentes ao implante do biomaterial mostraram aumento de capilares

regionais, indicando neovascularização (Nv) (Figura 74).

120

Figura 74 - Regiões de neovascularização (Nv) localizadas no tecido conjuntivo submuscular (TCS) e

periféricas às cavidades septadas (Cs), há macrófagos (M) contendo grânulos negros em seu citoplasma

adjacentes à região (coloração HE).

O pigmento negro contendo associação com o hidrogel encontra-se, nesse grupo,

disperso pela matriz extracelular do tecido conjuntivo, observando integração maior da rede

polimérica formada durante a injeção e posterior gelificação, corroborando para a diminuição

do infiltrado inflamatório.


O grupo de 14 dias de implante apresentou manutenção das cavidades de implante de

hidrogel conforme observadas nos grupos anteriores, contudo, acompanhando o processo

ocorrido nos demais grupos, houve a formação de vários pequenos compartimentos constituídos

de filamentos de hidrogel (H) contendo pigmento negro, deposição de colágeno jovem nos

septos (S) de formação dentro das cavidades de implante e macrófagos contendo grânulos

negros integrados à essa formação tecidual. Pode-se observar a formação compartimentalizada

121

ao longo da periferia da cavidade de implantação do biomaterial com suas características

septações e integração ao tecido conjuntivo adjacente (figura 75).

Figura 75 - Cavidades (Cs) formadas no tecido conjuntivo submuscular (TCS) contendo septações

internas (S) (coloração HE).

Com o decorrer do tempo de 14 dias, maior tempo de observação do implante no

projeto, pode-se notar a formação de uma lâmina inflamatório-cicatricial (LIC) (Figuras 76 e

77, respectivamente) constituída de matriz extracelular do tecido conjuntivo e matriz

filamentosa de hidrogel permeadas por macrófagos (M) que fagocitaram os resíduos do

biomaterial.

Figura 76 - Cavidades perilesionais (Cs) com septações (S) contendo macrófagos (M) em seu interior

(coloração HE).

122

Figura 77 - Lâmina inflamatório-cicatricial (LIC) contendo macrófagos (M) com grânulos negros em seu

interior (coloração HE).

Com a análise in vivo do hidrogel de Poli(Ninam-co-AAc-co-HEMAPLDLA-co-

TMC) (81/15/4) pode-se observar suas características inflamatórias (localizando os tipos

celulares prevalentes), formação cicatricial, comportamento relativo à biocompatibilidade em

tecido conjuntivo (comparando a intensidade do infiltrado inflamatório ao longo dos tempos

analisados, não verificando sinais de morte celular no local de implantação do hidrogel e

verificando a integração ao tecido original), tempo de degradação com manutenção de

fragmentos no tecido e alterações da arquitetura histológica local que possibilitam aplicações

em cenários de regeneração e reparação para este biomaterial.

O infiltrado inflamatório fez-se presente a partir do tempo de 1 dia, mostrando uma

característica de resposta aguda à presença do hidrogel, iniciando celularidade de monócitos

em diferenciação seguindo para o tecido conjuntivo adjacente ao implante e poucos macrófagos

típicos diferenciados. Os fragmentos do biomaterial encontraram-se maiores no primeiro

tempo, portanto viu-se a invasão de macrófagos e monócitos em diferenciação na matriz do

hidrogel, formando poros decorrentes da fagocitose e instalando-se nesses sítios como

posteriormente observado na lâmina inflamatório-cicatricial do período de 14 dias de implante.

A celularidade de macrófagos contendo pigmento negro em seu citoplasma, por vezes

grande quantidade de grânulos dificultando a visualização adequada do núcleo dessas células,

teve sua maior representatividade nos tempos de 3 e 5 dias, formando grandes aglomerados

perilesionais e faixas de células pigmentadas no tecido subcutâneo.

Nos tempos de 7 e 14, com a visualização de aglomerados focais e de tamanho

reduzido, constata-se o direcionamento principalmente para resíduos de hidrogel ainda não

totalmente degradados e diminuição significativa do infiltrado inflamatório.

Nos tempos analisados observou-se a majoritária presença de macrófagos, portanto a

reação inflamatória induzida pelo hidrogel é substancialmente fagocítica, logo não sendo

constatada a presença de mastócitos em quantidade elevada ou linfócitos induzidos por reações

123

de hipersensibilidade mediada por linfócitos (parâmetros verificados, laudos descritivos das

análises, nas lâminas realizadas com o material extraído dos animais comparadas a celularidade

habitual encontrada em tecido normal).

