síntese e atividade microbiana de nanopartículas metálicas · fotolitografia, a decomposição...
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS – UNIFAL-MG
Campus avançado de Poços de Caldas
Gabriela Consolini
Síntese e atividade microbiana de
nanopartículas metálicas
Poços de Caldas / MG
Novembro de 2015
2
Gabriela Consolini
Síntese e atividade microbiana de
nanopartículas metálicas
Trabalho de conclusão de curso apresentado à
Universidade Federal de Alfenas como parte dos
requisitos para a obtenção do título de Engenheira
Química sob orientação da Profª. Drª. Tania Regina
Giraldi.
Poços de Caldas / MG
Novembro de 2015
FICHA CATALOGRÁFICA
C755s Consolini, Gabriela .
Síntese e atividade microbiana de nanopartículas metálicas. /Gabriela Consolini.
Orientação de Tania Regina Giraldi. Poços de Caldas: 2015.
21 fls.: il.; 30 cm.
Inclui bibliografias: fl. 20-21
Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Engenharia Química) –
Universidade Federal de Alfenas– Campus de Poços de Caldas, MG.
1. Nanopartículas. 2. Ácidos húmicos. 3. Nanotecnologia.. I . Giraldi, Tania Regina.(orient.).II. Universidade Federal de Alfenas – Unifal
III. Título.
CDD 620.5
3
RESUMO
A nanociência consiste no estudo das propriedades, utilização e fenômenos de materiais
que apresentam escala nanométrica, e possibilita o avanço de um campo que está crescendo e
ganhando importância devido a sua variedade de aplicações, a nanotecnologia. A produção de
nanopartículas (NPs) aumenta a cada dia e suas aplicações são inúmeras, porém seu impacto
no ambiente e consequentemente na saúde da população deve ser tratado com certo cuidado.
O objetivo deste trabalho foi estudar alguns métodos de síntese de NPs de prata e ouro, e
utilizá-las em interação com as substâncias húmicas. Além disso, avaliou-se o comportamento
de bactérias na presença destas NPs, a fim de simular seu descarte nomeio ambiente. Enfim,
com este projeto, comprovou-se a eficácia do método de síntese de NPs de prata e de ouro,
sendo ele de bottom up utilizando a redução química, estudou-se a interferência do ácido
húmico no processo de aglomeração dessas NPs, além de sua toxicidade em bactérias.
Palavras-chave: nanopartículas, prata, ouro, ácidos húmicos, toxicidade.
4
Sumário
1. Introdução ...................................................................................................................................... 5
2. Revisão bibliográfica ..................................................................................................................... 6
3. Justificativa .................................................................................................................................... 9
4. Objetivo ........................................................................................................................................ 10
5. Materiais e Métodos .................................................................................................................... 10
5.1. Síntese de nanopartículas ............................................................................................................ 10
5.1.1. Nanopartículas de prata funcionalizadas com citrato de sódio............................................. 11
5.1.2. Nanopartículas de prata funcionalizadas com ácido húmico ................................................ 11
5.1.3. Nanopartículas de ouro funcionalizadas com citrato de sódio .............................................. 11
5.1.4. Nanopartículas de ouro funcionalizadas com ácido húmico ................................................. 12
5.2. Caracterização de nanopartículas de prata e ouro ................................................................... 12
5.2.1. Espectrofotometria de UV-visível ............................................................................................ 12
5.2.2. Espalhamento dinâmico de luz (DLS) ..................................................................................... 12
5.3. Atividade antimicrobiana de nanopartículas de prata ............................................................. 12
6. Resultados e Discussão ................................................................................................................ 13
6.1. Formação e Estabilidade das nanopartículas metálicas ........................................................... 13
6.2. Interação entre as nanopartículas metálicas e ácido húmico com controle de pH e força iônica..................................................................................................................................................... 15
6.3. Influência das nanopartículas de prata no crescimento de bactérias ...................................... 18
7. Conclusão ..................................................................................................................................... 20
8. Referências bibliográficas ........................................................................................................... 20
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1. Introdução
O estudo de nanopartículas teve início há mais de cem anos, e ainda continua em
ascensão. Faraday, em 1857, desenvolveu alguns experimentos com nanopartículas de ouro e,
nos dias atuais, a tecnologia está evoluindo e levando as pesquisas para a escala nanométrica
(BLACKMAN, 2008). Outro importante precursor da nanotecnologia foi Richard Feynman,
ganhador do prêmio Nobel de Física em 1965, que propôs a manipulação de átomos
individuais para fornecer um novo material com propriedades novas, prevendo o potencial
tecnológico das nanoestruturas (ROZ; et. al., 2015).
