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U N I V E R S I D A D E D E S Ã O P A U L O
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA – EEL
GUILHERME AUGUSTO MARTINS DA SILVA
Síntese Enzimática, Caracterização Físico-Química e Térmica de
Biodiesel de Sebo Bovino por Rota Etílica
Lorena-SP
2009
GUILHERME AUGUSTO MARTINS DA SILVA
Síntese Enzimática, Caracterização Físico-Química e Térmica de
Biodiesel de Sebo Bovino por Rota Etílica
Dissertação apresentada a Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Engenharia Química. Área de Concentração: Processos Catalíticos e Biocatalíticos Orientadora: Dra. Heizir Ferreira de Castro
Lorena- SP
2009
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Catalogação na Publicação
Biblioteca Universitária Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo
Silva, Guilherme Augusto Martins da
Síntese enzimática, caracterização físico-química e térmica de biodiesel de sebo bovino por rota etílica / Guilherme Augusto Martins da Silva; orientadora Heizir Ferreira de Castro.—Lorena: 2009.
97 f: fig.
Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de Concentração: Processos Catalíticos e Biocatalíticos) – Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo.
1. Biodiesel 2. Sebo bovino 3. Lipase 4. Etanol. I. Título.
577.152.9 - CDU
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho especialmente a minha mãe, Rosana Mary Martins, por todo o apoio e confiança em mim
depositado, pelo carinho e atenção nos conselhos dados e pelo seu exemplo, me ensinando a importância do
conhecimento na vida de um ser humano. Mãe, sem você nada disso seria possível.
AGRADECIMENTOS
A professora Heizir pela mais profunda dedicação, paciência, sinceridade e excelente orientação que certamente farão toda a diferença na minha formação.
Ao meu pai Antônio Luiz, pelo carinho e pelo apoio incessante em todas as etapas desse trabalho.
A minha Vó Cidinha pelos conselhos, pelo mais profundo carinho, afeto e dedicação em todos os momentos da minha vida.
Ao meu irmão Vinícius que por muitas vezes fez o papel de pai na minha jornada para a conclusão desse trabalho.
As minhas tias Silvana e Simone pela presença imprescindível na minha vida e durante toda a etapa dos meus estudos.
A todos os meus familiares que me apoiaram e acreditaram neste trabalho.
A minha colega Cibele pela presteza na realização das análises de infravermelho.
Aos professores Victor H. Perez, Júlio C. dos Santos pelos ensinamentos e experiência passados durante esses anos de convivência.
A professora Ana Paula pela ajuda na discussão das análises de termogravimetria, RMN e FTIR.
Aos meus amigos do Laboratório de Biocatálise, André, Matheus, Felipe, Renato, Daniel, e as minhas amigas, Patrícia, Larissa, Gisele, Ariela, Grazielle, Lívia, Aline e Ana Paula.
Em especial ao meu amigo André do Laboratório de Biocatálise que durante toda a execução deste trabalho foi companheiro e muito prestativo.
Aos meus irmãos que por vezes chamo-os de amigo, Diogo, Cassiano que embora distantes estão sempre presentes, e os meus amigos da banda, Lucas, Celso e Pimenta, pela grande amizade e afinidade.
A minha namorada Janaína Cescon, pela paciência, companheirismo, carinho incondicional e apoio absoluto durante esta fase da minha vida.
A Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão de bolsa de estudo.
RESUMO
SILVA, G. A. M. Síntese enzimática, caracterização físico-química e térmica de biodiesel de sebo bovino por rota etílica. 2009, 97 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena/ SP, 2009.
O objetivo deste projeto foi estabelecer um processo de síntese enzimática de biodiesel empregando sebo bovino como matéria-prima lipídica. Para o desenvolvimento deste projeto de mestrado, o trabalho experimental foi direcionado para as seguintes atividades: 1) Determinação das propriedades físico-químicas da matéria-prima; 2) Testes de seleção do derivado imobilizado mais efetivo para mediar a síntese de biodiesel a partir do sebo bovino; 3) Estabelecimento de metodologias para analisar o produto transesterificado por diferentes técnicas; 4) Otimização da síntese de biodiesel por planejamento experimental; 5) Aumento de escala e comprovação do modelo estatístico e 6) Caracterização do produto formado e comparação com o biodiesel comercial. Os resultados das análises de composição da matéria-prima indicaram que a amostra de sebo bovino atende ao padrão exigido para ser utilizado na reação de transesterificação (baixo teor de água e índice de acidez). Para os testes de triagem do biocatalisador, diferentes fontes de lipase (EC 3.1.1.3) foram imobilizadas no suporte híbrido POS-PVA e utilizadas para mediar a reação de transesterificação do sebo bovino e etanol em meio isento de solventes. Todas as reações foram realizadas nas mesmas condições operacionais (temperatura de 45°C, razão molar de 1:9 (gordura/álcool) e 400 unidades de atividade enzimática por grama de sebo bovino). Os rendimentos de transesterificação, bem como os valores de produtividade, foram os parâmetros relevantes na escolha do biocatalisador mais efetivo. Os produtos transesterificados obtidos com rendimentos superiores a 90% foram ainda submetidos a análises complementares, tais como viscosidade cinemática, espectrometria de absorção na região do infravermelho e termogravimetria. O derivado imobilizado selecionado (Pseudomonas cepacia) foi caracterizado quanto às suas propriedades bioquímicas, cinéticas e de estabilidade térmica. Um planejamento experimental foi adotado para determinar a influência do pH e da temperatura na atividade enzimática. Para o estudo da cinética enzimática foram realizados experimentos com diferentes concentrações de substrato (azeite de oliva) visando determinar os parâmetros Km e Vmax na cinética de Michaelis-Menten. Um estudo da estabilidade térmica da lipase livre e imobilizada foi realizado a 60°C para determinar a constante de desativação térmica. Na seqüência, o derivado imobilizado selecionado foi utilizado para otimizar as variáveis do processo (temperatura e razão molar) empregando a metodologia de superfície de resposta, obtendo o seguinte modelo matemático para o rendimento de transesterificação: Y = 86,89-7,46 x1-2,04 x2 em que x1 e x2 são os valores codificados para as variáveis temperatura e razão molar, respectivamente. Com os resultados obtidos, as condições ótimas de reação foram determinadas por software (T= 48ºC e razão molar 1:7 (sebo:etanol)) e então um experimento de comprovação do modelo foi realizado usando uma massa de 110 gramas de meio reacional. Os valores de rendimento da reação apresentaram uma boa correlação com os resultados preditos pelo modelo (91,62% em 8h de reação). Finalmente o produto obtido foi submetido a uma sequência de testes e análises para verificar o potencial do processo enzimático. Os testes indicaram que o processo enzimático é capaz de produzir biodiesel com boa qualidade, apesar de não atender plenamente as normas estabelecidas pela Agência Nacional de Petróleo para uso de combustíveis no país. Palavras chave: Biodiesel, Sebo-bovino, Etanol, Lipase.
ABSTRACT
SILVA, G. A. M. Enzymatic synthesis, physico-chemical and thermal characterization of biodiesel from beef-tallow by ethyl route. 2009, 97 f. Dissertation (Master of Science in Chemical Engineering) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena/ SP, 2009.
The objective of this project was to establish a process for enzymatic synthesis of biodiesel using beef tallow and ethanol as feedstock. For the development of this project, the experimental work was directed to the following activities: 1) Determination of the physicochemical properties of the raw material; 2) Tests for selection of the most efficient immobilized derivative to mediate the biodiesel synthesis from beef tallow; 3) Methodology establishment for analyzing the product transesterificated by different techniques; 4) Optimization the synthesis of biodiesel by factorial design; 5) Mathematical model comprovation and increase the reaction mass 6) Characterization of the product formed and comparison with the industrial biodiesel. The results of analysis of composition of the raw materials indicated that the sample of beef tallow meets the standard required to be used in the transesterification reaction (low water content and acidity). For screening tests of biocatalysts, different sources of lipase (EC 3.1.1.3) were immobilized on POS-PVA support and used to mediate the transesterification of beef tallow and ethanol in solvent free medium. All reactions were performed under the same operating conditions (temperature of 45°C, molar ratio of 1:9 (fat/ alcohol) and 400 units of enzyme activity per gram of beef tallow). The transesterification yields and the productivity values were important parameters in choosing the most effective biocatalysts. Transesterificated products obtained with yields higher than 90% were subjected to additional tests, such as kinematic viscosity, infrared spectroscopy, thermogravimetry and 1H NMR. The immobilized derivative selected (Pseudomonas cepacia) was characterized according to biochemical and kinetics properties and thermal stability. An experimental design was adopted to determine the influence of pH and temperature on enzyme activity. To study the enzyme kinetics experiments were performed with different concentrations of substrate (olive oil) to determine the parameters Km and Vmax in the Michaelis-Menten kinetics. A study of thermal stability of free and immobilized lipase was performed at 60 °C to determine the constant of thermal deactivation. Following this, the chosen immobilized derivative was used to optimize the transesterification reaction (temperature and molar ratio) via response surface methodology, obtaining the following mathematical model (Y=86.89-7.46x1-2.04x2) for the transesterification yield, where x1 and x2 are the coded values for the variables temperature and molar ratio, respectively. Optima reaction conditions were determined by software (T = 48 ° C and molar ratio of 1:7 (tallow: ethanol)) and then a trial to confirm the mathematical model was performed using 110 g of reaction medium. The yield value showed good correlation with results predicted by the model (91.62% in 8 h reaction). Finally, the product was submitted to a sequence of tests and analysis to verify the potential of the enzymatic process. The tests indicated that the enzymatic process allows producing biodiesel with good quality, although the specifications recommended by the Brazilian Petroleum Agency (ANP) to be used as biofuel were not fully attained.
Keywords: Biodiesel, Beef-tallow, Ethanol, Lipases
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1. Dados estatísticos da produção de biodiesel dos últimos 4 anos (milhões de litros). .................................................................................................................. 17
Figura 2.1. Reservas de petróleo segundo regiões geográficas – 2003 (bilhões de barris). . 20
Figura 2.2. Distribuição das matérias-primas oleaginosas para produção de biodiesel no território brasileiro. ............................................................................................. 22
Figura 2.3. Potencial de participação de diferentes matérias-primas lipídicas na produção de biodiesel no Brasil. ............................................................................................. 23
Figura 2.4. Equação geral da transesterificação de triacilglicerol com álcool. ..................... 26
Figura 2.5. Reação de transesterificação de matéria-prima lipídica contendo elevada concentração de ácidos graxos livres via catálise ácida. .................................... 27
Figura 2.6. Fluxograma do processo de transesterificação química catalisada por álcali. ... 29
Figura 2.7. Fluxograma do processo de transesterificação enzimática. ................................ 29
Figura 3.1. Reator de vidro utilizado para síntese de biodiesel nos testes de triagem da fonte de lipase. ............................................................................................................. 44
Figura 3.2. Reator com agitação mecânica e condensador de refluxo. ................................. 46
Figura 3.3. Processo de decantação do biodiesel. ................................................................. 46
Figura 4.1. Perfil de formação dos ésteres de etila (-■-C14; -●-C16, -▲-C18, -▼- C18:1, –Total) em função do tempo de reação da etanólise do sebo bovino catalisada por diferentes lipases imobilizadas em POS-PVA. Todos os ensaios foram realizados a 45°C, sob agitação magnética. Lipase PS (a), Lipase AK (b), Lipolase (c), lipase Pancreática (d), Piccantase R8000 (e)................................. 59
Figura 4.2. Espectro na região do infravermelho das amostras de sebo bovino refinado e do biodiesel sintetizado pelas lipases PS e AK. ...................................................... 61
Figura 4.3. Análise termogravimétrica das amostras de sebo bovino (linha vermelha) e do biodiesel sintetizados pela atuação das lipases PS (linha verde) e AK (linha azul). (a) TG, (b) DTG........................................................................................ 63
Figura 4.4. Ressonância magnética nuclear de prótons das amostras de sebo bovino e do biodiesel sintetizado pelas lipases PS e AK. ...................................................... 65
Figura 4.5. Superfície de resposta de acordo com a equação predita para a atividade hidrolítica da lipase PS livre. .............................................................................. 68
Figura 4.6. Superfície de resposta de acordo com a equação predita para a atividade hidrolítica da lipase PS imobilizada. .................................................................. 68
Figura 4.7. Atividade hidrolítica da lipase de Pseudomonas cepacia livre em função da concentração do substrato. .................................................................................. 70
Figura 4.8. Atividade hidrolítica da lipase de Pseudomonas cepacia imobilizada em função da concentração do substrato. ............................................................................. 70
Figura 4.9. Desativação térmica da lipase PS livre e imobilizada em POS-PVA (experimentos conduzidos em solução tampão fosfato 0,1 M, pH 6,5 sob temperatura de 60 ºC, considerando como 100% a atividade da lipase livre em 43290 U/g e do derivado imobilizado em 2009 U/g). ........................................ 71
Figura 4.10. Espectro na região do infravermelho da lipase PS livre e imobilizada em POS-PVA. ................................................................................................................... 72
Figura 4.11. Perfil de formação dos monoésteres de etila (-■-C14; -●-C16, -▲-C18, -▼- C18:1, –♦–Total) na reação de transesterificação do sebo bovino empregando lipase PS imobilizada em POS-PVA, sob diferentes condições operacionais (ensaios 1 a 6). .................................................................................................... 74
Figura 4.11. Perfil de formação dos monoésteres de etila (-■-C14; -●-C16, -▲-C18, -▼- C18:1, –♦–Total) na reação de transesterificação do sebo bovino empregando lipase PS imobilizada em POS-PVA, sob diferentes condições operacionais (ensaios 7 a 11). .................................................................................................. 75
Figura 4.12. Superfície de resposta para o rendimento de transesterificação do sebo bovino e etanol catalisada pela lipase PS imobilizada em POS-PVA em função da temperatura e razão molar, de acordo com o modelo predito pela equação 4.1. 77
Figura 4.13. Rendimento de transesterificação em função dos resultados obtidos pelo planejamento experimental. ................................................................................ 77
Figura 4.14. Análise termogravimétrica das amostras de biodiesel obtidas na reação transesterificação do sebo bovino com etanol catalisada pela lipase PS imobilizada em diferentes condições reacionais. ............................................... 78
Figura 4.15. Análise termogravimétrica comparativa das amostras de biodiesel sintetizadas pela lipase PS, observando o efeito da temperatura. .......................................... 79
Figura 4.16. Análise termogravimétrica comparativa das amostras de biodiesel sintetizadas pela lipase PS, observando o efeito da razão molar. .......................................... 79
Figura 4.17. Perfil de formação dos monoésteres de etila (-■-C14; -●-C16, -▲-C18, -▼- C18:1, –♦–Total) na reação de transesterificação do sebo bovino empregando lipase PS imobilizada em POS-PVA nas condições preditas pelo modelo estatístico. ........................................................................................................... 80
Figura 4.18. Análise termogravimétrica da amostra de biodiesel obtido na reação de comprovação do modelo estatístico (48˚C e razão molar 1:7 sebo/etanol) empregando a lipase PS como catalisador. ......................................................... 83
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1 - Principais vantagens e desvantagens dos processos químico e enzimático para a produção de biodiesel. ...................................................................................... 28
Tabela 2.2 - Ácidos graxos presentes no sebo bovino. ......................................................... 36
Tabela 2.3 - Propriedades dos principais ácidos graxos presentes em óleos e gorduras. ..... 36
Tabela 2.4 - Dados comparativos entre as propriedades do biodiesel metílico obtido de diferentes matérias-primas e o diesel mineral. ................................................. 37
Tabela 2.5 - Aplicação de técnicas termoanalíticas para determinação de propriedades dos combustíveis. .................................................................................................... 40
Tabela 3.1 - Equipamentos utilizados ................................................................................... 42
Tabela 3.2 - Propriedades morfológicas do suporte POS-PVA quanto à área superficial, volume de poros e tamanho médio dos poros................................................... 43
Tabela 3.3 - Níveis reais e codificados para as variáveis temperatura e razão molar, avaliados segundo planejamento experimental estrela rotacional. ................... 45
Tabela 3.4 - Níveis reais e codificados para as variáveis temperatura e pH, avaliados segundo planejamento experimental estrela rotacional. ................................... 47
Tabela 3.5 - Condições para determinação dos ésteres de etila. ........................................... 52
Tabela 4.1 - Propriedades do sebo bovino refinado.............................................................. 55
Tabela 4.2 - Atividade hidrolítica, teor de proteínas e atividade específica das lipases testadas ............................................................................................................. 56
Tabela 4.3 - Atividades hidrolítica e sintética dos derivados imobilizados em POS-PVA e rendimento de imobilização.............................................................................. 57
Tabela 4.4 - Resumo dos experimentos realizados utilizando diferentes lipases imobilizadas em POS-PVA ativado com epicloridrina. ........................................................ 60
Tabela 4.5 - Viscosidade do sebo bovino e das amostras de biodiesel obtidas nas reações catalisadas pela lipase PS e AK. ....................................................................... 61
Tabela 4.6 - Etapas e temperaturas de degradação térmica para as amostras de sebo bovino, biodiesel sintetizado pela atuação das lipases PS e AK. .................................. 64
Tabela 4.7 - Resultados obtidos no planejamento experimental para avaliação do efeito das variáveis pH e temperatura na atividade hidrolítica da lipase PS livre e imobilizada. ...................................................................................................... 67
Tabela 4.8 - Estimativas dos efeitos das variáveis, erro padrão e valores de p para a atividade hidrolítica da lipase PS livre e imobilizada segundo os resultados dos planejamentos. .................................................................................................. 67
Tabela 4.9- Modelos obtidos pela superfície de resposta gerada no planejamento experimental estrela rotacional, considerando a atividade enzimática (A, U/g) como função dos valores codificados de pH (x1) e temperatura (x2). .............. 68
Tabela 4.10 - Análise de variância (ANOVA) para a atividade hidrolítica da lipase PS livre. .......................................................................................................................... 69
Tabela 4.11 - Análise de variância (ANOVA) para a atividade hidrolítica da lipase PS imobilizada em POS-PVA. ............................................................................... 69
Tabela 4.12 - Valores de km e Vmax obtidos a partir das curvas da atividade hidrolítica em função da concentração de substrato. ............................................................... 70
Tabela 4.13 - Constantes de inativação térmica da lipase livre e imobilizada e seus respectivos tempos de meia-vida. ..................................................................... 71
Tabela 4.14 - Características bioquímicas e cinéticas das preparações de lipase PS livre e imobilizada em POS-PVA. ............................................................................... 72
Tabela 4.15 - Matriz experimental e resultados obtidos de acordo com o planejamento fatorial 22 estrela rotacional utilizado para avaliar a influência das variáveis: temperatura e razão molar no rendimento da transesterificação do sebo bovino e etanol. ............................................................................................................. 73
Tabela 4.16- Estimativas dos efeitos das variáveis, erro padrão e valores de p para o rendimento de transesterificação segundo os resultados do planejamento estrela rotacional. ......................................................................................................... 76
Tabela 4.17 - Análise de variância (ANOVA) para os rendimentos de transesterificação do sebo bovino com etanol. ................................................................................... 76
Tabela 4.18 – Comparação das propriedades do biodiesel e adequação a norma vigente. ..... 81
ÍNDICE DE SIGLAS
AK – Lipase de Pseudomonas fluorescens
ANP – Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis
ASTM – American Society for Testing and Materials
CG – Cromatografia Gasosa
DTG – Termogravimetria diferencial
FTIR – Fourier Transform Infrared Spectroscopy
Kd – Constante de desativação térmica
Km – Constante de afinidade da enzima pelo substrato, constante de Michaelis-Menten
OGR – Óleos e gorduras residuais
PEG – Polietilenoglicol
POS-PVA – Polissiloxano - álcool polivinil
PS – Lipase de Pseudomonas cepacia
t1/2 – Tempo de meia vida
TAG – Triacilgliceróis
TEOS – Tetraetilortossilicato
TG – Termogravimetria
Vmax – Velocidade máxima de reação
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 16
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................ 20
2.1 Matriz energética............................................................................................................................ 20
2.2. Matérias-primas para produção de biodiesel ............................................................................. 22
2.3. Óleos vegetais e gorduras como fonte de energia renovável...................................................... 23
2.4. Reação de transesterificação para produção de biodiesel ......................................................... 25
2.5. Transesterificação enzimática ...................................................................................................... 27
2.6. Utilização de lipases imobilizadas como catalisadores ............................................................... 30
2.7. Processos de obtenção de biodiesel por via enzimática .............................................................. 31
2.8. Propriedades do biodiesel ............................................................................................................. 33
2.9. Métodos analíticos para quantificação da qualidade do biodiesel ............................................ 38
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 41
3.1. Enzimas .......................................................................................................................................... 41
3.2. Suporte de imobilização ................................................................................................................ 41
3.3. Matérias-primas ............................................................................................................................ 41
3.4. Amostra de biodiesel ..................................................................................................................... 41
3.5. Outros materiais e reagentes ........................................................................................................ 41
3.5. Equipamentos ................................................................................................................................ 42
3.6. Procedimento experimental .......................................................................................................... 42 3.6.1. Síntese e ativação do suporte híbrido POS-PVA ......................................................................................... 42 3.6.2. Imobilização de lipases de diferentes fontes no suporte híbrido ................................................................. 43 3.6.3. Testes de triagem da lipase mais efetiva para efetuar a síntese de biodiesel ............................................... 43 3.6.4.Otimização da transesterificação enzimática de sebo bovino e etanol por planejamento experimental ...... 44 3.6.5.Comprovação do modelo estatístico ............................................................................................................ 45 3.6.6. Separação dos ésteres (recuperação do glicerol) ......................................................................................... 46
3.7. Caracterização das propriedades bioquímicas e cinéticas do derivado imobilizado selecionado ............................................................................................................................................ 47 3.7.1. Propriedades bioquímicas ............................................................................................................................ 47 3.7.2. Parâmetros cinéticos da lipase livre e imobilizada ...................................................................................... 47 3.7.3. Estabilidade térmica da lipase livre e imobilizada ....................................................................................... 48
3.8. Métodos de análises ....................................................................................................................... 48 3.8.1. Características da matéria-prima (sebo bovino) .......................................................................................... 48 3.8.1.1. Índice de Acidez (I.A.) ............................................................................................................................. 48 3.8.1.2. Índice de Peróxido (I.P.) ........................................................................................................................... 49 3.8.1.3. Índice de Saponificação (I.S.) ................................................................................................................... 49 3.8.1.4. Índice de Iodo (I.I.) ................................................................................................................................... 50 3.8.2.Determinação das propriedades da lipase livre e imobilizada ...................................................................... 50 3.8.2.1.Teor de proteína ......................................................................................................................................... 50 3.8.2.2. Atividade hidrolítica da lipase e derivados imobilizados ......................................................................... 51 3.8.2.3. Atividade sintética dos derivados imobilizados ........................................................................................ 51 3.8.3. Análises do biodiesel ................................................................................................................................... 52 3.8.3.1. Determinação dos ésteres formados na reação de etanólise da gordura animal ........................................ 52 3.8.3.2. Análise de viscosidade do sebo bovino e do biodiesel ............................................................................. 53 3.8.3.3 Análise Termogravimétrica ....................................................................................................................... 53 3.8.3.4 Espectroscopia vibracional na região do infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) ................. 53
3.8.3.5 Ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) ........................................................................ 54
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 55
4.1. Caracterização da matéria-prima ................................................................................................ 55
4.2. Imobilização de lipases de diferentes fontes no suporte híbrido POS-PVA ............................. 56
4.3. Seleção do derivado imobilizado para mediar a transesterificação do sebo bovino com etanol ................................................................................................................................................................ 58
4.4. Análise do produto transesterificado (biodiesel) ........................................................................ 60 4.4.1.Viscosidade cinemática ................................................................................................................................ 60 4.4.2. Espectroscopia na região do infravermelho ................................................................................................. 61 4.4.3. Análise termogravimétrica .......................................................................................................................... 62 4.4.4. Ressonância magnética nuclear de próton ................................................................................................... 64
4.5. Propriedades bioquímicas, cinéticas do derivado selecionado para aplicação na reação de transesterificação do sebo bovino. ...................................................................................................... 66 4.5.1. Propriedades bioquímicas ............................................................................................................................ 66 4.5.2. Parâmetros cinéticos .................................................................................................................................... 69 4.5.3. Constante de desativação térmica da lipase livre e imobilizada .................................................................. 70 4.5.4. Espectro na região do Infravermelho ........................................................................................................... 71
4.6-Otimização das condições de transesterificação enzimática do sebo bovino com etanol catalisada pela lipase PS imobilizada em POS-PVA ......................................................................... 73
4.7- Estabilidade térmica das amostras de biodiesel ......................................................................... 78
4.8- Comprovação do modelo estatístico da síntese de biodiesel catalisada pela lipase de Pseudomonas cepacia e análise do produto obtido ............................................................................ 80 4.8.1- Comprovação do modelo estatístico............................................................................................................ 80 4.8.2 Comparação das propriedades do biodiesel obtido por vias enzimática e química ...................................... 81 4.8.3 Análise termogravimétrica ........................................................................................................................... 82
4.9- Análise da viabilidade técnica da produção de biodiesel derivado de sebo bovino................. 83
5. CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 85
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ................................................................... 87
REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 88
16
1. INTRODUÇÃO
O Brasil é um país com sua logística sustentada nas malhas rodoviárias e,
conseqüentemente, o consumo de diesel, pelas frotas (1,434 milhão de caminhões) é
significativo (ANTT, 2009). Esse elevado consumo, aliado ao impacto ambiental decorrente
da emissão, principalmente, de particulados e os custos de importação de uma fração do
diesel, requer pesquisas que proporcionem alternativas para melhorar este cenário, tanto no
aspecto econômico quanto no aspecto ambiental.