A resposta tecidual cicatricial do tecido relativo ao local de implante foi verificada de

modo mais significativo no tempo de 14 dias, indicada pela deposição de colágeno jovem nos

compartimentos formados pela interação ocorrida entre o hidrogel e o tecido conjuntivo

adjacente. O hidrogel de Poli(NIPAAm-co-AAc-co-HEMAPLDLA-co-TMC) (12% m/v),

observando as características celulares do tecido subcutâneo perilesional, não apresentou

indução de apoptose ou causa de necrose teciduais na análise das lâminas obtidas dos animais

utilizados no estudo, logo sugerindo biocompatibilidade oportuna para aplicações nesse tipo de

tecido.

O tempo de biodegradação do hidrogel, acompanhado pelos tempos de permanência

do implante, ocorreu em sua grande parte no intervalo dos períodos de 5 e 7 dias, verificando

em 5 dias, a permanência de pequenos fragmentos isolados do biomaterial circundados por

aglomerados de macrófagos e em 7 dias não encontrando as formações sólidas características

do hidrogel nos compartimentos formados pelo tecido.

Particularmente a alteração arquitetural promovida pelo hidrogel mostrou-se

interessante por criar, no tempo de 1 dia com grandes cavidades pela expansão volumétrica do

implante e no tempo de 3 dias com a sustentação de cavidades de tamanho menor, evoluindo

para compartimentalização e formação de septos mais estruturados no tempo de 5 dias, no

tempo de 7 dias promovendo a integração das cavidades ao tecido conjuntivo submuscular e no

tempo de 14 dias gerando uma camada ricamente compartimentalizada criada no tecido

subcutâneo.

124

CONCLUSÕES

Esta tese teve como objetivo sintetizar um novo macrômero biodegradável e utilizado

como elemento de modificação de propriedades de hidrogéis de N-isopropilacrilamida. As

características predominantes do hidrogel foram sua capacidade de ser injetável, ter resposta à

mudança de temperaura e possuir segmentos biodegradáveis acoplados à um hidrogel

notavelmente sem degradação. A síntese efetuada em duas etapas, a primeira (do macrômero)

via abertura de anel dos ésteres cíclicos das lactonas e do anel de trimetileno carbonato

modificados com 2-hidróxietilmetacrilato, e a segunda etapa, formando o hidrogel via

polimerização via radical livre, mostraram-se adequadas e completamente estáveis nos tempos

de 24 horas.

A avaliação macroscópica do material aponta a característica de injetação com agulhas

de baixo calibre (26 gauge), a seleção deste tipo de agulha tem em vista a invasividade dos

procedimentos cirúrgicos, além disso percebe-se o pouco tempo necessário para a gelificação

do hidrogel e consequentemente atingir as propriedades de gelificação.

Os estudos de instumescimento apresentaram resultados entre 36 e 171%,

demonstrando todas as sínteses com capacidade de absorver fluídos e consequentemente

fármacos dissolvidos nesta solução.

A caracterização química demonstra a copolimerização dos segmentos ésteres ao 2-

hidróxietil metacrilato (HEMA) bem como a incorporação deste macrômero ao hidrogel de

PNIPAAm, a técnica de RMN apontou a copolimerização de todo os monômeros envolvidos

na polimerização do macrômero e consequentemente do hidrogel, com rendimentos médios de

65%, já a técnica de FTIR indicou a presença dos grupamentos químicos pertencentes ao

monômeros utilizados na síntese, corroborando assim a análise de RMN.

As propriedades térmicas obtidas por via de DSC apontam comportamento LCST

muito bem definido para o hidrogel ao ponto que todas as sínteses apresentam o comportamento

em temperaturas inferiores à 37ºC (temperatura corporal), assim sendo o material apresentou

as propriedades necessárias quando na temperatura corporal.

Os ensaios reológicos apontaram grande estabilidade ao material devido à inserção dos

grupamentos ésteres e carbonatos degradáveis às cadeias de PNIPAAm, a transição de fase

LCST foi também corroborada por ensaios reológicos, já a viscosidade dinâmica aponta que os

materiais com teor de 4% de ácido acrílico apresentam menor viscosidade, assim sendo maior

facilidade para a injeção.

125

Os ensaios de degradação in vitro, apontam perdas de massas de até 80% dos hidrogeis

em 19 semanas, comprava-se então a degradação dos materiais com um longo período de

tempo, além disso a estabilidade dos materiais nos tempos iniciais de implante, o que confere

uma excelente característica tendo em vista a aplicação de carreador de células para o tecido

lesionado.