A habilidade de manipular, criar e controlar materiais e objetos na escala nanométrica
com o objetivo de produzir novos materiais que contém determinadas propriedades é chamada
de nanotecnologia. Estudar esses procedimentos possibilita o alcance de um campo que está
crescendo e ganhando importância devido a sua variedade de aplicações (BLACKMAN,
2008).
Nanopartículas (NPs) podem ser encontradas na natureza. Alguns exemplos são os
óxidos de ferro, substâncias húmicas e também polissacarídeos e peptidoglicanos. Estas NPs
naturais podem ser encontradas como um resultado do intemperismo mineral e também a
atividade microbiana. Conhecer o impacto destas NPs no ambiente juntamente com suas
propriedades químicas, facilita a compreensão de seu comportamento em várias vertentes,
como, por exemplo, em efluentes, uma vez que elas estão em elevadas concentrações e podem
causar efeitos prejudiciais ao ciclo biológico do corpo d’água onde são descartadas. Uma
função das NPs naturais é fazer com que o transporte de contaminantes nas águas superficiais
seja mais fácil e evitar a contaminação de determinada região. Porém, caso ocorra a agregação
de partículas maiores, essas podem bloquear a ação das NPs, ocorrendo sedimentação das
mesmas. (JU-NAM; LEAD, 2008).
As NPs também podem ser sintetizadas em laboratório, o que possibilita obter
materiais com tamanhos e formas controlados, gerando modificações das propriedades físicas
e químicas do material em relação a sua escala micrométrica. Estas NPs têm muitas
aplicações, tais como em ciências biológicas, medicina, indústria farmacêutica, cosméticos e
eletrônicos e está sendo expandido cada vez mais para satisfazer os interesses das indústrias,
dos cientistas e do governo (JU-NAM; LEAD, 2008).
6
2. Revisão bibliográfica
Quando em escala nanométrica, os materiais têm propriedades e características
diferentes daquelas em tamanho usual. Isto ocorre devido ao número de átomos na superfície
que causa diferentes efeitos deste material quando submetido a determinadas condições (JU-
NAM; LEAD, 2008).
A nanotecnologia abrange várias áreas como a mecânica, a óptica, a medicina, a
eletrônica, entre outras, sendo considerada uma área multidisciplinar. Novas estruturas de NPs
vêm sendo estudadas e desenvolvidas para poder obter novas propriedades e aplicações desses
nanomateriais. As propriedades das NPs são diferentes das partículas em escala maior, pois
materiais brutos se comportam de acordo com a mecânica clássica, mas quando em nano
escala as partículas têm um comportamento individual e são regidas pela mecânica quântica.
Um exemplo é o de alguns materiais cerâmicos frágeis que, quando apresentam partículas
reduzidas a escala nanométrica, apresentam características como maleabilidade e maior
deformação (GARCIA, 2011).
Além de NPs cerâmicas, NPs metálicas vêm sendo alvo de estudos, como por
exemplo, de prata e ouro. Dentre uma variada gama de materiais, NPs de prata têm sido
bastante estudadas, por apresentarem uma ampla variedade de aplicações. Assim como todos
os materiais nanométricos, descargas de NPs de prata devem ser controladas e mantidas em
um limite para evitar danos aos seres vivos e ao meio ambiente. O perigo que apresenta essas
NPs é a capacidade delas em interferir na força motriz de prótons, na geração de ATP, na
permeabilidade da membrana e em muitas outras funções nas células (CUMBERLAND;
LEAD, 2009).