A busca por combustíveis alternativos é incessante e se intensificou nos últimos anos,
principalmente pela volatilidade do preço do barril de petróleo que alcançou valores próximos
a U$150,00 no primeiro trimestre de 2008, fechando o ano abaixo dos US$ 60,00. O etanol
brasileiro, por exemplo, obtido pelo processo de fermentação de matérias-primas sacaríneas
(caldo de cana-de-açúcar e melaço), vem sendo utilizado como alternativa aos combustíveis
derivados do petróleo desde 1980. No cenário atual, outras tecnologias que se destacam são:
(i) o H-BIO, tecnologia desenvolvida pela Petrobrás, na qual o óleo vegetal in-natura é
hidrogenado e adicionado ao diesel mineral e (ii) o biodiesel, mono-alquil ésteres de ácidos
graxos derivados de matérias-primas lipídicas, como óleos vegetais ou gorduras animais,
obtidos pela reação de transesterificação com álcool de cadeia curta (VASUDEVAN;
BRIGGS, 2005).
Entre essas tecnologias, a produção de biodiesel é considerada área prioritária para
desenvolvimento no país desde 2002 quando foi anunciado pelo Governo Federal o Programa
Brasileiro de Desenvolvimento Tecnológico do Biodiesel (PROBIODIESEL), tendo como
objetivo estabelecer um arcabouço regulatório para o desenvolvimento e a produção nacional
de biodiesel (KNOTHE et al., 2006). Baseado neste programa, o governo brasileiro em 13 de
janeiro de 2005 publicou a Lei 11.097 que estabelece o uso obrigatório comercial de misturas
com 2% de biodiesel e 98% de óleo diesel (mistura B2) para início de 2008, atualmente em
vigor a mistura B3, esperando-se para 2013 o aumento da participação do biodiesel para 5%
(B5) (PNPB, 2008). Esta iniciativa tem estimulado a produção nacional de biodiesel, que
segundo dados da Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis (ANP),
passou de 69 mil m3 em 2006 para 402 mil m3 em 2007, fechando o ano de 2008 com mais de
1 milhão de m3 (ANP, 2009).
17
-
20,000
40,000
60,000
80,000
100,000
120,000
140,000
Jane
iro
Feve
reiro
Mar
çoAbr
ilM
aio
Junh
oJu
lho
Agosto
Setem
bro
Out
ubro
Novem
bro
Dezem
bro
Mês
m3
2005 2006 2007 2008 2009
Figura 1.1. Dados estatísticos da produção de biodiesel dos últimos 4 anos (milhões de litros).
Fonte: ANP, 2009.
A metodologia comercial de obtenção de biodiesel utiliza freqüentemente catalisadores
homogêneos (alcalinos ou ácidos) para a transesterificação do óleo ou gordura, na presença de
metanol, produzindo ésteres metílicos de ácidos graxos e glicerol. No Brasil, a opção de
desenvolver um processo de obtenção de biodiesel a partir de etanol, representará uma
independência do modelo dominante de obtenção de biodiesel europeu e americano que
seguem a rota tecnológica metílica.
No que se refere a produção de biodiesel por transesterificação tanto por catálise
homogênea como heterogênea, verifica-se, individualmente, vantagens e desvantagens que
justificam um estudo detalhado para uma escolha adequada em função das prioridades
técnicas e/ou econômicas envolvidas.
Os catalisadores básicos usados na transesterificação homogênea incluem NaOH,
KOH, carbonatos e alcóxidos (SCHUCHARDT; SERCHEL; VARGAS, 1998), entretanto o
NaOH é o catalisador mais usado tanto por razões econômicas como pela sua disponibilidade
no mercado. A reação de transesterificação catalisada por esta base é aproximadamente 4000
vezes mais rápida que a ácida, sendo mais apropriada do ponto de vista comercial. Entretanto,
a rota por catalisador homogêneo acarreta dificuldades na separação, formação de sabões,
elevado teor residual de sódio e elevado índice de acidez, dentre outros inconvenientes. A
18
síntese de biodiesel empregando catalisador heterogêneo significa oportunidade concreta de
recuperação do catalisador, elimina os problemas de separação, índice de acidez e teor de
sódio verificados no processo anterior. Além disso, o uso de catalisador heterogêneo minimiza
os problemas relativos às etapas finais de purificação do biodiesel, pois reduz a ocorrência das
reações indesejáveis de saponificação e permite uma simplificação e redução dos custos dos
processos pela diminuição do número de operações associadas. Várias pesquisas recentes
relacionadas a alcoólise de triglicerídeos envolvem o uso de catalisadores heterogêneos, como
por exemplo, zeólitas básicas, óxidos e carbonatos de metais alcalino-terrosos e enzimas, em
particular lipases (PINTO et al., 2005; ROZYCKI et al., 2006; AKO et al, 2008).
A rota enzimática vem sendo investigada no país por diversos pesquisadores, incluindo
o Grupo de Biocatálise da Escola de Engenharia de Lorena (EEL-USP) que, desde 2003, vem
estudando a síntese enzimática de biodiesel empregando óleos vegetais de baixo custo, como
os óleos de babaçu e palma (URIOSTE, 2004; SILVA; VIEIRA; CASTRO, 2005; MENDES;
VIEIRA; CASTRO, 2006; PAULA et al., 2007; MOREIRA, 2007; MOREIRA et al., 2007;
DA RÓS, 2009). Os resultados obtidos são altamente promissores referentes à aplicação de
lipases estabilizadas em suporte não comercial híbrido constituído de polissiloxano-álcool
polivinil (POS-PVA), demonstrando que os produtos obtidos atendem as especificações
exigidas pela Agência Nacional de Petróleo para uso como biocombustível (MOREIRA et al.,
2007).
Para dar seqüência a essa linha de pesquisa, o presente projeto contempla a síntese
enzimática de biodiesel empregando, como modelo de estudo, o sistema reacional sebo
bovino e etanol. O sebo bovino foi selecionado como fonte de triglicerídeos por inúmeras
razões. A primeira delas, e talvez a mais importante, é o fato do sebo bovino não ser uma
matéria prima de consumo humano direto, ou seja, não compete com a indústria de alimentos
como o óleo de soja, por exemplo. O aspecto econômico é a outra razão importante para a
escolha do sebo bovino, uma vez que essa matéria lipídica é considerada um resíduo e,
portanto, apresenta um custo bem inferior quando comparada com outras matérias-primas
disponíveis atualmente para a produção de biodiesel no Brasil. Finalmente, com relação à
disponibilidade da matéria prima, a oferta nacional de sebo bovino é estimada em torno de
600 mil toneladas/ ano, sendo, portanto, uma fonte sustentável para a produção do
biocombustível em função da ascensão da indústria de processamento de carne bovina,
resultando na vantagem de reduzir o impacto poluidor desse subproduto que é gerado na
própria indústria agropecuária.
19
Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo estabelecer um processo de
síntese enzimática de biodiesel pela rota etílica, empregando sebo bovino como matéria-prima
lipídica e lipase imobilizada como catalisador. Para tanto foram realizadas as seguintes etapas:
1) Seleção do sistema imobilizado na reação de transesterificação do sebo bovino com etanol,
sem adição de solventes, tomando como parâmetros a velocidade de formação dos ésteres e
rendimento de reação; 2) Estabelecimento das condições de transesterificação, empregando o
sistema imobilizado selecionado em função das variáveis que interferem no processo, tais
como: temperatura e razão molar etanol/ sebo bovino, visando propor um modelo que
represente a eficiência do processo em função das variáveis selecionadas, utilizando a técnica de
planejamento experimental; 3) Comprovação do modelo estatístico e caracterização físico-
química e térmica do produto transesterificado.
20
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Matriz energética
A demanda de energia, sempre crescente no atual mundo industrializado, e os
problemas de poluição causados pelo uso de combustíveis fósseis levam à necessidade do
desenvolvimento de fontes de energia renováveis e de menor impacto ambiental que as
tradicionais. Este fato tem gerado um interesse por fontes alternativas para a substituição dos
combustíveis oriundos do petróleo. Além disso, deve-se considerar que as reservas mundiais
de petróleo são limitadas. A Figura 2.1 identifica, no mapa mundial, as reservas de petróleo
existentes em 2003.
Figura 2.1. Reservas de petróleo segundo regiões geográficas – 2003 (bilhões de barris). Fonte: Ultraperiferias, 2008.
Biomassa, bagaço de cana-de-açúcar, energia eólica e solar, álcool e o biodiesel são,
portanto, algumas fontes de energia limpa e que precisam ser melhor aproveitadas para
construção de um desenvolvimento com sustentabilidade (METZGER, 2001). Estudos atuais
apontam que a utilização da biomassa para fins energéticos vem tendo uma participação
crescente perante a matriz energética mundial, permitindo estimar que, até o ano de 2050, o
uso mundial de biomassa disponível deverá ser duas vezes maior do que a atual (FISCHER;
SCHRATTENHOLZER, 2001).
21
No Brasil, em 2007, o consumo de etanol foi da ordem de 16,47 bilhões de litros e
essa demanda vem aumentando de forma a tornar o mercado interno o principal motor da
produção (CONAB, 2008). Nesse sentido, diversos trabalhos de pesquisa vêm sendo
desenvolvidos visando aumentar a produtividade do etanol, sem aumentar a área plantada de
cana-de-açúcar utilizando, por exemplo, como matéria-prima o bagaço excedente gerado nas
plantas sucroalcooleiras.
Outra tecnologia desenvolvida como fonte alternativa ao combustível fóssil é a
hidrogenação da mistura de diesel mineral com óleo vegetal denominada H-BIO. As
vantagens da utilização desse método são inúmeras e dentre elas destacam-se o aumento da
qualidade do óleo diesel com teores reduzidos de enxofre e a não geração de subprodutos.
Porém, os problemas da utilização de combustíveis fósseis não são totalmente resolvidos em
razão do H-BIO ser apenas uma mistura com o diesel fóssil. Assim, a produção do biodiesel
está inserida em um processo cíclico que auxilia na minimização do efeito estufa, uma vez
que possibilita um equilíbrio entre a massa de carbono fixada no combustível e aquela
liberada na combustão. Adicionalmente, quando se utiliza álcool de origem mineral na
produção de biodiesel (rota metílica), somente uma parte do CO2 é reabsorvido; por outro
lado, quando se utiliza álcool de origem vegetal (rota etílica), a reabsorção ocorre na íntegra.
No aspecto ambiental, as vantagens da utilização do biodiesel são também
significativas. Entre elas, é pertinente destacar que, o biodiesel apresenta baixa toxicidade, é
biodegradável, em geral não contém enxofre e compostos aromáticos e reduz
significativamente a emissão de gases, como o monóxido de carbono (RAMOS et al., 2003).
A ausência de enxofre na composição química do biodiesel confere outra grande vantagem:
não há emissões de gases sulfurados (SOx), característicos em motores movidos a derivados
de petróleo, o que contribui, efetivamente, para a minimização do fenômeno da chuva ácida
(CHANG et al., 1996). Além disso, diferentemente do combustível fóssil, o CO2 liberado na
queima do biodiesel é reciclado por absorção durante o crescimento da massa vegetal por
meio da fotossíntese (SHEEHAN et al., 1998).
A implantação de um programa energético como o biodiesel, abre oportunidades para
grandes benefícios sociais decorrentes do alto índice de geração de emprego por capital
investido, culminando com a valorização do campo e a promoção do trabalhador rural, além
das demandas por mão-de-obra qualificada para o processamento (OLIVEIRA; COSTA,
2001).
22
2.2. Matérias-primas para produção de biodiesel
As matérias-primas para a produção de biodiesel podem ser de diferentes origens:
óleos vegetais, gorduras animais e óleos e gorduras residuais (OGR).
Em todo o mundo, as matérias lipídicas mais típicas para a produção de biodiesel são
os óleos refinados. A escolha da matéria-prima é de grande importância no processo de
produção uma vez que leva-se em conta a disponibilidade, o custo, as propriedades de
armazenamento e o seu desempenho como combustível (DUARTE, 2009). Na União
Européia, por exemplo, emprega-se, para a produção de biodiesel, os óleos de colza e girassol
e nos Estados Unidos o óleo de soja e as gorduras animais (KNOTHE et al., 2006).
O Brasil apresenta uma ampla variedade de culturas oleaginosas, que com o Programa
Nacional de Biodiesel, podem favorecer o pequeno produtor e promover o desenvolvimento
em regiões mais distantes dos grandes centros urbanos e tecnológicos do país. A Figura 2.2
mostra a variedade de matérias-primas e como essas culturas estão distribuídas pelo mapa
geográfico brasileiro.
Figura 2.2. Distribuição das matérias-primas oleaginosas para produção de biodiesel no território brasileiro.
Fonte: Biodieselbr, 2009.
Entre as gorduras animais que são possíveis de serem transformadas em biodiesel,
merecem destaque o sebo bovino, os óleos de peixes, a banha de porco, gordura de frango,
23
entre outras matérias graxas. Outra possibilidade de produção do biodiesel é a reutilização de
óleos e gorduras vegetais residuais (OGR) de processos de fritura de alimentos, que tem se
mostrado atraente na medida em que aproveita o óleo vegetal como combustível após sua
utilização alimentar (WUST, 2004; HAAS, 2005). Observa-se que uma pequena porcentagem
dos OGR vem sendo coletada para a fabricação de sabão ou de rações para animais, sendo que
a maior parte ainda é eliminada através do sistema de esgoto e lixo, gerando uma carga
adicional para o tratamento de esgoto. O combustível produzido a partir de OGR apresenta
vantagens do ponto de vista ecológico com relação ao óleo diesel derivado do petróleo, e
vantagens com relação ao custo quando comparado ao biodiesel padrão produzido a partir do
óleo de colza. Em comparação com o diesel, o éster de OGR possui a vantagem de não emitir,
na combustão, compostos de enxofre, além de ser rapidamente biodegradável no solo e na
água (KNOTHE et al., 2006).
Recentemente, o sebo bovino tem se revelado como uma promissora fonte de matéria
prima para produção industrial de biodiesel devido a sua alta produção e baixo custo de
comercialização. Essa matéria-prima tem potencial para contribuir com uma parcela de 10%
na produção industrial de biodiesel (Figura 2.3). Atualmente, duas plantas industriais de
produção de biodiesel com o emprego do sebo bovino já estão operando no país com
capacidade de 50 kt/ano (Usina Barraálcool – Mato Grosso) e 100kt/ano (Usina Bertini – São
Paulo).
Figura 2.3. Potencial de participação de diferentes matérias-primas lipídicas na produção de biodiesel no Brasil. Fonte: Faleiros, 2007.
2.3. Óleos vegetais e gorduras como fonte de energia renovável
Os componentes de óleos e gorduras são os triacilgliceróis (TAG). Quimicamente, os
TAG são ésteres de ácidos graxos com glicerol (1,2,3-propanotriol). Os TAG de óleos
24
vegetais e gorduras animais contêm, tipicamente, diferentes tipos de ácidos graxos. Como
cada ácido graxo apresenta propriedades químicas peculiares, o perfil da composição dos
ácidos graxos presentes nos óleos e gorduras ditará as propriedades físicas e químicas da
matéria-prima como, por exemplo, viscosidade, ponto de fusão e estabilidade à oxidação
(KNOTHE, 2005).
Entretanto, a utilização direta de óleos vegetais em motores a diesel é muito
problemática. Estudos efetuados em diversos óleos vegetais mostraram que a sua combustão
direta conduz à carbonização na cabeça do injetor, resistência à injeção nos segmentos dos
êmbolos, diluição do óleo do Carter, contaminação do óleo lubrificante, entre outros
problemas. As causas desses problemas foram atribuídas à polimerização dos triglicerídeos,
por meio de suas ligações duplas, que conduzem à formação de depósitos, assim como a baixa
volatilidade e a alta viscosidade dos óleos vegetais que conduzem a problemas na atomização
do combustível (COSTA NETO; ROSSI, 2000; RAMOS et al., 2003).
