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ARAPONGAS 2016
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO STRICTO SENSU MESTRADO
EM SAUacuteDE E PRODUCcedilAtildeO DE RUMINANTES
SIMONE MARTINS SPITI
TIacuteTULO OCORREcircNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CAtildeES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE
LEITE DE IVAIPORAtilde ndash PR
SIMONE MARTINS SPITI
Cidade ano
AUTOR
Arapongas
2016
TIacuteTULO OCORREcircNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CAtildeES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE
LEITE DE IVAIPORAtilde ndash PR
Dissertaccedilatildeo apresentada agrave UNOPAR como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes Orientador Prof Dr Joatildeo Luis Garcia
SIMONE MARTINS SPITI
TIacuteTULO OCORREcircNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CAtildeES DE
PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORAtilde ndash PR
Dissertaccedilatildeo apresentada agrave UNOPAR no Mestrado em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes aacuterea
e concentraccedilatildeo em Medicina Veterinaacuteria como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de
Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores
_________________________________________ Prof Dr Joatildeo Luis Garcia
UEL
_________________________________________ Prof Dr Luiz Fernando da Cunha Filho
UNOPAR
_________________________________________ Prof Dr Joseacute da Silva Guimaratildees Juacutenior
UEL
Londrina 01 de marccedilo de 2016
Ficha catalograacutefica elaborada com dados fornecidos pelo(a) autor (a)
Biblioteca UNOPAR Arapongas - Maria Luci Juliani Grano CRB ndash 9776
SPITI Simone Martins
Ocorrecircncia de neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de
leite de Ivaiporatilde ndash PR Arapongas UNOPAR 2016
63p
Orientador Joatildeo Luiacutes Garcia
Dissertaccedilatildeo (Mestrado) UNOPAR - Medicina Veterinaacuteria - Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes
2016
1 Medicina Veterinaacuteria - Dissertaccedilatildeo de mestrado ndash Unopar 2 Sauacutede e Produccedilatildeo de
Ruminantes 3 Neosporose 4 Neosporose caninum 5 Reproduccedilatildeo de animais 6
Bovinos de leite 7 Soropositivo 8 Aborto I Garcia Joatildeo Luiacutes II Titulo
CDU 619636
DEDICO com muito amor
Ao Deus Pai nosso criador e Nossa Senhora
Agrave meu namorado Giovani que tanto me apoiou nessa caminhada natildeo me
deixando desanimar
Aos meus pais Edel e Osvaldir que sempre estatildeo do meu lado pelo exemplo
de vida e de dedicaccedilatildeo
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus pela graccedila maior a VIDA por me fazer capaz de realizar meus
sonhos e natildeo desistir nunca ao longo da estrada sempre buscando o conhecimento
Ao meu namorado Giovani pelo apoio incentivo companheirismo por todo
amor carinho e compreensatildeo nesta etapa da minha vida
Aos meus pais Edel e Osvaldir que dedicaram sua vida natildeo soacute para a minha
formaccedilatildeo acadecircmica mas principalmente para a minha formaccedilatildeo como pessoa por
terem me ensinado os valores nobres da vida e por me inspirar a ser cada dia
melhor
Agrave minha irmatilde Solange meu cunhado Edson e minha avoacute Maria que sempre
me apoiaram em todos os momentos faacuteceis ou difiacuteceis
As minhas sobrinhas Ana Carolina e Lauany Maria que satildeo muito importantes
na minha vida amo demais
Ao Professor Joatildeo Luis Garcia por todo ensinamento dedicaccedilatildeo ajuda
confianccedila e compreensatildeo que me ofereceu ao longo do trabalho Minha eterna
amizade e admiraccedilatildeo
Ao Professor Luiz Fernando Da Cunha Filho pelo incentivo apoio e amizade
natildeo soacute no periacuteodo do mestrado mas tambeacutem como grande parceiro no trabalho do
dia a dia
Agrave Universidade Norte do Paranaacute (UNOPAR) e agrave Universidade Estadual de
Londrina (UEL) que me proporcionaram a oportunidade de voltar aos ldquobancos
escolaresrdquo para atualizar e aprofundar meus conhecimentos
Aos funcionaacuterios e amigos Meacutercia Thais Agostinho Seacutergio Carol Miura
Isabely Ana Flaacutevia e Beatriz do Laboratoacuterio de Protozoologia Veterinaacuteria da UEL
que se colocaram a disposiccedilatildeo para me ajudar a minha eterna gratidatildeo sem eles
natildeo seria possiacutevel realizaccedilatildeo deste trabalho
Aos proprietaacuterios que disponibilizaram suas propriedades e animais e natildeo
mediram esforccedilos para auxiliar na conclusatildeo deste trabalho
Aos professores funcionaacuterios e alunos da UNOPAR e da UEL pela ajuda e
motivaccedilatildeo
Aos colegas de turma do mestrado pela amizade e pelos momentos de
convivecircncia que tornaram mais leves os ldquofardosrdquo deste periacuteodo de mestrado
A todos que direta ou indiretamente me apoiaram neste trabalho
lsquolsquoBom mesmo eacute ir a luta com determinaccedilatildeo abraccedilar a vida com paixatildeo perder com
classe e vencer com ousadia pois o triunfo pertence a quem se atreve A vida eacute
muito para ser insignificantersquorsquo
Charles Chaplin
Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de
Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do
Paranaacute Arapongas
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino
de leite Soropositivo Aborto
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50
Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e
total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica
Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo
pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em
hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg
de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552
Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em
Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53
Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados
positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo
a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95
valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do
desenho(2015)54
LISTA DE QUADRO
Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999
a 2015)28
LISTA DE FIGURA
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14
ANEXOS
Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60
Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
microm Micrometro
ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico
NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase
IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina
IFN-y Interferon - gamma
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 10
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12
22 Impacto econocircmico 12
23 Hospedeiros 13
24 Ciclo de vida 14
25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16
251 Transmissatildeo horizontal 16
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17
26 Patogenia 18
261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20
27 Sinais cliacutenicos 21
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23
29 Diagnoacutestico 23
291 Diagnoacutestico cliacutenico 23
292 Diagnoacutestico Laboratorial 24
210 Controle 25
211 Prevalecircncia em bovinos 27
212 Tratamento da neosporose 28
3 REFEREcircNCIAS 30
4 OBJETIVOS
41 Objetivo Geral 39
42 Objetivos especiacuteficos 39
5 ARTIGO 40
CONCLUSOtildeES 55
10
1 INTRODUCcedilAtildeO
A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii
foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e
posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo
Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente
disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento
esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma
doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)
Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como
uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em
todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos
econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de
laticiacutenios
A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N
caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade
nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que
alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida
contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a
transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND
HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que
11
fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas
soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de
anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008
SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam
conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental
importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil
12
2 Revisatildeo de literatura
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia
Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia
Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje
reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos
equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)
Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais
semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas
neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido
com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais
entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al
1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina
22 Impacto econocircmico
O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas
reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico
da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo
relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos
indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da
produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES
2011)
As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar
porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada
ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem
da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de
forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada
pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
15
catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
16
epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
17
variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
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INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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MONTEIRO S G Parasitologia na Medicina Veterinaacuteria 1ordf Ed Satildeo Paulo Rocca p151 ndash 153 2010
MUumlLLER N VONLAUFEN N GIANINAZZI C LEIB S L HEMPHILL A Application of real-time fluorescent PCR for quantitative assessment of Neospora caninum infections in organotypic slice cultures of rat central nervous system tissue Journal of Clinical Microbiology v 40 p 252-255 2002
OLIVEIRA VSF AacuteLVAREZ-GARCIA G ORTEGA-MORA LM BORGES LMF SILVA AC Abortions in bovines and Neospora caninum transmission in an embryo transfer center Veterinary Parasitology 173 206-210 2010
PAREacute J HIETALA SK THURMOND MC An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serological diagnosis of Neospora sp infection in cattle Journal of Veterinary Diagnostic Investigation v7 p352-359 1995 PITEL P H PRONOST S CHATAGNON G TAINTUNIER D FORTIER G amp BALLET J J Neosporosis in bovine dairy herds from the west of France detection of Neospora caninum DNA of abortes fetuses seroepidemiology of Ncaninum in cattle and dogs Veterinary Parasitology v 102 n 4 p 269-277 2001 ROMANELLI PR FREIRE RL VIDOTTO O MARANA ERM OGAWA L DEPAULA VSO GARCIA JL NAVARRO IT Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms Paranaacute State Brazil Research in Veterinary Science v 82 n 2 p 202-207 2007 RITTA NETO A S Anaacutelise da conjuntura agropecuaacuteria ndash Agrometeorologia ndash Safra 201011 ndash PARANAacute SEABDERAL 2010
59
SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870
60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
SIMONE MARTINS SPITI
Cidade ano
AUTOR
Arapongas
2016
TIacuteTULO OCORREcircNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CAtildeES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE
LEITE DE IVAIPORAtilde ndash PR
Dissertaccedilatildeo apresentada agrave UNOPAR como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes Orientador Prof Dr Joatildeo Luis Garcia
SIMONE MARTINS SPITI
TIacuteTULO OCORREcircNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CAtildeES DE
PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORAtilde ndash PR
Dissertaccedilatildeo apresentada agrave UNOPAR no Mestrado em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes aacuterea
e concentraccedilatildeo em Medicina Veterinaacuteria como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de
Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores
_________________________________________ Prof Dr Joatildeo Luis Garcia
UEL
_________________________________________ Prof Dr Luiz Fernando da Cunha Filho
UNOPAR
_________________________________________ Prof Dr Joseacute da Silva Guimaratildees Juacutenior
UEL
Londrina 01 de marccedilo de 2016
Ficha catalograacutefica elaborada com dados fornecidos pelo(a) autor (a)
Biblioteca UNOPAR Arapongas - Maria Luci Juliani Grano CRB ndash 9776
SPITI Simone Martins
Ocorrecircncia de neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de
leite de Ivaiporatilde ndash PR Arapongas UNOPAR 2016
63p
Orientador Joatildeo Luiacutes Garcia
Dissertaccedilatildeo (Mestrado) UNOPAR - Medicina Veterinaacuteria - Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes
2016
1 Medicina Veterinaacuteria - Dissertaccedilatildeo de mestrado ndash Unopar 2 Sauacutede e Produccedilatildeo de
Ruminantes 3 Neosporose 4 Neosporose caninum 5 Reproduccedilatildeo de animais 6
Bovinos de leite 7 Soropositivo 8 Aborto I Garcia Joatildeo Luiacutes II Titulo
CDU 619636
DEDICO com muito amor
Ao Deus Pai nosso criador e Nossa Senhora
Agrave meu namorado Giovani que tanto me apoiou nessa caminhada natildeo me
deixando desanimar
Aos meus pais Edel e Osvaldir que sempre estatildeo do meu lado pelo exemplo
de vida e de dedicaccedilatildeo
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus pela graccedila maior a VIDA por me fazer capaz de realizar meus
sonhos e natildeo desistir nunca ao longo da estrada sempre buscando o conhecimento
Ao meu namorado Giovani pelo apoio incentivo companheirismo por todo
amor carinho e compreensatildeo nesta etapa da minha vida
Aos meus pais Edel e Osvaldir que dedicaram sua vida natildeo soacute para a minha
formaccedilatildeo acadecircmica mas principalmente para a minha formaccedilatildeo como pessoa por
terem me ensinado os valores nobres da vida e por me inspirar a ser cada dia
melhor
Agrave minha irmatilde Solange meu cunhado Edson e minha avoacute Maria que sempre
me apoiaram em todos os momentos faacuteceis ou difiacuteceis
As minhas sobrinhas Ana Carolina e Lauany Maria que satildeo muito importantes
na minha vida amo demais
Ao Professor Joatildeo Luis Garcia por todo ensinamento dedicaccedilatildeo ajuda
confianccedila e compreensatildeo que me ofereceu ao longo do trabalho Minha eterna
amizade e admiraccedilatildeo
Ao Professor Luiz Fernando Da Cunha Filho pelo incentivo apoio e amizade
natildeo soacute no periacuteodo do mestrado mas tambeacutem como grande parceiro no trabalho do
dia a dia
Agrave Universidade Norte do Paranaacute (UNOPAR) e agrave Universidade Estadual de
Londrina (UEL) que me proporcionaram a oportunidade de voltar aos ldquobancos
escolaresrdquo para atualizar e aprofundar meus conhecimentos
Aos funcionaacuterios e amigos Meacutercia Thais Agostinho Seacutergio Carol Miura
Isabely Ana Flaacutevia e Beatriz do Laboratoacuterio de Protozoologia Veterinaacuteria da UEL
que se colocaram a disposiccedilatildeo para me ajudar a minha eterna gratidatildeo sem eles
natildeo seria possiacutevel realizaccedilatildeo deste trabalho
Aos proprietaacuterios que disponibilizaram suas propriedades e animais e natildeo
mediram esforccedilos para auxiliar na conclusatildeo deste trabalho
Aos professores funcionaacuterios e alunos da UNOPAR e da UEL pela ajuda e
motivaccedilatildeo
Aos colegas de turma do mestrado pela amizade e pelos momentos de
convivecircncia que tornaram mais leves os ldquofardosrdquo deste periacuteodo de mestrado
A todos que direta ou indiretamente me apoiaram neste trabalho
lsquolsquoBom mesmo eacute ir a luta com determinaccedilatildeo abraccedilar a vida com paixatildeo perder com
classe e vencer com ousadia pois o triunfo pertence a quem se atreve A vida eacute
muito para ser insignificantersquorsquo
Charles Chaplin
Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de
Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do
Paranaacute Arapongas
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino
de leite Soropositivo Aborto
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50
Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e
total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica
Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo
pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em
hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg
de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552
Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em
Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53
Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados
positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo
a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95
valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do
desenho(2015)54
LISTA DE QUADRO
Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999
a 2015)28
LISTA DE FIGURA
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14
ANEXOS
Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60
Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
microm Micrometro
ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico
NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase
IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina
IFN-y Interferon - gamma
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 10
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12
22 Impacto econocircmico 12
23 Hospedeiros 13
24 Ciclo de vida 14
25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16
251 Transmissatildeo horizontal 16
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17
26 Patogenia 18
261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20
27 Sinais cliacutenicos 21
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23
29 Diagnoacutestico 23
291 Diagnoacutestico cliacutenico 23
292 Diagnoacutestico Laboratorial 24
210 Controle 25
211 Prevalecircncia em bovinos 27
212 Tratamento da neosporose 28
3 REFEREcircNCIAS 30
4 OBJETIVOS
41 Objetivo Geral 39
42 Objetivos especiacuteficos 39
5 ARTIGO 40
CONCLUSOtildeES 55
10
1 INTRODUCcedilAtildeO
A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii
foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e
posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo
Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente
disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento
esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma
doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)
Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como
uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em
todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos
econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de
laticiacutenios
A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N
caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade
nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que
alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida
contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a
transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND
HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que
11
fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas
soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de
anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008
SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam
conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental
importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil
12
2 Revisatildeo de literatura
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia
Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia
Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje
reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos
equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)
Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais
semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas
neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido
com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais
entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al
1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina
22 Impacto econocircmico
O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas
reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico
da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo
relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos
indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da
produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES
2011)
As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar
porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada
ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem
da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de
forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada
pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
15
catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
16
epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
17
variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
SIMONE MARTINS SPITI
TIacuteTULO OCORREcircNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CAtildeES DE
PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORAtilde ndash PR
Dissertaccedilatildeo apresentada agrave UNOPAR no Mestrado em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes aacuterea
e concentraccedilatildeo em Medicina Veterinaacuteria como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de
Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores
_________________________________________ Prof Dr Joatildeo Luis Garcia
UEL
_________________________________________ Prof Dr Luiz Fernando da Cunha Filho
UNOPAR
_________________________________________ Prof Dr Joseacute da Silva Guimaratildees Juacutenior
UEL
Londrina 01 de marccedilo de 2016
Ficha catalograacutefica elaborada com dados fornecidos pelo(a) autor (a)
Biblioteca UNOPAR Arapongas - Maria Luci Juliani Grano CRB ndash 9776
SPITI Simone Martins
Ocorrecircncia de neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de
leite de Ivaiporatilde ndash PR Arapongas UNOPAR 2016
63p
Orientador Joatildeo Luiacutes Garcia
Dissertaccedilatildeo (Mestrado) UNOPAR - Medicina Veterinaacuteria - Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes
2016
1 Medicina Veterinaacuteria - Dissertaccedilatildeo de mestrado ndash Unopar 2 Sauacutede e Produccedilatildeo de
Ruminantes 3 Neosporose 4 Neosporose caninum 5 Reproduccedilatildeo de animais 6
Bovinos de leite 7 Soropositivo 8 Aborto I Garcia Joatildeo Luiacutes II Titulo
CDU 619636
DEDICO com muito amor
Ao Deus Pai nosso criador e Nossa Senhora
Agrave meu namorado Giovani que tanto me apoiou nessa caminhada natildeo me
deixando desanimar
Aos meus pais Edel e Osvaldir que sempre estatildeo do meu lado pelo exemplo
de vida e de dedicaccedilatildeo
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus pela graccedila maior a VIDA por me fazer capaz de realizar meus
sonhos e natildeo desistir nunca ao longo da estrada sempre buscando o conhecimento
Ao meu namorado Giovani pelo apoio incentivo companheirismo por todo
amor carinho e compreensatildeo nesta etapa da minha vida
Aos meus pais Edel e Osvaldir que dedicaram sua vida natildeo soacute para a minha
formaccedilatildeo acadecircmica mas principalmente para a minha formaccedilatildeo como pessoa por
terem me ensinado os valores nobres da vida e por me inspirar a ser cada dia
melhor
Agrave minha irmatilde Solange meu cunhado Edson e minha avoacute Maria que sempre
me apoiaram em todos os momentos faacuteceis ou difiacuteceis
As minhas sobrinhas Ana Carolina e Lauany Maria que satildeo muito importantes
na minha vida amo demais
Ao Professor Joatildeo Luis Garcia por todo ensinamento dedicaccedilatildeo ajuda
confianccedila e compreensatildeo que me ofereceu ao longo do trabalho Minha eterna
amizade e admiraccedilatildeo
Ao Professor Luiz Fernando Da Cunha Filho pelo incentivo apoio e amizade
natildeo soacute no periacuteodo do mestrado mas tambeacutem como grande parceiro no trabalho do
dia a dia
Agrave Universidade Norte do Paranaacute (UNOPAR) e agrave Universidade Estadual de
Londrina (UEL) que me proporcionaram a oportunidade de voltar aos ldquobancos
escolaresrdquo para atualizar e aprofundar meus conhecimentos
Aos funcionaacuterios e amigos Meacutercia Thais Agostinho Seacutergio Carol Miura
Isabely Ana Flaacutevia e Beatriz do Laboratoacuterio de Protozoologia Veterinaacuteria da UEL
que se colocaram a disposiccedilatildeo para me ajudar a minha eterna gratidatildeo sem eles
natildeo seria possiacutevel realizaccedilatildeo deste trabalho
Aos proprietaacuterios que disponibilizaram suas propriedades e animais e natildeo
mediram esforccedilos para auxiliar na conclusatildeo deste trabalho
Aos professores funcionaacuterios e alunos da UNOPAR e da UEL pela ajuda e
motivaccedilatildeo
Aos colegas de turma do mestrado pela amizade e pelos momentos de
convivecircncia que tornaram mais leves os ldquofardosrdquo deste periacuteodo de mestrado
A todos que direta ou indiretamente me apoiaram neste trabalho
lsquolsquoBom mesmo eacute ir a luta com determinaccedilatildeo abraccedilar a vida com paixatildeo perder com
classe e vencer com ousadia pois o triunfo pertence a quem se atreve A vida eacute