Utilizando células tronco embrionárias de rato, o ensaio de diferenciação celular

demonstrou que o material se comporta adequadamente como substrato celular, e que a

diferenciação ocorre nas condições de cultura celular bem como nos substratos de hidrogel.

Finalmente nos ensaios de biocompatibilidade in vivo verificou-se pouca resposta

inflamatória nos hidrogéis, onde a composição 86/10/4 mostra-se menos estável em curtos

períodos de tempo, já a composição 81/15/4 apresenta excelente estabilidade a partir dos 5 das

de injeção, ambas possuem boa adesão aos tecidos, compartimentalização adequada para

carreamento de células ou drogas.

Por fim, após as caracterizações apresentadas demonstrou-se a síntese de um hidrogel

não degradável copolimerizado à macrômeros que lhe conferem propriedades de degradação e

biocompatibilidade, assim sendo, o material demonstrou-se perfeitamente viável para a

utilização como carreador de fármacos e celular, consequenteente sendo indicado para as

aplicações como biomaterial.

Sugere-se, portanto, como trabalhos futuros a este estudo, uma avaliação do

comportamento dos hidrogéis em diferentes pH, a fim de verificar a alteração dos graus de

intumescimento do hidrogéis e respostas mecânicas em condições adversas ao apresentado,

outras sugestões seriam estudos de formação dos reticulados dos hidrogéis via termogravimetria

(TGA) com modelos matemáticos, ex. Flinn-Wall-Ozawa, para avaliar a formação das ligações

covalentes formadas no momento da gelificação.

126

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139

APÊNDICE A - RESULTADOS LIBERAÇÃO CONTROLADA BEPE FAPESP

2015/20933-7

1 INTRODUCTION

Iron is an essential nutrient of the body but is toxic when accumulated. Since it plays

a critical role in many cellular processes, its homeostatic balance in cells must be tightly

regulated. However, since the human body does not have an efficient means of excreting the

in- flux of excess iron, leakage from storage proteins like ferritin and eventual iron saturation

of transferrin can ultimately result in the circulation of highly reactive non-transferrin bound

iron (NTBI) in plasma1. NTBI can form reactive oxygen species which cause oxidative stress

2. This NTBI in the plasma known as labile plasma iron (LPI) is found systemically and

can cause great damage in diseases such as iron overload 3, beta thalassemia 4, alcoholic liver

disease 5, diabetes 6,7, myelodysplastic syndromes 8, acute or chronic hepatic failure 9, end stage

renal failure 10 and in stem cell transplantation 11. Elevated labile iron levels are also found

locally in atherosclerosis 12, the tumor microenvironment 13 and many neurodegenerative

diseases 14,15. Herein we describe a LPI-responsive hydrogel which releases doses of the

chelator deferoxamine (DFO) 16 according to the detected quantity of LPI in its environment.

Chelation therapy is the most effective way to treat iron overload and diseases with iron

dyshomeostasis. However, excess iron must be removed without depriving cells of the essential

iron needed for normal metabolism 17. Also, chelators are often plagued with an extremely short

residence time in the body and excessive iron removal which can result in fatality 18. Therefore,

a safe and effective device is needed to regulate iron chelation levels to avoid removing too

much iron too fast from cells. Hydrogels are a perfect candidate for this job because of their

long duration in the body and their sensitivity to stimuli. Hydrogels can be injected into the

140

body and can swell at body temperature. They can respond to stimuli by increasing in volume

and, if a substance is entrapped inside the hydrogel, it will be released as the pores get bigger.

2 DEVELOPMENTS

In order to build and test this responsive drug delivery system, five different steps were

performed:

• Find a hydrogel that reacts to pH change;

• Determine the molecular weight cutoff of the hydrogel’s pores;

• Detect the quantity of LPI in the hydrogel’s environment by entrapping DFO;

• Study the release of DFO according to the detected quantity of LPI;

• Test the hydrogel in an in vitro model of iron overload or other diseases with iron

dyshomeostasis.