Tecnicamente, vários estudos têm sido conduzidos para desenvolver derivados de
óleos vegetais, cujas propriedades e desempenho se aproximam do óleo diesel. Um
combustível alternativo deve ter uma técnica praticável, ser economicamente competitivo,
ambientalmente aceitável e prontamente disponível (MEHER; SAGAR; NAIK, 2006).
Três processos podem ser destacados para adequar o uso de óleos e gorduras como
combustíveis: Pirólise, Micro-emulsificação e a Transesterificação.
Pirólise é a conversão química causada pela adição de energia térmica, na presença de
nitrogênio (GROSSLEY; HEYES; HUDSON, 1962; BILLAUD; DOMINGUEZ; BROUTIN,
1995). Embora o produto da pirólise seja similar ao diesel proveniente do petróleo, a remoção
do oxigênio durante o processo térmico elimina qualquer benefício ambiental do produto
(MA; HANNA, 1999).
As microemulsões são formadas por três tipos de componentes: óleo, álcool e um
composto anfifílico. Os compostos anfifílicos são selecionados principalmente por sua
capacidade de emulsificar as misturas de óleo/ álcool, mas sua estrutura também contribui nas
propriedades finais do combustível formulado. A formulação de um combustível híbrido, tal
como as microemulsões, são geralmente mais baratas de se preparar do que o biodiesel, uma
vez que se usa a simples tecnologia de misturar os componentes em temperatura ambiente.
Todavia, apesar das microemulsões apresentarem boas características, no que diz respeito aos
padrões de atomização, verificou-se que, em longo prazo, provocam a deposição de carbono
no motor, a combustão incompleta e o aumento da viscosidade dos óleos lubrificantes
(KNOTHE et al., 2006).
25
A transesterificação é a mais comum e considerada a melhor rota para a utilização dos
óleos vegetais e gorduras como alternativa ao diesel fóssil, pois confere ao produto (biodiesel)
características como viscosidade, índice de cetano muito próximas das do diesel. Os óleos
vegetais, quando submetidos ao processo de transesterificação, sofrem quedas bruscas nos
valores do ponto de névoa e viscosidade, podendo, assim, com o combustível obtido, ser
queimado diretamente em motores diesel sem a necessidade de adaptação (FUKUDA;
KONDO; NODA, 2001).
2.4. Reação de transesterificação para produção de biodiesel
Para a reação de interesse, ou seja, transesterificação de óleos e gorduras para
produção de biodiesel, utiliza-se um álcool de cadeia curta, normalmente o metanol ou etanol,
uma fonte de triglicerídeos e um catalisador.
De modo geral, denomina-se transesterificação um conjunto de reações que utilizam
um triglicerídeo como reagente comum. Existe um conjunto de reações de transesterificação,
que diferem entre si de acordo com a substância que reage com o triglicerídeo. Quando se
emprega um éster, a transesterificação é chamada de interesterificação, quando emprega um
ácido é chamada acidólise, quando emprega o glicerol é chamada de glicerólise e quando se
emprega um álcool chama-se alcoólise. Nesse último caso, a reação é utilizada para produção
de biodiesel, obtendo-se glicerol como subproduto (FUKUDA; KONDO; NODA, 2001). Os
álcoois que podem ser utilizados são o metanol, etanol, propanol, butanol e pentanol,
principalmente pelo custo e suas propriedades físico-químicas (menor cadeia carbônica)
(MACEDO; MACEDO, 2004).
Na primeira etapa, ocorre a conversão do triglicerídeo para diglicerídeo, seguido pela
conversão do diglicerídeo para monoglicerídeo, e do monoglicerídeo para glicerol,
fornecendo, no balanço final da reação, três moléculas de éster para cada molécula de
triglicerídeo (FREEDMAN; BUTTERFIELD; PRYDE, 1986; NOUREDDINI; ZHU, 1997).
Um método muito utilizado para monitoramento da reação é a análise cromatográfica que
pode ser desenvolvido tanto para identificação de regentes ainda presentes no meio reacional
(mono, di e triglicerídeos) quanto para identificação de ésteres (FILLIERES; BENJELLOUN-
MLAYAH; DELMAS, 1995).
A reação de transesterificação com álcool pode ser representada pela equação geral
ilustrada na Figura 2.4. Para que ocorra a reação é importante monitorar as três etapas
consecutivas e a reversibilidade da reação (FUKUDA; KONDO; NODA, 2001).
26
Alguns parâmetros que se deve levar em conta em uma reação de transesterificação
são: o efeito da razão molar, temperatura e tempo de reação e o tipo de catalisador. Para a
realização da transesterificação, é necessário utilizar um excesso de álcool a fim de aumentar
a eficiência do processo, excesso esse que pode ser recuperado posteriormente. Nessa etapa se
formam duas fases: a glicerina e o biodiesel. Após a separação entre as fases, o biodiesel deve
ser purificado antes de sua utilização em motores. A glicerina pode ser recuperada e com isso
aumentar a lucratividade do processo, além do que este co-produto apresenta um vasto campo
na aplicação das indústrias químicas podendo ser utilizada, por exemplo, na fabricação de
medicamentos, cosméticos, aditivos alimentícios e lubrificantes (KNOTHE et al., 2006;
FOGLIA; NELSON; MARMER, 1998).
Figura 2.4. Equação geral da transesterificação de triacilglicerol com álcool.
A escolha do catalisador depende do tipo e da qualidade da matéria-prima a ser
utilizada (MARCHETTI; MIGUEL; ERRAZU, 2007). Por exemplo, quando se utiliza uma
matéria-prima com alto índice de acidez, ou seja, contendo elevados teores de ácidos graxos
livres, o catalisador do tipo ácido é o mais eficiente, por não apresentar restrições quanto às
propriedades de acidez da matéria-prima, embora necessite de um maior tempo de reação
quando comparado ao catalisador alcalino (VICENTE; MARTÍNEZ; ARACIL, 2004). Desta
forma, matérias-primas como óleos de frituras residuais, que apresentam elevado grau de
oxidação, são mais eficientes quando transesterificadas com catalisadores ácidos. A Figura 2.5
mostra, genericamente, uma reação de transesterificação de um material graxo contendo
elevado teor de ácidos graxos livres.
27
Figura 2.5. Reação de transesterificação de matéria-prima lipídica contendo elevada concentração de ácidos graxos livres via catálise ácida.
No caso da catálise alcalina, é necessário atentar para o teor de ácidos graxos livres
presentes na matéria-prima, bem como o teor de água. Esses fatores interferem negativamente
no processo, já que consomem o catalisador, formando sabão, aumentam a viscosidade do
produto final e dificultam a separação da glicerina (BRADSHAW; MEULY, 1944;
FREEDMAN; PRYDE; MOUNTS, 1984; FEUGE; GROSE, 1949). Os catalisadores alcalinos
mais utilizados são NaOH, KOH, carbonatos e os alcóxidos como metóxido de sódio e
etóxido de sódio (KNOTHE et al., 2006).
Apesar das transesterificações usando catalisadores químicos fornecerem altos níveis
de conversões em triglicerídeos em curtos períodos de tempo, esse tipo de catalisador
apresenta inúmeros problemas, tais como: necessidade de grande energia térmica para
ocorrência da reação, problemas com a recuperação do glicerol, a necessidade de um
tratamento posterior ao processo para remoção do catalisador (ácido ou base) do produto, as
águas de lavagem necessitam de um tratamento adequado e, por fim, a qualidade da matéria-
prima com relação aos teores de ácidos graxos livres e umidade prejudica severamente o
rendimento da reação.
2.5. Transesterificação enzimática
O processo de transesterificação enzimática consiste no processo de modificação
lipídica catalisada pelas lipases, enzimas obtidas predominantemente de bactérias, leveduras e
fungos. O processo, se otimizado, oferece inúmeras vantagens em relação ao processo
químico, pois permite maior controle sobre a distribuição posicional dos ácidos graxos no
produto final devido à seletividade e regioespecificidade das lipases (De CASTRO et al.,
2004).
As lipases são conhecidas por terem a propensão a atuar mais efetivamente em
28
moléculas de cadeia carbônica longa do que de cadeia carbônica curta (AKOH et al., 2007).
Assim, de modo geral, a eficiência da transesterificação dos triglicerídeos com metanol parece
ser muito menos favorecida do que com etanol, tanto em sistemas com ou sem solventes
orgânicos (MACEDO; MACEDO, 2004; DU; XU; LIU, 2003).
Uma comparação das principais vantagens e desvantagens das vias química e
enzimática é apresentada na Tabela 2.1 (ANTCZAK et al., 2009; ROZYCKI et al., 2006). Em
particular, deve ser observado que o subproduto glicerol pode ser facilmente recuperado, sem
processos complexos, e os ácidos graxos livres nos óleos também são convertidos em seus
ésteres correspondentes. Verifica-se, ainda, que a via enzimática substitui os agressivos
produtos usados como catalisadores na via química, propicia a reciclagem do catalisador,
evita a contaminação do biodiesel facilitando assim o processo de purificação.
Tabela 2.1 - Principais vantagens e desvantagens dos processos químico e enzimático para a produção de biodiesel.
Vias Vantagens Desvantagens
Química
• Simplicidade;
• Alto rendimento;
• Curto tempo de reação.
• Dificuldade de separação do catalisador;
• Impossibilidade de reutilização do catalisador;
• Obtenção de produtos com menor grau de pureza.
Enzimática
• Facilidade de separação do catalisador (suporte);
• Obtenção de produtos com maior grau de pureza;
• Longo tempo de reação; • Custo elevado das enzimas; • Baixo rendimento.
As Figuras 2.6 e 2.7 mostram os fluxogramas dos processos de obtenção de biodiesel
por transesterificação química e transesterificação enzimática, respectivamente.
A limitação para a aplicação industrial do processo de transesterificação enzimática é
ainda o alto custo das enzimas, tornando a substituição dos catalisadores químicos um grande
desafio. Vários trabalhos vêm sendo realizados com o intuito de contornar esse problema,
incluindo a imobilização das lipases em suportes que permitem a reutilização do derivado
imobilizado.
29
Figura 2.6. Fluxograma do processo de transesterificação química catalisada por álcali.
Figura 2.7. Fluxograma do processo de transesterificação enzimática.
30
2.6. Utilização de lipases imobilizadas como catalisadores
Enzimas imobilizadas são sistemas enzimáticos fisicamente confinados ou localizadas
em certa região definida do espaço com retenção de suas atividades catalíticas e que podem
ser usada repetida e continuamente. A imobilização tem, sob o ponto de vista comercial, como
finalidade a utilização da atividade enzimática por um período de tempo maior, operar de
forma contínua possibilitando um melhor controle das variáveis do processo, facilitar a
separação do biocatalisador do produto de reação, conferir a enzima propriedades catalíticas
como maior estabilidade ao pH e temperatura (ZANIN; MORAES, 2004).
Para a escolha do suporte, devem ser consideradas as propriedades físicas e químicas,
bem como aquelas relativas à regeneração do material. Os suportes são divididos em suportes
orgânicos, inorgânicos e híbridos. Devido à complexidade da natureza enzimática, não existe
um suporte ideal e universal para um processo enzimático, portanto, critérios devem ser
tomados na escolha do suporte de forma a atender as necessidades de cada situação.
O método de imobilização determinará como a enzima se ligará ao suporte. A enzima
pode ser fixada na superfície de um suporte por meio de interações como: adsorção física,
ligação iônica, ligação covalente e ligação a um metal (quelação). Portanto, para estabelecer
um processo enzimático bem sucedido, é necessário escolher uma enzima com grande
afinidade pelo substrato a ser trabalhado, um suporte para imobilização que atenda aos
requisitos do reator e do processo escolhido, e, finalmente, e não menos importante, a escolha
do método de imobilização para a fixação da enzima ao suporte (ZANIN; MORAES, 2004).
Apesar da existência de inúmeros suportes comerciais, a utilização de lipases
imobilizadas em processos tem exigido a elaboração de matrizes específicas para essa
finalidade, que resultem em preparados imobilizados com elevadas atividades e características
hidrodinâmicas adequadas ao uso em reatores (BALCÃO; PAIVA; MALCATA, 1996;
ZANIN; MORAES, 2004; DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004).
As mais recentes tecnologias requerem materiais com combinação de propriedades
que não são encontradas nos materiais convencionais (PEREIRA; ZANIN; CASTRO, 2003).
Materiais híbridos orgânico-inorgânico são preparados pela combinação de componentes
orgânicos e inorgânicos e constituem uma alternativa para a produção de novos materiais
multifuncionais, com uma larga faixa de aplicações (GILL; BALLESTEROS, 1998).
Independentemente da estratégia utilizada para preparar uma matriz híbrida o processo sol-gel
é, indiscutivelmente, o mais empregado (GILL; BALLESTEROS, 1998). O processo sol-gel
envolve diversas variáveis, como tempo e temperatura da reação, natureza do catalisador,
31
concentração de reagentes, entre outros (REETZ et al., 1998; KEELING-TUCKER et al.,
2000). Estas variáveis determinam as características finais dos materiais, incluindo a
porcentagem de hidrólise e condensação de grupos reativos, densidade de reticulação e
homogeneidade do produto. Além disso, aditivos químicos podem ser usados para melhorar o
processo e obter materiais com melhores propriedades o que possibilita modificações nas
propriedades mecânicas, controle de porosidade e ajuste no balanço hidrofílico/ hidrofóbico
(REETZ et al., 1998).
Materiais sol-gel têm sido empregados como suporte para a imobilização de enzimas
tanto por encapsulação (REETZ et al., 1998; KEELING-TUCKER et al., 2000) como por
ligação covalente (BRUNO et al., 2004; FREITAS, 2006; PAULA et al., 2008).
Recentemente foi testada com sucesso uma matriz híbrida constituída de
polissiloxano-álcool polivinílico (POS-PVA) para imobilização de diferentes fontes de lipase:
Mucor miehei (BRUNO et al., 2004), Candida antarctica (FREITAS, 2006), pancreática
(PAULA et al., 2007); Pseudomonas fluorescens (MOREIRA, 2007; SANTOS et al., 2008);
Candida rugosa (PAULA et al., 2008) e Pseudomonas cepacia (DA RÓS, 2009). Essa matriz
combina os atributos físico-químicos de materiais inorgânicos e orgânicos, permitindo a
manipulação da hidrofilicidade e hidrofobicidade, condutividade elétrica, carga iônica,
porosidade e propriedades mecânicas em geral (PAULA et al., 2008), bem como elevada
atividade e estabilidade. Em função desses resultados promissores, este suporte foi
selecionado para imobilizar as preparações de lipase a serem testadas no presente trabalho.
2.7. Processos de obtenção de biodiesel por via enzimática
Trabalhos publicados indicam que a síntese enzimática de biodiesel é dependente de
diversas variáveis, incluindo: sistema reacional (tipo de óleo e álcool), origem da preparação
enzimática, tipo de suporte de imobilização, razão molar óleo e álcool, temperatura, entre
outros fatores (RANGANATHAN; NARASIMHAM; MUTHUKUMAR, 2008).
Verifica-se uma tendência ao uso dos óleos de soja ou palma, de preparações de
lipases imobilizadas disponíveis comercialmente (Lipozyme e/ou Novozym 435) e o metanol
como doador do grupo acila. Devido à elevada polaridade desse álcool (ISO et al., 2001) as
reações são efetuadas em meio contendo solvente orgânico, com clorofórmio, 1-4-dioxano e
benzeno em proporções geralmente elevada da ordem de 50- 90% em relação à massa total de
reagentes envolvidos (KRISNANGKURA; SIMAMAHARNNOP, 1992). Para emprego de
outros álcoois (etanol, propanol e butanol) não é necessária á adição de solventes orgânicos no
meio reacional, o que viabiliza o processo de obtenção de biodiesel com redução de custos
32
com solvente (normalmente tóxicos, alta inflamabilidade e alto custo) e etapas de destilação, o
que reduz o consumo de energia (ISO et al., 2001). Nos trabalhos desenvolvidos no Brasil,
preferencialmente tem sido usado etanol como doador do grupo acila, por ser proveniente de
biomassa tornando o processo totalmente independente do petróleo.
Mittelbach (1990) estudou a transesterificação do óleo de girassol empregando
preparações de lipase imobilizadas disponíveis comercialmente, como Mucor miehei
(Lipozyme) e Candida antarctica (Novozym 435). Foram utilizados como agentes acilantes o
metanol, etanol e butanol, na presença (éter de petróleo) ou ausência de solventes. Os
rendimentos mais elevados foram obtidos com o etanol e o butanol independente da presença
de solvente, porém, o metanol produziu somente traços de produto na ausência de solvente.
Em trabalhos similares, essa limitação foi atribuída ao efeito inibitório do metanol sobre a
enzima imobilizada, isto é, perda de atividade enzimática causada pela alta concentração de
metanol no meio reacional.
Vários estudos comprovaram que para superar este problema e obter elevados
rendimentos em ésteres metílicos é recomendado a adição gradativa do metanol ao meio
reacional. Shimada et al. (1999); Wu et al. (1999); Watanabe et al. (2000) e Kaieda et al.
(2000) reportaram conversões entre 80 a 97% realizando a adição de metanol em três
bateladas seqüenciais. Adotando essa metodologia, foi também demonstrado que, por simples
decantação da mistura de reação, houve separação entre as fases de ésteres metílicos e de
glicerol.
O glicerol formado como sub-produto também pode ter efeito negativo sobre a
atividade enzimática. Bako et al. (2002) sugeriram que esse efeito inibitório pode ser reduzido
pela remoção do glicerol do meio reacional por meio de diálise e efetuaram experimentos
associando adições seqüenciais de metanol e remoção de glicerol de forma contínua, obtendo
rendimentos de 97% a 50ºC. Aplicando essa metodologia e utilizando como biocatalisador
Thermomyces lanuginosus (Lipozyme TL IM) para transesterificar o óleo de soja, obteve-se
um rendimento máximo de 98% a 40ºC, sendo reportado a manutenção de um rendimento de
94%, mesmo após quinze ciclos de reação.
Com relação à utilização de sebo bovino como matéria–prima, numa pesquisa
detalhada foi verificada que entre 56 trabalhos listados na Web of Science (palavras-chave:
biodiesel e sebo bovino), apenas 6 são referentes ao uso de sebo bovino como matéria-prima
para a produção de biodiesel. Entre esses, somente dois artigos são diretamente relacionados
com a aplicação de tecnologia enzimática (NELSON; FOGLIA; MARMER, 1996, HSU et al.,
2001).
33
Nelson; Foglia; Marmer, (1996) investigaram a reação de transesterificação de alguns
óleos vegetais e sebo bovino, utilizando álcoois primários, secundários e diversas lipases. Os
melhores resultados foram obtidos na alcoólise do sebo com metanol ou etanol com a lipase
de Mucor miehei. Os rendimentos obtidos com etanol hidratado foram superiores ao do
anidro. Utilizando-se álcoois secundários, a lipase de Candida antartica foi a mais eficiente.
Hsu et al., (2001) demonstraram que a lipase de Pseudomonas cepacia foi eficiente na
transesterificação de sebo bovino com etanol, alcançando uma conversão da ordem de 95%
em 24h. A adição de peneira molecular na proporção de 0,4% em relação ao substrato
auxiliou no controle da reação reversa (hidrólise).
O desempenho em motores dos ésteres etílicos e iso-propílicos obtidos a partir de sebo
bovino, bem como suas propriedades a baixa temperatura, foram comparáveis aos valores
observados para os ésteres metílicos de sebo bovino e de óleo de soja (WU et al., 1998),
incentivando, dessa forma, o uso do sebo e do etanol como fontes de matérias-primas para
produção de biodiesel.
2.8. Propriedades do biodiesel
As propriedades dos ésteres graxos que constituem o biodiesel determinam as
propriedades finais do combustível. Estas propriedades são determinadas pelas características
estruturais das moléculas do ácido graxo e do álcool que geram o éster. Algumas das
características estruturais que influenciam as propriedades do biocombustível originado a
partir de uma molécula de éster são: o comprimento da cadeia, o grau de insaturação e a
presença de ramificações (KNOTHE, 2005).
A análise destas características são fatores determinantes para a obtenção de um
biocombustível de alta qualidade, sendo que as análises químicas e físicas são conduzidas por
metodologias variadas, como por exemplo: parâmetros de cor, massa específica à 20 ºC, teor
de enxofre, resíduo de carbono, índice de cetano, índice de peróxido, entre outras.
