simulaÇÃo da dinÂmica populacional de leveduras
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MODELAGEM E SIMULAÇÃO DA DINÂMICA POPULACIONAL DE LEVEDURAS NAS DORNAS DE FERMENTAÇÃO DO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE BIOETANOLTRANSCRIPT
MODELAGEM E SIMULAÇÃO DA DINÂMICA POPULACIONAL
DE LEVEDURAS NAS DORNAS DE FERMENTAÇÃO DO
PROCESSO DE PRODUÇÃO DE BIOETANOL
M. I. BERTO2, M. A. C. SOUZA
1 , C. M. A. GALVÃO
1 e D. I. P. ATALA
1
1CTC – Centro de Tecnologia Canavieira
e-mail: [email protected] 2 GEPC – Instituto de Tecnologia de Alimentos
e-mail: [email protected]
RESUMO – No processo industrial de produção de bioetanol, a levedura utilizada para o
start-up da fermentação não é, necessariamente, a variedade que permanecerá no sistema
até o final da safra. Na maioria dos casos, a variedade de levedura que inicializa o
processo é substituída logo no primeiro mês por outras variedades de leveduras, que
adentram através da alimentação do mosto nas dornas, denominadas contaminantes ou
selvagens. Estas leveduras contaminantes do processo, geralmente apresentam
desempenho industrial inferior às leveduras selecionadas e trazem como conseqüência,
perdas de eficiência e desempenho industrial. Deste modo, conhecer a dinâmica
populacional das leveduras selecionadas e contaminantes ao processo fermentativo
fomentaria futuras estratégias de controle da contaminação. Para isso, foi realizada a
modelagem de um processo industrial de produção de bioetanol, operando em batelada
alimentada, com alimentação do mosto contendo leveduras contaminantes, floculantes ou
não, considerando o reciclo de células, perdas do fermento na etapa de centrifugação e na
purga (sangria) para controle do volume celular. A simulação das diversas condições
operacionais foi realizada através de um programa codificado em LabView 8.5 sendo o
conjunto de equações diferenciais integradas em algoritmo de Runge-Kutta de 4° ordem.
Como resultado, foi possível determinar o tempo de permanência da levedura industrial
selecionada em função do grau de contaminação e da variação da concentração de
substrato no mosto.
PALAVRAS-CHAVE: fermentação alcoólica; dinâmica populacional; leveduras; modelagem;
simulação.
1. INTRODUÇÃO.
Os processos industriais de produção de bioetanol operam, em sua maioria, com o processo
denominado Melle Boinot, ou seja, processo batelada alimentada com reciclo de biomassa. Este
processo caracteriza-se por recuperar o fermento, com a utilização de centrífugas, e posterior
tratamento do mesmo, com a adição de ácido sulfúrico. Este tratamento tem a função de
controlar a contaminação bacteriana, promover a desfloculação das leveduras e aumentar a
viabilidade celular, entre outros.
O mosto usado para a fermentação é composto por uma mistura entre caldo, água e
melaço, sendo este último usado nas unidades que produzem açúcar e álcool. Sua concentração
em açúcar é uma função da qualidade da matéria prima (cana-de-açúcar), das condições
climáticas e operacionais (paradas programadas e não programadas) sendo estes os motivos que
conferem uma grande variabilidade de sua concentração ao longo dos 210 dias de safra no ano.
Da colheita, a cana carrega consigo uma imensa flora microbiana natural, entre elas
leveduras e bactérias, que entram na usina através das moendas. Estas leveduras e bactérias
resistem à maioria das etapas de processamento podendo chegar às dornas em elevada
proporção, dependendo das etapas de tratamento do caldo instalado nas unidades produtoras.
Estas leveduras contaminantes que chegam às dornas de fermentação através do mosto, são
denominadas de leveduras selvagens ou nativas e, na maioria dos casos, apresentam as seguintes
características:
Floculação;
Elevadas taxas de multiplicação;
Alta taxa de utilização do substrato para manutenção e crescimento;
Baixa capacidade de produção de etanol; e
Baixa resistência ao etanol
No entanto, pode acontecer que uma destas cepas selvagem tenha um ótimo desempenho
industrial podendo ser usada para a partida da safra seguinte. Vários são os fatores que
determinam a permanência ou não da levedura industrial selecionada no início do processo ao
longo da safra sendo os principais, listados a seguir:
Grau de contaminação do mosto;
Variabilidade da concentração de açúcar do mosto;
Eficiência da centrifuga;
Purga ou sangria;
Teor alcoólico das dornas; e
Contaminação bacteriana.