Um estudo feito por Agnihotri et al mostrou que ao introduzir NPs de prata em
soluções contendo bactérias do tipo E. coli e também B. subtilis houve um impacto no
crescimento desses microorganismos. O crescimento bacteriano diminuiu de acordo com o
aumento da concentração de NPs (AGNIHOTRI; et al., 2014).
Outro tipo de NPs sintéticas que vêm atraindo a atenção dos pesquisadores são as NPs
de ouro. Isto porque apresentam propriedades e aplicações em diversas áreas, entre elas,
catálise, óptica e eletrônicos. São também parte de compósitos, quando adicionados aos
polímeros e podem ser aplicadas em recipientes plásticos, roupas e sapatos (DIEGOLI; et. al.,
2008). Lin et. al mostraram como NPs de ouro podem ser utilizadas na detecção de doenças
infecciosas. A técnica utilizada foi de mudança de cor em que observou-se a olho nu a
7
presença de antígenos e ácidos nucleicos na amostra sem a necessidade de utilizar
equipamentos muito complexos (LIN; et al., 2013).
Estudos indicam que o tamanho e forma de NPs influenciam a sua toxicidade,
especialmente se houver agregação de partículas com o passar do tempo. A fim de
compreender seus efeitos e evitar a contaminação, há necessidade de estudar a estrutura e o
comportamento destas sob condições ambientalmente controladores de pH, força iônica e
verificar os seus efeitos sobre o crescimento de bactérias (FABREGA; et. al., 2009).
Há vários métodos de síntese de NPs, porém estes são divididos em métodos físicos e
métodos químicos. Nos métodos físicos, chamados top down (no português, de cima para
baixo), para se obter as NPs utilizam-se de processos físicos, como moagem, têmpera e a
fotolitografia, a decomposição térmica, a irradiação, a difusão, entre outras. Os métodos
químicos são denominados bottom up (no português, de baixo para cima) e envolvem espécies
moleculares em reações químicas para gerar o crescimento dos aglomerados síntese
eletroquímica ou uso de elementos biológicos para essa síntese (JU-NAM; LEAD, 2008),
(CARVALHO, 2013).
Figura 1 - Esquema dos métodos top down e bottom up de síntese de NPs.
Fonte: (SUNEEL, 2014)
8
Um método que vem sendo muito utilizado é o de redução química. Neste método,
ocorre a redução dos cátions metálicos para sua forma elementar, em escala nanométrica, na
presença de agentes redutores como, por exemplo, o boridreto de sódio. Outro agente
necessário neste tipo de reação é um agente estabilizante que pode ser o próprio agente
redutor, ou outro composto químico, por exemplo, ácidos húmicos, no qual sua proporção
molar em relação ao agente redutor é geralmente 2:1. Esta proporção permite a obtenção de
NPs mais estáveis impedindo sua aglomeração (CARVALHO, 2013).
Substâncias húmicas são compostos orgânicos presentes em sedimentos, turfas e solos que
possuem uma estrutura complexa e indefinida. Essas substâncias são encontradas em estágios
de degradação animal e vegetal através de ações químicas ou biológicas e não possuem uma
composição química definida. A classificação dessas substâncias ocorre de acordo com suas
características que podem ser ácidas, hidrofílicas, amorfas e possuírem alto peso molecular.
Uma classificação são os ácidos húmicos que são insolúveis em pH baixo. Algumas
propriedades das substâncias húmicas são a redução e complexação dos íons metálicos,
solubilização, hidrólise, adsorção e transporte. Isso ocorre devido ao caráter coloidal e à
natureza anfifílica dessas substâncias (PETRONI, 2013).
Gunsolus et al. conduziram um estudo em que demonstraram que a estabilidade das
NPs de prata promovida pelas substâncias húmicas depende do tipo de substância e do agente
de revestimento das NPs. Nesse estudo, NPs de prata foram colocadas em contato com ácidos
húmicos e fúlvicos e concluiu-se que a taxa de agregação das NPs depende da composição
química dessas substâncias (GUNSOLUS; et al., 2015).
Segundo Sharma et al., em seus estudos de interação de NPs de prata com ácidos
húmico e fúlvico pôde-se observar mudanças nas cargas e na estabilização dessas NPs. A
liberação de prótons nas NPs de prata revestidas com citrato de sódo diminui quando foram
adicionadas as soluções contendo os ácidos (SHARMA; et al., 2014).