O estabelecimento de padrões internacionais para este biocombustível tem sido
estudado há algum tempo e tem por objetivo facilitar a comercialização. Alguns padrões
foram desenvolvidos na Itália, Áustria e Alemanha. O padrão estabelecido pela Alemanha,
DIN V51606 (Deutsches Institut für Normung, 2003), serviu como referência para outros
padrões e fixa o índice de iodo em no máximo 115, parâmetro este, discutível por restringir os
biocombustíveis oriundos da soja. Nos EUA, a elaboração de um padrão para o biodiesel
segue as normas ASTM (American Society for Testing and Materials), para o diesel
convencional e a inclusão do índice de iodo tem encontrado obstáculos. Os EUA apresentam
34
uma significativa produção de soja e o índice de iodo para o óleo extraído desta oleaginosa,
bem como os ésteres derivados, fica em torno de 117 – 140 ou 120 – 143 (ALBUQUERQUE
et al., 2009).
No Brasil, por meio da Portaria 255 de 15/09/03, a Agência Nacional do Petróleo ANP
estabeleceu as especificações iniciais para o biodiesel puro a ser adicionado no óleo diesel
automotivo para testes em frotas cativas ou para uso em processo industrial específico nos
termos da Portaria 240 de 25/08/03. Posteriormente, a especificação definitiva para o
biodiesel foi publicada na Portaria 42 (KNOTHE et al., 2006).
A especificação brasileira é similar à européia e americana, com alguma flexibilização
para atender às características de matérias-primas nacionais. Alguns itens possuem a
informação “anotar”, significando que a ANP não estabeleceu um valor máximo ou mínimo.
Nas análises, esses campos devem ser anotados para referência. Existem vários motivos para a
ANP se posicionar dessa maneira, em se tratando de viscosidade (a mistura B20 deve atender
a viscosidade especificada para diesel) e do índice de iodo (indicador de ligações duplas e,
portanto do nível de insaturação do biodiesel). Isto visa não criar obstáculos à utilização de
algumas matérias-primas, como a mamona (alta viscosidade) ou a soja e o girassol (alto teor
de ácido linoleico, poliinsaturado e, portanto com alto índice de iodo).
O número de cetano é um indicativo adimensional da qualidade de ignição de um
combustível diesel. Essa propriedade é similar a octanagem, termo mais conhecido e usado
para a gasolina e álcool. Um combustível com alta octanagem tende a ter baixo número de
cetano, em outras palavras, a octanagem por definição indica a dificuldade de explosão,
enquanto a cetanagem é indicativo de facilidade de explosão. O combustível de referência de
alta qualidade para determinar o número de cetano é o hexadecano (C16H34), um
hidrocarboneto longo de cadeia linear. O número de cetano de um combustível diesel é
determinado pelo tempo de retardamento da ignição, isto é, pelo tempo que passa entre a
injeção do combustível nos cilindros e a ocorrência da ignição. Valores fora de uma faixa
adequada para combustível diesel ocasionam problemas no bom funcionamento do motor.
Combustíveis com alto número de cetano, a combustão pode ocorrer antes do combustível e
do ar estarem apropriadamente misturados, resultando na emissão de fumaça e uma
combustão incompleta. Valores de número de cetano muito baixo podem ocasionar
trepidações no motor, falhas no funcionamento, aumento excessivo na temperatura do ar,
aquecimento lento do motor na partida fria (1ª partida do dia). Portanto, existe uma faixa para
o número de cetano que os fabricantes de motores diesel recomendam que é entre 40 e 50.
A escala de cetano esclarece o porquê dos triacilgliceróis encontrados nos óleos e
35
gorduras serem adequados para uma alternativa de combustível diesel. As cadeias longas,
lineares e não ramificada dos ácidos graxos, similares às existentes em n-alcanos dos
combustíveis diesel tradicionais de boa qualidade, remetem a um alto número de cetano.
A viscosidade pode ser definida como uma resistência à vazão, associada à fricção ou
atrito interno de uma parte do fluído que escoa sobre a outra afetando, com isso, o
funcionamento do motor. Quanto maior a viscosidade, maior a tendência de ocasionar
problemas no processo de atomização e conseqüentemente formação de depósitos dentro do
motor, e em casos mais severos o entupimento de bicos injetores e graves danos no sistema de
injeção. Apesar de ser favorável do ponto de vista energético, o uso de óleos in natura como
alternativa para combustíveis foi relativamente abandonada principalmente devido ao
problema da alta viscosidade dos óleos (SCHWAB; BAGBY; FREEDMAN, 1987). Estudos
efetuados em diversos óleos vegetais mostraram que a sua combustão direta conduz à
carbonização na cabeça do injetor, resistência à injeção nos segmentos dos êmbolos, diluição
do óleo do cárter, contaminação do óleo lubrificante, entre outros problemas. As causas desses
problemas foram atribuídas à polimerização dos triacilgliceróis por meio de suas duplas
ligações que conduzem à formação de depósitos, assim como à baixa volatilidade e à elevada
viscosidade dos óleos vegetais que geram problemas na atomização do combustível. O
processo de transesterificação deve reduzir a viscosidade inicial do óleo ou gordura para
valores similares do diesel (KNOTHE et al., 2006; RAMOS et al., 2003).
Estudos feitos nessa área investigaram a relação que as matérias primas e os álcoois
reagentes têm sobre as diversas propriedades do biodiesel. Geralmente, número de cetano,
calor de combustão, ponto de fusão e viscosidade aumentam claramente com o aumento da
cadeia dos ácidos graxos e decrescem quando aumentam a insaturação (KNOTHE, 2005).
A Tabela 2.2, mostra a concentração de ácidos graxos presentes no sebo bovino,
ficando claro a presença da maioria de ácidos graxos saturados, o que confere ao biodiesel
derivado desta matéria prima algumas características peculiares. A maior proporção
encontrada é de ácido oléico (18:1), essa distribuição afeta diretamente a viscosidade do sebo,
bem como suas propriedades físicas e químicas. O biodiesel derivado de sebo bovino
apresenta alguns inconvenientes com relação às propriedades à baixa temperatura que podem
levar a precipitação e, conseqüentemente, a um baixo desempenho do motor. Entretanto, com
relação ao número de cetano e a estabilidade oxidativa, o sebo bovino apresenta superioridade
frente aos óleos vegetais devido ao baixo grau de insaturação (KNOTHE et al., 2006).
A Tabela 2.3 apresenta os valores descritos na literatura para o número de cetano, a
viscosidade e o calor de combustão em função do tamanho da cadeia dos principais ácidos
36
graxos e ésteres para biodiesel. A Tabela 2.4 compara as propriedades do diesel de petróleo e
do biodiesel de diferentes fontes de matéria prima.
Tabela 2.2 - Ácidos graxos presentes no sebo bovino.
Ácido Graxo Fórmulas Massa Molar (g/mol)
(%) Sebo
Mirístico C14H28O2 14:0 228 1 a 6
Palmítico C16H32O2 16:0 256 20 a 37
Palmitoleico C16H30O2 16:1 254 1 a 9
Heptadecanóico C17H34O2 17:0 270 1 a 3
Esteárico C18 H36O2 18:0 284 25 a 40
Oléico C18 H34O2 18:1 282 31 a 50
Linoleico C18 H32O2 18:2 280 1 a 5
Fonte: FIRESTONE, 2006.
Tabela 2.3 - Propriedades dos principais ácidos graxos presentes em óleos e gorduras.
Substância Número de Cetano
Viscosidade (40°C) (cP)
Calor de Combustãoc, d (kg cal/mol)
Ácido Caprílico Metil Éster Etil Éster
- - - 33,6 0,99a 1313
- 1,37a (25°C) 1465 Ácido Cáprico
Metil Éster Etil Éster
47,7 - 1453,07 (25°C) 47,2a 1,40a 1625 51,2a 1,99a (25°C) 1780
Ácido Láurico Metil Éster Etil Éster
- - 1763,25 (25°C) 61,4a 1,95b 1940
- 2,88b 2098 Ácido Mirístico
Metil Éster Etil Éster
- - 2073,91 (25°C) 66,2a 2,69a 2254 66,9a - 2406
Ácido Palmítico Metil Éster Etil Éster
- - 2384,76 (25°C) 74,5a 3,60b 2550 85,9b - 2717
Ácido Esteárico Metil Éster Etil Éster
61,7a - 2696,12 (25°C) 86,9a 4,74a 2859 76,8b - 3012
Ácido Oléico Metil Éster Etil Éster
46,1b - 2657,4 (25°C) 55a 3,73a 2828
53,9a 5,50a (25°C) - Fontes: a –KLOPFENSTEIN, 1985 b –KNOTHE; MATHEAUS; RYAN III, 2003 c –FREEDMAN; BAGBY, 1989-a d – WEAST, 1986
37
Tabela 2.4 - Dados comparativos entre as propriedades do biodiesel metílico obtido de diferentes matérias-primas e o diesel mineral.
Matéria-prima Viscosidade Cinemática
(mm²/s)
Número de Cetano
Poder calorífico inferior (MJ/l)
Ponto de Névoa (ºC)
Ponto de Fulgor
(ºC)
Densidade (g/L)
Enxofre (% m/m) Referência
Amendoim 4,9 (37,8ºC) 54 33,6 5 176 0,883 -
SRIVASTA;
PRASAD, 2000
Soja 4,5 (37,8ºC) 45 33,5 1 178 0,885 -
Babaçu 3,6 (37,8ºC) 63 31,8 4 127 0,879 -
Palma 5,7 (37,8ºC) 62 33,5 13 164 0,880 -
Girassol 4,6 (37,8ºC) 49 33,5 1 183 0,860 -
Sebo bovino 4,99 (40ºC) 61,8 - 15,6 187,8 - - YAHYA; MARLEY,
1994
Milho (Residual) 6,23 (30ºC) 63,9 42,3 - 166 0,884 0,0013 YAMANE; UETA;
SHIMAMOTO, 2001 Colza (Residual) 9,48 (30ºC) 53 36,7 - 192 0,895 0,002
Colza 4,2 (40ºC) 51-59,7 32,8 - - 0,882 -
VARESE; VARESE,
1996 Diesel 1,2-3,5 (40ºC) 51 35,5 - - 0,83-0,84
-
38
2.9. Métodos analíticos para quantificação da qualidade do biodiesel
Para a obtenção de um biocombustível de alta qualidade, algumas características
técnicas são imprescindíveis tais como: a reação de transesterificação deve ser completa,
refletindo a ausência total de ácidos graxos remanescentes, e o biodiesel produzido deve ser
de alta pureza, não contendo traços de glicerina residual ou álcool excedente de reação
(KNOTHE et al., 2006).
A estabilidade à oxidação do biodiesel é um outro parâmetro importante para
determinar por quanto tempo as características do produto final serão preservadas, sob
condições de armazenagem, calor, umidade, presença de traços de metais e a natureza do
tanque de armazenamento. As razões para auto-oxidação do biodiesel estão relacionadas à
presença de ligações duplas nas cadeias dos ésteres. Essas reações de oxidação ocorrem em
diferentes velocidades, dependendo do número e da posição das duplas ligações
(FREEDMAN; BAGBY, 1989-b). Estudos comprovaram que altas temperaturas, presença de
metais, luz e ar facilitam o processo de oxidação, sendo a estrutura do ácido graxo o fator
mais influente sobre a propriedade oxidativa do biodiesel.
Para melhorar a estabilidade oxidativa do biodiesel, TANG et al. (2008) investigaram
a influência de antioxidantes como o alfa-tocoferol, o butirato de hidroxianisole (BHA), o
butirato de hidroxitolueno (BHT) e verificaram que a ação do antioxidante aumenta
juntamente com a sua concentração e que o local reservado para armazenagem do biodiesel é
de crucial importância na manutenção das suas propriedades combustíveis por um maior
período de tempo.
Para a análise dessa propriedade existem vários métodos que remetem à qualidade do
material. O índice de acidez apresenta uma boa alternativa para o acompanhamento da
qualidade do combustível durante a armazenagem. Este índice revela o grau de oxidação do
material e é expresso em miligramas de hidróxido de potássio para neutralizar os ácidos
graxos livres presentes em um grama de amostra. O índice de peróxido e o índice de iodo
também estão relacionados com a estabilidade oxidativa do biodiesel, porém, o índice de
peróxido é o método menos aconselhável para acompanhar a estabilidade à oxidação por
apresentar um comportamento inicial crescente e depois decrescente devido à formação de
produtos secundários de oxidação. O índice de Iodo é uma medida indicativa do teor de
insaturação do material graxo.
Outra técnica que apresenta grande potencial para a determinação da estabilidade
térmica e oxidativa do biodiesel é a Análise Térmica, termo que abrange um grupo de técnicas
39
nas quais uma propriedade física ou química de uma substância, ou de seus produtos de
reação, é monitorada em função do tempo ou da temperatura, enquanto a temperatura da
amostra, sob uma atmosfera específica, é submetida a uma programação controlada
(HASSEL, 1976).
As técnicas de análise térmica mais empregadas compreendem a análise
termogravimétrica (TG ou TGA), análise térmica diferencial (DTA), calorimetria exploratória
diferencial (DSC), análise termo-mecânica (TMA), análise dilatométrica (DIL), análise
dínamo-mecânica (DMA) e análise do flash de luz ou laser (LFA).
TG é uma técnica na qual a massa de uma substância é medida em função da
temperatura, enquanto a substância é submetida a uma programação controlada de
temperatura. DTA é uma outra técnica que consiste em medir a diferença de temperatura
(∆T), entre a substância e o material de referência, enquanto ambos estão sujeitos a um
programa controlado de temperatura. A análise de DSC é uma técnica que relaciona a
diferença entre a energia fornecida à substância e a de um material de referência, em função
da temperatura, enquanto ambos são submetidos a uma programação controlada de
temperatura (DANTAS et al., 2007-a; DUNN, 2006). DIL é a técnica na qual a mudança nas
dimensões de uma amostra é medida em função da temperatura enquanto esta é submetida a
uma programação controlada. DMA é um método termo-analítico desenvolvido para
caracterização do comportamento mecânico de um material quando este é submetido a forças
dinâmicas (freqüência e carga oscilante) a um programa controlado de temperatura. E
finalmente o LFA, que é uma das técnicas mais utilizadas para a caracterização da
difusividade térmica de um material que é aquecido por um pequeno pulso de laser ou luz de
alta intensidade energética (WENDHAUSEN; RODRIGUES; MARCHETTO, 2009).
Os métodos termoanalíticos são vantajosos, em relação aos métodos convencionais,
pois apresentam uma maior precisão e sensibilidade, empregam uma menor quantidade de
amostra e apresentam uma maior variedade de resultados em um único gráfico (LIMA et al.,
2007; DANTAS et al., 2007-a; DANTAS et al., 2007-b).
Na Tabela 2.5 são listados alguns trabalhos que utilizaram as técnicas termoanalíticas
para determinação da estabilidade térmica e oxidativa de amostras de biodiesel obtidas de
diversas fontes de matéria-prima pelas rota metílica ou etílica.
40
Tabela 2.5 - Aplicação de técnicas termoanalíticas para determinação de propriedades dos combustíveis.
Matéria Prima Álcool Catalisador Objetivo Referência
Óleo de soja virgem e residual
Etanol NaOH
Comparação da estabilidade oxidativa de ésteres etílicos de ácidos graxos de soja, utilizando Racimat e técnicas termoanalíticas
FERRARI; OLIVEIRA; SCABIO, 2005
Óleo de babaçu Metanol KOH Avaliação da termogravimetria e calorimetria do biodiesel de babaçu obtido por rota metílica
SANTOS et al., 2007.
Óleo de Soja
Metanol KOH Comportamento térmico e reológico do diesel e misturas com biodiesel de metanol
CANDEIA et al., 2007
Óleo de milho Metanol/ Etanol
Não especificado
Estudo térmico (TG e TGA) e cinético do biodiesel de milho obtido por rotas etílicas e metílicas visando determinar os parâmetros cinéticos da decomposição do biodiesel
DANTAS et al., 2007-a
Óleo de rícino Metanol/ Etanol
KOH
Cálculo dinâmico da cinética da decomposição térmico do biodiesel de óleo de rícino por TG variando a taxa de aquecimento para o cálculo dos parâmetros cinéticos
CONCEIÇÃO et al., 2007
Óleo de milho Metanol/ Etanol
Não especificado
Caracterização e compensação dos efeitos cinéticos do biodiesel de milho
DANTAS et al., 2007-b
Óleo de babaçu Etanol NaOH
Caracterização do biodiesel de babaçu etílico empregando TG para determinar ponto de ebulição e pressão de vapor.
LIMA et al., 2007
41
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Enzimas
No desenvolvimento deste trabalho foram utilizadas 5 preparações de lipases
comerciais de diferentes fontes e fornecedores, incluindo as lipases de Pseudomonas cepacia
(Lipase PS) e Pseudomonas fluorescens (Lipase AK) manufaturadas pela Amano
Pharmaceuticals (Japão), Thermomyces lanuginosus (Lipolase) gentilmente cedida pela
Novozymes (Paraná), Rhizopus oryzae (Piccantase R8000) manufaturada pela DSM Food
Specialties (Delft, Holanda) e lipase de pâncreas de porco (Tipo II) adquirida da Sigma Co
(St. Louis, MO, EUA).
3.2. Suporte de imobilização
Como suporte de imobilização das lipases testadas foi utilizada uma matriz híbrida
preparada pela técnica sol-gel (PAULA et al., 2008), empregando como precursor
Tetraetilortossilicato (TEOS) adquirido da Aldrich (Sigma-Aldrich Chemical, St. Louis, MO,
EUA).
3.3. Matérias-primas
Como materiais de partida para a síntese de biodiesel foram utilizados: etanol anidro
(98%, Vetec) e amostra de sebo bovino refinado fornecida pela FERTIBOM (Catanduva-SP,
Brasil), tendo a seguinte composição em ácidos graxos (w/v): 3% mirístico, 25% palmítico,
32% esteárico e 40% oléico, com massa molecular média de 856.76 g. mol-1.
3.4. Amostra de biodiesel
A amostra de biodiesel etílico de sebo bovino (BIOMAX) foi gentilmente doada pela
FERTIBOM Indústrias LTDA (Catanduva-SP), lote processado em 30/05/2007 sem adição de
conservantes.
3.5. Outros materiais e reagentes
Os outros reagentes utilizados foram: Epicloridrina, Hexano p.a. (Reagen Chemical
Co, São Paulo, Brasil); Acetona p.a. (Merck, Darmstadt, Alemanha); Etanol comercial; Ácido
Láurico (Cromoline Química Fina Ltda, Diadema/SP, Brasil), peneira molecular 0,32cm de
diâmetro (Silicato de sódio e alumínio) tipo 13 X-BHD adquirida da Sigma-Aldrich
42
Chemical; Goma arábica em pó, pura e Polietilenoglicol – PEG-1.500 ambos da marca Synth
(adquirido da Hipperquímica, Santo André - SP, Brasil). Azeite de oliva comercial (baixa
acidez, grau comercial). Indicador ácido-base (fenolftaleína – Colleman). Álcool polivinílico
(MM=72.000 Reagen), HCl (mínimo 36%, Isofar) e Tetraetilortossilicato (Sigma-Aldrich). Os
demais materiais e reagentes foram adquiridos comercialmente em grau analítico.
3.5. Equipamentos
A Tabela 3.1 apresenta os equipamentos utilizados no desenvolvimento deste trabalho.
Tabela 3.1 - Equipamentos utilizados.
Tipo de análise e/ou Ensaio Equipamento Modelo/ fabricante
Medidas de pH Potenciômetro Modelo TEC2, Tecnal (TECNAL,
Piracicaba/SP, Brasil)
Atividade hidrolítica Bureta Digital Modelo Bürette, Hirschmann
Techcolor (Hirschmann Techcolor)
Dosagem de proteínas
Espectofotômetro UV-Visível
Modelo Cary 50 Conc., Varian (Varian Inc. Corporate Headquarters,
Palo Alto, CA, EUA)
Teor de umidade Balança analítica
ID 50, Marte (Marte Balanças e Aparelhos de
Precisão Ltda, Santa Rita do Sapucaí / MG, Brasil)
Dosagem de monoésteres
Cromatógrafo a gás Modelo GC-3800,Varian
(Varian Inc. Corporate Headquarters, Palo Alto, CA, EUA)
Agitação Agitador mecânico Modelo RW20-Digital, IKA, (IKA Laboratory Equipment,
Marconi, Piracicaba-SP, Brasil)
3.6. Procedimento experimental
3.6.1. Síntese e ativação do suporte híbrido POS-PVA
O composto híbrido de polissiloxano-álcool polivinílico foi sintetizado, conforme
metodologia descrita por Paula et al. (2008), pela mistura de 5mL de tetraetilortossilicato
(TEOS), 5mL de etanol e 6mL de uma solução de álcool polivinílico (PVA) 2% (m/v). Essa
mistura foi aquecida a 60º C, sob agitação, com adição de duas a três gotas de HCl
concentrado. Após um período de incubação de 40 min, a preparação foi mantida a 25ºC por
48 h até a completa evaporação do álcool e polimerização para formação do suporte híbrido.