Varias foram as tentativas de monitorar a levedura durante o processo fermentativo. A
ferramenta mais utilizada é a técnica de plaqueamento seguida de análise de cariotipagem.
Através desta análise, o setor tem como base que a levedura inoculada no início do processo
permanece cerca de 45 dias nas dornas. Nas unidades com as piores condições, este tempo é
reduzido para aproximadamente 20 dias e nas melhores unidades, pode-se prolongar esta
permanência, em pequena fração, até o final da safra.
Dentro deste contexto, o presente trabalho tem por finalidade avaliar a dinâmica
populacional de cepas de levedura no processo industrial de produção de bioetanol, utilizando a
técnica de modelagem e simulação, através da influência da concentração de substrato e do grau
de contaminação por levedura do mosto.
2. MATERIAL E MÉTODOS.
2.1 A Fermentação.
A Figura 1 apresenta o esquema do processo fermentativo batelada alimentada com reciclo
de biomassa (Melle Boinot) usado para o estudo da dinâmica populacional de leveduras.
Neste processo o mosto é alimentado com uma concentração conhecida de substrato,
contendo ou não contaminação, nas dornas de fermentação previamente carregadas com cerca de
1/3 de seu volume útil com o fermento tratado a uma concentração de 30% em volume.
O tempo de enchimento depende da capacidade instalada na usina e varia de unidade para
unidade. Um valor médio encontrado é de 4 horas, sendo que o processo permanece por mais 3
horas (operando em batelada) para que ocorra o consumo total dos açúcares presente no meio.
Após a fermentação, o volume é enviado para as centrifugas onde ocorre a separação em
duas linhas:
Vinho delevedurado; e
Creme ou leite de levedura.
A concentração da biomassa na linha de vinho delevedurado e creme de levedura
dependem, praticamente, de dois fatores:
Eficiência da Centrífuga; e
Levedura floculante ou não.
Centrífuga
Fermentado
F, Xi, Yi, Zi, S, P
Vinho
Delevedurado
Fv, Xiv, Yiv, Ziv S, P
Tratamento
Fermento
Creme
Fc, Xic,Yic, Zic, S, P
Água e Ácido
Fw
Creme
Fr, Xir, Yir, Zir, Sr, Pr
Sangria
Purga
Fp, Xip,Yip, Zip, S, P
Alimentação
Fa, Xia, Yia, Zia, Sa, Pa
Fermentador
Pé-de-Cuba
Figura 1: Esquema do processo batelada alimentada com reciclo de biomassa (Melle Boinot)
usado para o estudo da dinâmica populacional de leveduras no processo industrial.
As centrífugas geralmente apresentam uma eficiência na ordem de 99%, fazendo que
somente 1% das leveduras presentes no processo saia, pela linha de vinho delevedurado para
posterior envio para as colunas de destilação.
A lei de Stokes é o fenômeno que rege a separação das partículas na centrífuga sendo que a
velocidade de sedimentação é proporcional ao quadrado do seu diâmetro. Assim, a fração de
biomassa que deixa o processo pela linha de vinho delevedurado é basicamente composto por
partículas de diâmetros menores, sendo improvável encontrar leveduras com características
floculantes nesta linha.
A purga ou sangria é feita com a finalidade de manter a concentração de biomassa
constante eliminando o excesso ocorrido pela multiplicação nas dornas. Nesta etapa, as cepas são
igualmente separadas e este ponto de eliminação pode variar de unidade para unidade. Para este
trabalho foi escolhido o ponto logo na saída da centrífuga.
No tratamento ácido é adicionado água e ácido sulfúrico com a finalidade de reduzir o pH
e ajustar a concentração do creme para a próxima etapa de fermentação. Neste trabalho a
concentração de biomassa foi ajustada para 30% em volume.
Deste modo, tem-se o pé-de-cuba para a próxima fermentação completando assim, o ciclo
de fermentação. Na usina, considerando que as etapas de limpeza, de enchimento, de
fermentação, de centrifugação e de tratamento ácido somam um tempo total de 12 horas por
ciclo, aproximadamente. Assim, uma dorna é usada 2 vezes ao dia e 420 vezes na safra (210
dias).
2.2 Modelagem e Simulação.
O Balanço de Massa global e para os componentes biomassa viável (Xi), Biomassa morta
(Yi), Biomassa total (Zi), Substrato (S) e Produto (P) para o fermentador é apresentado nas
equações (1) a (6). Como premissa foi considerada que não há variação da densidade ao longo do
processo e o volume ocupado pela biomassa na dorna.