NPs podem ser caracterizadas por meio de inúmeros métodos, entre eles, difração de
raios x, microscopias, entre outros. No presente trabalho, utilizou-se a espectroscopia de
absorção na região do UV-Visível e espalhamento dinâmico de luz (DLS).
A técnica de espectroscopia de absorção de UV/Vis foi utilizada com o intuito de
comprovar a presença das NPs de prata e ouro nas soluções. Essa técnica consiste em
quantificar a luz absorvida e que é posteriormente dispersa pela amostra. A cubeta com a
amostra é posicionada entre a fonte de luz e o detector, a intensidade da luz é medida antes e
9
após passar pela amostra e a soma da luz absorvida e dispersa gera o espectro (CARVALHO,
2013). Já o método DLS também denominado de espalhamento dinâmico de luz, foi utilizado
para medir a agregação das NPs. Este método consiste na incidência de um laser na amostra
contendo NPs e de acordo com a intensidade em que o laser é dispersado pelas partículas que
estão em movimento na solução, permitindo relacioná-la matematicamente com o raio da
partícula (CARVALHO, 2013).
Desta forma, aplicando-se a metodologia adequada é possível sintetizar e caracterizar as
NPs e estudar seu comportamento em relação a aglomeração na presença de substâncias
orgânicas e com controle de força iônica através de soluções de sal, assim como sua
toxicidade quando em contato com microorganismos.
3. Justificativa
Na engenharia química, a nanotecnologia pode ser aplicada em várias áreas, como por
exemplo, no processo de produção de novos catalisadores nanoestruturados, membranas de
separação em nanoescala, entre outros. Além disso, o presente estudo pode contribuir para
inovações que levam ao surgimento de fabricações em escala manométrica em diversas áreas
como química física, química computacional, engenharia de sistemas moleculares, mecânica
molecular, e muitas outras.
A área da nanotecnologia cresce a cada dia, porém seu impacto no ambiente e
consequentemente na saúde da população deve ser tratado com certo cuidado. A
contaminação ambiental ocorre devido às características peculiares desses nanomateriais, tais
como seu tamanho, sua capacidade de aglomeração e de dispersão, o que ocasiona danos, de
maneira acumulativa, à cadeia alimentar (PASCHOALINO; et al., 2010).Os estudos sobre a
toxicidade, a degradabilidade e também a disponibilidade das NPs já é uma necessidade. No
Brasil, foi criado em 2002 o Programa Nacional de Nanotecnologia com o intuito de
desenvolver o conhecimento em relação a produtos e processos que envolvam a
nanotecnologia (BRASIL, 2008).
NPs de prata e ouro têm chamado a atenção devido aos perigos que apresentam
quando descartadas em grande quantidade no meio ambiente. O conhecimento de seu
comportamento e suas propriedades como tamanho, condições de aglomeração e dispersão
pode ajudar empresas e laboratórios a tomarem um cuidado especial ao descartar essas
10
substâncias. Outra vantagem é o desenvolvimento de novas utilidades e aplicações dessas
partículas.
Desta forma, o presente trabalho se justifica por avaliar os impactos de NPs de prata e
ouro em bactérias para prever o efeito de seu descarte no meio ambiente e poder incentivar a
busca por soluções de tratamento para esses efluentes.
4. Objetivo
O objetivo deste trabalho foi estudar métodos de síntese de NPs metálicas e observar sua
formação e através do estudo da sua interação com as substâncias húmicas, promover
resultados sobre sua relação com a agregação das NPs. Além disso, analisar o comportamento
de bactérias na presença de NPs metálicas, a fim de simular o descarte destas para o ambiente.
5. Materiais e Métodos
Este tópico foi dividido em várias etapas, e está apresentado no fluxograma representado pela Figura 2. Abaixo cada procedimento será descrito com maiores detalhes.
Figura 2 - Fluxograma das etapas do projeto.