3 RESULTS AND DISCUSSIONS

3.1 PH-SENSITIVE HYDROGELS

A hydrogel that swells when pH is lowered is required as a transduction mechanism to

release doses of chelator according to the detected quantity of labile iron (see Detection of Labile

Plasma Iron). Nine different hydrogels were tested in PBS and pH 5 to determine their swelling

behaviour. Nine different synthesis (S1 to S9) see Table 9. The literature suggests that they are

pH-sensitive 19 20. The capsules were weighed at multiple times and the degree of swelling was

calculated, charted and compared. Hydrogels S3, S5 and S6 swelled when they were tested in

pH 5, while they stayed at the same volume in PBS (Fig. 78 c,e,f). They are thus the most

attractive candidates for the device. These hydrogels were tested at shorter time intervals in

PBS, pH 5 and pH 3 and for a longer period of time. We found that hydrogel S5 swelled more

as the pH got lower and that the greater part of the swelling occurred in the first 30 minutes (Fig.

141

79) This is essential since the hydrogel will release more chelator as more LPI is detected by

DFO and it will release it very soon after detection. Hydrogels S3 and S6 did not have these

properties, therefore hydrogel S5 was selected as the ideal candidate for the probe. Furthermore,

in acid solution hydrogel S5’s functional groups were shown to tilt using Infrared spectroscopy.

Tabela 9 – Compositions of Hydrogels were used in this work

Code Composition (NIPAAm /

Macromer / Acrilic Acid

Letter Used in Graphics

S1 88/10/2 A

S3 83/15/2 C

S5 78/20/2 E

S7 86/10/4 G

S9 81/15/4 I

S8 76/20/4 H

S2 84/10/6 B

S4 79/15/6 D

S6 74/20/6 F

142

Figura 78 - Swelling in response to pH change. Blue = PBS Solution; Orange = pH 5

Figura 79 – Swelling of Hydrogel S5 in different pH solutions. Blue = PBS (pH 7.4); Red = pH 3; Green =

pH 5

143

3.2 MOLECULAR WEIGHT CUTOFF

DFO can chelate small quantities of iron which is bound to transferrin or ferritin since

DFO has a higher binding affinity 21 then those transporter molecules. However, entrapping

DFO prevents transferrin bound iron and ferritin bound iron from being detected. Transferrin

has a molecular weight of around 80 kDa 22 and ferritin has a molecular weight of 474 kDa 23.

However, using UV-Vis spectroscopy to test an array of large dextrans, hydrogel S5 was found

to not let molecules with a molecular weight of 70 kDa enter by diffusion through its pores. LPI

and DFO have low molecular weight and can pass through the hydrogel’s pores easily.

3.3 DETECTION OF LABILE PLASMA IRON

DFO is a hydroxamate siderophore. These molecules have the property of

deprotonating when they bind to Fe (III) (Equation 1) 24. This property is not well known for

DFO because, when it is delivered in the blood, the blood buffer system neutralizes the released

proton. However, the blood buffer system does not have an effect on solutions inside a hydrogel

injected subcutaneously.

Fe(H2O)63+ + R1C(O)N(OH)R2 → Fe(H2O)4(R1C(O)N(O)R2)

2+ + H+ + 2H2O (Eq. 1)

When DFO is entrapped in the hydrogel and NTBI enters by diffusion (Fig 3B), DFO

forms a complex with the NTBI and releases a proton. This causes the pH to lower and the

hydrogel swells (Fig. 80C). Since the LPI concentration in the hydrogel reflects the LPI

concentration in its environment, the pH is lowered according to the detected quantity of LPI in

the hydrogel’s environment. DFO was entrapped inside hydrogel S5 during its synthesis and its

presence inside the hydrogel was verified by UV-Vis spectroscopy.

144

Figura 80 – Scheme of Hydrogel Detection of NTBI and release chelator

3.4 RELEASE OF CHELATOR

When the pH is lowered, the hydrogel swells increasing the size of its pores and DFO

is released (Fig. 80D). When the pH returns to its normal level, the hydrogel shrinks back

and DFO is no longer released. Thus, the chelator is released according to the quantity of LPI

in the environment. The hydrogel S5 with the entrapped deferoxamine was tested in PBS and

PBS with a concentration of 5 µmol/L, 10 µmol/L and 15 µmol/L of ferric ammonium citrate

(LPI is often found bound to citrate in the body), which are average concentrations of LPI in

patients suffering from iron overload and other diseases with iron dyshomeostasis 25. The

release of chelator was observed using UV- Vis spectroscopy and the hydrogels were also

weighed to determine if they swelled. The release of chelator at each concentration gave results

similar to Fig. 2 as was expected.