muito para ser insignificantersquorsquo
Charles Chaplin
Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de
Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do
Paranaacute Arapongas
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino
de leite Soropositivo Aborto
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50
Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e
total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica
Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo
pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em
hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg
de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552
Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em
Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53
Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados
positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo
a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95
valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do
desenho(2015)54
LISTA DE QUADRO
Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999
a 2015)28
LISTA DE FIGURA
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14
ANEXOS
Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60
Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
microm Micrometro
ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico
NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase
IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina
IFN-y Interferon - gamma
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 10
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12
22 Impacto econocircmico 12
23 Hospedeiros 13
24 Ciclo de vida 14
25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16
251 Transmissatildeo horizontal 16
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17
26 Patogenia 18
261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20
27 Sinais cliacutenicos 21
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23
29 Diagnoacutestico 23
291 Diagnoacutestico cliacutenico 23
292 Diagnoacutestico Laboratorial 24
210 Controle 25
211 Prevalecircncia em bovinos 27
212 Tratamento da neosporose 28
3 REFEREcircNCIAS 30
4 OBJETIVOS
41 Objetivo Geral 39
42 Objetivos especiacuteficos 39
5 ARTIGO 40
CONCLUSOtildeES 55
10
1 INTRODUCcedilAtildeO
A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii
foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e
posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo
Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente
disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento
esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma
doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)
Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como
uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em
todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos
econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de
laticiacutenios
A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N
caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade
nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que
alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida
contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a
transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND
HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que
11
fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas
soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de
anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008
SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam
conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental
importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil
12
2 Revisatildeo de literatura
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia
Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia
Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje
reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos
equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)
Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais
semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas
neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido
com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais
entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al
1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina
22 Impacto econocircmico
O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas
reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico
da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo
relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos
indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da
produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES
2011)
As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar
porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada
ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem
da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de
forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada
pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
15
catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
16
epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
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variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
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INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
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O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
Ficha catalograacutefica elaborada com dados fornecidos pelo(a) autor (a)
Biblioteca UNOPAR Arapongas - Maria Luci Juliani Grano CRB ndash 9776
SPITI Simone Martins
Ocorrecircncia de neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de
leite de Ivaiporatilde ndash PR Arapongas UNOPAR 2016
63p
Orientador Joatildeo Luiacutes Garcia
Dissertaccedilatildeo (Mestrado) UNOPAR - Medicina Veterinaacuteria - Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes
2016
1 Medicina Veterinaacuteria - Dissertaccedilatildeo de mestrado ndash Unopar 2 Sauacutede e Produccedilatildeo de
Ruminantes 3 Neosporose 4 Neosporose caninum 5 Reproduccedilatildeo de animais 6
Bovinos de leite 7 Soropositivo 8 Aborto I Garcia Joatildeo Luiacutes II Titulo
CDU 619636
DEDICO com muito amor
Ao Deus Pai nosso criador e Nossa Senhora
Agrave meu namorado Giovani que tanto me apoiou nessa caminhada natildeo me
deixando desanimar
Aos meus pais Edel e Osvaldir que sempre estatildeo do meu lado pelo exemplo
de vida e de dedicaccedilatildeo
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus pela graccedila maior a VIDA por me fazer capaz de realizar meus
sonhos e natildeo desistir nunca ao longo da estrada sempre buscando o conhecimento
Ao meu namorado Giovani pelo apoio incentivo companheirismo por todo
amor carinho e compreensatildeo nesta etapa da minha vida
Aos meus pais Edel e Osvaldir que dedicaram sua vida natildeo soacute para a minha
formaccedilatildeo acadecircmica mas principalmente para a minha formaccedilatildeo como pessoa por
terem me ensinado os valores nobres da vida e por me inspirar a ser cada dia
melhor
Agrave minha irmatilde Solange meu cunhado Edson e minha avoacute Maria que sempre
me apoiaram em todos os momentos faacuteceis ou difiacuteceis
As minhas sobrinhas Ana Carolina e Lauany Maria que satildeo muito importantes
na minha vida amo demais
Ao Professor Joatildeo Luis Garcia por todo ensinamento dedicaccedilatildeo ajuda
confianccedila e compreensatildeo que me ofereceu ao longo do trabalho Minha eterna
amizade e admiraccedilatildeo
Ao Professor Luiz Fernando Da Cunha Filho pelo incentivo apoio e amizade
natildeo soacute no periacuteodo do mestrado mas tambeacutem como grande parceiro no trabalho do
dia a dia
Agrave Universidade Norte do Paranaacute (UNOPAR) e agrave Universidade Estadual de
Londrina (UEL) que me proporcionaram a oportunidade de voltar aos ldquobancos
escolaresrdquo para atualizar e aprofundar meus conhecimentos
Aos funcionaacuterios e amigos Meacutercia Thais Agostinho Seacutergio Carol Miura
Isabely Ana Flaacutevia e Beatriz do Laboratoacuterio de Protozoologia Veterinaacuteria da UEL
que se colocaram a disposiccedilatildeo para me ajudar a minha eterna gratidatildeo sem eles
natildeo seria possiacutevel realizaccedilatildeo deste trabalho
Aos proprietaacuterios que disponibilizaram suas propriedades e animais e natildeo
mediram esforccedilos para auxiliar na conclusatildeo deste trabalho
Aos professores funcionaacuterios e alunos da UNOPAR e da UEL pela ajuda e
motivaccedilatildeo
Aos colegas de turma do mestrado pela amizade e pelos momentos de
