síntese, caracterização e avaliação da toxicidade de novas ... · antioxidante (selvaraj,...

Departamento de Química

Síntese, caracterização e avaliação da toxicidade de novas hidrazonas antioxidantes: potenciais MPACs para o tratamento da Doença de

Alzheimer

Aluno: Sergio Luiz Pinto Castiñeiras Filho

Orientador: Nicolás Adrian Rey

Co-Orientadora: Rachel Ann Hauser-Davis

1. Introdução

Com o aumento da expectativa de vida observado nas últimas décadas, vem ocorrendo um incremento da incidência de doenças neurodegenerativas, tais como a Doença de Alzheimer (DA) e a doença de Parkinson. Indivíduos acometidos pela DA sofrem de diversos

sintomas neuropatológicos em nível molecular, como, por exemplo, estresse oxidativo generalizado, má formação e distribuição alterada das mitocôndrias, falhas na homeostase de

biometais, a presença de placas senis, emaranhados neurofibrilares, degeneração neurovascular e perdas neuronais (Mancino, Hindo et al., 2009; Chen, Chen et al., 2011). As placas senis, consideradas atualmente como o único diferencial para o diagnostico post

mortem desta doença, caracterizam-se predominantemente pela presença de depósitos do peptídeo Aß. Altas quantidades de íons metálicos fisiológicos, como Zn2+ e Cu2+, também têm sido observadas nestas placas, o que indica uma possível interação do peptídeo Aß com estes

biometais, podendo considerar-se este evento como um fator chave na DA. O elemento ferro também tem sido implicado na agregação dos emaranhados neurofibrilares, além de

contribuir, assim como o cobre, para os processos oxidativos que ocorrem nas células nervosas, como, por exemplo, a reação de Fenton geradora do radical hidroxila, que é altamente reativo e prejudicial ao organismo (Scott e Orvig, 2009; Budimir, 2011; Chen,

Chen et al., 2011). MPACs (do inglês, metal-protein attenuating compounds) representam uma classe

emergente de agentes terapêuticos para o tratamento de desordens neurodegenerativas, levando à restauração da homeostase de metais fisiológicos e à redução de estresse oxidativo, portanto revertendo ou reduzindo a progressão da doença. O mecanismo de ação dos MPACs,

no caso de sua aplicação em sistemas biológicos afetados pela DA, se deve pela competição destes compostos com o peptídeo Aß pela ligação com os íons metálicos citados

anteriormente, prevenindo a oligomerização do peptídeo sem desregular a homeostase metálica natural do organismo, e também prevenindo a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS, ou radicais livres) (Scott e Orvig, 2009; Gaeta, Molina-Holgado et al., 2011).

A atividade protetiva que a quercetina (Figura 1) - um flavonóide com alta capacidade antioxidante (Selvaraj, Chowdhury et al., 2013) - exerce sobre células neuronais contra os

efeitos deletérios do peptídeo Aß está bem documentado na literatura (Ansari et al., 2009). Por exemplo, moléculas híbridas da quercetina e seus complexos de coordenação já foram sintetizados e testados in vitro para avaliar seus efeitos no tratamento de câncer, visto que

esses compostos tendem a ter propriedades antioxidantes, antitumorais e antimicrobiológicas (Subrahmanyam e Prakash, 2012).


Figura 1 – Estrutura molecular da quercetina.

O grupo de pesquisa do LABSO-Bio tem obtido sucesso com a utilização de

hidrazonas derivadas do agente anti-tuberculose isoniazida como potenciais MPACs (Nogueira, 2011 ; De Freitas, Da Silva et al., 2013). Através de reações de formação de iminas pela condensação do grupo amina da isoniazida com o grupo carbonila de outra

molécula precursora, pode-se sintetizar compostos híbridos geometricamente favoráveis para a formação de complexos, devido aos átomos doadores originais da isoniazida e até do outro

precursor, criando-se assim um ligante com boa capacidade de complexação, detentor das características químicas inerentes de seu precursor.

Por estes motivos, o presente projeto de pesquisa visa aliar as propriedades

antioxidantes do polifenol quercetina às propriedades complexantes da isoniazida, a fim de produzir uma nova hidrazona híbrida com potencial para atuar como fármaco para o

tratamento da DA. Assim, o objetivo deste trabalho é sintetizar e caracterizar este potencial MPAC com atividade antioxidante, e realizar ensaios de toxicidade aguda em cobaias, a fim de realizar um estudo farmacológico inicial do composto através da averiguação de alterações

na homeostase metálica e de bioindicadores de estresse oxidativo.

2. Metodologia

2.1. Síntese e caracterização do CBNSQ

Em um béquer, foi pesado 0,3243 g (1 mmol) de quercetina (MM = 302,25 g mol-1), que foi dissolvida completamente em 25 mL de metanol, formando uma solução amarela, que em seguida foi transferida para um balão de reação de 100 mL. Em um béquer, foi pesado

0,1370 g (1 mmol) de isoniazida (MM = 137,14 g mol-1), que foi dissolvida completamente em 15 mL de metanol.