O composto foi então triturado até que passasse completamente por uma peneira padrão série
43
Tyler (adquirido da Hipperquímica, Santo André/SP, Brasil) de 42 MESH e ficasse retido em
peneira de 60 MESH. As principais propriedades morfológicas do suporte obtido são
apresentadas na Tabela 3.2, e informações complementares do suporte são descritas em
Santos et al., 2008. Em seguida, o suporte foi ativado com solução de epicloridrina 2,5% (v/v)
em tampão fosfato de sódio (0,1 M e pH 7,5), na proporção massa de suporte: volume de
solução de 1:10, sendo esta mistura mantida sob agitação por 1 h à temperatura ambiente.
Após este período, o suporte foi lavado exaustivamente com água destilada e solução tampão
de fosfato, e em seguida levado à estufa (60 ºC) por 24 h.
Tabela 3.2 – Propriedades morfológicas do suporte POS-PVA quanto à área superficial, volume de poros e tamanho médio dos poros.
Área superficial específica (m²/g)
Volume de poros (cm³/g)
Tamanho médio dos poros (Å)
461,00 0,275 22,91
(SANTOS et al., 2008).
3.6.2. Imobilização de lipases de diferentes fontes no suporte híbrido
O suporte ativado foi embebido em hexano numa relação sólido: líquido de 1:10 e
mantido sob agitação branda por 2 h. Após este período, o sólido foi decantado e o excesso de
hexano foi removido. Ao suporte foi então adicionado PEG 1500 e lipase na proporção de 250
mg de enzima: 1g suporte: 100 µL de PEG. A lipase imobilizada foi recuperada por filtração a
vácuo, com posterior lavagem com uma solução de hexano e acetona (1:1). A atividade
hidrolítica do derivado imobilizado foi determinada pelo método de hidrólise do azeite de
oliva (SOARES et al., 1999). O rendimento de imobilização (η%) foi calculado pela Equação
3.1.
( ) 100% 0
×=U
U Sη Equação 3.1
em que: U0 = unidades de atividade oferecidas para imobilização; US= unidades de atividade
enzimática total presente no suporte (atividade x massa seca).
3.6.3. Testes de triagem da lipase mais efetiva para efetuar a síntese de biodiesel
As reações de síntese do biodiesel foram realizadas em reatores de vidro cilíndrico (6
cm de altura e 4 cm de diâmetro interno) encamisados com capacidade de 50 mL de volume
(Figura 3.1). Para o controle de temperatura das reações foi utilizado um banho termostatizado
44
Modelo 145, Marconi (MARCONI, Piracicaba/SP, Brasil). Os meios reacionais continham
misturas de sebo bovino e etanol numa razão molar fixa gordura/etanol de 1:9 e foram
incubados com diferentes preparações de lipase imobilizada em POS-PVA numa proporção
fixa de 400 Unidades de atividade por grama de sebo. Todos os experimentos foram
realizados com 30 gramas de meio reacional numa temperatura de 45°C, sob agitação
magnética constante por um período máximo de 48 h. As reações foram monitoradas pela
retirada de alíquotas do meio reacional para dosagem dos ésteres etílicos formados por
cromatografia de fase gasosa, empregando metodologia estabelecida por Urioste et al. (2008).
Figura 3.1. Reator de vidro utilizado para síntese de biodiesel nos testes de triagem da fonte de lipase.
3.6.4.Otimização da reação de transesterificação enzimática de sebo bovino e etanol planejamento experimental
A otimização das condições reacionais da reação de transesterificação do sebo bovino
foi efetuada por meio de planejamento experimental, considerando como variáveis
independentes: temperatura e razão molar (sebo/etanol). As sínteses foram realizadas em
reator de vidro cilíndrico de capacidade de 50 mL, acoplado com condensador de refluxo
(Figura 3.1) contendo sebo bovino e etanol na razão molar adequada, para o experimento
correspondente. A Tabela 3.3 mostra os níveis selecionados para o planejamento experimento
proposto.
45
Tabela 3.3 - Níveis reais e codificados para as variáveis temperatura e razão molar, avaliados segundo planejamento experimental estrela rotacional.
Variáveis Níveis
Reais Codificadas -αααα -1 0 1 +αααα
Temperatura X1 46 48 53 58 60
Razão Molar (etanol/sebo)
X2 6 7 9,5 12 13
As reações foram realizadas com a lipase PS (Pseudomonas cepacia) imobilizada em
POS-PVA nma proporção fixa de 400 Unidades de atividade por grama de meio reacional.
Todos os experimentos foram realizados com 30 gramas de meio reacional, sob agitação
magnética constante por um período máximo de 48 h. O progresso da síntese foi
acompanhado pela retirada de alíquotas, ao longo da reação, para quantificação da formação
dos ésteres de etila por cromatografia de fase gasosa, empregando metodologia estabelecida
por Urioste et al. (2008). Os resultados obtidos foram analisados com auxílio dos softwares
Statistica versão 5.0 (StatSoft Inc., USA) e Design Expert 6.0 (Stat Ease Corporation, USA).
3.6.5.Comprovação do modelo estatístico
As condições otimizadas preditas no delineamento experimental foram utilizadas para
efetuar um experimento de comprovação do modelo estatístico gerado. Para realização deste
ensaio foi utilizado um reator de vidro cilíndrico encamisado com 400mL de capacidade (8cm
de altura e 8cm de diâmetro), equipado com sistema de agitação mecânica e condensador de
refluxo, como ilustrado na Figura 3.2. O reator possuia a mesma configuração dos reatores
utilizados nos ensaios propostos no delineamento fatorial, como anteriormente mostrado na
Figura 3.1 (ítem 3.6.4).
Neste ensaio empregou-se 110g de meio reacional na razão molar de 1:7 (gordura:
etanol). O carregamento enzimático foi mantido em 400 Unidades de atividade hidrolítica por
grama de meio reacional e a reação foi conduzida a 48˚C por um período máximo de 18h. O
progresso da síntese foi acompanhado pela retirada de alíquotas, ao longo da reação, para
quantificação da formação dos ésteres de etila por cromatografia de fase gasosa, empregando
metodologia estabelecida por Urioste et al. (2008).
46
Figura 3.2. Reator com agitação mecânica e condensador de refluxo.
3.6.6. Separação dos ésteres (recuperação do glicerol)
Para a separação da glicerina liberada na síntese do biodiesel, o meio reacional foi
submetido a uma etapa de purificação, constituída de uma lavagem com água destilada. O
volume da amostra recolhido foi medido e em seguida adicionado o mesmo volume de água
destilada. A mistura foi transferida para um funil de decantação (Figura 3.3), efetuando-se
uma agitação e deixando a mistura em repouso por 30 min para a separação das fases. A fase
superior era composta pelos ésteres de etila (biodiesel) e a fase inferior por glicerol e água de
lavagem. A fase inferior foi descartada e a fase superior submetida à evaporação em rota-
evaporador.
Figura 3.3. Processo de decantação do biodiesel.
47
3.7. Caracterização das propriedades bioquímicas e cinéticas do derivado imobilizado selecionado
3.7.1. Propriedades bioquímicas
A influência do pH e da temperatura na atividade hidrolítica da lipase PS livre e do
derivado imobilizado foram avaliadas em experimentos realizados segundo um planejamento
experimental 22 estrela rotacional com quatro replicatas no ponto central. Como variáveis
resposta foram consideradas as atividades hidrolíticas da lipase livre e imobilizada. Os níveis
reais e codificados das variáveis em estudo estão apresentados na Tabela 3.4.
Tabela 3.4 - Níveis reais e codificados para as variáveis pH e temperatura avaliados segundo planejamento experimental estrela rotacional.
Variáveis Níveis
Reais Codificadas -αααα -1 0 1 +αααα pH X1 6,1 6,5 7,5 8,5 8,9
Temperatura X2 36 40 50 60 64
Em frascos Erlenmeyer de 125 mL foram adicionados: 5 mL de substrato (preparado
pela emulsão de azeite de oliva com solução de goma arábica a 7%), 4 mL de solução tampão
fosfato de sódio (0, 1 M, com pH variável, 6,1, 6,5, 7,5, 8,5, 8,9) e preparação enzimática
(0,5mg/mL), para enzima livre ou 0,05g do derivado imobilizado. Os frascos foram incubados
em temperaturas variadas (36, 40, 50, 60 e 64 ºC) por 5 min, em banho termostatizado com
agitação. Após o período de incubação, a reação foi paralisada pela adição de 10 mL de uma
mistura de acetona e etanol (1:1) e os ácidos graxos formados titulados com solução de KOH
0,02 M (SOARES et al., 1999). Os resultados obtidos foram analisados com auxílio dos
softwares Statistica versão 5.0 (StatSoft Inc., USA) e Design-Expert 6.0 (Stat-Ease
Corporation, USA).
3.7.2. Parâmetros cinéticos da lipase livre e imobilizada
Para o cálculo da constante de Michaelis-Menten foram preparados sistemas reacionais
contendo ácidos graxos totais em concentrações variáveis obtidos a partir de emulsões
preparadas em diferentes proporções de azeite de oliva (10-70%) e solução aquosa de goma
arábica (7% m/v). As velocidades iniciais das reações de hidrólise, catalisada pelas
preparações de lipase livre e imobilizada, foram determinadas de acordo com a metodologia
de hidrólise do azeite de oliva (SOARES et al., 1999). As constantes cinéticas Km e Vmax
foram determinadas pelo Programa Enzyme fitter.
48
3.7.3. Estabilidade térmica da lipase livre e imobilizada
A estabilidade térmica das preparações de lipase foi determinada por meio da
incubação de amostras da lipase livre (1 mL, 5 mg/mL) e imobilizada (0,05 g) numa
temperatura de 60 °C em meio aquoso (0,1 M tampão fosfato, pH 6,5) durante diferentes
períodos de incubação. Para a lipase livre retiram-se amostras nos tempos de 5, 10, 15, 30 e 60
min, e para a lipase imobilizada retiram-se amostras nos intervalos de 30, 60 e 120 min. Após
tratamento térmico, as amostras de lipase (livre e imobilizada) foram imediatamente resfriadas
e a atividade residual determinada a 40 °C, pelo método da hidrólise do azeite de oliva,
conforme metodologia modificada por Soares et al. (1999). As constantes de desativação (kd),
foram calculadas pela Equação 3.2.
tKdAoA ×−= lnln Equação. 3.2
em que: A0 = atividade enzimática inicial; A = atividade residual após tratamento térmico
durante um certo período de incubação (t).
Os tempos de meia-vida para a enzima livre e imobilizada foram calculados pela
Equação 3.3.
dKt
693,02
1 = Equação. 3.3
3.8. Métodos de análises
3.8.1. Características da matéria-prima (sebo bovino)
3.8.1.1. Índice de Acidez (I.A.)
O índice de acidez da matéria-prima foi determinado de acordo com as normas do
Instituto Adolfo Lutz (1985). Para esta determinação em um Erlenmeyer pesaram-se cerca de
2,0 g da amostra, seguida da adição de 25mL de uma mistura de éter etílico e álcool etílico
(95%) preparada na proporção 2:1 em volume. Em seguida, titulou-se com solução de
hidróxido de potássio (KOH) de concentração 0,01M previamente padronizada, utilizando-se
fenolftaleína como indicador. O resultado foi calculado pela relação entre a massa em
miligramas de hidróxido de potássio consumidos por grama de amostra analisada, conforme
as Equações 3.4 (a, b).
49
amostra
basebasebrancoamostra
m
CMMVVAI
××−=
)(..
Equação 3.4 (a)
amostra
basegraxoácidobrancoamostra
m
CMMVVAGL
100)(%
×××−=
Equação 3.4 (b)
Em que: Vamostra = Volume de solução de KOH gasto na titulação da amostra (mL), Vbranco =
Volume de solução de KOH gasto na titulação do branco (mL), MMbase = Massa Molar do
KOH (56,1g/mol), Cbase = Concentração molar da solução de KOH (mol/L), MMácido graxo =
Massa Molar do ácido oléico (282 g/mol), mamostra = Massa de amostra (g).
3.8.1.2. Índice de Peróxido (I.P.)
O índice de peróxido da matéria-prima foi determinado de acordo com o método
oficial Cd 8b-90 da AOCS (2004). Para esta determinação, uma massa de aproximadamente
5g de amostra foi submetida à reação com solução saturada de iodeto de potássio por 1 min. O
excesso de iodeto de potássio foi então titulado com tiossulfato de sódio 0,01N. O resultado
foi calculado pela relação entre a quantidade em miliequivalentes de peróxido por 1000g de
amostra. O cálculo do índice de peróxido foi realizado de acordo com a Equação 3.5:
amostra
oTiossulfatbrancoamostra
m
CVVPI
1000)(..
××−=
Equação 3.5
Em que: V amostra = Volume de solução de tiossulfato de sódio gasto na titulação da amostra
(mL), V branco = Volume de solução de tiossulfato de sódio gasto na titulação do branco (mL),
C tiossulfato = Concentração molar da solução de tiossulfato de sódio (mol/L), m amostra = Massa
de amostra (g)
3.8.1.3. Índice de Saponificação (I.S.)
O índice de saponificação da matéria-prima foi determinado de acordo com as normas
do Instituto Adolfo Lutz (1985). Para esta medida, uma amostra de 2,5 g da amostra foi
saponificada com solução alcoólica de hidróxido de potássio (4% m/v) e titulada com ácido
clorídrico (0,5 N). O cálculo do índice de saponificação foi realizado de acordo com a
Equação 3.6.
50
amostra
HClKOHamostrabranco
m
CMMVVSI
××−=
)(..
Equação 3.6
Em que: Vamostra = Volume de solução de KOH gasto na titulação da amostra (mL), Vbranco =
Volume de solução de KOH gasto na titulação do branco (mL), MMbase = Massa Molar do
KOH (56,1g/mol), CHCl = Concentração molar da solução de HCl (mol/L), mamostra = Massa de
amostra (g)
3.8.1.4. Índice de Iodo (I.I.)
O índice de iodo da matéria-prima foi determinado pelo Método de Hübl de acordo
com as normas do Instituto Adolfo Lutz (1985). Para esta determinação, uma amostra (cerca
de 0,25g) foi submetida à reação com solução de iodo por 30 min ao abrigo da luz e
posteriormente titulada com solução de tiossulfato de sódio 0,1N. O branco foi realizado com
10 mL de clorofórmio e 20 mL de solução alcoólica de iodo 5%. O cálculo do índice de iodo
foi realizado pela Equação 3.7:
amostra
oTiossulfatIamostrabranco
m
CMMVVII
×
×××−=
2
1,0)(.. 2
Equação 3.7
Em que: Vamostra = Volume de solução de tiossulfato de sódio gasto na titulação da amostra
(mL), Vbranco = Volume de solução de tiossulfato de sódio gasto na titulação do branco (mL),
MMI2 = Massa Molar do I2 (253,8g/mol), Ctio = Concentração molar da solução de tiossulfato
de sódio (mol/L), mamostra = Massa de amostra (g)
3.8.2.Determinação das propriedades da lipase livre e imobilizada
3.8.2.1.Teor de proteína
O conteúdo de proteína nas preparações de lipase livre foi determinado pelo método de
Bradford (BRADFORD, 1976) utilizando-se o reagente brilhante de Comassie Blue e
Albumina bovina cristalina (ABS) como padrão. Para a determinação da absorbância foi
utilizado um espectrofotômetro UV-Visível (modelo Cary 50 Conc., Varian- Varian Inc.
Corporate Headquarters, Palo Alto, CA, EUA).
51
3.8.2.2. Atividade hidrolítica da lipase e derivados imobilizados
A atividade enzimática da lipase nas formas livre e imobilizada foi determinada pelo
método de hidrólise do azeite de oliva, conforme metodologia modificada por Soares et al.
(1999). Os ácidos graxos liberados foram titulados com solução de KOH (0,02M) utilizando
fenolftaleína como indicador. Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de
enzima que libera 1µmol de ácido graxo por minuto de reação, nas condições do ensaio. As
atividades foram calculadas segundo a Equação 3.8 e expressas em µmol/g.min (U).
mt
MVVg
molahidrolíticAtividade BA
⋅
⋅⋅−=
⋅
610)(min
µ Equação 3.8
Em que: VA= volume de KOH gasto na titulação da amostra, VB = volume do KOH gasto na
titulação do branco, M = molaridade da solução de KOH, t = tempo de reação em min, m =
massa em gramas.
3.8.2.3. Atividade sintética dos derivados imobilizados
A atividade sintética das preparações de lipase imobilizada foi quantificada pelo
consumo do ácido láurico na reação de esterificação do laurato de glicerila empregando
substrato numa razão molar ácido-álcool de 3:1 a 60ºC e incubando com concentração
enzimática de 5% (m/m), em relação à massa de reagentes de partida, mantida sob agitação
por 40 min (LANGONE; SANTANA, 1999). A reação foi iniciada pela adição da enzima ao
meio reacional, em um reator de vidro aberto com capacidade de 20 mL provido de agitação
mecânica e conectado a um banho termostatizado. Alíquotas de 200 µL, em duplicata, foram
retiradas do meio reacional nos tempos inicial e após 40 min de reação e diluídas em 10 mL
de solução de acetona-etanol (1:1) com a finalidade de cessar a reação e de extração dos
ácidos restantes. A quantidade de ácido carboxílico consumido foi determinada por titulação
com solução de NaOH 0,02 M. Uma unidade de atividade foi definida pela concentração de
enzima necessária para esterificar 1µmol de ácido por minuto, nas condições experimentais
adotadas. A atividade sintética foi calculada pela Equação 3.9.
met
MVVadorbiocatalisdegUtéticaAtividade
.
10..)()/(sin
3400 −
= Equação 3.9
Em que: M é concentração molar da solução de NaOH (0,02 M); V0 é o volume de NaOH
gasto na titulação da amostra no tempo zero (mL); V40 é o volume de NaOH gasto na titulação
52
da amostra após 40 min de reação (mL); me é a massa de preparação enzimática utilizada na
reação (g); t é o tempo de reação (min).
3.8.3. Análises do biodiesel
3.8.3.1. Determinação dos ésteres formados na reação de etanólise da gordura animal
As concentrações dos ésteres formados na reação de etanólise do sebo bovino foram
determinadas por cromatografia de fase gasosa, utilizando-se um cromatógrafo Modelo GC-
3800,Varian (Varian Inc. Corporate Headquarters, Palo Alto, CA, EUA) uma coluna
empacotada (5%DEGS CHR-WHP 80/100 6ft 2.0mmID 1/8inOD, RESTEK), operando nas
condições definidas nas Tabela 3.5, conforme estabelecido por Urioste et al. (2008). As
amostras foram previamente diluídas com hexano numa proporção de 1:3.
Tabela 3.5 - Condições para determinação dos ésteres de etila.
Padrão interno Hexanol (0,0275 g/g) Programa de temperaturas 120 ºC por 10 min e 170 ºC por 18 min Rampa de Aquecimento 25 ºC/ min
Gás de arraste Nitrogênio Atenuação do cromatógrafo A, B e C = 16
Preparação da amostra 0,1 g da amostra em 0,3 g de hexano Preparação para injeção 1:1 (amostra : padrão interno)
Tempos de retenção dos Monoésteres de etila
Padrão Interno (P.I.) 1,17min C8 EtOH 4,13 min
C10 EtOH 8,26 min C12 EtOH 10.77 min C14 EtOH 12,31 min C16 EtOH 15,04 min C18 EtOH 20,96 min
C18:1 EtOH 23,57 min C18:2 EtOH 26,83 min
O rendimento (R) das reações de síntese de biodiesel foi definido como o valor que
expressa a massa total obtida de ésteres de etila (Mt) em relação à massa teórica esperada de
ésteres de etila (Me). Me foi determinada a partir da massa de ácidos graxos presente na massa
inicial da gordura de sebo (M0), da massa molecular correspondente a cada ácido (MMa) e do
éster correspondente (MMe). Este cálculo é representado pela Equação 3.10 (a), em que M0
corresponde ao produto da concentração mássica de cada ácido graxo (Ca), com a massa
inicial de óleo utilizada (Mi) Equação 3.10 (b). O rendimento foi calculado utilizando a massa
53
total de ésteres obtida pela análise por cromatografia gasosa (Mt) pela massa teórica de ésteres
de etila (Me), conforme mostrado na Equação 3.10 (c).
