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SNPs e suas aplicações

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASCENTRO DE BIOTECNOLOGIADISCIPLINA DE GENÔMICA II

Karine BegniniDoutoranda em Biotecnologia

CONCEITO

Variação genômica mais abundante

1 a cada 300 nucleotídeos 10 milhões no genoma humano

Ocorrência NATURAL

90% das variações genômicas são SNPs

MUTANTE ou MUTAÇÃO

X X

Posições de base única no DNA genômico, em que ocorrem diferenças nos ALELOS de um mesmo gene, em indivíduos normais de uma população.

1%

CONCEITO

Mutações pontuais (INSERÇÃO/DELEÇÃO) não são SNPs!

cSNP: bases variantes que ocorrem no cDNA (RNA)

Podem ocorrer em qualquer parte do genoma, mas são mais frequentes em regiões não codificantes

CLASSIFICAÇÃO

NÚMERO DE ALELOS

• Bi/Di-alélicos dois alelos diferentes*

• Tri-alélicos três alelos diferentes

• Tetra-alélicos quatro alelos diferentes

CLASSIFICAÇÃO

TIPO DE BASE

• Transição substituição de uma purina por outra purina (C-T) ou de uma pirimidina por outra pirimidina (G-A)

• Transversão substituição de uma purina por uma pirimidina (C-A) (C-G) (T-A) (T-G)

2/3 de todos os SNPs são C-T

EFEITOS NA TRANSCRIÇÃO/TRADUÇÃO

POLIMORFISMO SINÔNIMO OU SILENCIOSO

Substituição do nucleotídeo resulta em um códon que codifica o MESMO aminoácido (e portanto proteínas IGUAIS)

POLIMORFISMO NÃO SINÔNIMO

Substituição resulta em um novo códon (proteínas ALTERADAS)

alteração no códon modifica o aminoácido

alteração no códon resulta em um stop códon

DNA SNP T para A

Códon no RNAGAU para GUU

AminoácidoAspartato para Valina

Mudança na proteína

Aspartato Valina

mRNA

C T

G A U G U U

GAU GUU

C AA A

IMPORTÂNCIA

“Combustível” que dirige a evolução

Resposta a tratamentos médicos

Suscetibilidade a doenças

MEDICINA PREVENTIVA

MEDICINA INDIVIDUALIZADA

Somente ~15% dos SNPs são comuns aos demais primatas

APLICAÇÕES

MEDICINA INDIVIDUALIZADA

Câncer

Doenças Cardiovasculares

Doenças Degenerativas

Diabetes

Problemas Reprodutivos

MARCADORES BIOLÓGICOS

APLICAÇÕES

MEDICINA DE POPULAÇÕES

Marcadores genéticos de regiões associadas a doenças/características relacionadas a populações específicas

AGROPECUÁRIA

Marcadores genéticos pra doenças

Reprodução e Produtividade

APLICAÇÕES

TRABALHOS GPO

Arg72Pro SNP da p53:

CCC PROLINA

CGC ARGININA

Pro/Pro

Pro/Arg

Arg/Arg

PROLINA

ARGININA • sem histórico câncer• baixo peso ao nascer• indivíduos pele branca

• indivíduos pele negra• histórico familiar câncer


TRABALHOS GPO


CCC PROLINA

CGC ARGININA

Pro/Pro

Pro/Arg

Arg/Arg

PRO/ARG

ARG/ARG• baixa associação com aborto

• alta associação com aborto


APLICAÇÕES

TRABALHOS GPO

MÉTODOS DE DETECÇÃO

FERRAMENTAS DE IDENTIFICAÇÃO

SEQUENCIAMENTO

• Seqüenciamento Sanger, seqüenciamento de segunda geração (Roche 454, Solexa-Illumina; Solid; Pirosequenciamento)

• Vantagem: avaliação de muitos SNPs ao mesmo tempo

• Desvantagem: custo elevado; interpretação errônea dados.

PCR RFLP

O fragmento de gene contendo o SNP de interesse é amplificado com primers específicos por PCR, purificado e submetido a um tratamento

com uma enzima de restrição (digestão) que reconheça apenas um dos alelos. Posteriormente, os fragmentos são separados por eletroforese

para diferenciação dos alelos por tamanho.

digestão digestão –– AciIAciI ou ou SfcISfcI

sanguesangue DNADNA PCRPCR eletroforeseeletroforese ananáálise em gellise em gel

eletroforeseeletroforese

360C

2hClivagem ezimática Clivagem ezimática

BstU BstU II

sanguesangue DNADNA PCRPCR eletroforeseeletroforese ananáálise em gel lise em gel

eletroforeseeletroforese

de agarose de agarose

ananáálise em gellise em gelananáálise em gel lise em gel de agarose de agarose


Tabela 1 – Seqüências dos primers para a detecção do polimorfismo do códon 72 no éxon 4

Tabela 2 – Fragmentos do polimorfismo do códon 72 obtidos com a RFLP e seus respectivos

genótipos

Fragmentos

(pb)

Genótipos

Pro/Pro Pro/Arg Arg/Arg

199 Sim Sim Não

113 Não Sim Sim

86 Não Sim Sim

PCR RFLP Arg72Pro SNP da p53:

Pro/Pro Pro/ArgArg/Arg

• Vantagens:

1.não requer equipamentos avançados2. simples

PCR RFLP

• Desvantagens:

1.Extremamente laboriosa2.Um único SNP por vez3.Existência de enzima de restrição que diferencie os dois alelos

Pro/Pro Pro/ArgArg/Arg



Hibridização – real time PCR

Sonda Taqman®: detecta sequências específicas nos fragmentos de DNA amplificados por PCR.


Hibridização – real time PCR

• Vantagens:

1.Extremamente precisa e rápida2.Análise de muito SNPs por reação

• Desvantagens:

1.Bastante cara2.Necessita equipamentos mais complexos3.Sonda específica pra cada SNP


Outras técnicas

Microarranjos de DNA

Espectometria de massa

Microssatélites

BANCOS DE BANCOS DE DADOSDADOS


FUNCIONALIDADE

OBRIGADA!

[email protected]

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