O balão de reação contendo a solução de quercetina foi submetido a aquecimento em banho de glicerina e colocado sob agitação através de uma chapa de aquecimento, e 2 mL de ácido acético glacial foram adicionados lentamente a esta solução, seguida da adição gradual

da solução de isoniazida. O balão de reação foi colocado então em refluxo em temperatura em torno de 60-70

ºC. A solução foi mantida nestas condições por 2 h após o início do refluxo. Transcorrido este tempo, o balão foi removido do sistema de refluxo e mantido em temperatura ambiente até o resfriamento.

O precipitado amarelo-pálido obtido, denominado CBNSQ, foi separado por filtração à vácuo, utilizando um funil de Buchner e papel filtro, no qual foi despejada a suspensão,

sendo o particulado retido no papel filtro e a solução-mãe coletada no quitassato. O precipitado do filtro foi mantido em temperatura ambiente para secagem sobre um vidro de relógio por 24 h e então mantido em estufa a 70 ºC por mais 24 h. A solução-mãe foi

armazenada em um béquer, no qual se observou formação de novo precipitado amarelo-pálido após 10 dias, sendo coletado da mesma maneira. O rendimento médio das diversas sínteses

realizadas foi calculado.


A caracterização do composto CBNSQ foi realizada através de espectroscopia vibracional, em um espectrofotômetro de absorção na região do infravermelho médio, modelo 100 FT-IR, da Perkin-Elmer, sendo os dados coletados a intervalos de 0,5 cm-1 com resolução

de 4 cm-1, velocidade de varredura de 0,2 cm s-1 e número de varreduras igual a 120, na região de 4000-450 cm-1, sendo a amostragem feita em pastilhas de brometo de potássio seco. A

mesma análise foi realizada para os reagentes quercetina e isoniazida, cujas bandas foram atribuídas conforme observado na literatura (Heneczkowski, Kopacz et al., 2001; Chourasiya, Upadhayay et al., 2012; González-Baró, Pis-Diez et al., 2012). As atribuições do CBNSQ

foram feitas por comparações com os espectros de seus precursores e com o auxílio da literatura de referência (Silverstein, Webster et al., 2015).

Determinações dos teores dos elementos carbono, hidrogênio e nitrogênio do CBNSQ foram realizadas de forma simultânea a partir da curva de calibração obtida com padrões em um analisador elementar (CHN), modelo EA112, da Thermo Electron, sendo pesado em

balança analítica entre 2 e 3 mg de amostra, em duplicata, as quais foram acondicionadas em uma cápsula de estanho.

A análise termogravimétrica do CBNSQ foi realizada em analisador Perkin Elmer, modelo Pyris 1 TGA, em atmosfera de nitrogênio, na faixa de temperatura de 20 a 900 ºC, a taxa de aquecimento de 10 ºC min-1.

O ensaio de ponto de fusão foi realizado utilizando um ponto de fusão a seco, modelo Q340S, da SP Labor.

O espectro de RMN de 1H e COSY foram obtidos em um RMN Bruker Avance II 400 MHz, utilizando clorofórmio deuterado como solvente.

2.2. Teste de toxicidade aguda e quantificação de metais, glutationa reduzida (GSH) e

metalotioneínas (MT)

2.2.1. Teste de estabilidade em solução 20 % (v/v) DMSO/água

Foi pesado 0,0043 g de CBNSQ em um béquer, dissolvido em seguida com

aproximadamente 5 mL de DMSO e avolumada a 10 mL em balão volumétrico. Uma alíquota de 1 mL foi retirada dessa solução, e colocada em outro balão volumétrico de 10 mL. Foram adicionados a esse balão mais 1 mL de DMSO, e a solução foi avolumada para 10 mL com

água ultrapura. Desta solução foram aliquotados 2 mL para outro balão volumétrico de 10 mL e avolumados com uma solução aquosa 20 % v/v DMSO, resultando em uma solução 2,0 x

10-5 mol L-1 de CBNSQ. Esta solução foi analisada em um espectrofotômetro UV-VIS (Lambda 35, Perkin

Elmer, EUA), através de uma varredura de 200 a 800 nm nos instantes 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12,

24, 26, 28, 30 e 48 h. A banda em 369 nm foi selecionada para calcular a degradação percentual do composto.

2.2.2. Ensaios biológicos

Todos os experimentos envolvendo o uso de cobaias foram aprovados por uma Comissão de Ética da PUC-Rio e universidades colaboradoras (protocolo no CEUA/036/2013), e estão de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal

adotados pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório/Colégio Brasileiro de Experimentação Animal em conformação com o Guia da Sociedade Norte Americana de

Neurociências e Comportamento para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Ibanez, Simo et al., 2012).

Foram pesados 16 ratos Wistar machos, dos quais 4 foram classificados como grupo

controle, que não passaram por nenhum tratamento; outros 4 como grupo veículo, nos quais se injetou apenas uma solução salina 10% DMSO; e os demais 8 como grupo de injetados,


nos quais se injetou a solução salina 10% DMSO com CBNSQ na concentração 200 mg de CBNSQ por quilograma de massa corpórea.

Após 72 h, não foram verificadas mudanças comportamentais nas cobaias injetadas

tanto com o veículo quanto com o composto. Os animais foram então sacrificados, e os rins, fígado, cérebro e coração de todos os indivíduos foram removidos, pesados separadamente, e

armazenados em tubos de polipropileno estéreis e congelados em freezer -20 ºC.