5.1. Síntese de nanopartículas
As NPs de prata e ouro foram sintetizadas pelo método bottom up que envolve a
redução dos sais metálicos correspondentes, utilizando diferentes agentes redutores, tais como
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citrato de sódio e borohidreto de sódio. O citrato de sódio e ácido húmico foram utilizados
para estabilizar as NPs em suspensão. Abaixo serão detalhadas as metodologias das referidas
sínteses.
5.1.1. Nanopartículas de prata revestidas com citrato de sódio
A preparação das NPs de prata foi feita utilizando citrato de sódio como agente
estabilizante e borohidreto de sódio para a redução dos sais metálicos em solução aquosa.
Foram preparadas soluções de 50 mL de citrato de sódio 0,31M, 50 mL de nitrato de prata
0,25 M e borohidreto de sódio 0,25 M. As soluções de citrato de sódio e nitrato de prata
foram adicionadas em um erlenmeyer e agitadas por 30 min. Depois, 5mL da solução de
borohidreto de sódio foi adicionado lentamente e a agitação foi mantida por mais 10 minutos.
A solução foi aquecida até levantar fervura, permaneceu aquecida por mais 90 minutos e foi
resfriada em temperatura ambiente. A concentração final de prata foi de aproximadamente 26
mg/L (CUMBERLAND; et. al., 2009).
5.1.2. Nanopartículas de prata revestidas com ácido húmico
Na presença de ácido húmico, as NPs de prata foram preparadas usando boridreto de
sódio como agente redutor dos sais de prata. Uma solução de 10 mL de ácido húmico 0,001%
foi preparada e misturada em um erlenmeyer com 10 mL de solução de nitrato de prata 1 M.
Essa solução foi agitada por 5 minutos e, então, foram adicionados rapidamente 10 ml de
solução de borohidreto de sódio 10 M mantendo a agitação até que a cor mudasse de amarelo
para marrom claro (DUBAS; et. al., 2008).
5.1.3. Nanopartículas de ouro revestidas com citrato de sódio
Para a síntese de NPs de ouro, o citrato de sódio foi utilizado tanto como agente
redutor quanto como agente estabilizante. Em um erlenmeyer uma solução de 100 ml de
𝐻𝐴𝑢𝐶𝑙4 (0,25 M) foi aquecida até ferver e o aquecimento foi mantido por mais 5 minutos.
Foram adicionados 3mL de uma solução de citrato de sódio (38,8 M) preparada no mesmo
momento à solução de sais de ouro, mantendo o aquecimento por mais 10 minutos até que a
solução apresentasse coloração vermelha. A solução final foi resfriada a temperatura ambiente
(DIEGOLI; et. al., 2008).
12
5.1.4. Nanopartículas de ouro revestidas com ácido húmico
Uma solução de NPs de ouro revestidas com ácido húmico foi preparada utilizando
boridreto de sódio como agente redutor. Uma solução de 10 mL de ácido húmico 0,001% foi
preparada e adicionada a um erlenmeyer com 10 mL de solução de 𝐻𝐴𝑢𝐶𝑙4 (1 M). Após 5
minutos de agitação, 10 mL de borohidreto de sódio (10 M) foram adicionados rapidamente e
a solução foi mantida em agitação até ocorrer mudança de cor de amarelo para azul escuro
(DUBAS; et. al., 2008).
5.2. Caracterização de nanopartículas de prata e ouro
5.2.1. Espectrofotometria de UV-visível
Para a análise das suspensões coloidais de NPs, foi utilizado um espectrofotômetro de
absorção de UV-visível U-2900 da HITACHI. As amostras foram analisadas logo após a sua
preparação (t = 0) e a cada 2 horas durante os primeiros dois dias. Após este período, uma
análise foi realizada a cada 24 horas, a fim de investigar a estabilidade das suspensões
coloidais. O intuito desta análise foi estudar a interação das NPs de prata e de ouro com ácido
húmico adicionado às soluções, sob condições controladas de pH e de força iônica, em que
utilizou-se uma solução de 𝐶𝑎(𝑁𝑂3)2.