convivecircncia que tornaram mais leves os ldquofardosrdquo deste periacuteodo de mestrado
A todos que direta ou indiretamente me apoiaram neste trabalho
lsquolsquoBom mesmo eacute ir a luta com determinaccedilatildeo abraccedilar a vida com paixatildeo perder com
classe e vencer com ousadia pois o triunfo pertence a quem se atreve A vida eacute
muito para ser insignificantersquorsquo
Charles Chaplin
Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de
Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do
Paranaacute Arapongas
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino
de leite Soropositivo Aborto
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50
Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e
total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica
Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo
pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em
hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg
de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552
Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em
Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53
Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados
positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo
a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95
valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do
desenho(2015)54
LISTA DE QUADRO
Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999
a 2015)28
LISTA DE FIGURA
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14
ANEXOS
Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60
Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
microm Micrometro
ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico
NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase
IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina
IFN-y Interferon - gamma
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 10
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12
22 Impacto econocircmico 12
23 Hospedeiros 13
24 Ciclo de vida 14
25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16
251 Transmissatildeo horizontal 16
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17
26 Patogenia 18
261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20
27 Sinais cliacutenicos 21
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23
29 Diagnoacutestico 23
291 Diagnoacutestico cliacutenico 23
292 Diagnoacutestico Laboratorial 24
210 Controle 25
211 Prevalecircncia em bovinos 27
212 Tratamento da neosporose 28
3 REFEREcircNCIAS 30
4 OBJETIVOS
41 Objetivo Geral 39
42 Objetivos especiacuteficos 39
5 ARTIGO 40
CONCLUSOtildeES 55
10
1 INTRODUCcedilAtildeO
A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii
foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e
posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo
Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente
disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento
esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma
doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)
Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como
uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em
todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos
econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de
laticiacutenios
A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N
caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade
nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que
alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida
contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a
transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND
HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que
11
fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas
soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de
anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008
SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam
conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental
importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil
12
2 Revisatildeo de literatura
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia
Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia
Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje
reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos
equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)
Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais
semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas
neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido
com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais
entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al
1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina
22 Impacto econocircmico
O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas
reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico
da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo
relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos
indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da
produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES
2011)
As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar
porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada
ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem
da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de
forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada
pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
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catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
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epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
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variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
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26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
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preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
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Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
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INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
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O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
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propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
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O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
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A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
DEDICO com muito amor
Ao Deus Pai nosso criador e Nossa Senhora
Agrave meu namorado Giovani que tanto me apoiou nessa caminhada natildeo me
deixando desanimar
Aos meus pais Edel e Osvaldir que sempre estatildeo do meu lado pelo exemplo
de vida e de dedicaccedilatildeo
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus pela graccedila maior a VIDA por me fazer capaz de realizar meus
sonhos e natildeo desistir nunca ao longo da estrada sempre buscando o conhecimento
Ao meu namorado Giovani pelo apoio incentivo companheirismo por todo
amor carinho e compreensatildeo nesta etapa da minha vida
Aos meus pais Edel e Osvaldir que dedicaram sua vida natildeo soacute para a minha
formaccedilatildeo acadecircmica mas principalmente para a minha formaccedilatildeo como pessoa por
terem me ensinado os valores nobres da vida e por me inspirar a ser cada dia
melhor
Agrave minha irmatilde Solange meu cunhado Edson e minha avoacute Maria que sempre
me apoiaram em todos os momentos faacuteceis ou difiacuteceis
As minhas sobrinhas Ana Carolina e Lauany Maria que satildeo muito importantes
na minha vida amo demais
Ao Professor Joatildeo Luis Garcia por todo ensinamento dedicaccedilatildeo ajuda
confianccedila e compreensatildeo que me ofereceu ao longo do trabalho Minha eterna
amizade e admiraccedilatildeo
Ao Professor Luiz Fernando Da Cunha Filho pelo incentivo apoio e amizade
natildeo soacute no periacuteodo do mestrado mas tambeacutem como grande parceiro no trabalho do
dia a dia
Agrave Universidade Norte do Paranaacute (UNOPAR) e agrave Universidade Estadual de
Londrina (UEL) que me proporcionaram a oportunidade de voltar aos ldquobancos
escolaresrdquo para atualizar e aprofundar meus conhecimentos
Aos funcionaacuterios e amigos Meacutercia Thais Agostinho Seacutergio Carol Miura
Isabely Ana Flaacutevia e Beatriz do Laboratoacuterio de Protozoologia Veterinaacuteria da UEL
que se colocaram a disposiccedilatildeo para me ajudar a minha eterna gratidatildeo sem eles
natildeo seria possiacutevel realizaccedilatildeo deste trabalho