2.2.3. Determinação de glutationa reduzida (GSH) nos órgãos

2.2.3.1. Extração de GSH das amostras

Amostras úmidas de cérebro, fígado, coração e rins de cada rato foram pesadas em

triplicata e homegeneizadas em pH 7,0 em solução tampão de fostato de sódio 0,1 mol L-1 e sacarose 0,25 mol L-1, sob fluxo de gás nitrogênio. As amostras foram centrifugadas a 13500

rpm por 30 minutos a temperatura de 4 ºC, os sobrenadantes foram separados em microtubos de 2 mL estéreis, colocados novamente sob fluxo de nitrogênio e congelados a -20 ºC até a posterior análise.

2.2.3.2. Quantificação de GSH nas amostras

As concentrações de GSH foram determinadas por espectroscopia de absorção molecular UV-Vis, utilizando GSH (Sigma-Aldrich, Alemanha) como padrão externo. Para as

curvas analíticas foram confeccionados no mínimo 5 pontos. As amostras foram quantificadas de acordo com a literatura: ácido 5,5’ – ditio-bis-(2–nitrobenzóico) (DTNB) 0,25 mmol L-1 e tampão fosfato de sódio 0,1 mol L-1 de pH 8,0 foram acrescentados às amostras recém-

descongeladas e aos pontos da curva na proporção de 1:1. As amostras e pontos da curva foram incubados ao abrigo de luz por 15 min, e em seguidas suas absorvâncias foram medidas

em 412 nm em um espectrofotômetro Lambda 35, Perkin Elmer, EUA. Os dados entre grupos foram comparados estatisticamente pelo teste ANOVA para averiguação de diferenças significativas.

2.2.4. Determinação de metalotineínas (MT)

2.2.4.1. Extração de MT das amostras de cérebro

A extração de MT foi baseada na extração térmica proposta por Erk e colaboradores

(Erk, Ivanković et al., 2002). Amostras liofilizadas (Liotop 101, Liobrás, SP) de cérebro de cada rato foram pesadas em triplicata e homogeneizadas em tampão de Tris-HCl 20 mmol L-1

de pH 8,6, Fenil-metil-sulfonil-fluoreto (PMFS) 0,5 mmol L-1 (agente antiproteolitico) e β-mercaptoetanol 0,01 % (v/v) (agente redutor), e em seguida centrifugadas a 13300 rpm por 60 min a 4 ºC. Os sobrenadantes contendo as MT foram separados em microtubos de 2 mL

estéreis e submetidos à aquecimento a 70 oC durante dez minutos. As alíquotas foram novamente centrifugadas a 13300 rpm por 30 min a 4 ºC, os novos sobrenadantes foram

separados e transferidos para colunas de separação Vivaspin® (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Alemanha), e centrifugadas a 11500 rpm por 30 min a 4 ºC. Os sobrenadantes finais na parte de cima da coluna tiveram seus volumes medidos com microseringa de vidro, e

foram então transferidos para outros microtubos de 2 mL estéreis e congelados a -20º até a posterior análise (Belda-Palazón, Nohales et al., 2014).

2.2.4.2. Quantificação de MT nas amostras de cérebro

A quantificação de MT foi realizada por espectrometria de absorção molecular UV-Vis, recorrendo-se da reação de Ellman (Ellman, 1959) utilizando GSH (Sigma-Aldrich, Alemanha) como padrão externo, com pelo menos 5 pontos para construir a curva analítica.

As concentrações de MT nas amostras foram calculadas utilizando a relação de 1 mol de MT sendo equivalente a 20 mols de GSH (Viarengo, Ponzano et al., 1997; Viarengo, Burlando et


al., 1999; Linde e Garcia-Vazquez, 2006). As amostras recém-descongeladas foram tratadas com uma solução de EDTA 4,0 mmol L-1 contendo HCl 1,0 mol L-1 e DTNB 0,43 mmol L-1, em uma solução de NaCl 2,0 mol L-1 e tampão fosfato de sódio 0,2 mol L-1 de pH 8,0. Após

incubação ao abrigo da luz por 30 min, as absorvâncias das amostras foram determinadas em 412 nm em um espectrofotômetro Lambda 35, Perkin Elmer, EUA). Os dados entre grupos

foram comparados estatisticamente pelo teste ANOVA para averiguação de diferenças significativas.

2.2.5. Determinação dos metais Cu, Fe e Zn

A quantificação dos metais foi realizada com amostras liofilizadas (Liotop 101,

Liobrás, SP) dos órgãos das cobaias. Aproximadamente 100 mg de cada amostra foram acidificados com 1 mL de ácido nítrico subdestilado (Vetec, RJ, Brasil), e mantidas em

descanso overnight. O material de referência (MRC) utilizado foi o DORM-4 (Dogfish muscle – músculo de peixe-cão, NRC, Canadá), em duplicata. Após o descanso, as amostras foram aquecidas a 80-100 °C durante aproximadamente 4 h para digestão. Após o resfriamento, as

amostras e os MRC foram avolumados a 10 mL e duas diluições (de 10 e 100 vezes) foram preparadas. Três brancos de análise foram preparados da mesma forma. Os elementos de

interesse foram determinados por ICP-MS, em um modelo ELAN DRC II (Perkin Elmer, Sciex, Norwalk, CT, EUA), no modo padrão, sem o uso de célula de reação. As amostras foram introduzidas por um nebulizador do tipo Meinhard com uma câmara ciclônica twister.