5.2.2. Espalhamento dinâmico de luz (DLS)
O equipamento de DLS modelo Zetasizer Nano S da marca Malvern foi utilizado para
medir o tamanho das partículas em amostras das suspensões de NPs. O cálculo do tamanho
das partículas foi feito a partir da média de cada amostra medida incluindo todos os desvios-
padrão. Todas as medições foram realizadas no tempo zero, e para as soluções misturadas
com ácido húmico sob pH e força iônica controlados, as análises foram realizadas no tempo
zero, depois de 24 horas e 48 horas.
5.3. Atividade antimicrobiana de nanopartículas de prata
O crescimento bacteriano: A bactéria gram-positiva Bacillus subtilis foi escolhida
como o organismo de teste. A cultura foi mantida em meio Luria-Bertani de placas de ágar, e
as colônias individuais foram transferidas e incubadas durante a noite a 30°C imersas em
caldo nutriente.
13
As curvas de crescimento: Todos os testes foram realizados em triplicata. As soluções
de controle foram realizadas sem a presença de NPs. As curvas de crescimento da bactéria,
expostas e não expostas a NPs de prata foram determinadas com base no valor de absorção
ótica durante 12 horas, utilizando um espectrofotômetro de microplacas Multiskan GO da
Thermo Scientific.
6. Resultados e Discussão
6.1. Formação e Estabilidade das nanopartículas metálicas
Para a avaliação da formação das NPs de prata revestidas com citrato de sódio, as
mesmas foram submetidas a análises de espectroscopia UV-Vis U-2900 da HITACHI.
Observou-se um pico de absorbância no valor de 390 nm, como mostra a Figura 3
(BANKURA; et al, 2012). Este resultado indica que as NPs sintetizadas são de prata, pois
essa solução apresenta uma ressonância de plasmon de superfície que é responsável pela
coloração amarelada da solução. Outra característica relevante é de não haver agregação das
NPs, pois pode-se observar apenas uma banda no gráfico, o que sugere a presença de
partículas que absorvem o mesmo comprimento de onda.
Figura 3 - Espectro UV-Vis das NPs de prata.
O mesmo experimento foi realizado com as NPs de ouro revestidas com citrato de
sódio, Figura 4. O comprimento de onda na máxima absorbância foi de 518 nm, o que
comprova a presença de NPs de ouro na suspensão, pois, assim como as NPs de prata, essa
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
300 350 400 450 500 550
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)
NPs de prata revestidas com citrato de sódio
14
solução também apresenta uma ressonância de plasmon de superfície que é responsável por
sua coloração avermelhada (DANKESREITER, 2011).
Figura 4 - Espectro UV-Vis das NPs de ouro.
Para determinar o tamanho das partículas, foram realizadas medidas de DLS. Com
auxílio do software Minitab, construiu-se o histograma com os resultados de tamanhos
apresentando valores de 5,61±1,39 nm para as NPs de prata (FIGURA 5) e 27,73±10,57nm
para as NPs de ouro. O valor alto de desvio padrão das NPs de ouro sugere que essa
suspensão apresenta uma heterogeneidade no tamanho das partículas.
Figura 5 - Distribuição do tamanho das NPs de prata no DLS.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
450 500 550 600 650 700
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)
NPs de ouro revestidas com citrato de sódio
8.47.26.04.83.62.4
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Média 5.607DesvPad 1.387N 42
Tamanho (nm)
Freq
uênc
ia
Histograma de NPs de prata
15
Figura 6 - Distribuição do tamanho das NPs de ouro no DLS.
6.2. Interação entre as nanopartículas metálicas e ácido húmico com
controle de pH e força iônica
Medidas de absorbâncias suspensões de prata e ouro foram realizadas com o auxílio de
um espectofotômetro de UV-visível, onde mostra a comparação entre a solução com apenas
NPs e a solução com ácido húmico, Figura 7.
O pH medido da solução de NPs de prata foi de 6,91 e quando a força iônica foi
controlada, adicionando uma solução de 𝐶𝑎(𝑁𝑂3)2, pôde-se observar uma agregação das
NPs. Ainda que haja o pico de absorbância próximo ao valor de 400 nm, há uma diminuição
na sua absorbância e também o surgimento de um ombro na banda, comprovando a agregação
de algumas partículas.
