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Biocatálise em Fase Orgânica Maria Alice Zarur Coelho Priscilla Filomena Fonseca Amaral Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos

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Biocatálise em Fase Orgânica

Maria Alice Zarur Coelho

Priscilla Filomena Fonseca Amaral

Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos

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Biocatálise em Fase Orgânica

Vantagens:trocas no equilíbrio da reação, como conseqüência da alteração do coeficiente de partição de

substratos e produtos entre as fases de interesse;

redução da inibição devido a substratos e produtos;

facilidade de recuperação de produtos e biocatalisador;

aumento da termoestabilidade do biocatalisador;

menor risco de contaminação microbiana;

aumento da estereoespecificidade na resolução de misturas racêmicas;

variação na especificidade de algumas enzimas por seus substratos;

aumento da solubilidade das espécies apolares;

a imobilização freqüentemente não é necessária, mas se esta é desejável uma simples adsorção ou deposição sobre superfícies não porosas é satisfatória.

Desvantagens:desnaturação e/ou inibição do biocatalisador pela presença do solvente orgânico;

aumento da complexidade do sistema de reação;

custos adicionais de solventes, co-solventes ou surfactantes.

Motivação

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Sistemas de Biocatálise em Fase Orgânica

• Homogêneos: misturas de água com solventes orgânicos miscíveis

• Heterogêneos:

Macro-heterogêneos

Micro-heterogêneos - micelas reversas

Sistema Líquido-líquido

Sistema Sólido-líquido-líquido

Enzimas sólidas suspensas em solventes orgânicos

Biocatálise em Fase Orgânica

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Biocatálise em Fase Orgânica

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Sistemas de Biocatálise em Fase Orgânica

• Homogêneos:

Biocatálise em Fase Orgânica

Efeito: Interação do solvente com a enzima

Causa: Solubilização da capa de água;

Trocas conformacionais

Exemplos:

• síntese de penicilina G com penilicinaacilase de Kluyvera citrophila em glicerol 20% (v/v) • síntese de aspartame por termosilinaem soluções de água e metanol

atividades de síntese ; atividades hidrolíticas(aumento da conc. do solvente orgânico miscível)

• deslocamento favorável do equílibrio na reação de isomerização da glicose a frutose com glicose isomerase ao aumentar-se a concentração de etanol em misturas etanol-água

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Sistemas de Biocatálise em Fase Orgânica

• Macro-Heterogêneos: Sistema Líquido-líquido

Biocatálise em Fase Orgânica

• a reação enzimática ocorre somente na fase aquosa• O substrato se encontra dissolvido na fase orgânica e é particionado na fase aquosa

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Sistemas de Biocatálise em Fase Orgânica

• Macro-Heterogêneos: Sistema Líquido-líquido

Biocatálise em Fase Orgânica

Vantagens:• converter compostos pouco solúveis em água;

• conduzir com alto rendimento reações que ocorram com formação de água como produto (p.ex., síntese de peptídeos e de ésteres de aminoácidos);

• preparação simples;

• fácil separação de produtos de reação e regeneração da enzima.

Desvantagens:• partição de solventes polares usados como fase orgânica em água - perda de atividade

catalítica da enzima dissolvida na fase aquosa;

• área interfacial água-solvente orgânico é bastante pequena e conseqüentemente a magnitude da transferência de massa através da interface é baixa - emulsão;

• intensa agitação pode gerar uma tendência das enzimas a adsorver-se na interface.

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Sistemas de Biocatálise em Fase Orgânica

• Macro-Heterogêneos: Sistema Sólido-líquido-líquido

Biocatálise em Fase Orgânica

Enzima: imobilizada• adsorção a suportes sólidos porosos;• união covalente à superfície do suporte sólido;• encapsulamento em géis poliméricos

Protegidos do contato direto com a interface

Ex.: -hidroxiesteróide desidrogenase emágua-acetato de etila:• imobilizada em Sepharose 4B e ativada com CNBr: 60% da ativ. inicial (2 meses);• enzima livre: inativada (poucos dias).