Durante a análise, 103Rh foi utilizado como padrão interno em concentração de 20 mg L-1. Os resultados foram obtidos através da média das três leituras feitas para cada amostra, após

calibração externa com soluções de calibração multielementares obtidas através de diluições apropriadas da solução padrão (Merck IV). Os dados entre grupos foram comparados estatisticamente pelo teste ANOVA para averiguação de diferenças significativas.

3. Resultados e Discussão

3.1. Síntese e caracterização do CBNSQ

O CBNSQ sintetizado apresentou cor amarelo-pálido, tendo rendimento médio em

torno de 72 %. A reação e a estrutura esperada estão esquematizadas a seguir na Figura 2:

O

NNH

N

O

OH

OH

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

NH2

NH O

N

+ + OH2Ac. Acético, MeOH

refluxo 2h

quercetina isoniazida CBNSQ

Figura 2 - Reação de síntese do CBNSQ.

3.1.1. Termogravimetria (TG/DTG) e Ensaio de Ponto de Fusão

A curva de TG/DTG não demonstrou ocorrência de decaimento entre 90 e 150 ºC demonstrando ausência de solvente de hidratação na estrutura molecular do CBNSQ.


O ensaio de ponto de fusão demonstrou entre 260 e 265 ºC enegrecimento do composto antes de qualquer mudança de estado físico, da mesma forma que a primeira decomposição na TG/DTG ocorre na faixa de temperatura de 200 a 340 ºC. Portanto, o

CBNSQ não apresenta ponto de fusão real a pressão de 1 atm.

3.1.2. Análise Elementar CHN

A Tabela 1 apresenta os valores experimentais da amostra e os valores para a estrutura

teórica proposta, a qual é considerada como ausente de solvente de hidratação, conforme verificado pela análise termogravimétrica.

Tabela 1 - Resultado experimental da análise CHN e valores teóricos da estrutura proposta.

C (%) H (%) N (%)

Experimental 57,4 3,9 9,6

Teórico 59,9 3,6 10

Comparando-se os valores, observou-se apenas pequenas diferenças entre os teores experimentais e teóricos, o que reforça o sucesso da síntese e a estrutura molecular esperada

para o CBNSQ.

3.1.3. Espectroscopia vibracional de absorção no infravermelho médio (IV)

Comparando as estruturas moleculares dos reagentes quercetina e isoniazida com a do

produto CBNSQ, apresentadas na reação da Figura 2, esperava-se a formação de uma imina (ligação C=N), a ausência da amina primária (R-NH2) presente na isoniazida, e também a ausência da carbonila (C=O) da quercetina.

Em relação a carbonila, foi verificada sua banda de estiramento no espectro do CBNSQ em 1662 cm-1. Esse estiramento também é presente nos reagentes: 1666 cm-1 na

isoniazida e 1665 cm-1 na quercetina. Assim, é uma banda por si só inconclusiva para certificação da formação do CBNSQ, mas ainda sim, representa um forte indício da presença da carbonila na molécula, proveniente da estrutura da isoniazida.

Quanto a ausência de amina primária, não foram observadas bandas no espectro do CBNSQ em torno de 3111 e 3013 cm-1, que correspondem aos estiramentos assimétrico e

simétrico clássicos desse grupo. Uma banda de estiramento N-H da amida secundária em 3317 cm-1 foi observada no espectro do CBNSQ, podendo ser equivalente a um deslocamento sofrido pela banda em 3303 cm-1 no espectro da isoniazida. Contudo, no espectro da

quercetina observa-se também uma banda em 3320 cm-1 referente ao estiramento O-H. Portanto, diante da diversidade de grupos hidroxilas esperado no CBNSQ, tornou-se difícil

realizar atribuições precisas para os estiramentos N-H misturados com os estiramentos O-H, afinal bandas na região entre 4000 e 2000 cm-1 podem sofrer deslocamentos pouco previsíveis devido as ligações de hidrogênio, altamente presente no CBNSQ rico em hidroxilas.

Finalmente, não foi observada uma banda em torno de 1634 cm-1 no CBNSQ, atribuída a dobramento angular da amina primária na isoniazida, sendo um indício maior da ausência

desse grupo funcional no CBNSQ. Em relação à formação da ligação C=N, pode ser observado seu possível estiramento

em 1616 cm-1, sendo um ombro a esquerda da banda 1606 cm-1. Essa banda fortemente sugere

o sucesso da síntese. Além disso, uma banda larga de estiramento O-H em 3403 cm-1 no espectro da

quercetina aparentemente foi deslocada para 3450 cm-1 e tornou-se afiada no espectro do

CBNSQ. Tal deslocamento evidencia a mudança do contexto químico de pelo menos um grupo hidroxila originalmente presente na quercetina, sendo mais provável uma das duas

ligadas aos carbonos 3 e 5 (Figura 1).