3.5 IN VITRO TESTING

The hydrogel entrapped with DFO will be tested in an iron overloaded cell culture and

a normal cell culture. If the hydrogel releases DFO in the iron overloaded culture, this will cause

the cells to be depleted in iron and they will biosynthesize more transferrin to compen- sate and

145

biosynthesize less ferritin, a storage molecule 26. We will thus indirectly detect the release of

deferoxamine by performing a Northern Blot analysis for transferrin mRNA and an

immunoprecipitation for ferritin. If the transferrin levels have increased and ferritin levels have

decreased, then DFO will have been released.

4 DISCUSSION

To our knowledge, this is the first drug delivery system to detect elevated levels of LPI

in vivo and release a chelator in response. Assays have been proposed to detect LPI outside the

body for diagnosis and research 27, 28. However, these assays which use siderophores like

deferoxamine to detect LPI can have skewed results since siderophores complex small

quantities of transferrin and ferritin bound iron 2, The hydrogel we developed can also more

precisely detect LPI as an assay, since we determined it had pore sizes that would not let these

big transporter molecules permeate through the membrane, but allowed the entry of LPI.

Finally, the hydrogel can be injected in the blood to treat disease with systemic iron

dyshomeostasis and, more interestingly, localized iron dyshomeostasis. Labile iron is emerging

as a promising therapeutic target for many diseases 29 and this device could potentially be used

to release many other drugs in response to elevated levels of LPI.

5. PRELIMINARY RESULTS

In this study we have tested the sweeling of hydrogels in the presence of different pH,

choosing the best composition to use in the release studies. The swelling tests show the S5 is

the best composition for use in deferoxamine release; this fact is because the ability of the

material decrease the swelling in lower pH environments, this fact is important because when

the organism have a lot of iron the pH of the blood change to lower levels.

The release of deferoxamine by UV-visible is going to be presented in the next report

and we believe the results will be presented in an international congress.

146

APÊNDICE B – RESULTADOS XPS E TGA BEPE FAPESP 2015/20933-7

INTRODUCTION

Hydrogels are defined as tridimensional networks made by homo or copolymers

crosslinked by physical or chemical process that swelling in water 36. Chemical crosslinked

hydrogels have covalent bonds between polymeric chains to form the crosslinks, physical

crosslinked hydrogels in other way does not have covalent bonds between chains, they are

linked by intermolecular forces such as electrostatic, hydrophobic or hydrogen bonds37.

Injectable hydrogels are promising candidates in biomaterials field, mainly in tissue

engineering applications, given their swelling and mechanical properties, ability to encapsulate

drugs and cells, further the minimum invasive application38.

The objective of this work was the surface characterization by XPS (x-ray

photoelectron spectroscopy) and TGA (thermogravimetric analysis. Proving the

copolymerization between the monomers NIPAAm (N-Isopropylacrylamide), AAc (Acrylic

Acid) and the macromer HEMAPLADLA-co-TMC (hydroxiethylmetacrilate, L and D,L lactic

acid, trymethylene carbonate).

2. RESULTS AND DISCUSSIONS

2.1 X-RAY PHOTOELECTRON SPECTROSCOPY (XPS)

X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) was performed with a VG ESCALAB 3 MK

II (Thermo VG Scientific), using non-monochromated Mg Ka X-rays (h? = 1253,6 eV) at an

instrument resolution of 0,7 eV and a perpendicular take-off angle. The analysis chamber

pressure was < 10-9 torr. Following Shirley background removal, the component peaks were

separated by the VG Avantage software. The energy was calibrated by setting the C1s C-C

peaks of all the surfaces to 285 eV. FWHM values were those previously established in our

147

laboratory. The samples were disinfected and kept on the desiccator 15 min to ensure be

completely dry, and after were analyzed.

Figure 81 show the structure of hydrogels and Table 10, 11 and 12 summarizes the

results between chemical bonds existing in hydrogels with 10%, 15% and 20% of macromers

respectively calculated by XPS.

Figura 81 - schematic representation of the copolymer of poli(NIPAAm-co-AAc-co¬-HEMAPLDLA-co¬-

TMC)

Tabela 10 – Atomic percentage of elements and chemical bond comparison between hydrogels with 10%

of macromer

Tabela 11 - Atomic percentage of elements and chemical bond comparison between hydrogels with 15% of

macromer

Tabela 12 – Atomic percentage of elements and chemical bond comparison between hydrogels with 20%

of macromer

148

We divided groups with the same amount of macromer (HEMAPLDLA-co-TMC),

figure 82, 83 e 84 shows the XPS spectra for the elements C1s, O1s and N1s for hydrogels with

10%, 15% and 20% of macromer respectively.