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Sistemas de Biocatálise em Fase Orgânica

• Macro-Heterogêneos: Sistema Sólido-líquido-líquido

Biocatálise em Fase Orgânica

Vantagens em relação aos sistemas líquido-líquido:

Desvantagem:

• Facilitar a separação do biocatalisador do sistema de reação para sua posterior reutilização;

• Promover uma interface comparativamente grande;

• Limitar a transferência de massa, especialmente quando a hidrofobicidade da matriz e dos reagentes que difundem sejam marcadamente distintas.

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Sistemas de Biocatálise em Fase Orgânica

• Macro-Heterogêneos: Enzimas Sólidas Suspensas em Solventes Orgânicos

Biocatálise em Fase Orgânica

Enzima: preparados comerciais de enzima, em estado cristalino ou liofilizadas, e enzimas precipitadas com acetona a partir de uma solução aquosa;

solvente orgânico e uma enzima sólida hidratada, protegida do contato com o

solvente orgânico por uma capa de proteína desnaturada

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Sistemas de Biocatálise em Fase Orgânica

• Macro-Heterogêneos: Enzimas Sólidas Suspensas em Solventes Orgânicos

Biocatálise em Fase Orgânica

Solventes hidrofóbicos x Solventes hidrofílicos;

Existência de uma “memória” enzimática;

Aumento da rigidez devido a desidratação

• No nível molecular...

• Aumento da termoestabilidade;

• Troca de especificidade que mostram as enzimas pelos seus substratos

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Dependência da atividade da lipase pancreática com o pH da solução aquosa a partir da qual a enzima foi recuperada

(*) Transesterificação entre tributirina e heptanol, em mistura formada pelo éster e heptanol 2M, contendo 0.02% de água;(o) Hidrólise de tributirina em água(pH = 8.4 corresponde ao pH ótimo de atividade hidrolítica)

Sistemas de Biocatálise em Fase Orgânica

• Macro-Heterogêneos: Enzimas Sólidas Suspensas em Solventes Orgânicos

Biocatálise em Fase Orgânica

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Sistemas de Biocatálise em Fase Orgânica

• Macro-Heterogêneos: Enzimas Sólidas Suspensas em Solventes Orgânicos

Biocatálise em Fase Orgânica

Solventes hidrofóbicos x Solventes hidrofílicos;

Existência de uma “memória” enzimática;

Aumento da rigidez devido a desidratação

• No nível molecular: grupos iônicos da enzima adquirem um certo estado de ionização na solução aquosa e este estado e sua atividade correspondente são retidos no estado sólido e em solvente orgânico

• Aumento da termoestabilidade;

• Troca de especificidade que mostram as enzimas pelos seus substratos

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Sistemas de Biocatálise em Fase Orgânica

• Macro-Heterogêneos: Enzimas Sólidas Suspensas em Solventes Orgânicos

Biocatálise em Fase Orgânica

Vantagens devido a insolubilidade e a desidratação das proteínas suspensas em um meio orgânico de baixa polaridade :

• Aumento da termoestabilidade e estabilidade de armazenamento

• As moléculas de enzima retém sua conformação original em presença de solventes orgânicos mesmo em altas temperaturas;

• Alternativa a imobilização da enzima em um suporte, por oferecer as vantagens próprias de uma enzima imobilizada no que se refere a sua maior rigidez configuracional;

• Permite recuperar facilmente o biocatalisador;

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Sistemas de Biocatálise em Fase Orgânica

• Micro-Heterogêneos: Micelas reversas

Biocatálise em Fase Orgânica

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Sistemas de Biocatálise em Fase Orgânica

• Micro-Heterogêneos: Micelas reversas

Biocatálise em Fase Orgânica

Propriedades:

Vantagens:

• Capacidade de reter grande quantidade de água;

• Capacidade para apanhar as moléculas de proteínas (enzimas) em sua estrutura interna;

Como? Quantidade de água?