MMa
MMeMoMe
).(= (a) MiCaMo .= (b) 100×=
Me
MtR (c)
Equação 3. 10
3.8.3.2. Análise de viscosidade do sebo bovino e do biodiesel
Os valores da viscosidade absoluta em função da taxa de deformação foram medidos
em viscosímetro Brookfield Modelo LVDVII (Brookfield Viscometers Ltd, Inglaterra)
empregando o cone CP 42. As medidas foram feitas em duplicata a 50 °C para o sebo bovino
e a 40°C para o biodiesel, empregando 1 mL de amostra. As análises do produto
transesterificado foram efetuadas após a etapa de purificação, conforme descrito no item
3.6.4. Os dados obtidos (viscosidade, taxa de deformação e tensão de cisalhamento) foram
ajustados de acordo com a lei de potência (Equação 3.11), conforme descrito por Freitas et al.
(1998).
nK γτ ⋅= Equação 3.11
Em que: τ é a tensão de cisalhamento, γ é a taxa de deformação aplicada, n é o valor do
coeficiente angular e K é o índice de consistência.
3.8.3.3 Análise Termogravimétrica
Um analisador termogravimétrico Shimadzu TGA 50 foi utilizado para efetuar as
análises de termogravimetria das amostras de sebo bovino e dos produtos transesterificados
obtidos com rendimentos de reação superiores a 90%, adotando as seguintes condições de
análise: fluxo de 50mL/ min de nitrogênio, taxa de aquecimento de 10 °C/min na faixa de
aquecimento de 25 a 1000°C.
3.8.3.4 Espectroscopia vibracional na região do infravermelho por Transformada de Fourier
(FTIR)
Amostras de sebo bovino, biodiesel, lipase livre e do derivado imobilizado foram
submetidas à análise de espectroscopia na região do Infravermelho por Transformada de
Fourier (FTIR), conduzida na faixa de onda de 400 a 4000 cm-1, para o acompanhamento da
54
reação de transesterificação e do procedimento de imobilização. O Espectrômetro utilizado foi
modelo Spectrum GX, Perkin Elmer.
3.8.3.5 Ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H)
A ressonância magnética nuclear (RMN) é uma técnica baseada nas transições entre
níveis de energia de um núcleo, quando colocado em um capo magnético externo. É uma
técnica de espectroscopia bastante difundida e muito utilizada para elucidação de moléculas
orgânicas. Quando a amostra é colocada em um campo magnético pode sofrer absorção da
radiação eletromagnética na região de radio freqüência em função de determinados núcleos
dessa molécula. Os núcleos, por sua vez, possuem cargas que podem girar em torno do seu
próprio eixo nuclear gerando um dipolo magnético. As análises de ressonância magnética
nuclear protônica (RMN 1H) das amostras do sebo bovino e biodiesel foram realizadas em um
espectrofotômetro Varian modelo Mercury 300MHz. O solvente utilizado foi clorofórmio
deuterado (CDCl3) utilizando-se como referência o tetrametilsilano.
55
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste capítulo são apresentados e discutidos os resultados experimentais obtidos ao
longo do desenvolvimento deste trabalho, incluindo composição da matéria prima (sebo
bovino refinado), testes de seleção do derivado imobilizado mais efetivo para conduzir a
reação de transesterificação do sebo bovino com etanol e otimização da reação de síntese de
biodiesel empregando o catalisador mais eficiente. O derivado imobilizado selecionado foi
caracterizado com relação as suas propriedades bioquímicas, cinéticas e estabilidade térmica.
O biodiesel obtido nas condições otimizadas foi caracterizado com relação as propriedades de
interesse do projeto, aplicando técnicas de Espectroscopia de Absorção na Região do
Infravermelho, Espectroscopia de Ressonância Nuclear de Próton e Termogravimetria (TG).
4.1. Caracterização da matéria-prima
As características da amostra de sebo bovino quantificadas por técnicas descritas em
3.8 estão listadas na Tabela 4.1 juntamente com os limites desejáveis para utilização desta
matéria- prima para síntese de biodiesel.
Tabela 4.1 - Propriedades do sebo bovino refinado.
Características Amostra de sebo bovino Limites (Máx.)
Índice de Acidez (mg KOH/g) 1,96 10
Índice de Saponificação (mg KOH/g) 197,03 190-200
Índice de Iodo (g I2/ 100g) 33,49 33-47
Índice de Peróxido (meq/ 1000g) 2,54 10
Ácidos Graxos Livres (%) 0,95 1
Fonte: FIRESTONE, 2006.
Os índices de acidez e de peróxido indicam a deterioração da gordura em termos de
rancidez hidrolítica, a partir da concentração de ácidos graxos livres na gordura (pelo índice
de acidez) e rancidez oxidativa (pelo índice de peróxido). O índice de saponificação identifica
a presença de óleos e gorduras que contenham uma grande porção de ácidos graxos de baixa
massa molecular, assim, quanto menor a massa molecular do ácido graxo, maior será o índice
de saponificação. O índice de iodo revela o grau de insaturação de matéria-prima.
56
Os valores listados na Tabela 4.1 indicam que a amostra de sebo bovino empregada no
desenvolvimento desse projeto atende o grau de pureza exigido para ser utilizada na reação de
transesterificação e são similares aos descritos por Filho (2007).
4.2. Imobilização de lipases de diferentes fontes no suporte híbrido POS-PVA
Foram utilizadas cinco preparações de lipases comercializadas por diferentes
fornecedores. A caracterização dessas preparações foi uma etapa preliminar necessária, tendo
em vista que os valores de atividade fornecidos pelos fabricantes são determinados na maioria
dos casos por métodos diversos. Desta forma, na Tabela 4.2 são apresentadas as atividades
hidrolíticas dessas preparações empregando a hidrólise do azeite de oliva como método de
análise (pH 7,0 e 37°C), conforme procedimento descrito na seção 3.8. A Tabela 4.2, também
inclui os teores de proteína e as atividades específicas dessas preparações.
Tabela 4.2 - Atividade hidrolítica, teor de proteínas e atividade específica das lipases testadas.
Fonte da lipase Nome Comercial
Atividade hidrolítica
(U/g)
Proteína (mg/g)
Atividade específica (U/mg de proteína)
Pseudomonas cepacia Lipase PS 39760 13 3156
Pseudomonas fluorescens Lipase AK 19820 14 1416
Thermomyces lanuginosus Lipolase 57894 15 3886
Rhizopus oryzae Piccantase R8000 19874 134 149
Lipase de pâncreas de porco Lipase pancreática 6484 122 53
* valores em matéria seca.
As atividades especificas das lipases testadas apresentaram uma ampla faixa de
variação entre 53 a 3886 U/mg de proteína, indicando diferentes graus de pureza. A
preparação Lipolase foi que apresentou a atividade específica mais elevada (cerca de
3900U/mg de proteína), enquanto a lipase de pâncreas de porco foi que apresentou o menor
grau de pureza. Entretanto, para aplicação em biocatálise preparações enzimáticas comerciais
com baixo teor de pureza são geralmente usadas, devido seu baixo custo e elevada
estabilidade, tendo em vista essas preparações contem agentes como açúcares ou outras
substâncias inertes que atuam como estabilizantes da enzima.
Adotando o procedimento descrito no item 3.6.1, o suporte POS-PVA, previamente
ativado com epicloridrina, foi utilizado para imobilizar as diferentes preparações de lipases. A
57
Tabela 4.3 apresenta os dados relativos aos teores de umidade, atividades hidrolítica e
sintética e os rendimentos de imobilização obtidos para cada preparação de lipase.
Tabela 4.3 - Atividades hidrolítica e sintética dos derivados imobilizados em POS-PVA e rendimento de imobilização.
Enzima Umidade (%)
Atividade hidrolítica
(U/g)
Atividade sintética
(U/g)
Rendimento de imobilização
(%) Lipase PS 11,06 1460 ± 83,66 29,50 ± 1,65 15,83 Lipase AK 13,37 1210 ± 68,36 31,00 ± 1,34 25,35 Lipolase 15,75 1570 ± 75,42 24,50 ± 1,87 7,59
Piccantase R8000 16,47 2014± 78,56 12,70 ± 0,34 42,14 Lipase Pancreática 12,31 728 ± 4, 72 7,5 ± 0.55 52,52
O teor de umidade do derivado imobilizado é um parâmetro crítico que afeta o
equilíbrio da reação, sendo recomendada a utilização de derivados imobilizados com baixos
teores de umidade para não favorecer a reversibilidade da reação, evitando desta forma,
redução no rendimento da transesterificação. Assim sendo, especial atenção foi dada ao
procedimento experimental de imobilização, para se obter derivados imobilizados com teores
de umidade em níveis inferiores a 20%.
A atividade hidrolítica do derivado imobilizado é de crucial importância, pois além de
fornecer dados referentes à recuperação de atividade catalítica no suporte (rendimento de
imobilização), será utilizada no cálculo da massa do biocatalisador para mediar a reação de
transesterificação. Conforme anteriormente estabelecido (DA ROS, 2009) uma quantidade
mínima de 400 unidades de atividade por grama de óleo ou gordura é necessária para alcançar
um bom rendimento de transesterificação. A atividade sintética informa a capacidade do
derivado imobilizado de sintetizar um éster, ou seja, este dado pode estar diretamente
relacionado com a capacidade do biocatalisador de mediar a reação de transesterificação.
Os rendimentos de imobilização das diferentes lipases variaram entre 7,6 a 52,5%.
Com exceção das lipases de R. oryzae (Piccantase R8000) e pancreática, todas as lipases
resultaram em rendimentos de imobilização inferiores a 30%. O maior rendimento de
imobilização foi obtido pela lipase pancreática, significando que esta preparação apresentou a
maior afinidade pelo suporte. Entretanto, esse derivado apresentou baixa atividade sintética
nas condições testadas (7,5 U/g).
As atividades hidrolíticas mais elevadas foram fornecidas pelos derivados
imobilizados obtidos pelas lipases Piccantase R8000, Lipolase e PS.
58
Com relação à atividade sintética, os derivados obtidos pelas lipases AK, PS e
Lipolase foram os que apresentaram atividade catalítica mais elevada.
Os distintos valores de rendimentos obtidos podem estar relacionados com as
diferentes fontes de lipases avaliadas. Neste caso, as diferenças estruturais entre as moléculas
protéicas de cada enzima resultaram em diferentes interações enzima-suporte, conforme
constatado na literatura (PAULA et al., 2009).
4.3. Seleção do derivado imobilizado para mediar a transesterificação do sebo bovino com etanol
Os ensaios de transesterificação foram efetuados nas condições descritas no item 3.6.4
e os resultados obtidos referentes à formação de monoésteres de etila (biodiesel) em função do
tempo são apresentados nas Figuras 4.1 (a-e). Os rendimentos em ésteres e produtividades
alcançados para cada preparação de lipase testada são mostrados na Tabela 4.4.
As observações das Figuras 4.1 (a-e) indicam que o perfil dos ésteres formados foi
particular para cada derivado imobilizado, mostrando a seletividade de determinadas lipases
com relação ao tamanho de cadeia dos ácidos graxos presentes no sebo bovino.
As lipases PS e AK apresentaram seletividade semelhante para os ácidos esteárico,
oléico e palmítico (Figuras 4.1 a, b). A lipase pancreática, Figura 4.1 (d) apresentou
seletividade para os ácidos oléico e esteárico, tendo praticamente alcançado o equilíbrio
reacional em 24h. A lipase Piccantase R8000 foi a única preparação, entre as analisadas, que
apresentou seletividade pelo ácido graxo de menor cadeia, o ácido mirístico, conforme
mostrado na Figura 4.1 (e).
Desta forma, verifica-se que tanto a velocidade de reação quanto o rendimento em
ésteres foram dependentes da fonte de lipase utilizada. Os máximos valores obtidos em
concentração mássica de ésteres de etila variaram entre 1,7 a 66,8% m/m correspondendo,
respectivamente, a rendimentos de 2,52 a 99,78% (Tabela 4.4).
As lipases Piccantase e pancreática não foram eficazes na transesterificação do sebo
bovino, confirmando o perfil já detectado pela dosagem da atividade sintética. A Lipolase
também não foi efetiva na reação de transesterificação do sebo bovino com etanol, apesar de
ter apresentado uma atividade sintética da ordem de 12,7 U/g.
59
0 6 12 18 24 30 36 42 480
10
20
30
40
50
60
70
Lipase PS
C14
C16
C18
C18:1
Total
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
(a)
0 6 12 18 24 30 36 42 480
10
20
30
40
50
60 Lipase AK
C14 C16 C18 C18:1 Total
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
(b)
0 12 24 36 480.0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
Lipase Lipolase
C14 C16 c18 C18:1 Total
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
(c)
0 12 24 36 480
1
2
3
4
5
Lipase Pancreática
C14 C16 C18 C18:1 Total
Ést
eres
Etíl
icos
(%
m/m
)
Tempo (h)
(d)
0 12 24 36 480.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Lipase Piccantase
C14 C16 C18 C18:1 Total
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
(e)
Figura 4.1. Perfil de formação dos ésteres de etila (-■-C14; -●-C16, -▲-C18, -▼- C18:1, –Total) em função do tempo de reação da etanólise do sebo bovino catalisada por diferentes lipases imobilizadas em POS-PVA. Todos os ensaios foram realizados a 45°C, sob agitação magnética. Lipase PS (a), Lipase AK (b), Lipolase (c), lipase Pancreática (d), Piccantase R8000 (e).
60
Os desempenhos mais elevados foram alcançados pela atuação das lipases AK e PS,
alcançando, em 48 h, concentrações em ésteres, respectivamente, de 62,38 e 66,7% m/m,
correspondendo a rendimentos de 93,26 e 99,78%.
Considerando que as lipases PS e AK apresentaram desempenhos similares na síntese
de biodiesel a partir do sebo bovino, a seleção do biocatalisador mais eficiente foi baseada nas
propriedades dos produtos transesterificados.
Tabela 4.4 - Resumo dos experimentos realizados utilizando diferentes lipases imobilizadas em POS-PVA ativado com epicloridrina.
Lipases Rendimento de transesterificação (%)
Produtividade (mg/g.h)
Lipase PS 99,78 13,90
Lipase AK 93,26 13,00
Lipolase 2,33 0,5
Piccantase R 8000 3,02 0,4
Lipase pancreática 6,20 1,8
4.4. Análise do produto transesterificado (biodiesel)
Os produtos obtidos na transesterificação do sebo bovino com etanol catalisada pelas
lipases PS e AK foram purificados (separação do glicerol formado e extração de álcool
residual no aparelho de rota-evaporador) e posteriormente analisados, incluindo viscosidade
dinâmica, termogravimetria, espectroscopia de absorção na região do infravermelho e RMN 1H.
4.4.1.Viscosidade cinemática
A viscosidade pode ser usada como um parâmetro para o controle da reação de
biodiesel, confirmando a conversão dos óleos vegetais ou gorduras animais em ésteres
(KNOTHE et al., 2006) pela redução acentuada da viscosidade da matéria-prima e do
biodiesel.
Para a determinação da viscosidade do sebo bovino refinado foi adotada uma
temperatura de 50°C, pois abaixo dessa temperatura o sebo bovino se encontrava em estado
físico fora de especificação para operação do viscosímetro. As amostras de biodiesel obtidas
pela atuação dos derivados imobilizados das lipases PS e AK, após as etapas de purificação
foram analisadas a 40°C.
61
A Tabela 4.5 mostra os valores encontrados para a viscosidade do sebo bovino (43,82
cP) e das amostras de biodiesel obtidas pela atuação das lipases PS (5,98 cP) e AK (7,34 cP).
Apesar de ambas amostras terem apresentado consistente redução da viscosidade, a amostra
de biodiesel obtida na reação catalisada pela lipase PS forneceu a menor viscosidade, o que
também confirma o valor mais elevado de conversão dos triglicerídeos em ésteres etílicos,
como determinado por cromatografia de fase gasosa (Tabela 4.4).
Tabela 4.5 - Viscosidade do sebo bovino e das amostras de biodiesel obtidas nas reações catalisadas pela lipase PS e AK.
Sebo Refinado (50°C)
Biodiesel (Lipase PS)
Biodiesel (Lipase AK)
Viscosidade
Absoluta (cP) 43,82 5,89 7,34
4.4.2. Espectroscopia na região do infravermelho
Outra técnica para monitoramento da transesterificação de óleos e gorduras é a
espectroscopia na região do infravermelho (MONTEIRO et al., 2008).
A Figura 4.2 apresenta as bandas de vibração obtidas dos espectros na região de
infravermelho das amostras de sebo bovino e do biodiesel sintetizado pela atuação das lipases
PS e AK.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
Tra
nsm
itânc
ia (
%)
Sebo bovino
Biodiesel (Lipase PS)
723
1159
1471174428512914
1159
1471174428432926
Número de onda ( cm-1)
Biodiesel (Lipase AK)
2920 2857 1744 1460
1172
720
723
Figura 4.2. Espectro na região do infravermelho das amostras de sebo bovino refinado e do biodiesel sintetizado pelas lipases PS e AK.
62
A amostra de sebo bovino apresentou um espectro com bandas de vibração
relacionadas aos triglicerídeos em 1159 e 1733cm-1, respectivamente, referentes aos
estiramentos dos grupos C-O e C=O. Apresentou também absorção em comprimentos de onda
de 2848 e 2917cm-1 referente a ligação C-H.
Para o espectro da amostra de biodiesel obtido pela atuação da lipase AK, verificou-se
apenas um pequeno deslocamento das bandas de absorção quando comparados aos
estiramentos do sebo bovino, fato não observado com amostra de biodiesel obtido pela
atuação da lipase PS. Esse tipo de comportamento é similar ao reportado na literatura para
amostras de sebo bovino e biodiesel obtido desta matéria-prima lipídica. Em se tratando de
um triéster (sebo bovino) e após a reação de transesterificação se formam mono e di ésteres,
era de se esperar que as curvas estivessem no mesmo comprimento de onda (MOTHÉ et al.,
2005; MOURA et al., 2006; STUART; GEORGE; MCINTYRE, 1996).
4.4.3. Análise termogravimétrica
A análise termogravimétrica gera como resultado uma curva de decomposição térmica
que informa as etapas de degradação das amostras em função da temperatura. Por meio da
análise desses dados, é possível estabelecer parâmetros de estabilidade térmica da gordura in-
natura e o biodiesel obtido. Além disso, essas informações dizem respeito à qualidade e as
propriedades do biocombustível, permitindo classificar o produto como sendo confiável e
consistente com os padrões de qualidade exigidos pelas normas oficiais.
As Figuras 4.3 (a) e (b), relacionadas, respectivamente, aos gráficos de TG e DTG,
apresentam os resultados dessa análise para as amostras de sebo bovino e do biodiesel obtido
na transesterificação empregando as lipases PS e AK. Os dados referentes às etapas de
degradação térmica são apresentados na Tabela 4.6.
O sebo bovino se mostrou estável termicamente até a temperatura de 210°C,
demonstrando apenas um estágio de degradação térmica entre 210-560°C, com perda de
massa de 99% referente à decomposição térmica de triglicerídeos. A amostra de biodiesel
transesterificado com a lipase PS apresentou apenas um estágio de decomposição térmica na
faixa de temperatura de 128–290°C, com perda de massa de aproximadamente 98% referente
à decomposição dos ésteres etílicos.
63
(a)
100 200 300 400 500 600 7000
20
40
60
80
100
Per
da d
e m
assa
(%
)
Temperatura (ºC)
Biodiesel (Lipase PS) Biodiesel (Lipase AK) Sebo bovino
(b)
100 200 300 400 500 600 700 8000.0
-0.5
-1.0
-1.5 Biodiesel (Lipase PS) Biodiesel (Lipase AK) Sebo bovino
DT
G (
dm/d
T)
Temperatura (ºC)
Figura 4.3. Análise termogravimétrica das amostras de sebo bovino (linha vermelha) e do biodiesel sintetizados pela atuação das lipases PS (linha verde) e AK (linha azul). (a) TG, (b) DTG.
64
Tabela 4.6 - Etapas e temperaturas de degradação térmica para as amostras de sebo bovino, biodiesel sintetizado pela atuação das lipases PS e AK.
Amostra Etapa Tinicial (˚c) Tfinal (˚c) ����massa(%)
Sebo Bovino 1 210 560 99,00
Biodiesel (Lipase PS) 1 128 290 98,00
Biodiesel
(Lipase AK)
1 26 56 4,46
2 124 280 75,84
3 280 505 19,70
Com relação à amostra de biodiesel preparado com a lipase AK, observaram-se três
estágios de degradação térmica. O primeiro ocorreu na faixa de temperatura de 26–56°C, com
perda de massa de 4,46%, devido à presença de umidade na amostra. O segundo estágio
ocorreu na faixa de temperatura de 124–280°C, com perda de massa de 75,84%, referente à
decomposição de ésteres etílicos. O terceiro estágio ocorreu na faixa de temperatura de 280–
365°C, com perda de massa 19,70%, referente à decomposição de mono, di e triglicerídeos
não convertidos em ésteres.