FFadt
dV (1)
VrxXiFXaiFadt
VXid
)(
(2)
VrdYiFYaiFadt
VYid
)(
(3)
YiXidt
VZid
)( (4)
VrsSFSaFadt
VSd
)( (5)
VrpPFPaFadt
VPd
)( (6)
Onde: V é o volume [L]; Fa é vazão de alimentação no fermentador [L/h]; F é vazão de saída do fermentador
[L/h]; X, Y e Z são as concentrações de biomassa viável, morta e total na dorna [g/L]; Xa, Ya e Za são as
concentrações de biomassa viável, morta e total na linha de alimentação [g/L]; o índice i representa o tipo de cepa de
levedura estudada; Sa e Pa são as concentrações de substrato (açúcar) e produto (etanol) na linha de alimentação
[g/L]; S e P são as concentrações de substrato (açúcar) e produto (etanol) na dorna [g/L]; rx, rd, rs e rp são as
velocidades de formação de biomassa viável, morte celular, consumo de substrato e formação de produto [g/L/h].
Das particularidades do processo, as equações (1) a (6) podem representar um processo
batelada, batelada alimentada e contínuo quando:
Batelada: Vazões de alimentação e retirada das dornas nulo (Fa=F=0) e volume
constante e maior que zero (dV/dt = 0);
Batelada Alimentada: Vazão de alimentação maior que zero (Fa>0), vazão de retirada
nulo (F=0) e acúmulo de volume na dorna (dV/dt >0);
Contínuo: Vazões de alimentação e retirada das dornas maior que zero (Fa>0 e F>0).
O volume pode ser constante desde que as vazões sejam iguais, caso contrário há
acúmulo ou esvaziamento da dorna.
Assim, enquanto a dorna é alimentada com o mosto, o modelo que representa o processo é
o de batelada alimentada e quando se atinge o volume desejado o modelo que representa o
processo é o de batelada.
A velocidade com que a biomassa viável é formada (rx), da morte celular (rd), do consumo
de substrato (rs) e da formação de produto (rp) é representada pelas equações (7) a (10).
Xrx (7)
X;P))exp(Kdp(Kdt rd (8)
Xmx+ Yxs
rxrs (9)
Xmp+rx Yxs
Ypsrp (10)
Onde: é a velocidade especifica de crescimento celular [1/h]; Kdt é a constante de morte celular devido ao
efeito da temperatura [1/h]; Kdp é a constante de morte celular devido ao efeito da concentração de etanol [L/g];
Yxs é o rendimento em biomassa (quanto de substrato é usado para o crescimento celular); Yps é o rendimento em
produto (quanto de substrato é efetivamente transformado em produto – etanol); mx é o coeficiente de manutenção
celular [g de substrato/ g de biomassa/ h]; e mp produção de etanol associado ao crescimento celular [g de etanol/g
de biomassa/h].
A velocidade especifica de crescimento () é representada pela equação e contempla os
efeitos inibitórios exercido pela concentração de substrato, biomassa e produto.
mn
iPm
P
Xm
ZiSKi
SKs
S
11expmax (11)
Onde: max é a máxima velocidade específica de crescimento celular [1/h]; Ks é a constante de Monod [g/L];
Ki é a constante de inibição pelo substrato [g/L]; Xm é a máxima concentração de biomassa na qual cessa o
metabolismo da levedura [g/L]; Pm é a máxima concentração de etanol na qual cessa o metabolismo da levedura
[g/L]; n e m são coeficientes de ajuste.
O conjunto de equações diferenciais foi integrado usando o algoritmo de
Runge-Kutta de 4° ordem, codificado em Linguagem G, através do Software LabVIEW 8.5
produzido pela National Instruments.
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES.
Os parâmetros e constantes cinéticas usados para realizar as simulações para os
microrganismos usados, são apresentados na Tabela 1. Os valores dos parâmetros e constantes
cinéticas foram baseados nos valores estimados nos trabalhos de
Atala et al. 2001, Andrade et al. 2007, Rivera et al. 2006. Somente 5 parâmetros foram alterados
os demais permaneceram constantes.
Tabela 1: Parâmetros e constantes cinéticas usados para a realização da simulação do processo fermentativo.