• Flexibilidade – Enzima hidrofílica;

– Enzima superficialmente ativa;

– Enzima hidrofóbica

• Meio naturalEx.: Constante cinética para a oxidação de pirogalol por peroxidase solubilizada dentro de micelas reversas é aproximadamente cem vezes maior que a obtida em solução aquosa

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Princípios Físico-Químicos

Papel da água:

Biocatálise em Fase Orgânica

• As propriedades fisico-químicas exibidas por uma enzima estão vinculadas direta ou indiretamente com o papel da água nas interações não-covalentes (eletrostáticas, pontes de hidrogênio, van der Waals e hidrofóbicas)

• É requerida alguma quantidade de água para a catálise enzimática;

• Hipótese: uma pequena camada hidratante para atuar como componente primário do microambiente da mesma;

• Princípio: manter uma enzima totalmente hidratada e ativa, conservando uma pequena proporção de água no volume de reação;

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Princípios Físico-Químicos

Papel da água:

ex: quimiotripsina em octano (50 H2O : E)

polifenoloxidase em clorofórmio (0,5% v/v H2O)

Glucoamilase: D-glicose em di e trietileno glicol (10% v/v H2O)

Biocatálise em Fase Orgânica

• Quantidade

• Atividade

(o) dietileno glicol; ( ) trietileno glicol

A quantidade de água adsorvida por uma enzima em solventes orgânicos proporciona uma melhor correlação para a atividade enzimática

Enzimas sem atividade em solventes org. são empregadas a níveis sub-ótimos de

hidratação

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Princípios Físico-Químicos

Interações que afetam a estabilidade

Biocatálise em Fase Orgânica

• Propriedades catalíticas completa: estrutura conformacionalestritamente definida (interações com o meio e entre elas mesmas);

• Pontes de enxofre:

reduzem a possibilidade de desdobramento da enzima;

limitam a agregação e posterior inativação irreversível.

Conformação Interações

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Princípios Físico-Químicos

Interações que afetam a estabilidade

Biocatálise em Fase Orgânica

• Ligações hidrogênio:

Solvente aquoso:

Solvente não aquoso:

Incapaz de formar enlaces hidrogênio (ou fracos)

Maximiza as ligações hidrogênio internas

Estrutura alternativa: custo energético mais alto para a enzima

Conformação inativa ou perda de flexibilidade conformacional

Conformação Interações

Cadeia polipeptídica desdobrada: ligações hidrogênio com o solvente.

Proteína dobrada: ligações hidrogênio com o solvente e interações intra-cadeia.

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Princípios Físico-Químicos

Interações que afetam a estabilidade

Biocatálise em Fase Orgânica

• Interações eletrostásticas:

Ambiente aquoso: a solvatação de seus resíduos carregados tende a ser máxima e, em conseqüência, sua estabilidade aumenta.

Ambiente hidrofóbico: as pontes salinas são muito instáveis

Conformação Interações

Interações não-covalentes alcançarão um novo equilíbrio em um solvente orgânico, o que pode resultar em perda de atividade catalítica e, em alguns casos, desdobramento.Contudo, em sistemas severamente perturbados, tais como o de umaenzima em um solvente orgânico polar, podem-se realizar algumas modificações que permitam redistribuir as interações críticas e, em conseqüência, compensar o efeito desfavorável do solvente.

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Princípios Físico-Químicos

Propriedades dos solventes e seus efeitos

Biocatálise em Fase Orgânica

• inibição ou inativação da enzima: Devido a: alterações nas interaçõesOcorre com: enzimas solúveis em sistemas bifásicos

sistemas aquosos com baixa [solventes] miscíveis com a água

• interage com substratos e produtos:Devido a: afinidadeConsequência: diminuição da atividade catalíticaExemplo: clorofórmio (aceptor de radicais fenólicos) diminui a atividade

catalítica da peroxidase na oxidação de fenóis

• remove a capa de águaDevido a: afinidade do solvente com a águaConsequência: diminuição da atividade catalíticaOcorre com: solventes polares (solubilizam água)