70605040302010
30
25
20
15
10
5
0
Média 27.73DesvPad 10.57N 101
Tamanho (nm)
Freq
uênc
ia
Histograma de NPs de ouro
16
Figura 7 - Comparação dos espectros UV-Vis das NPs de prata revestidas com citrato de sódio e NPs de prata com ácido humico e controle de pH e força iônica.
No caso das suspensões de ouro, o pH da suspensão apresentou valor de 6,62 e,
diferentemente das NPs de prata, houve maior estabilidade das suspensões com um mínimo
de agregação observado pela diminuição do pico de absorbância, Figura 8.
Figura 8 - Comparação dos espectros UV-Vis das NPs de ouro revestidas com citrato de sódio e NPs de ouro com ácido humico e controle de pH e força iônica.
Análises de DSL foram utilizadas para medir o tamanho das NPs de prata e ouro. Para
esse teste foram selecionadas diferentes suspensões e condições a fim de comparar a
influência da adição de um estabilizante na solução e controle de força iônica por adição de
solução de sal. A Tabela 1 apresenta os resultados obtidos a partir das análises de DLS.
00.10.20.30.40.50.60.70.8
300 350 400 450 500 550
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)
AgNPs coated Sodium Citrate AgNPs + Humic Acid + Ionic Strength
00.10.20.30.40.50.6
400 450 500 550 600 650 700
Asor
bânc
ia
Comprimento de onda (nm)
AuNPs coated with Sodium Citrate
AuNPs + Humic Acid + Ionic Strength
NPs de prata revestidas comcitrato de sódio
NPs de prata com controle de força iônica
NPs de ouro revestidas com citrato de sódio
NPs de ourocom controle de força iônica
17
Tabela 1 - Tamanho médio das NPs em diferentes condições medidas no DLS.
Tamanho Médio (nm)
Desviopadrão (nm)
NPs prata revestidas com citrato de sódio
5.61 1.39
NPs prata com ácido húmico 16.69 5.41 NPs ouro revestidas com citrato de sódio
27.73 10.57
NPs ouro com ácido húmico 19.19 6.34 NPs prata com controle de força iônica
1370.41 721.34
NPs ouro com controle de força iônica
1366.41 468.16
NPs prata com ácido húmico e controle de força iônica
42.89 23.36
NPs prata com ácido húmico e controle de força iônica (2º dia)
43.44 22.99
NPs prata com ácido húmico e controle de força iônica (3º dia)
55.60 40.69
NPs ouro com ácido húmico e controle de força iônica
30.23 15.67
NPs ouro com ácido húmico e controle de força iônica (2º dia)
35.82 14.22
NPs ouro com ácido húmico e controle de força iônica (3º dia)
36.04 14.70
Ao adicionar-se ácido húmico nas suspensões, o mesmo age como um estabilizador
mantendo as NPs de prata em um tamanho de 16,69±5,41 nm e as NPs de ouro em um
tamanho de 19,19±6,34 nm, diferindo dos valores obtidos anteriormente apenas com o
revestimento de citrato de sódio.
Os valores obtidos foram aceitáveis exceto os das suspensões, tanto de prata quanto de
ouro, em que havia apenas o controle da força iônica e nenhum estabilizador, pois nessas
soluções houve aglomeração das NPs que chegaram a um tamanho muito maior que o padrão.
O controle da força iônica leva à aglomeração das partículas, mas, com a presença de ácido
húmico na suspensão, essa aglomeração é controlada evitando a precipitação das partículas.
As medidas foram tomadas em 3 dias consecutivos e os resultados mostram que houve um
leve aglomeração durante esse período porém ela foi controlada. Uma característica que não
pode ser controlada foi a homogeneidade do tamanho das NPs que foi identificada pelo alto
valor de desvio padrão das amostras.
18
6.3. Influência das nanopartículas de prata no crescimento de
bactérias
A fim de simular o descarte de NPs ao meio ambiente e prever sua toxicidade, foram
conduzidos estudos interagindo as NPs de prata com bactérias. A bactéria utilizada para o
teste de toxicidade das NPs de prata foi a B. subutilis pois trata-se de uma bactéria gram-
positiva. A Figura 9 apresenta o efeito bactericida de diferentes concentrações de NPs de prata
revestidas com citrato de sódio quando em contato com as bactérias.