Figura 82 – XPS spectra for hydrogels with 10% of macromer

149


150


In case of materials with 10% (w/w) of macromer, we have in S2 we can check a bigger

atomic percentage of peaks in 285 eV than S7 and S1, in other hand we have less quantity of

peaks in 288 eV and 399.8 eV, which means that we have less NIPAAm monomers in this

synthesis than in S7 or S1.

Peak localized in 284.6 eV have small changes between the compositions, it makes

sense because all the mass quantity of macromer in the beginning of the synthesis of the

copolymer was the same (10% w/w). At the peak 533.8 eV that corresponds to carboxylic acid

groups in the acrylic acid we have an expected reduction of the atomic percentage when we put

less mass of this compound in the synthesis, the difference between the synthesis and the results

found probably it is because large amounts of O=C-N groups was in the surface and the XPS is

a surface characterization technique.

151

For materials with 15% (w/w) of macromer, we have checked higher at% in S3 (285

eV) demonstrating this material have more quantity of carbon-carbon, probably due to the

quantity of NIPAAm added in the synthesis, but an important aspect would be considerate is

the fact in S9 we have higher atomic percentage of C-O (284.6 eV), we attribute this fact like

an optimal limit for the polymerization between the monomers and the macromer.

Finally, with 20% of macromer we have a higher quantity of C-O (284.6 eV) in S5

composition, this composition has 4% of acrylic acid in the synthesis, is the same standard for

all the compositions with 4% of acrylic acid, it is an indication that 4% of acrylic acid is a limit

for the maximum efficiency between the macromer and the backbone of poly N-isopropyl

acrylamide.

An important lift point is about the XPS characterization, this technique has

limitations, one of them is the analysis just in the surface of the material, because of that

polymers with higher molar mass have different conformational structures, adding more

reagents or monomers we can change this structure, and because of this we have differences

between synthesis with same amount of macromer for example. In another hand, we have

consistency between XPS and NMR (data not shown), proving the copolymerization of all

monomers to form the hydrogel.

2.2 THERMOGRAVIMETRIC ANALYSIS (TGA)

Thermogravimetric analysis was performed to evaluate the thermostability of the

hydrogels, solutions with 12% (w/v) of hydrogels was put into aluminum pans and submitted

to heating from 25 ºC to 300ºC, in a heath flow of 10ºC/min. The results of Tonset, Td and weight

loss are summarized in Table 13.

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Tabela 13 – TGA results of hydrogels

Composition Tonset (ºC) Td (ºC) Weight Loss (%)

88/10/2 135 200 82

86/10/4 159 240 82,5

84/10/6 134 204 83,35

83/15/2 150 223 82,3

81/15/4 128 195 83,28

79/15/6 90 135 74,47

78/20/2 135 199 84,43

76/20/4 55 83 72

74/20/6 149 220 82,95

All hydrogels composition has thermostability in lower temperatures, the beginning of

degradation of the hydrogels are higher than 100ºC, except in the compositions 79/15/6 and

76/20/4, in the first case we believe the big quantity of acrilyc acid gives more hydrophilicity

to material and keeps higher quantities of water, in other hand when have the heating of the

sample this water are liberated fast and the structure have no time to new rearrangement and

does not keeps the stability even in lower temperatures. The same explanation is valid for the

composition 76/20/4; the difference is just in the quantity of macromer, higher quantity of the

macromer entrapped more quantity of water and the effect is similar that occurs in the

composition 79/15/6.

Another important consideration is the beginning of weight loss of the materials are

higher than 100ºC, that phenomena occurs by the entrapment of water in the hydrogels, even

when we have a constant heat flow, the water vapors are tied in hydrogels, and just adding more

energy in the materials we have the beginning of weight loss. Figures 85, 86 e 87 shows the

TGA curves for the compositions with 10%, 15% and 20% of macromer respectively.

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Figura 85 – TGA Curves for Hydrogel with 10% of macromer


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All curves show a behavior of stability in the beginning of heat, after temperature

increases the water are released from the hydrogel in vapor form, and we have considerably

weight loss – more than 80% in each material – it corroborates the results found in swelling

test, when we have swelling ratios higher than 100% in some cases. The stability of hydrogels

in higher temperatures, just the release of water is very important for biomedical application

when the body temperature is around 37ºC. The mass remaining (around 20%) is the material

in the beginning of solution and gelation of hydrogel.

sÍntese e caracterizaÇÃo de uma classe de hidrogÉis...

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