Aos proprietaacuterios que disponibilizaram suas propriedades e animais e natildeo
mediram esforccedilos para auxiliar na conclusatildeo deste trabalho
Aos professores funcionaacuterios e alunos da UNOPAR e da UEL pela ajuda e
motivaccedilatildeo
Aos colegas de turma do mestrado pela amizade e pelos momentos de
convivecircncia que tornaram mais leves os ldquofardosrdquo deste periacuteodo de mestrado
A todos que direta ou indiretamente me apoiaram neste trabalho
lsquolsquoBom mesmo eacute ir a luta com determinaccedilatildeo abraccedilar a vida com paixatildeo perder com
classe e vencer com ousadia pois o triunfo pertence a quem se atreve A vida eacute
muito para ser insignificantersquorsquo
Charles Chaplin
Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de
Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do
Paranaacute Arapongas
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino
de leite Soropositivo Aborto
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50
Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e
total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica
Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo
pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em
hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg
de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552
Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em
Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53
Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados
positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo
a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95
valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do
desenho(2015)54
LISTA DE QUADRO
Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999
a 2015)28
LISTA DE FIGURA
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14
ANEXOS
Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60
Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
microm Micrometro
ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico
NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase
IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina
IFN-y Interferon - gamma
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 10
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12
22 Impacto econocircmico 12
23 Hospedeiros 13
24 Ciclo de vida 14
25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16
251 Transmissatildeo horizontal 16
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17
26 Patogenia 18
261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20
27 Sinais cliacutenicos 21
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23
29 Diagnoacutestico 23
291 Diagnoacutestico cliacutenico 23
292 Diagnoacutestico Laboratorial 24
210 Controle 25
211 Prevalecircncia em bovinos 27
212 Tratamento da neosporose 28
3 REFEREcircNCIAS 30
4 OBJETIVOS
41 Objetivo Geral 39
42 Objetivos especiacuteficos 39
5 ARTIGO 40
CONCLUSOtildeES 55
10
1 INTRODUCcedilAtildeO
A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii
foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e
posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo
Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente
disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento
esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma
doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)
Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como
uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em
todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos
econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de
laticiacutenios
A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N
caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade
nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que
alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida
contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a
transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND
HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que
11
fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas
soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de
anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008
SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam
conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental
importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil
12
2 Revisatildeo de literatura
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia
Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia
Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje
reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos
equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)
Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais
semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas
neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido
com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais
entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al
1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina
22 Impacto econocircmico
O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas
reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico
da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo
relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos
indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da
produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES
2011)
As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar
porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada
ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem
da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de
forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada
pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
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catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
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epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
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variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
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Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
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INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
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O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
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propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
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O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
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A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus pela graccedila maior a VIDA por me fazer capaz de realizar meus
sonhos e natildeo desistir nunca ao longo da estrada sempre buscando o conhecimento
Ao meu namorado Giovani pelo apoio incentivo companheirismo por todo
amor carinho e compreensatildeo nesta etapa da minha vida
Aos meus pais Edel e Osvaldir que dedicaram sua vida natildeo soacute para a minha
formaccedilatildeo acadecircmica mas principalmente para a minha formaccedilatildeo como pessoa por
terem me ensinado os valores nobres da vida e por me inspirar a ser cada dia
melhor
Agrave minha irmatilde Solange meu cunhado Edson e minha avoacute Maria que sempre
me apoiaram em todos os momentos faacuteceis ou difiacuteceis
As minhas sobrinhas Ana Carolina e Lauany Maria que satildeo muito importantes
na minha vida amo demais
Ao Professor Joatildeo Luis Garcia por todo ensinamento dedicaccedilatildeo ajuda
confianccedila e compreensatildeo que me ofereceu ao longo do trabalho Minha eterna
amizade e admiraccedilatildeo
Ao Professor Luiz Fernando Da Cunha Filho pelo incentivo apoio e amizade
natildeo soacute no periacuteodo do mestrado mas tambeacutem como grande parceiro no trabalho do
dia a dia
Agrave Universidade Norte do Paranaacute (UNOPAR) e agrave Universidade Estadual de
Londrina (UEL) que me proporcionaram a oportunidade de voltar aos ldquobancos
escolaresrdquo para atualizar e aprofundar meus conhecimentos
Aos funcionaacuterios e amigos Meacutercia Thais Agostinho Seacutergio Carol Miura
Isabely Ana Flaacutevia e Beatriz do Laboratoacuterio de Protozoologia Veterinaacuteria da UEL
que se colocaram a disposiccedilatildeo para me ajudar a minha eterna gratidatildeo sem eles
natildeo seria possiacutevel realizaccedilatildeo deste trabalho
Aos proprietaacuterios que disponibilizaram suas propriedades e animais e natildeo
mediram esforccedilos para auxiliar na conclusatildeo deste trabalho
Aos professores funcionaacuterios e alunos da UNOPAR e da UEL pela ajuda e