Figura 9 - Curva de crescimento da bactéria B. subtilis exposta a diferentes
concentrações de NPs de prata revestidas com citrato de sódio.
A concentração mínima inibitória (em inglês, minimum inhibitory concentration ou
MIC) foi definida como a menor concentração que causa uma diminuição de 80% na
absorbância quando comparada com a solução controle. No estudo das curvas de crescimento,
a absorbância obtida na solução controle mostrou que as bactérias atingiram a fase
estacionária de crescimento após 8 horas.
A Figura 9 também apresenta dois ciclos de crescimento, indicando um crescimento
bifásico. As curvas de crescimento mostraram dois ciclos em formato de s. O primeiro ciclo
de crescimento foi identificado entre 4 e 8 horas e o segundo ciclo foi identificado entre 8 e
10 horas não apresentando uma fase intermediária. Crescimento bifásico ocorre quando um
microorganismo apresenta duas fases de crescimento devido ao uso de dois substratos
Tempo (horas)
Dens
idad
e óp
tica
Controle
NPs prata (1ppm)
NPs prata (5ppm)
NPs prata (10 ppm)
19
diferentes para seu crescimento (DE JAGER, 2009). Após redução do primeiro substrato, o
microrganismo começa a utilizar o segundo substrato (MEUNIER, 1999).
As concentrações de NPs de prata utilizadas nesse estudo foram similares às
concentrações esperadas na natureza, baseado no artigo publicado por Luoma, S. N
(LUOMA, 2015). A concentração máxima de NPs utilizada foi baseada na concentração
mínima inibitória (2,5 ppm) e na concentração mínima bactericida (10 ppm) observadas para
a B. subitilis de acordo com Mirzajani et al. Mais de 80% de inibição foi observada no MIC
nas amostras contendo 5 e 10 ppm de NPs de prata, Figura 9.
Após determinar os valores de MIC, uma segunda curva de crescimento foi elaborada
usando as soluções de NPs com diferentes revestimentos (citrato e ácido húmico) e também as
soluções com diferentes concentrações de Ag+ (1 e 5 ppm), o resultado se está apresentado na
Figura 10. Obteve-se quase uma completa inibição, mais de 80%, nas amostras de NPs
revestidas com citrato e com ácido húmico e concentração de 5ppm de Ag+.
Figura 10 - Curvas de crescimento da bactériaB. subtilisexposta a mesmas concentrações de NPs de prata revestidas com citrate de sódio, NPs com ácido húmico, Nps revestidas com
ácido húmico e diferentes concentrações de Ag+ livres (1 e 5 ppm).
Os mecanismos que explicam a inibição bacteriana devido a presença de NPs de prata
ainda não é muito clara. Um suposto mecanismo para a atividade bactericida das NPs sugere
que os íons de prata se acumulam na membrana da bactéria causando um aumento
significativo na sua permeabilidade e resultando em sua morte.
Tempo (horas)
Dens
idad
e óp
tica
Controle
NPs prata (5ppm)
NPs prata + força iônica (5ppm)
NPs prata + ácido húmico(5 ppm)
Ag+ (1ppm)
Ag+ (5ppm)
20
7. Conclusão
As sínteses e caracterizações das NPs de prata e de ouro foram executadas de forma
apropriada. A adição de ácido húmico em soluções que apresentavam pH similar ao
encontrado na natureza fez com que as NPs se estabilizassem e evitassem a perda de material
por aglomeração.
O efeito bactericida das NPs de prata pode ser observado apenas em concentrações
acima de 5 e 10 ppm. Abaixo desses valores, as NPs apenas diminuíram o crescimento das
bactérias. As soluções com Ag+ também mostraram um inibição no crescimento das bactérias
em concentrações acima de 5ppm. Portanto, para o descarte de NPs de prata na natureza, a
concentração da solução deve estar abaixo de 5ppm para não interferir no crescimento de
microorganismos presentes no meio ambiente.
8. Referências bibliográficas
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