Outra observação no espectro do CBNSQ foi a presença das bandas 1606, 1561 e 1528 cm-1 de estiramento de anel aromático, verificado em 1610, 1561 e 1521 cm-1 no espectro da quercetina, e as bandas em 1602 e 1555 cm-1 no espectro da isoniazida. Por mais que sejam

bandas de grupos funcionais presentes em ambos reagentes e no produto, elas demonstram a preservação de tais grupos, além do fato de que o deslocamento dessas bandas no espectro do

CBNSQ em relação a ambos seus precursores demonstra que sua estrutura não é uma simples mistura de quercetina e de isoniazida.

A Tabela 2 demonstra as principais bandas que contribuem para caracterização do

CBNSQ.

Tabela 2 – Atribuição das principais bandas de IV, em cm-1, do CBNSQ em comparação com as de seus precursores.

Quercetina Isoniazida CBNSQ

ν O-H (fenol) 3403 3450

3320 3317

3288 3285

ν as. N-H (amina) 3111

ν s. N-H (amina) 3013

ν N-H (amida) 3303 3317

ν C=O (carbonila) 1665 1666 1662

δ NH2 (amina) 1634

ν C=N (imina) 1616

ν C=C (anel) 1610 1602 1606

1561 1555 1561

1521 1528

δ C-OH (fenol) 1405 1419

1380 1373

1318 1326

δ N-H (amida) 1219 1217

ν C-O (fenol) 1168 1169

1132 1119

ν – estiramento; ν s. – estiramento simétrico; ν as. – estiramento assimétrico; δ – deformação

angular.

3.1.4. Ressonância Magnética Nuclear de 1H (RMN de 1H) e mapa de contornos COSY

Como observado na Figura 2, na estrutura esperada do CBNSQ, há 9 hidrogênios

ligados a anéis aromáticos, cuja região característica no RMN ocorre, geralmente, entre 6 e 10 ppm (Silverstein, Webster et al., 2015). O espectro RMN de 1H e o mapa de contornos COSY, obtidos experimentalmente, estão apresentados nas Figuras 3 e 4, respectivamente.


Figura 3 – Espectro de RMN de 1H do composto CBNSQ.

Figura 4 – Mapa de cotornos COSY do composto CBNSQ.


Nessa região, foram observados no espectro 5 sinais, cujas integrais foram próximas a 1 (indicando 4 hidrogênios com propriedades magnéticas diferentes), e outros 2 sinais, cujas integrais foram próximas de 2 (indicando 4 hidrogênios, equivalentes magneticamente em

duplas). Portanto totalizou-se 9 hidrogênios ligados a anel aromático, assim como a proposta teórica.

Além disso, observou-se na estrutura teórica que os 5 hidrogênios ligados a anel aromático provenientes da estrutura da quercetina são todos diferentes magneticamente pois não se verifica plano de simetria que permita atribuir semelhança. Os outros 4 hidrogênios

ligados ao anel da piridina pertencem a estrutura da isoniazida, sendo equivalentes quimicamente entre si os dois em posição meta e os dois em posição orto (considerando a

perspectiva de o nitrogênio piridínico ser a posição para). Assim seria esperado no RMN dois sinais com integrais equivalentes a 2 para o CBNSQ, o que foi verificado experimentalmente. No mapa de contornos COSY, foi observado que dois sinais de integral equivalente a

1 interagiam entre si, caracterizando, de acordo com a estrutura teórica do CBNSQ, os dois hidrogênios vicinais ligados aos carbonos 5’ e 6’ herdados da quercetina (Figura 1). Outra

interação entre os dois sinais de integral equivalente a 2 naturalmente foi observada, referentes aos hidrogênios orto e meta do anel piridínico herdado da isoniazida. Nenhuma outra interação foi observada, caracterizando os demais hidrogênios isolados de integral

equivalente a 1, ligados aos carbonos 6, 8 e 2’ originais da quercetina (Figura 1).

3.2. Resultados do ensaio de toxicidade aguda

3.2.1. Teste de estabilidade

A solução utilizada teve composição 20 % DMSO, pois para menores proporções de DMSO/água não foi possível elaborar uma solução plenamente homogênea, característica essencial para uma análise espectroscópica em solução. Assim, esta foi a solução melhor

simulada da suspensão salina de CBNSQ 10 % DMSO utilizada para injeção. A Figura 5 mostra os espectros UV-Vis nos diversos instantes entre 0 e 48 h da solução 2 x 10-5 mol L-1

de CBNSQ para o teste de estabilidade. A identificação do deslocamento hipocrômico da banda em 369 nm ao longo do tempo, indicado pela seta na Figura 5, sugeriu degradação do CBNSQ na solução veículo simulada.

Figura 5 – Espectros da solução aquosa 20 % DMSO de CBNSQ nos diversos instantes entre

0 e 48h.


A absorvância medida no instante zero para esta solução foi igual a 0,620, e após 48 h foi igual a 0,539, para a banda em 369 nm. Isto corresponde a um decaimento de 13 %, o que indica que o composto apresenta estabilidade adequada para injeção em um tempo médio de 2

h decorridos desde a preparação da suspensão até a injeção no último rato.

3.2.2. Observações acerca da dissecação dos indivíduos

Todas as cobaias injetadas com solução veículo DMSO 10 % ou com solução de

composto CBNSQ no veículo citado sobreviveram após o período de 72 h e não foi observada nenhuma alteração comportamental em relação ao grupo controle. Assim, o CBNSQ mesmo em dosagens extremamente elevadas não se demonstrou letal. Após a dissecação das cobaias,

foi observado enrijecimento do coração no grupo injetado com composto em relação ao grupo controle e ao injetado apenas com veículo, o que pode indicar cardiotoxicidade do CBNSQ.