SA C1 C2 C3 C4
Floc Não Não Sim Não Sim
max 0,42 0,45 0,44 0,45 0,44
Pm 110 94 94 90 90
Yxs 0,045 0,08 0,08 0,08 0,08
Yps 0,47 0,45 0,45 0,43 0,43
Kdp 0,38 0,44 0,44 0,44 0,44
O microrganismo base foi a levedura industrial denominada SA (isolada da Usina Santa
Adélia) por ser amplamente usada nos processos industriais.
Foram usadas como contaminantes 4 leveduras com parâmetros cinéticos distintos. Todas
as leveduras contaminantes apresentaram elevados rendimentos em biomassa (Yxs), maior
velocidade especifica máxima de crescimento celular (max), baixa resistência à concentração de
etanol (Kdp), baixo rendimento em etanol (Yps) e menor concentração de etanol na qual cessa o
crescimento celular (Pm) quando comparada com a levedura industrial. As leveduras
contaminantes C2 e C4 apresentam características de floculação.
Para o estudo do efeito da concentração de leveduras contaminantes na alimentação foram
simuladas contaminações da ordem de 100 a 10
6 UFC (Unidades Formadoras de Colônias), em
proporções iguais de cada levedura contaminante. Nas dornas de fermentação a concentração
final é de aproximadamente 10 g/L e isto representa uma contagem da ordem de 107 UFC. Para o
estudo do efeito da concentração de substrato na alimentação foram simulados mostos contendo
140 g/L à 200 g/L de substrato.
A Figura 2 apresenta o estudo da influência da concentração de leveduras contaminantes
na permanência da levedura industrial ao longo dos 420 ciclos da safra, de um mosto contendo
180 g/L de substrato. Nesta figura é possível observar que contaminações com concentrações
acima de 106 UFC, a levedura industrial é eliminada praticamente nos primeiros 100 ciclos (50
dias). Contaminações da ordem de 4x105 UFC a levedura industrial é observada ao final dos 420
ciclos (35% aproximadamente), aumentando a medida que a concentração da contaminação
diminui. Em contaminações inferiores a 104 UFC, a fração da levedura industrial ao final dos
420 ciclos é superior a 90%.
Figura 2: Estudo da influência da concentração de leveduras contaminantes na alimentação de um mosto com
180 g/L de substrato na permanência da levedura industrial ao longo dos 420 ciclos de safra.
A Figura 3 apresenta o estudo da influência da concentração de substrato na permanência
da levedura industrial, ao longo dos 420 ciclos da safra, para uma contaminação de 4x106 UFC
na alimentação. É possível observar que, para esta intensidade de contaminação, a concentração
de substrato não apresenta influência na permanência de levedura industrial sendo esta,
eliminada do processo após cerca 60 ciclos ou 30 dias de operação.
Figura 3: Estudo da influência da concentração de substrato na permanência da levedura industrial ao longo
dos 420 ciclos para uma contaminação de 4x106 células.
Para concentrações de contaminantes menores é possível observar a influência da
concentração de substrato na alimentação (Figura 4 e Figura 5). Quanto menor for a
concentração de substrato na alimentação, maior será o favorecimento do estabelecimento da
população de leveduras contaminantes. Deste modo, para aumentar a possibilidade de
permanência da levedura industrial, o processo deve operar com eleva concentração de substrato,
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450Ciclos
% S
A4 X 10^6
2 X 10^6
8 X 10^5
4 X 10^5
2 X 10^5
4 X 10^4
4 X 10^3
4 X 10^2
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Ciclos
% S
A
140 g/L
160 g/L
180 g/L
200 g/L
pois isto gera, um meio com elevado teor alcoólico. Leveduras industriais toleram elevados
teores alcoólicos e este fato pode ser usado como um fator de seleção e de inibição do
estabelecimento da população contaminante.
Figura 4: Estudo da influência da concentração de substrato na permanência da levedura industrial ao longo
dos 420 ciclos para uma contaminação de 4x105 células.
Figura 5: Estudo da influência da concentração de substrato na permanência da levedura industrial ao longo
dos 420 ciclos para uma contaminação de 4x104 células.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 100 200 300 400
Ciclos
% S
A
140 g/L
160 g/L
180 g/L
200 g/L
0
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0,6
0,7
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0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Ciclos
% S
A
140 g/L
160 g/L
180 g/L
200 g/L
As Figuras 6 e 7 apresentam o estudo da dinâmica populacional das leveduras
contaminantes presentes no processo, após 420 ciclos de fermentação, para um mosto contendo
180 g/L de substrato e uma contaminação na alimentação de 4X105
e 4X106 UFC,
respectivamente.