Esses resultados são similares aos descritos por Moura et al. (2006) em amostra de
biodiesel obtido por transesterificação química (KOH) do sebo bovino com metanol. Uma
perda de massa de 96,08% referente a decomposição de ésteres metílicos foi observada na
faixa temperatura entre 119,12–283,34°C. Adicionalmente, na faixa de temperatura de
283,34–492,59 °C com uma perda de massa de 3,08% referente à decomposição térmica de
resíduos de mono, di e triglicerídeos.
No caso da amostra de biodiesel obtida com a lipase de PS, foi observada apenas a
faixa de temperatura de degradação térmica dos ésteres de etila. Esse fato indica a ausência de
triglicerídeos na amostra de biodiesel, confirmando os dados de elevado rendimento,
apresentado na Tabela 4.4.
4.4.4. Ressonância magnética nuclear de próton
Informações adicionais referentes à qualidade das amostras de biodiesel foram obtidas
por análise de RMN 1H como mostrado na Figura 4.4. Esses grupos são atribuídos como
segue (MONTEIRO et al., 2008): a) prótons olefínicos e próton metilênicos do glicerol; b)
prótons metilênicos do glicerol; c) prótons α-carboxílicos; d) prótons alílicos externos; e) β-
carboxílicos; f) prótons metilênicos dos ácidos graxos do triacilglicerol; g) prótons metílicos
terminais.
65
Como verificado na Figura 4.4 um multiplete em 4,10-4,32 ppm (sinal b) referentes
aos prótons dos carbonos 1 e 3 da molécula do glicerol desaparecem completamente, devido à
conversão de triglicerídeos. A formação dos ésteres etílicos pode ser observada na região em
4,0-4,2 ppm, sendo representada por um quarteto. A partir destes espectros foi possível
concluir que a reação de transesterificação do sebo bovino ocorreu com sucesso.
ppm (t1)1.02 .03.04.05.06.07.08.0
4.00
5.69
5.52
3.64
Sebo bovino a
b
cd e
f g
1.02.03.04.05.06.07.08.0
Biodiesel (lipase PS)
1.02.03.04.05.06.07.08.0
Biodiesel ( lipase AK)
Figura 4.4. Ressonância magnética nuclear de prótons das amostras de sebo bovino e do biodiesel sintetizado pelas lipases PS e AK.
Com base nesses dados, foi possível concluir que o biodiesel obtido pela atuação da
lipase PS apresentou um melhor conjunto das propriedades quando comparadas com o
biodiesel obtido com a lipase AK. Esse resultado é bastante similar ao obtido por Hsu et al.
(2001) que também demonstraram que a lipase de Pseudomonas cepacia foi a mais eficiente
na transesterificação de sebo bovino com etanol, alcançando uma conversão da ordem de 95%
em 24h e a adição de peneira molecular na proporção de 0,4% em relação ao substrato
auxiliou no controle da reação reversa (hidrólise). Em outro trabalho e mesmo adotando
diferentes condições reacionais (utilizando hexano como solvente) esta preparação de lipase
foi também reportada como a mais efetiva para catalisar a conversão de sebo bovino em
ésteres metílicos (NELSON; FOGLIA; MARMER, 1996).
66
4.5. Propriedades bioquímicas, cinéticas do derivado selecionado para aplicação na reação de transesterificação do sebo bovino.
Tendo selecionado o derivado imobilizado mais efetivo para mediar a síntese de
biodiesel a partir do sebo bovino, as propriedades bioquímicas, cinéticas e de estabilidade
térmica da lipase PS imobilizada em POS-PVA foram determinadas, para permitir melhor
conhecimento desses parâmetros, sobre a reação enzimática e, portanto, utilizar plenamente a
potencialidade catalítica desse derivado imobilizado.
4.5.1. Propriedades bioquímicas
A determinação das propriedades bioquímicas (pH e temperatura) foi realizada com o
auxílio da metodologia de superfície de resposta, uma coleção de técnicas estatísticas e
matemáticas, que tem se mostrado útil no desenvolvimento e otimização de diversos
processos (SANTOS; CASTRO, 2006). Permite ainda a obtenção de modelos matemáticos
que, apesar de empíricos, possibilitam o levantamento e a comprovação de hipóteses
científicas que buscam explicar relações de causa e efeito entre os resultados experimentais e
as variáveis em estudo. Apesar de amplamente utilizada nas últimas décadas, a metodologia
de superfície de resposta foi apenas nos últimos anos empregada para estudos associados à
cinética enzimática (BOYACI, 2005; ANDERSON; ADLERCREUTZ, 1999), sendo este tipo
de trabalho ainda pouco relatado na literatura.
Neste trabalho foi adotado um planejamento fatorial 2² estrela rotacional com três
replicatas no ponto central para se determinar as melhores condições de pH e temperatura para
a atividade hidrolítica das lipases livre e imobilizada. A matriz do planejamento é apresentada
na Tabela 4.7, juntamente com os resultados experimentais. Os resultados foram avaliados
utilizando-se o programa Design-Expert 6.0 (Stat-Ease Corporation, USA). As estimativas dos
efeitos, erros-padrão e do valor de p para a resposta analisada são apresentadas na Tabela 4.8.
Para a lipase livre, os valores de atividade hidrolítica variam entre 24284 a 54756 U/g,
sendo os valores mais elevados de atividade obtida no ponto central (pH = 7,5 e temperatura=
50 °C). Verifica-se para a variável temperatura que tanto seu termo linear quanto o quadrático
apresentaram influência significativa ao nível de 95% de confiança. Por outro lado, para a
variável pH, somente o termo quadrático foi significativo a 95% de confiança (p> 0,1).
67
Tabela 4.7 - Resultados obtidos no planejamento experimental para avaliação do efeito das variáveis pH e temperatura na atividade hidrolítica da lipase PS livre e imobilizada.
Ensaios Variáveis codificadas Variáveis reais Atividade Hidrolítica (U/g)
pH T(ºC) pH T(ºC) Livre Imobilizada 1 -1 -1 6,5 40 33956 1468 2 1 -1 8,5 40 32812 2650 3 -1 1 6,5 60 44564 1381 4 1 1 8,5 60 48204 2717 5 0 0 7,5 50 54080 1902 6 0 0 7,5 50 52156 1962 7 0 0 7,5 50 54756 1911 8 -1,414 0 6,1 50 44200 1295 9 1,414 0 8,9 50 50024 2335
10 0 -1,414 7,5 36 24284 1973 11 0 1,414 7,5 64 32552 1979
Tabela 4.8 - Estimativas dos efeitos das variáveis, erro padrão e valores de p para a atividade hidrolítica da lipase PS livre e imobilizada segundo os resultados dos planejamentos.
Variáveis Lipase livre Lipase imobilizada
Efeito Erro padrão
Valor p
Efeito Erro padrão
Valor p
Media 53655 ± 779 0,0000* 1999 ± 12 0,0000* X1 (Linear) 2685 ± 955 0,1067 1259 ± 32 0,0007*
X1 (Quadrático) -5469 ± 1140 0,0408* ------ ------ ------ X2 (Linear) 9443 ± 955 0,0100* -10 ± 32 0,7865
X2 (Quadrático) -24275 ± 1140 0,0022* ------ ------ ------ X1.X2 2392 ± 1349 0,2182 77 ± 32 0,1403
* Significativos com 95% de confiança; X1 e X2 representam a variável pH e temperatura, respectivamente.
Para a lipase imobilizada, os valores de atividade hidrolítica variaram entre 1381 a
2717 U/g. As atividades mais elevadas foram obtidas no nível alto para o pH (8,5) para uma
ampla faixa de temperatura. Verifica-se ainda que para a variável pH, somente o termo linear
apresentou significância com 95% de confiança, não sendo constatado nenhum outro termo
significativo.
A partir dos resultados da Tabela 4.8, foi possível compor os modelos estatísticos
incluindo os coeficientes correspondentes aos efeitos significativos. Os coeficientes relativos
aos efeitos não significativos foram excluídos do modelo referente a atividade hidrolítica da
lipase livre, exceto quando eram necessários para manter a hierarquia do modelo (MYERS;
MONTGOMERY, 1995). Os coeficientes relativos aos efeitos não significativos, ou seja,
68
temperatura e interação entre pH e temperatura também foram excluídos do modelo referente
a atividade hidrolítica da lipase PS imobilizada.
As equações dos modelos obtidos são apresentadas na Tabela 4.9, obtendo-se as
superfícies de resposta e curvas de nível apresentadas nas Figuras 4.5 e 4.6.
Tabela 4.9- Modelos obtidos pela superfície de resposta gerada no planejamento experimental, considerando a atividade enzimática (A, U/g) como função dos valores codificados de pH (x1) e temperatura (x2).
Lipase Modelos R2
Livre A (U/g) = 53655 + 1343.X1 - 2734.X12 + 4721.X2 – 12137.X2
2 0,9545
Imobilizada A (U/g) = 1199 + 630.X1 0,9774
Figura 4.5. Superfície de resposta de acordo com a equação predita para a atividade hidrolítica da lipase PS livre.
Figura 4.6. Superfície de resposta de acordo com a equação predita para a atividade hidrolítica da lipase PS imobilizada.
A Figura 4.5 mostra a superfície de resposta referente a lipase PS livre que apresentou
um valor de pH (7,5) e temperatura (52°C) para a qual a atividade hidrolítica foi máxima, e os
pontos são os valores de atividade obtidos experimentalmente. A Figura 4.6 mostra a
superfície de resposta referente a lipase PS imobilizada em POS-PVA que apresentou um
valor de pH (8,9), com uma ampla faixa da temperatura (36 a 58°C) para o qual a atividade
hidrolítica foi máxima.
O teste de análise de variância dos modelos (ANOVA, Tabela 4.10 e 4.11), indicaram
que a falta de ajuste do modelo não foi significativa com nível de 95% de confiança (p>0,05).
69
Verifica-se ainda, pelo valor de R², que a equação ajustada foi capaz de explicar mais de 90%
da variabilidade dos valores experimentais tanto para a lipase livre quanto para a imobilizada.
Desta forma, considerou-se que os modelos estatísticos obtidos foram adequados para
descrever a atividade hidrolítica da lipase (livre e imobilizada) em função do pH e
temperatura.
Tabela 4.10 – Análise de variância (ANOVA) para a atividade hidrolítica da lipase PS livre.
Variáveis Soma
Quadrática (x 10-3)
Graus de Liberdade
Média Quadrática
(x 10-3)
F
Valores Prob > F
X1 14375 1 14375 7.8993 0,1067 X1
2 41883 1 41883 23.0152 0,0408* X2 177793 1 177793 97.6999 0,0101* X2
2 825221 1 825221 453.47 0,0022* Falta de Ajuste 44997 4 11249 6.1815 0,1441
Erro Puro 3640 2 1820 Cor total 1069960 10
*significante com nível de 95% de confiança
Tabela 4.11 – Análise de variância (ANOVA) para a atividade hidrolítica da lipase PS imobilizada em POS-PVA.
Variáveis Soma quadrática
Graus de liberdade
Média Quadrática
F Valores Prob > F
X1 1585081 1 1585081 1513,92 0,0006* Falta de Ajuste 34556 3 11519 11,00 0,0845
Erro Puro 2094 2 1047 Cor total 1621731 6
*significativo ao nível de 95% de confiança
4.5.2. Parâmetros cinéticos
Nas Figuras 4.7 e 4.8 são apresentadas as atividades da lipase livre e imobilizada,
respectivamente, em função da concentração de ácidos graxos presentes na emulsão óleo e
água contendo diferentes proporções de azeite de oliva (10-70% m/v). Os resultados obtidos
sugerem que a atividade de ambas formas de lipase (livre e imobilizada), em função da
concentração de ácidos graxos, segue cinética do tipo Michaelis-Menten, indicando que na
faixa de concentração estudada não se detectou uma possível inibição por produtos de reação
ou pela redução do teor de água no meio reacional.
As constantes de afinidade pelo substrato (Km) e a velocidade máxima de reação (Vmax)
foram calculadas com o auxílio do programa Enzyme Fitter e os modelos propostos levaram
70
aos resultados apresentados na Tabela 4.12. O menor valor de Km determinado para a lipase
imobilizada, indica que mediante imobilização a afinidade da lipase pelo substrato foi
incrementada. Esse comportamento pode ser atribuído a um provável efeito de purificação da
lipase livre que pode ter ocorrido durante o procedimento de imobilização. Esse efeito já foi
reportado para diferentes fontes lipase quando imobilizada no suporte híbrido POS-PVA,
demonstrando a compatibilidade desse suporte pela enzima lipase (PAULA et al., 2007;
PAULA et al., 2008).
0 372 744 1116 1488 1860 2232
0
1x104
2x104
3x104
4x104
5x104
6x104
Ativ
idad
e (U
/g)
Ácidos graxos (mM)
0 372 744 1116 1488 1860 22320
300
600
900
1200
1500
1800
2100
Ativ
idad
e (U
/g)
Ácidos graxos (mM)
Figura 4.7. Atividade hidrolítica da lipase de Pseudomonas cepacia livre em função da concentração do substrato.
Figura 4.8. Atividade hidrolítica da lipase de Pseudomonas cepacia imobilizada em função da concentração do substrato.
Tabela 4.12 - Valores de km e Vmax obtidos a partir das curvas da atividade hidrolítica em função da concentração do substrato.
4.5.3. Constante de desativação térmica da lipase livre e imobilizada
Experimentos foram efetuados para determinar a constante de desativação térmica (kd),
e o tempo de meia-vida da lipase PS livre e imobilizada em POS-PVA sob efeito da
temperatura de 60 ºC. As atividades residuais da lipase PS livre e do derivado imobilizado
após tratamento térmico foram plotadas na Figura 4.9 e utilizadas para calcular a constante de
desativação térmica (kd) e o tempo de meia-vida (Tabela 4.13).
Lipase km
(mM) Vmax
(U/g)
PS livre 4.018 56.441
PS imobilizada 1.883 3.873
71
0 20 40 60 80 100 120
0
20
40
60
80
100
PS livre PS imobilizada em POS-PVA
Ativ
idad
e R
esid
ual (
%)
Tempo (min)
Figura 4.9. Desativação térmica da lipase PS livre e imobilizada em POS-PVA (experimentos conduzidos em solução tampão fosfato 0,1 M, pH 6,5 sob temperatura de 60 ºC, considerando como 100% a atividade da lipase livre em 43290 U/g e do derivado imobilizado em 2009 U/g).
Os testes de estabilidade térmica demonstraram uma influência positiva do método de
imobilização na estabilidade da lipase, revelando um tempo de meia-vida da lipase
imobilizada em POS-PVA da ordem de 6,24 h, enquanto a enzima livre foi totalmente
desnaturada após 30 min de incubação a 60°C (tempo de meia-vida= 0,36h). Esse valor
corresponde a um aumento da estabilidade térmica de aproximadamente 17 vezes da lipase
imobilizada em POS-PVA.
Tabela 4.13 - Constantes de inativação térmica da lipase livre e imobilizada e seus respectivos tempos de meia-vida.
Lipase Kd
(h-1) Tempo de meia-vida
(h) Livre 1,92 0,36
Imobilizada 0,11 6,24
4.5.4. Espectro na região do Infravermelho
A espectroscopia na região do infravermelho (FTIR) foi também utilizada para
comprovar a eficiência do método de preparação do derivado imobilizado no que se refere à
incorporação da lipase PS no suporte. Na Figura 4.10 estão apresentados os espectros da
lipase livre e do derivado imobilizado. Verifica-se que o pico característico da lipase PS que
72
envolve o grupamento amino primário (–NH2) decorrente da vibração de deformação N–H
primária, está também presente no derivado imobilizado.
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 4000,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Lipase PS Livre Lipase PS Imobilizada em POS-PVA
Abs
orbâ
ncia
Número de onda (cm-1)
Figura 4.10. Espectro na região do infravermelho da lipase PS livre e imobilizada em POS-PVA.
Os dados descritos nesta seção (4.5) permitiram definir as principais características
bioquímicas e cinéticas da lipase de Pseudomonas cepacia imobilizada em POS-PVA,
permitindo utilizar plenamente a potencialidade catalítica desse derivado imobilizado na
síntese proposta. As principais características da lipase livre e imobilizada em POS-PVA
descritas nesta seção estão sumarizadas na Tabela 4.14.
Tabela 4.14 - Características bioquímicas e cinéticas das preparações de lipase PS livre e imobilizada em POS-PVA.
Propriedades catalíticas Lipase
Livre Imobilizada pH ótimo 7,5 8,5
Temperatura ótima (°C) 50 60 kd (60°C) 1,92 0,11
Tempo de meia-vida 60°C (h) 0,36 6,24 Km (mM) 4018 1883 Vmax (U/g) 56441 3873
73
4.6-Otimização das condições de transesterificação enzimática do sebo bovino com etanol catalisada pela lipase PS imobilizada em POS-PVA
Nesta etapa do trabalho foi adotado um planejamento estrela rotacional com três
replicatas no ponto central visando determinar a influência da temperatura e razão molar na
síntese de biodiesel empregando a lipase selecionada. O perfil de formação dos monoésteres
de etila para cada ensaio efetuado em função do tempo é mostrado na Figura 4.11. Como
variável de resposta foi considerado o rendimento de transesterificação em 6h de reação. A
matriz experimental e os resultados obtidos são apresentados na Tabela 4.15.
Tabela 4.15 - Matriz experimental e resultados obtidos de acordo com o planejamento fatorial 22 estrela rotacional utilizado para avaliar a influência das variáveis: temperatura e razão molar no rendimento da transesterificação do sebo bovino e etanol.
Ensaios Variáveis codificadas Variáveis reais Rendimento de
transesterificação (%)
T (ºC)
Razão Molar (etanol/sebo)
T (ºC)
Razão Molar (etanol/sebo)
1 -1 -1 48 7 92,02 2 1 -1 58 7 80,15 3 -1 1 48 12 87,45 4 1 1 58 12 75,62 5 0 0 53 9,5 91,13 6 -1,414 0 46 9,5 100 7 1,414 0 60 9,5 74,51 8 0 -1,414 53 6 91,84 9 0 1,414 53 13 86,73
10 0 0 53 9,5 87,57 11 0 0 53 9,5 88,79
Os resultados obtidos indicam que a lipase PS imobilizada em POS-PVA foi capaz de
formar os monoésteres de etila em todas as condições ensaiadas. Os rendimentos globais
variaram entre 74,51 a 100%. O rendimento mais elevado foi verificado na reação realizada
em meios contendo etanol e sebo bovino numa razão molar 9,5 e temperatura de 46°C (ensaio
6).
As estimativas dos efeitos, erros-padrão e do valor de p para a resposta analisada são
apresentadas na Tabela 4.16. Dentro da região analisada, verifica-se que os rendimentos de
transesterificação foram dependentes das variáveis lineares (X1, X2), temperatura e razão
molar, sendo que somente o termo linear da variável temperatura foi significativo ao nível de
95%. As variáveis quadráticas, bem como a interação, não foram estatisticamente
significativas.
74
0 6 12 18 24 30 36 42 480
10
20
30
40
50
60
70
80
90Experimento 1
Temperatura 48oCRazão Molar 1:7
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
0 6 12 18 24 30 36 42 480
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Experimento 2Temperatura 58oCRazão Molar 1:7
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
0 6 12 18 24 30 36 42 480
10
20
30
40
50
60
70
80
Experimento 3Temperatura 48oCRazão Molar 1:12
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
0 6 12 18 24 30 36 42 480
10
20
30
40
50
60
70
80Experimento 4
Temperatura 58oCRazão Molar 1:12
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
0 6 12 18 24 30 36 42 480
10
20
30
40
50
60
70
80
Experimento 5Temperatura 53oCRazão Molar 1:12
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
0 6 12 18 24 30 36 42 480
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Experimento 6Temperatura 46oCRazão Molar 1:9,5
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
Figura 4.11. Perfil de formação dos monoésteres de etila (-■-C14; -●-C16, -▲-C18, -▼- C18:1, –♦–Total) na reação de transesterificação do sebo bovino empregando lipase PS imobilizada em POS-PVA, sob diferentes condições operacionais (ensaios 1 a 6).