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Princípios Físico-Químicos

Propriedades dos solventes e seus efeitos

Biocatálise em Fase Orgânica

Atividade catalítica relativa da fosfatase ácida na hidrólise de p-nitrofenilfosfato em misturas de diferentes concentrações de

solventes orgânicos em água: ( ) etanol, ( ) dimetil-formamida, ( )glicerol

Solvente orgânico retira a água da capa superficial da proteína e

distorcer o estado de hidratação da molécula em uma proporção tal que a

conformação ativa cataliticamente em solução não se estabelece e, como conseqüência, a enzima se desnatura

e eventualmente precipita

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Princípios Físico-Químicos

Propriedades dos solventes e seus efeitos

Biocatálise em Fase Orgânica

• Propriedades: hidrofobicidade, polaridade, miscibilidade, solubilidade, tensão superficial, constante dielétrica, momento dipolar, densidade e viscosidade dos solventes orgânicos

• A capacidade desnaturante dos solventes não-aquosos tem uma alta correlação com sua hidrofobicidade. Quantificação: coeficiente de partição (P).

• Os solventes orgânicos mais hidrofílicos necessitam uma menor concentração crítica de água na mistura água-solvente orgânico para não provocar a desnaturação da enzima.

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Princípios Físico-Químicos

Propriedades de solutos e produtos de reação

Biocatálise em Fase Orgânica

• altas concentrações de substrato no micro-ambiente da enzima favorecem altas velocidades de reação enzimática;

• Interface: formação do gradiente de difusão

SUBSTRATO: Para impulsionar o substrato dissolvido na fase orgânica até a interface, as

polaridades do meio orgânico e o substrato devem ser diferentes;

Para manter solúvel o substrato na interface, as diferenças de polaridade entre a interface e o substrato devem ser pequenas;

Para situações em que uma dada concentração de substrato no microambiente da enzima provoque inibição (inibição por substrato), deve-se otimizar a polaridade da interface com respeito a polaridade do substrato.

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Princípios Físico-Químicos

Propriedades de solutos e produtos de reação

Biocatálise em Fase Orgânica

• altas concentrações de substrato no micro-ambiente da enzima favorecem altas velocidades de reação enzimática;

• Interface: formação do gradiente de difusão

PRODUTO:Para que os produtos não fiquem retidos na interface, as diferenças de polaridade

entre os produtos e a interface devem ser grandes;

Para que os produtos difundam até o solvente orgânico, a polaridade do mesmo deve ser semelhante a dos produtos; como conseqüência, se evitará a inibição por produtos, já que em torno da enzima a concentração dos mesmos será sempre baixa.

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Comportamento Cinético

Bases Conceituais: o comportamento de uma enzima em um sistema heterogêneo pode diferir daquele que apresenta em soluções homogêneas, mesmo em ausência de restrições difusionais.

Biocatálise em Fase Orgânica

• A concentração das espécies nas vizinhanças da enzima concentração presente na fase contínua do solvente

• Concentração do soluto na interface aquosa:

Concentração de soluto no solvente orgânico imiscível

Parâmetro de hidrofobicidade: P (coeficiente de partição);

• Assumindo a validez da equação de Michaelis-Menten:

i

i'

maxCi = concentração na interface

Ci = fç ( [solvente], P )

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Comportamento Cinético

Bases Conceituais:

Biocatálise em Fase Orgânica

• P Só é válido

quando se forma

interface real

• Cumprimento da Equação de Michaelis-Menten

• Substratos pouco solúveis em água:

Concentração limite de

crítica de substrato solubilidade

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Micelas reversas e sistemas bifásicos imiscíveis;Enzima suspensa em solvente orgânico anidro não tem como medir pH

pH da solução aquosa antes de liofilizar = máx ativ.

em sol aquosa

Comportamento Cinético

Parâmetros que influenciam a catálise enzimática:

Biocatálise em Fase Orgânica

• Efeito do pH:

Ativ. máx microambiente: pH ótimo da catáliseem fase aquosa

• Efeito da temperatura

reações responsáveis requerem água

pela inativação térmica

das enzimas

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• Efeito da temperatura

Ex.: Lipase pancreática a 100oC

Ambiente aquoso inativada instantaneamente

Solvente orgânico Ativ > que a 25oC em fase aquosa

Enzima suspensa em solvente orgânico anidro:

Solventes mais hidrofóbicos x Solventes mais hidrofílicos

Comportamento Cinético

Parâmetros que influenciam a catálise enzimática:

Biocatálise em Fase Orgânica

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• Efeito da temperatura

Micelas reversas

Depende: - do conteúdo de água

- da natureza do surfactante

Preparados termoestáveis

• Efeito da agitação

Micelas reversas e Sistemas com enzimas em solventes anidros: POSITIVO

Sistemas bifásicos imiscíveis: Aumento pode causar INATIVAÇÃO

Comportamento Cinético

Parâmetros que influenciam a catálise enzimática:

Biocatálise em Fase Orgânica

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• Efeito difusional

Enzima suspensa em solvente:

Redução do tamanho das partículas de biocatalisador

- Pulverização ou sonificação

Substrato atravessa capa de proteína desnaturada

Comportamento Cinético

Parâmetros que influenciam a catálise enzimática:

Biocatálise em Fase Orgânica

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Reatores Enzimáticos

Maria Alice Zarur Coelho

Priscilla Filomena Fonseca Amaral

Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos

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Reatores Enzimáticos

Introdução

Uso de enzima x fermentação

Enzima livre x imobilizada

Três tipos básicos de reatores:

• Custo de isolamento, imobilização;

• Maior rendimento

• Redução de contaminantes;

• Batelada ou contínuo (ou semi-contínuo)

• Tanque agitado (com ou sem ultra-filtração);

• Leito fluidizado;

• Leito fixo (coluna empacotada ou módulo fibrilar)

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Reatores Enzimáticos

Introdução

Tipos de reatores:

CSTRouPFR

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Reatores Enzimáticos

Escolha dos Reatores

Quanto a condução do processo

• Batelada

- Pequena escala

- Flexibilidade operacional

• Contínuo

- Larga escala

- Maior produtividade

- Facilidade de controle automático

- Constância nas condições operacionais

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Reatores Enzimáticos

Escolha dos Reatores

Quanto ao tipo de reator

• Aspectos operacionais

- Ex.: Controle rígido de pH

• Característica da corrente de alimentação

- Viscosidade

- Presença de material particulado

• Característica do biocatalisador (livre ou imob.)

- Característica do suporte

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Reatores Enzimáticos

Escolha dos Reatores

Quanto ao tipo de reator

• Aspectos cinéticos

- Reações que obedecem Michaelis-Menten:

leito fixo e fluidizado

- Reações com inibição pelo substrato:

Tanque com agitação

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AltosIdem reator contínuo de UF

DifícilAltaIdem colunaPistãoMódulo Fibrilar

AltosBoasIntermediário

Intermediária

Intermediária entre o tanque

agitado e a coluna

Intermediário

Reator de Leito

Fluidizado

AltosRegulares (problemas de

concentração na membrana)

FácilIntermediária

Idem tanque agitado contínuo

Mistura Perfeita

Reator Contínuo de Ultrafiltração

(UF)

Intermediários

Regulares (problemas de compactação e

canalização)

DifícilAltaMaior que o tanque agitado (exceto para

casos de inibição)

PistãoColuna Empacotada

BaixosBoasFácilBaixaMenor que em coluna (exceto para casos de

inibição)

Mistura Perfeita

Tanque Agitado

Contínuo

Custos de

Operação

Características Hidrodinâ

micas

Controle de

Parâmetros

Razão Enzima /

Volume do Reator

Eficiência de Conversão

Regime de

Fluxo

Tipo de Reator

Reatores Enzimáticos

Escolha dos Reatores

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Cinética de Michaelis-Menten, reação irreversível, sem inibição:

Reatores Enzimáticos

Cinética de Reatores Enzimáticos Ideais

• Reator batelada, isotérmico:

max

m

V Sr

K S r taxa de reação [mol.(s.L)-1]

o m maxo

SS S K ln V t

S

o

o

S

SSo m maxS K ln 1 V t

Conversão enzimática em

um reator batelada

max

m

V SdSr

dt K S

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Reatores Enzimáticos

Cinética de Reatores Enzimáticos Ideais

• Reator batelada, isotérmico

o m maxS K ln 1 V t

Variação da quantidade de substrato convertido ( ) com o tempo de reação (t) para diferentes relações de So/Km.