Deve-se considerar que a dosagem administrada foi bastante elevada, e, portanto, em dosagens terapêuticas esse efeito adverso pode não ser tão extremo, mas ainda sim um problema a ser avaliado futuramente caso o composto mostre-se promissor contra a DA.

3.2.2. Efeitos nas concentrações de GSH

Os coeficientes de correlação R2 das curvas analíticas foram sempre superiores a 0,9970. Na Figura 6 estão expressas as médias e respectivos desvios padrões das

concentrações de GSH em µmol g-1 pu (peso úmido) de cada grupo de ratos.

Cér

ebro

Fígad

o

Cora

ção

Rin

s

0

5

10

15

20

25

Controle

DMSO 10%

CBNSQ em DMSO 10%

GS

H (

mo

l g

-1p

u)

Figura 6 - Concentrações de GSH nos órgãos dos animais controle, injetados apenas com o

veículo e injetados com o CBNSQ.

Os dados entre grupos foram comparados através do teste estatístico ANOVA, considerando nível de significância igual a 0,05. No grupo de ratos injetados com o composto

CBNSQ, houve uma redução significativa da concentração de GSH no cérebro e nos rins, mas nenhuma diferença significativa para o fígado e para o coração, em relação ao grupo de ratos

injetados apenas com solução veículo. Visto que a GSH é uma molécula que atua como mecanismo de defesa primário contra estresse oxidativo no organismo, a redução significativa da concentração deste bioindicador


no cérebro pode ser um demonstrativo de que nesse órgão o estresse oxidativo foi atenuado pelo CBNSQ, e como resposta os níveis de GSH foram diminuídos a fim de atender a demanda momentânea desta molécula. Portanto, é bastante provável que o CBNSQ detenha

de fato uma atividade antioxidante, o que pode contribuir para amenizar a geração de radicais livres neste órgão em seres afetados pela DA. A redução ou não variação significativa de

GSH constatada nos demais órgãos é um índicio de atoxicidade do composto, principalmente considerando estas ocorrências nos rins e no fígado, respectivamente, que são órgãos de detoxificação.

3.2.3. Efeitos nas concentrações de MT

Os coeficientes de correlação R2 das curvas analíticas foram sempre superiores a 0,9970. Na Figura 7 estão expressas as médias e respectivos desvios padrões das

concentrações de MT em µmol g-1 ps (peso seco) de cada grupo de ratos. Devido ao alto custo da metodologia de extração de MT relacionado ao emprego de colunas de separação Vivaspin® estas metaloproteínas foram apenas determinadas no cérebro das cobaias por este

ser o órgão primariamente afetado pela DA.

MT

0.0

0.5

1.0

1.5

Controle

DMSO 10%

CBNSQ em DMSO 10%

MT

(

mo

l g

-1p

s)

Figura 7 - Concentrações de MT no cérebro dos animais controle, injetados apenas com o

veículo e injetados com o CBNSQ.

Os dados entre grupos foram comparados através do teste estatístico ANOVA, baseado em um nível de significância de 0,05. Assim como para os níveis de GSH, observou-se uma diminuição significativa da concentração de MT nos cérebros dos ratos injetados com

o composto em relação aos ratos injetados apenas com solução veículo DMSO 10 %. Essa diferença significativa pode indicar o potencial promissor do CBNSQ de sequestrar radicais

livres, mas também reflete alterações na homeostase de metais, as quais podem ser melhores analisadas pela averiguação direta das diferenças dos próprios metais quantificados por ICP-MS nesse órgão.

3.2.4. Efeito nas concentrações de metais Zn, Cu e Fe

As médias das concentrações dos metais Zn, Cu e Fe e respectivos desvios padrões nos órgãos (cérebro, fígado, rins e coração) de cada grupo, em µmol g-1 ps (peso seco) podem

ser observadas na Figura 8.


Figura 8 – Determinação dos níveis de metais nos órgãos dos animais controle, injetados

apenas com o veículo e injetados com o CBNSQ (A – Zn, B – Cu, e C – Fe).

Os dados entre grupos foram comparados através do teste estatístico ANOVA,

baseado em um nível de significância de 0,05. Nos ratos injetados com o composto CBNSQ, foi observado um aumento significativo das concentrações de Zn em todos os órgãos, de Cu

nos rins e no coração, de Fe no cérebro e nos rins, e uma redução significativa das concentrações de Fe no fígado, em relação aos ratos injetados apenas com o veículo DMSO 10 %. As elevações significativas dos três metais, em seus respectivos órgãos, indicam uma

perturbação de suas respectivas homeostases, sendo uma perspectiva negativa para o uso do composto como MPAC, visto principalmente que houve aumento significativo de Zn, além de

Fe, no cérebro dos ratos expostos ao CBNSQ. Contudo, isso não foi considerado impedimento total para futuros estudos fármacobiológicos do composto, já que a dosagem administrada foi aguda e em ratos sadios.