motivaccedilatildeo
Aos colegas de turma do mestrado pela amizade e pelos momentos de
convivecircncia que tornaram mais leves os ldquofardosrdquo deste periacuteodo de mestrado
A todos que direta ou indiretamente me apoiaram neste trabalho
lsquolsquoBom mesmo eacute ir a luta com determinaccedilatildeo abraccedilar a vida com paixatildeo perder com
classe e vencer com ousadia pois o triunfo pertence a quem se atreve A vida eacute
muito para ser insignificantersquorsquo
Charles Chaplin
Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de
Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do
Paranaacute Arapongas
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino
de leite Soropositivo Aborto
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50
Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e
total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica
Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo
pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em
hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg
de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552
Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em
Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53
Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados
positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo
a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95
valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do
desenho(2015)54
LISTA DE QUADRO
Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999
a 2015)28
LISTA DE FIGURA
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14
ANEXOS
Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60
Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
microm Micrometro
ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico
NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase
IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina
IFN-y Interferon - gamma
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 10
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12
22 Impacto econocircmico 12
23 Hospedeiros 13
24 Ciclo de vida 14
25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16
251 Transmissatildeo horizontal 16
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17
26 Patogenia 18
261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20
27 Sinais cliacutenicos 21
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23
29 Diagnoacutestico 23
291 Diagnoacutestico cliacutenico 23
292 Diagnoacutestico Laboratorial 24
210 Controle 25
211 Prevalecircncia em bovinos 27
212 Tratamento da neosporose 28
3 REFEREcircNCIAS 30
4 OBJETIVOS
41 Objetivo Geral 39
42 Objetivos especiacuteficos 39
5 ARTIGO 40
CONCLUSOtildeES 55
10
1 INTRODUCcedilAtildeO
A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii
foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e
posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo
Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente
disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento
esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma
doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)
Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como
uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em
todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos
econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de
laticiacutenios
A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N
caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade
nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que
alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida
contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a
transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND
HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que
11
fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas
soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de
anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008
SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam
conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental
importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil
12
2 Revisatildeo de literatura
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia
Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia
Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje
reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos
equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)
Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais
semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas
neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido
com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais
entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al
1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina
22 Impacto econocircmico
O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas
reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico
da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo
relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos
indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da
produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES
2011)
As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar
porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada
ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem
da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de
forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada
pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
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catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
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epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
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variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
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Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
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INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
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O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
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propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
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O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
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A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
lsquolsquoBom mesmo eacute ir a luta com determinaccedilatildeo abraccedilar a vida com paixatildeo perder com
classe e vencer com ousadia pois o triunfo pertence a quem se atreve A vida eacute
muito para ser insignificantersquorsquo
Charles Chaplin
Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de
Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do
Paranaacute Arapongas
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino
de leite Soropositivo Aborto
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50
Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e
total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica
Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo
pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em
hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg
de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552
Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em
Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53
Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados
positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo
a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95
valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do
desenho(2015)54
LISTA DE QUADRO
Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999
a 2015)28
LISTA DE FIGURA
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14
ANEXOS
Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60
Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
microm Micrometro
ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico
NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase
IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina
IFN-y Interferon - gamma
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 10
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12
22 Impacto econocircmico 12
23 Hospedeiros 13
24 Ciclo de vida 14
25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16
251 Transmissatildeo horizontal 16
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17
26 Patogenia 18
261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20
27 Sinais cliacutenicos 21