Figura 6: Estudo da dinâmica populacional das leveduras contaminantes presentes no processo após 420
ciclos de fermentação para uma contaminação na alimentação de 4X105 e concentração de substrato
de 180 g/L.
0
0,1
0,2
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0,4
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0,6
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1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Ciclos
% S
A
0
20
40
60
80
100
Eta
no
l [g
/L]
SA
C1
C2
C3
C4
P
Figura 7: Estudo da dinâmica populacional das leveduras contaminantes presentes no processo após 420
ciclos de fermentação para uma contaminação na alimentação de 4X106 e concentração de substrato
de 180 g/L.
Na Figura 6, onde a contaminação do mosto apresenta um valor na ordem de 105 UFC, a
levedura industrial foi a que apresentou dominância, quando comparada individualmente no
processo, chegando ao final dos 420 ciclos com cerca de 35 %. Cerca de 35 % das leveduras
presentes são floculantes (C2+C4) e o restante, 30% é composto por leveduras não floculantes
contaminantes (C1+C3).
Do total, 65% das leveduras presentes são contaminantes e traz, como conseqüência, uma
redução da concentração de etanol na dorna, de 75 g/L (100% de levedura industrial) para cerca
de 70 g/L ao final dos 420 ciclos, ou seja, uma redução de 5g/L, o que impacta negativamente na
produtividade e no custo.
Quando se analisa a Figura 7, onde a contaminação na alimentação é da ordem de 106
UFC, a levedura industrial deixa o processo após 60 ciclos (30 dias). As leveduras contaminantes
dominam o ambiente trazendo como conseqüência, a redução da concentração de etanol de 75%
(100% da levedura industrial) para cerca de 65 g/L após 60 ciclos, ou seja, 10 g/L a menos de
etanol a cada ciclo por mais 350 ciclos de fermentação.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
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Ciclos
% S
A
0
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60
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100
Eta
no
l [g
/L]
SA
C1
C2
C3
C4
P
4. CONCLUSÕES
O presente trabalho avalia a dinâmica populacional de leveduras industriais e
contaminantes no processo fermentativo de produção de bioetanol. Para isso, foi estudado o
impacto da concentração de substrato na alimentação (140 g/L a 200 g/L de açúcares
fermentescíveis) e do grau de contaminação do mosto (100 a 10
6 UFC) na permanência da
levedura industrial SA.
Elevado grau de contaminação (maior que 4x105 UFC) faz que a levedura industrial deixe
o processo, não havendo impacto positivo em trabalhar com elevados teores de açúcar.
Contaminações intermediárias (4x105 a 4x10
4 UFC) geram a expectativa de permanência
da levedura industrial ao longo dos 420 ciclos de fermentação. Neste caso, a utilização de mostos
mais concentrados em substrato promove uma maior expectativa de permanência da levedura
industrial por gerar vinhos mais alcoolizados e por estas leveduras apresentarem uma maior
resistência ao etanol (álcool tolerância) do que as leveduras contaminantes.
Contaminações inferiores (menor que 4x104
UFC) não interferem na permanência da
levedura industrial, finalizando os 420 ciclos de fermentação sempre com concentração superior
a 90% da população total.
Em todos os casos, a presença de leveduras contaminantes diminui a concentração de
etanol no vinho, quando comparado com o processo contendo somente levedura industrial, o que
impacta negativamente na produtividade e nos custo.
É importante ressaltar que este trabalho avalia um cenário, onde as leveduras
contaminantes apresentam um desempenho inferior às leveduras industriais. Com as tecnologias
disponíveis hoje, baseadas em biologia molecular, será possível avaliar e validar os modelos e os
resultados obtidos neste trabalho bem como propor processos que favorecem a permanência da
levedura industrial.
5. REFERÊNCIA
Atala, D. I. P., A. C. Costa, R. Maciel & F. Maugeri (2001) Kinetics of ethanol fermentation
with high biomass concentration considering the effect of temperature. Applied
Biochemistry and Biotechnology, 91-3, 353-365.
Andrade, R. R., E. C. Rivera, A. C. Costa, D. I. P. Atala, F. Maugeri & R. Maciel (2007)
Estimation of temperature dependent parameters of a batch alcoholic fermentation process.
Applied Biochemistry and Biotechnology, 137, 753-763.
Rivera, E. C., A. C. Costa, D. I. P. Atala, F. Maugeri, R. W. M. Maria & R. Maciel (2006)
Evaluation of optimization techniques for parameter estimation: Application to ethanol
fermentation considering the effect of temperature. Process Biochemistry, 41, 1682-1687.