O aumento significativo, por exemplo, da concentração de Fe, pode ser prejudicial no sentido de contribuir para ocorrência de geração de radicais livres através da reação de

Fenton, mas a redução da GSH nesse órgão demonstrou uma ação antioxidativa do CBNSQ. Logo, o aumento dos níveis de Fe provavelmente não resulta em danos ao órgão, pelo menos com relação ao seqüestro de radicais livres.

O aumento dos níveis de Zn pode resultar em um empecilho para o emprego do CBNSQ contra a DA, visto que esse metal se agrega ao peptídeo Aß formando as placas

senis, e um composto que propicie seu acúmulo no cérebro não cumpre sua função como MPAC. Contudo deve-se ainda esclarecer a forma química que esse metal se apresenta, ou seja, ainda seria importante um estudo sobre a competição entre o CBNSQ e o peptídeo Aß,

para averiguar se o CBNSQ, por mais que tenha tendência de acumular Zn no cérebro, seria

A B

C


capaz de dissociar o Zn das placas senis características da DA e, consequentemente, atenuar sua formação no tecido cerebral.

Em relação ao Cu, metal também vinculado a formação de placas senis, não foram

verificadas diferenças significativas no cérebro, o que pode caracterizar uma atuação do CBNSQ como MPAC para esse metal. A hipótese de não interação entre o composto e Cu é

pouco provável visto que a própria quercetina, precursora do CBNSQ, tem atividade complexante com esse metal (Torreggiani, Tamba et al., 2005), sendo provável que o metal se ligue ao CBNSQ pelo menos por átomos doadores originais da quercetina, ainda mais em

concentrações elevadas, que impõem a condição de agente limitante para os metais.

4. Conclusões

Uma nova hidrazona com propriedades antioxidativas, denominada CBNSQ, foi

sintetizada com sucesso, com rendimento médio de 72 %. A confirmação da sua identidade molecular e estrutural foi possível através de diversas técnicas analíticas: a análise termogravimétrica demonstrou ausência de solvente de hidratação na amostra realizada; a

partir disto, pela análise elementar CHN pode-se confirmar que o composto obtido experimentalmente detinha teores dos elementos C, H e N muito similares à proposta teórica

anidra; finalmente, por espectroscopia vibracional de absorção no IV médio e por ressonância magnética nuclear de 1H (RMN de 1H) junto a mapas de contornos COSY, particularidades da molécula foram identificadas, tais como estiramento do novo grupo funcional C=N e

identificação da quantidade e natureza químicomagnética de hidrogênios ligados a anel aromáticos particulares à molécula.

Realizada a caracterização da molécula, e após confirmação de sua estabilidade na solução veículo 10 % DMSO, a condução de testes biológicos de toxicidade aguda foi considerada válida. O composto CBNSQ se demonstrou não letal diante da sobrevivência e

comportamento natural das cobaias expostas ao composto e os níveis do biondicador de estresse oxidativo GSH apresentou reduções ou ausência de diferenças significativas em todos

os órgãos analisados do grupo de ratos injetado com CBNSQ em relação ao grupo de injetados somente com veículo, em que se identificou, principalmente, redução significativa no cérebro de ratos injetados com CBNSQ indicando uma potencial capacidade antioxidante

do composto. Em contrapartida, após dissecação das cobaias, foi verificada possível

cardiotoxicidade notada pelo enrijecimento do coração. Além dessa adversidade, foi observado o aumento significativo de um ou mais metais (Zn, Cu e Fe) nos órgãos analisados. Isto indicou uma perturbação homeostática, sendo uma perspectiva negativa para o uso do

composto como MPAC, visto, principalmente, que houve aumento significativo de Zn e Fe no cérebro dos ratos expostos ao CBNSQ. Contudo, isto não foi considerado impedimento para

futuros estudos fármaco-biológicos do composto, pois a dosagem administrada foi aguda e em ratos sadios. Fora isso, os níveis de GSH e MT diminuíram significativamente no cérebro das cobaias expostas ao CBNSQ em relação às expostas somente ao veículo, portanto o composto

possui ação antioxidante e combatente aos radicais livres, mesmo aqueles cuja formação seria favorecida pela reação de Fenton induzida pelo Fe. Em relação ao Zn, não foram observadas

placas depositadas de possíveis complexos formados entre CBNSQ e este ou até outros metais. Por mais que não se deseje que o novo composto desestabilize a homeostase, esse efeito colateral pode ser aceitável ou até mesmo ausente em dosagens clínicas, desde que o

CBNSQ consiga desagregar as placas senis de peptídeo Aß através da captura de Zn e Cu, este metal que por sua vez o CBNSQ se demonstrou atuar de fato como MPAC.

De qualquer forma, uma perspectiva realista do potencial farmacológico do CBNSQ

contra a DA só será obtida quando forem avaliadas suas atividades de complexação do com os biometais Zn e Cu, testadas a competição entre o CBNSQ e o peptídeo Aß por estes metais, e,


principalmente, quando o composto for testado em sistemas biológicos que simulem a doença. Considerando sua não-letalidade e a verificação biológica de sua capacidade antioxidante, o CBNSQ pode ser ainda um composto com potencial para tratamento da DA.

5. Referências

1 - Ansari, M. A. et al. Protective effect of quercetin in primary neurons against Abeta(1-42): relevance to Alzheimer's disease. J Nutr Biochem, v. 20, n. 4, p. 269-75, Apr 2009. ISSN 1873-4847. Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18602817 >.