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Reatores Enzimáticos

Cinética de Reatores Enzimáticos Ideais

• Reator contínuo CSTR ou PFR:

- Q: vazão volumétrica de alimentação de substrato (em [L.s-1])

- CSTR: R 0r *V Q S S VR volume de reação [L]

maxo R

m

V SQ S S *V

K S

o maxo m R

S S VS S K *V

S Q

o

o

S

SS maxo m R

VS K *V

1 Q

Conversão enzimática em

um reator CSTR

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Reatores Enzimáticos

Cinética de Reatores Enzimáticos Ideais

• Reator contínuo CSTR ou PFR:

- Q: vazão volumétrica de alimentação de substrato (em [L.s-1])

- PFR: VR volume de reação [L]

o

o

S

SSConversão

enzimática em um reator PFR

dVrdSQQSQS oo

maxo m R

o

VSS S K ln *V

S Q

maxo m R

VS K ln 1 *V

Q

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Reatores Enzimáticos

Cinética de Reatores Enzimáticos Ideais

• Reator contínuo CSTR ou PFR:

Relação entre a conversão ( ) e a vazão volumétria (Q) em ambos reatores enzimáticos para diferentes razões So/Km.

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Reatores Enzimáticos

• Desempenho de reatores contínuo CSTR ou PFR:

- S0 , S0/Km>10 e curvas similares para CSTR e PFR

- S0/Km e PFR tem maior

- Quantidade da enzima é um parâmetro importante

Cinética de Reatores Enzimáticos Ideais

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Reatores Enzimáticos

Inibição Enzimática e Performance do Reator

Inibição pelo substratomax

2

mis

V Sr

SS K K

22o max

o m Ris

S VS K *V

1 K Q• CSTR:

• PFR2

2o maxo m R

is

S VS K ln 1 *V

2K Q

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Reatores Enzimáticos

Inibição Enzimática e Performance do Reator

Inibição pelo substrato

• CSTR e PFR:

Efeito da inibição pelo substrato na conversão ( ) em função da vazão volumétria (Q) para um PFR (____) e um CSTR (----) em

diferentes razões So/Km.

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Reatores Enzimáticos

Inibição Enzimática e Performance do Reator

Inibição pelo produto

• Competitiva (altera o valor de Km):

- CSTR

- PFR

max

mip

V Sr

IS K 1

K

2maxm

o m o Rip

VKS K S *V

1 1 K Q

o maxmo m R

ip ip

S VK1 S 1 K ln 1 *V

K K Q

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Reatores Enzimáticos

Inibição Enzimática e Performance do Reator

Inibição pelo produto

• Não-competitiva

(altera o valor de Vmáx):

- CSTR

- PFR

max

m

ip

V Sr

S KI1

K

2 2o maxm

o m Rip o

S VKS K 1 *V

1 K S 1 Q

2o o maxmo o m R

ip ip ip ip

2S S VKS 1 S 1 K ln 1 *V

K K 2K K Q

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Efeito da inibição competitiva e não-competitiva na conversão ( ) em função do tempo de reação (t) para razão So/Km = 10 e diferentes relações de Kip/Km.

Reatores Enzimáticos

Inibição Enzimática e Performance do Reator

Inibição pelo produto

• Competitiva e não-competitiva

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Reatores Enzimáticos

Limitações difusionais no desempenho do reator

A limitação difusional externa: em reatores de leito fixo

Q baixo

A limitação difusional interna da taxa de reação de uma enzima imobilizada pode ser reduzida por:

• diminuição da razão atividade / volume do suporte, conduzindo a uma menor concentração de saída por unidade de volume do reator;

• aumento da concentração de substrato;

• diminuição da espessura ou do diâmetro do suporte da enzima imobilizada.

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Reatores Enzimáticos

Operação de Reatores Enzimáticos

Problemas operacionais

Perda de desempenho com o tempo

• Sistema de controle de pH;

• Atividade por unidade de volume no reator;

• Temperatura de operação

• Desnaturação: térmica ou de cizalhamento

• Envenenamento: por inibidores

• Contaminação microbiana

• Corrente de fluxo no reator mudar ou se a distribuição da enzima no reator se alterar

• Natureza do suporte

• Dessorção

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