75
0 6 12 18 24 30 36 42 480
10
20
30
40
50
60
70
80
Experimento 7Temperatura 60oCRazão Molar 1:9,5
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
0 6 12 18 24 30 36 42 480
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100Experimento 8
Temperatura 53oCRazão Molar 1:6
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
0 6 12 18 24 30 36 42 480
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100Experimento 9
Temperatura 53oCRazão Molar 1:13
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
0 6 12 18 24 30 36 42 480
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Experimento 10Temperatura 53oCRazão Molar 1:9,5
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
0 6 12 18 24 30 36 42 480
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Experimento 11Temperatura 53oCRazão Molar 1:9,5
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
Figura 4.11. Perfil de formação dos monoésteres de etila (-■-C14; -●-C16, -▲-C18, -▼- C18:1, –♦–Total) na reação de transesterificação do sebo bovino empregando lipase PS imobilizada em POS-PVA, sob diferentes condições operacionais (ensaios 7 a 11).
76
Tabela 4.16- Estimativas dos efeitos das variáveis, erro padrão e valores de p para o rendimento de transesterificação segundo os resultados do planejamento estrela rotacional.
Variáveis Rendimento
Efeito Erro padrão Valor p Media 86,84 ± 0,54 0,0000a
X1 (Linear) -14,94 ± 1,28 0,0073a
X2 (Linear) -4,29 ± 1,28 0,0785b
asignificativo ao nível de 95%, bsignificativo ao nível de 90%
A partir desses dados, foi possível compor o modelo estatístico incluindo os
coeficientes correspondentes aos efeitos significativos, como apresentado na equação 4.1, em
que: R representa o rendimento de transesterificação (%); X1 é o valor codificado da variável
temperatura e X2 o valor codificado da variável razão molar.
R (%) = 86,84 - 7,47 .x1 - 2,15. x2 Equação 4.1
A análise de variância do modelo estatístico (Tabela 4.17) indicou significância
estatística ao nível de 95% de confiança, não sendo constatada falta de ajuste (p= 0,2065).
Verifica-se ainda pelo valor de R² que a equação ajustada foi capaz de explicar 84,56% da
variabilidade dos valores experimentais. Desta forma, considerou-se que o modelo estatístico
foi adequado para descrever o rendimento de transesterificação em função da temperatura e
razão molar na síntese de biodiesel a partir do sebo bovino, obtendo-se a superfície de
resposta apresentada na Figura 4.12. Os valores preditos pelo modelo representado na
superfície de resposta indicam que o rendimento de transesterificação foi maximizado numa
temperatura de 46°C e razão molar sebo bovino/ etanol em 1:6.
Tabela 4.17 - Análise de variância (ANOVA) para os rendimentos de transesterificação do sebo bovino com etanol.
Variáveis Soma Quadrática
Grau de Liberdade
Média Quadrática
F Valores Prob > F
Modelo 483,11 2 241,55 21,91 0,0006 Temperatura X1 446,23 1 446,23 40,47 0,0002 Razão Molar X2 36,87 1 36,87 3,34 0,1048 Falta de ajuste 81,66 6 13,61 4,16 0,2065
Erro Puro 6,55 2 3,27 Cor Total 571,31 10
R2= 0,8456 F: Teste estatístico de comparação da variância nos ensaios, permitindo a avaliação da qualidade do ajuste do modelo.
77
Empregando-se o programa Design-Expert 6.0, procedeu-se à busca dos valores
máximos de rendimento da transesterificação enzimática do sebo bovino com etanol. Desta
forma, para se obter rendimentos superiores a 95%, é necessário trabalhar em condições
reacionais delimitadas, como apresentada pela Figura 4.13 (região em amarelo), sendo
selecionado a condição de nível baixo para ambas variáveis (temperatura =48˚C e razão molar
sebo:etanol 1:7).
Figura 4.13. Rendimento de transesterificação em função dos resultados obtidos pelo planejamento experimental.
Figura 4.12.- Superfície de resposta para o rendimento de transesterificação do sebo bovino e etanol catalisada pela lipase PS imobilizada em POS-PVA em função da temperatura e razão molar, de acordo com o modelo predito pela equação 4.1.
78
4.7- Estabilidade térmica das amostras de biodiesel
As amostras obtidas nas reações de transesterificação conduzidas de acordo com o
planejamento fatorial foram também submetidas à análise termogravimétrica para determinar
a estabilidade térmica do biodiesel originado em cada condição reacional. As curvas de TG
obtidas em cada condição experimental testada estão ilustradas na Figura 4.14.
As diversas amostras de biodiesel apresentaram uma semelhança notável, tendo um
primeiro estágio de decomposição térmica na faixa de temperatura entre 28 a 90°C, referente
à presença de umidade. O segundo estágio de perda de massa na faixa de 135–285ºC,
referente à decomposição térmica dos ésteres etílicos. O terceiro estágio com perda de massa
na faixa entre 340–420ºC, referente à decomposição térmica de mono, di e triglicerídeos que
não foram convertidos a ésteres.
50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% M
ássi
ca
Temperatura (oC)
Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3 Ensaio 4 Ensaio 5 Ensaio 6 Ensaio 7 Ensaio 8 Ensaio 9 Ensaio 10
Figura 4.14. Análise termogravimétrica das amostras de biodiesel obtidas na reação transesterificação do sebo bovino com etanol catalisada pela lipase PS imobilizada sob diferentes condições reacionais.
Esse comportamento similar, de todas as curvas apresentarem o mesmo perfil de
degradação térmica, já era esperado, tendo em vista que as amostras de biodiesel foram
submetidas ao teste de estabilidade térmica (TG) após 48 h de reação, quando conversões
superiores a 90% já tinham sido alcançadas em todas as condições testadas.
Para permitir uma melhor visualização do efeito das condições operacionais adotadas
79
(efeito da temperatura e da razão molar) as curvas termogravimétricas referentes aos ensaios 1
e 2 (temperaturas diferentes 48 e 58°C para meios constituídos com materiais de partida na
mesma razão molar sebo: etanol de 1:7) e ensaios 5 e 9 (mesma temperatura de 53°C para
meios constituídos com diferentes razões molares entre sebo e etanol = 1/9,5 e 1/13) foram
plotadas separadamente, como mostrado nas Figuras 4.15 e 4.16, respectivamente.
50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% M
ássi
ca
Temperatura (oC)
Ensaio 1 (T= 480C; RM =1:7)
Ensaio 2 (T= 580C; RM =1:7)
50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% M
ássi
ca
Temperatura (oC)
Ensaio 5 (T= 530C; RM= 1:9,5)
Ensaio 9 (T= 530C; RM= 1:13)
Figura 4.15. Análise termogravimétrica comparativa das amostras de biodiesel sintetizadas pela lipase PS, observando o efeito da temperatura.
Figura 4.16. Análise termogravimétrica comparativa das amostras de biodiesel sintetizadas pela lipase PS, observando o efeito da razão molar.
Verifica-se na Figura 4.15 a influência da temperatura das reações nos produtos
obtidos com relação às curvas de TG. A diferença mais notável foi referente à primeira etapa
de degradação térmica, que ocorreu na faixa entre 28 a 90°C, devido aos diferentes teores de
água presente nas amostras. Este teor de umidade foi menos acentuado no ensaio 2 devido a
utilização de condições mais elevadas de temperatura.
Na Figura 4.16, observa-se à influência da razão molar nos produtos resultantes com
relação às curvas de TG. A diferença, neste caso, pode ser associada ao teor de gordura
residual referente à terceira etapa de degradação térmica, que ocorreu na faixa de 340-420°C.
Na curva referente ao experimento 5, esta terceira etapa de degradação foi praticamente
imperceptível indicando que a amostra possui um teor mínimo de gordura residual. Este fato
80
sugere ainda que experimentos conduzidos em meios reacionais com elevado excesso de
etanol tendem a apresentar maiores teores de gordura residuais, e conseqüentemente, um
menor rendimento de transesterificação.
4.8- Comprovação do modelo estatístico da síntese de biodiesel catalisada pela lipase de Pseudomonas cepacia e análise do produto obtido
4.8.1- Comprovação do modelo estatístico
A última etapa do trabalho foi direcionada para comprovação do modelo estatístico
que representa a região ótima de temperatura e razão molar sebo bovino/etanol para conduzir
a síntese de biodiesel catalisada pela lipase PS imobilizada em POS-PVA. Para tanto, um
experimento adicional foi efetuado nas condições preditas pelo modelo estatístico em um
reator com mesma configuração, porém com maior volume útil de trabalho. Isso permitiu
também verificar a interferência do desempenho do biocatalisador selecionado numa
ampliação de volume. Esse ensaio foi efetuado com uma massa total de reagentes de 110 g
numa razão molar 1:7 (sebo:etanol) a 48˚C. O monitoramento da reação foi efetuado pela
determinação dos ésteres etílicos formados (Figura 4.17) em amostras retiradas em intervalos
de 2 h por um período máximo de 18 h.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 180
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Ést
eres
de
Etil
a (%
m/m
)
Tempo (h)
Figura 4.17. Perfil de formação dos monoésteres de etila (-■-C14; -●-C16, -▲-C18, -▼- C18:1, –♦–Total) na reação de transesterificação do sebo bovino empregando lipase PS imobilizada em POS-PVA nas condições preditas pelo modelo estatístico.
81
A reação apresentou um perfil de formação de ésteres de etila similar ao obtido
anteriormente, alcançando o equilíbrio em 12h de reação. O ponto de verificação do modelo
estatístico foi comprovado em 8 h, apresentando um rendimento de 91,62%, enquanto no
ensaio proposto no delineamento experimental (item 4.6) esse rendimento foi obtido com 6 h
de reação. Este deslocamento pode ser atribuído à ampliação de volume do meio reacional
que, de fato, ocasiona um desvio do comportamento esperado (BEEL, 2005).
4.8.2 Comparação das propriedades do biodiesel obtido por vias enzimática e química
As propriedades do biodiesel obtido experimentalmente em escala de bancada por via
enzimática foi comparado com as propriedades de uma amostra de biodiesel obtida por rota
química e fornecida comercialmente. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 4.18,
que também apresenta as especificações da ANP para o uso do biodiesel.
Tabela 4.18 – Comparação das propriedades do biodiesel e adequação a norma vigente.
Biodiesel Biodiesel comerciala
Especificações ANP
Índice de Acidez (mg KOH/g) 6,27 1,96 0,5 Índice de Iodo (g I2/g) 33,49 31,99 Max. 120*
Umidade (ppm) 1690,3 1521,3 500 ppm Viscosidade dinâmica (cP) 6,795 4,665 3-6 cSt
a Amostra de biodiesel manufaturada em 2007
*Norma EN 14214- Norma Européia (KNOTHE et al., 2006)
O índice de acidez é uma importante alternativa no monitoramento da qualidade do
processo de refino do biodiesel, permitindo ainda monitorar a qualidade do combustível
armazenado. Dados da literatura indicam que o índice de acidez, bem como a viscosidade,
aumentam com o grau de oxidação do biodiesel.
Os resultados apresentados pela Tabela 4.18 indicam que o biodiesel produzido pela
via enzimática apresentou um índice de acidez superior ao valor máximo estabelecido pelas
especificações da ANP (0,5 mg KOH/g). Esse elevado valor pode ter sido originado da
parcela de triglicerídeos, que ao invés de ser transesterificado, foi hidrolisado formando
ácidos graxos livres, aumentando a acidez do produto final.
Com relação ao índice de iodo, estudos reportados na literatura indicam que presença
de luz, ar, de metais como o cobre e temperaturas de estocagem elevadas são fatores que
aceleram o processo de oxidação, bem como reações de polimerização. Contudo, a influência
82
da estrutura dos ácidos graxos especialmente o grau de insaturação tem se mostrado o efeito
mais influente com relação à estabilidade oxidativa e reações de polimerização (KNOTHE et
al., 2006). Neste contexto, o índice de iodo pode se enquadrar em uma importante ferramenta
para predição da estabilidade oxidativa, visto que este índice está ligado com o grau de
insaturação presente na amostra de biodiesel.
O índice de iodo não sofreu alteração significativa quando comparado ao sebo bovino,
resultado esperado visto que a transesterificação não altera o perfil de insaturação da matéria
prima para o biodiesel (KNOTHE et al., 2006). Este índice é interessante para o biodiesel de
sebo bovino, pois a norma alemã estabelece um teto de 115g I2/g excluindo, com isso, o
biodiesel derivado da soja. Neste contexto, o biodiesel derivado de sebo bovino se destaca
como um produto de exportação em potencial para o mercado de biocombustíveis europeu
(MACHADO, 2008).
O teor de água é um outro parâmetro importante, pois o biodiesel é uma substância
muito higroscópica, isto é, absorve água com grande facilidade. A presença de água é
prejudicial, pois causa a degradação hidrolítica do combustível. O grande desafio da indústria
de biodiesel é manter o produto estocado até sua comercialização dentro das especificações
exigidas pela ANP e, portanto, os testes de umidade por Karl Fisher são de grande utilidade.
Os resultados obtidos para teores de água indicam uma quantidade similar de água
entre o biodiesel comercial e o biodiesel obtido pela via enzimática. O teor de água
estabelecido pela ANP é de 500ppm, portanto, tanto o biodiesel experimental quanto o
biodiesel comercial estão fora de especificação. No caso do biodiesel experimental, como se
trata de um combustível semipurificado, com uma simples etapa de secagem é possível
adequar o produto à especificação exigida.
A viscosidade é um parâmetro importante para a introdução do biodiesel na matriz
energética renovável de forma sustentável, ou seja, o combustível deve ser utilizado nos
motores atuais sem ocasionar problemas como entupimento do sistema de injeção e formação
de borras dentro da câmara de combustão. Os resultados apurados indicam que o valor de
viscosidade do biodiesel obtido por via enzimática foi maior do que o biodiesel comercial.
Esse valor de viscosidade é devido à presença de mono, di e triglicerídeos no biodiesel, tendo
em vista que a conversão total não foi alcançada.
4.8.3 Análise termogravimétrica
A Figura 4.18 apresenta o gráfico de TG e DTG correspondente à amostra de biodiesel
obtido com a reação de comprovação do modelo estatístico. O produto transesterificado
83
apresentou dois estágios de degradação térmica. O primeiro estágio ocorreu na faixa de
temperatura de 119-270˚C, com perda de massa de 81%, referente a degradação dos ésteres
etílicos. O segundo estágio ocorreu na faixa de 270-422˚C, referente a mono, di e
triglicerídeos que não foram convertidos a ésteres, confirmando os dados apresentados na
Tabela 4.18. A utilização de TG, embora estabeleça uma relação com a estabilidade térmica,
tem sido usada também na análise quantitativa (CHAND et al., 2009).
100 200 300 400 500 6000
20
40
60
80
100
DT
G (dm
/dT)
TG
Per
da d
e M
assa
(%
)
Temperatura (oC)
0.0
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
DTG
Figura 4.18. Análise termogravimétrica da amostra de biodiesel obtido com na reação de comprovação do modelo estatístico (48˚C e razão molar 1:7 sebo/etanol) empregando a lipase PS como catalisador.
4.9- Análise da viabilidade técnica da produção de biodiesel derivado de sebo bovino
O sebo bovino constitui-se uma alternativa efetiva para a produção de biodiesel devido
à disponibilidade crescente desta matéria-prima, visto que o Brasil ocupa a primeira posição
mundial entre os países exportadores de carne bovina. Além disso, tendo em vista que a
matéria-prima representa mais de 80% dos custos de um processo de síntese de biodiesel, o
sebo bovino, por apresentar um baixo custo no mercado interno, ocupa uma posição de
destaque entre as fontes alternativas de matérias-prima para a produção desse biocombustível
(FILHO, 2007; KNOTHE et al., 2006).
84
A transesterificação enzimática do sebo bovino com etanol demonstrou grande
potencial para produção de biodiesel. Contudo, são necessários cuidados com relação a alguns
parâmetros críticos apresentados nessa reação química, como por exemplo, a elevada
viscosidade do sebo bovino devido ao alto teor de ácidos graxos saturados presentes nesta
matéria prima. Portanto, especial atenção deve ser dada ao comportamento dessa propriedade
durante da reação, correlacionando com o rendimento da transesterificação.
Por meio da coleção dos dados apresentados, a utilização de um planejamento
experimental, bem como a comprovação desse modelo, apresentaram dados coerentes. Porém,
a escolha do rendimento de transesterificação como única variável resposta não foi suficiente
para o entendimento do mecanismo que governa a reação de transesterificação.
Nesse contexto, recomenda-se adotar duas variáveis respostas na análise estatística de
planejamentos experimentais visando uma otimização desta especifica reação, tais como
viscosidade e rendimento de transesterificação delimitando a região para otimização para
valores de rendimentos superiores a 99% e viscosidade inferiores 5 cP.
85
5. CONCLUSÃO
O presente trabalho teve como objetivo a transesterificação do sebo bovino para sua
utilização como combustível alternativo ao diesel convencional, utilizando lipase imobilizada
como biocatalisador. Os resultados obtidos foram promissores, entre os quais podem ser
destacadas as seguintes metas alcançadas:
1. Dentre as cinco preparações de lipases testadas na reação de interesse deste projeto, as
lipases de Pseudomonas cepacia e Pseudomonas fluorescens, ambas imobilizadas em
POS-PVA ativado com epicloridrina, foram as que apresentaram velocidades de
reação mais elevadas, revelando rendimentos elevados, respectivamente, da ordem de
99,78% e 93,26% em 48h.
2. Os produtos obtidos da transesterificação pela atuação dessas lipases (PS e AK) foram
submetidos às análises de viscosidade, termogravimetria, espectroscopia de absorção
na região do infravermelho e RMN 1H. Com base nos resultados dessas análises, foi
possível inferir que o biodiesel obtido com a lipase PS apresentou um melhor conjunto
de propriedades quando comparado com o biodiesel obtido com a lipase AK.
3. Levando-se em conta a pureza do produto obtido, foi selecionada a preparação de
Lipase PS imobilizada em POS-PVA como derivado mais efetivo para mediar a reação
de síntese de biodiesel a partir do sebo bovino.
4. A aplicação de técnicas auxiliares de caracterização das propriedades do produto
transesterificado, em especial a termogravimetria que pode ser utilizada não somente
para determinara estabilidade térmica mas também para monitorar o progresso da
reação de transesterificação.
5. As características bioquímicas (pH e temperatura) e cinéticas (Km e Vmax) do sistema
imobilizado selecionado foram determinadas por meio de um estudo comparativo
entre lipase livre e imobilizada. Foram observadas modificações no pH ótimo da
enzima imobilizada para valor mais elevado de pH (8,9) numa uma ampla faixa da
temperatura (36 a 58°C) quando comparados com a enzima na sua forma livre (pH =
7,5 e temperatura = 50 °C). O estudo da influência da concentração de substrato na
velocidade de reação mostrou um bom ajuste do modelo de Michaelis-Menten aos
pontos experimentais, com estimativa dos seguintes valores para Vmax (56441U/g para
lipase livre e 3873 U/g para a lipase imobilizada) e Km (4018 mM para lipase livre e
1883 mM para a lipase imobilizada). Este derivado foi 17 vezes mais estável
termicamente que a lipase na forma livre.
86
6. Empregando o derivado imobilizado selecionado (PS imobilizada em POS-PVA) as
condições reacionais (temperatura e razão molar) da transesterificação enzimática do
sebo bovino foram otimizadas, sendo constatada uma influência negativa tanto da
temperatura quanto da razão molar para o rendimento da reação, o que do ponto de
vista econômico é um resultado atraente visto que temperatura baixa significa menor
energia empregada no processo e razão molar baixa significa menor excesso de
reagentes (etanol).
7. Adotando as condições preditas (razão molar 1:7 (sebo:etanol) a 48ºC) pelo
delineamento experimental, a comprovação do modelo estatístico foi realizada em
reator com aumento de escala de três vezes, obtendo-se um rendimento coerente com o
resultado predito, da ordem de 91,62% de conversão em 8 h de reação.
8. As propriedades do produto transesterificado e semi-purificado não atenderam às
normas estabelecidas pela ANP para uso como combustível, principalmente em
relação a viscosidade, sendo necessário um estudo de otimização desta reação em
função de vários parâmetros de controle, tais como viscosidade, rendimento de
transesterificação e estabilidade térmica (termogravimetria).
9. A comparação do biodiesel experimental, obtido pelo processo enzimático e do
biodiesel comercial foi feita e mostrou uma boa similaridade das propriedades
indicando que a síntese enzimática é um processo promissor, pois pode originar um
produto refinado submetido a menor número etapas de purificação.
87
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
• Utilizar o programa Design expert para definir as condições operacionais de
transterificação do sebo bovino impondo critérios a serem alcançados: a) rendimento de
transesterificação > 99%; b) viscosidade do produto transesterificado< 5 cP; c) perda
de massa por termogravimetria ≥95%.
• Estruturar um sistema de reatores que permitam aumentar a produtividade e
estabilidade operacional do biocatalisador;
• Avaliar custos do processo enzimático visando à implementação de um processo
contínuo de obtenção de biodiesel.
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