2 - Belda-Palazón, B., M. A. Nohales, et al. Biochemical quantitation of the eIF5A

hypusination in Arabidopsis thaliana uncovers ABA-dependent regulation. Front Plant Sci, v.5, p.202. 2014.

3 - Budimir, A. Metal ions, Alzheimer's disease and chelation therapy. Acta Pharm, v.61, n.1, Mar, p.1-14. 2011.

4 - Chen, S. Y., Y. Chen, et al. Design, synthesis, and biological evaluation of curcumin analogues as multifunctional agents for the treatment of Alzheimer's disease. Bioorg Med

Chem, v.19, n.18, Sep, p.5596-604. 2011.

5 - Chourasiya, A., A. Upadhayay, et al. To Assess Isolation of quercetin- from the leaves of Azadirachta indica and antidiabetic study of The crude extracts. Journal of pharmaceutical and biomedical sciences, v.25, p.179-181. 2012.

6 - De Freitas, L. V., C. C. Da Silva, et al. Structural and vibrational study of 8-hydroxyquinoline-2-carboxaldehyde isonicotinoyl hydrazone--a potential metal-protein

attenuating compound (MPAC) for the treatment of Alzheimer's disease. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, v.116, Dec, p.41-8. 2013.

7 - Ellman, G. L. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys, v.82, n.1, May, p.70-7. 1959.

8 - Erk, M., D. Ivanković, et al. Evaluation of different purification procedures for the

electrochemical quantification of mussel metallothioneins. Talanta, v.57, n.6, Jul, p.1211-8. 2002.

9 - Gaeta, A., F. Molina-Holgado, et al. Synthesis, physical-chemical characterisation and biological evaluation of novel 2-amido-3-hydroxypyridin-4(1H)-ones: Iron chelators with the

potential for treating Alzheimer's disease. Bioorg Med Chem, v.19, n.3, Feb, p.1285-97. 2011. 10 - González-Baró, A. C., R. Pis-Diez, et al. Spectroscopic and theoretical study of the o-

vanillin hydrazone of the mycobactericidal drug isoniazid Journal of Molecular Structure. 1007: 95–101 p. 2012.

11 - Heneczkowski, M., M. Kopacz, et al. Infrared spectrum analysis of some flavonoids. Acta Pol Pharm, v.58, n.6, 2001 Nov-Dec, p.415-20. 2001.

12 - Ibanez, C., C. Simo, et al. Toward a Predictive Model of Alzheimer's Disease

Progression Using Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry Metabolomics. Analytical Chemistry, v.84, n.20, Oct 16, p.8532-8540. 2012.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18602817


13 - Linde, A. R. e E. Garcia-Vazquez. A simple assay to quantify metallothionein helps to learn about bioindicators and environmental health. Biochem Mol Biol Educ, v.34, n.5, Sep,

p.360-3. 2006.

14 - Mancino, A. M., S. S. Hindo, et al. Effects of clioquinol on metal-triggered amyloid-beta aggregation revisited. Inorg Chem, v.48, n.20, Oct, p.9596-8. 2009.

15 - Nogueira, V. D. S. Novo ligante binucleante para-substituido derivado da isoniazida e seus complexos binucleares de cobre(II) ou zinco(II) como ponteciais inibidores de fusão para

o tratamento do HIV/AIDS. Departamento de Química, PUC-Rio, 2011 16 - Scott, L. E. e C. Orvig. Medicinal inorganic chemistry approaches to passivation and

removal of aberrant metal ions in disease. Chem Rev, v.109, n.10, Oct, p.4885-910. 2009.

17 - Selvaraj, K., R. Chowdhury, et al. ISOLATION AND STRUCTURAL ELUCIDATION OF FLAVONOIDS FROM AQUATIC FERN AZOLLA MICROPHYLLA AND EVALUATION OF FREE RADICAL SCAVENGING ACTIVITY. International Journal of

Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, v.Vol 5, Suppl 3. 2013.

18 - Silverstein, R. M., F. X. Webster, et al. Spectrometric identification of organic compounds. Hoboken, N.J.: Wiley. 2015

19 - Subrahmanyam, N. P. V. e M. K. Prakash. Structure And Biological Activities Of Novel Phytochemicals Cu(Ii)-Quercetin Thiosemicarbazone And Its Derivatives: Potential Anti-Cancer Drugs. Journal of Pharma Medicine and Biological Sciences, v.1. 2012.

20 - Torreggiani, A., M. Tamba, et al. Copper(II)–Quercetin complexes in aqueous solutions:

spectroscopic and kinetic properties. Journal of Molecular Structure, v.744–747, p.759-766. 2005.

21 - Viarengo, A., B. Burlando, et al. Metallothionein as a tool in biomonitoring programmes. Biomarkers, v.4, n.6, p.455-66. 1999.

22 - Viarengo, A., E. Ponzano, et al. A simple spectrophotometric method for metallothionein evaluation in marine organisms: an application to Mediterranean and Antarctic molluscs.

Marine Environmental Research, v.44, n.1, p.69-84. 1997.

síntese, caracterização e avaliação da toxicidade de novas ... · antioxidante (selvaraj,...

Documents