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23
29 Diagnoacutestico 23
291 Diagnoacutestico cliacutenico 23
292 Diagnoacutestico Laboratorial 24
210 Controle 25
211 Prevalecircncia em bovinos 27
212 Tratamento da neosporose 28
3 REFEREcircNCIAS 30
4 OBJETIVOS
41 Objetivo Geral 39
42 Objetivos especiacuteficos 39
5 ARTIGO 40
CONCLUSOtildeES 55
10
1 INTRODUCcedilAtildeO
A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii
foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e
posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo
Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente
disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento
esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma
doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)
Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como
uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em
todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos
econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de
laticiacutenios
A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N
caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade
nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que
alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida
contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a
transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND
HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que
11
fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas
soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de
anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008
SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam
conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental
importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil
12
2 Revisatildeo de literatura
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia
Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia
Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje
reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos
equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)
Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais
semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas
neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido
com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais
entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al
1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina
22 Impacto econocircmico
O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas
reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico
da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo
relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos
indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da
produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES
2011)
As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar
porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada
ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem
da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de
forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada
pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
15
catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
16
epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
17
variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
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INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
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O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de
Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do
Paranaacute Arapongas
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino
de leite Soropositivo Aborto
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50
Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e
total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica
Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo
pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em
hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg
de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552
Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em
Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53
Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados
positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo
a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95
valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do
desenho(2015)54
LISTA DE QUADRO
Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999
a 2015)28
LISTA DE FIGURA
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14
ANEXOS
Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60
Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
microm Micrometro
ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico
NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase
IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina
IFN-y Interferon - gamma
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 10
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12
22 Impacto econocircmico 12
23 Hospedeiros 13
24 Ciclo de vida 14
25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16
251 Transmissatildeo horizontal 16
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17
26 Patogenia 18
261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20
27 Sinais cliacutenicos 21
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23
29 Diagnoacutestico 23
291 Diagnoacutestico cliacutenico 23
292 Diagnoacutestico Laboratorial 24
210 Controle 25
211 Prevalecircncia em bovinos 27
212 Tratamento da neosporose 28
3 REFEREcircNCIAS 30
4 OBJETIVOS
41 Objetivo Geral 39
42 Objetivos especiacuteficos 39
5 ARTIGO 40
CONCLUSOtildeES 55
10
1 INTRODUCcedilAtildeO
A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii
foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e
posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo
Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente
disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento
esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma
doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)
Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como
uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em
todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos
econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de
laticiacutenios
A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N
caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade
nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que
alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida
contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a
transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND
HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que
11
fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas
soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de
anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008
SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam
conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental
importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil
12
2 Revisatildeo de literatura
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia
Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia
Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje
reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos
equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)
Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais
semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas
neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido
com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais
entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al
1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina
22 Impacto econocircmico
O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas
reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico
da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo
relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos
indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da
produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES
2011)
As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar
porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada
ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem
da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de
forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada
pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
15
catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
16
epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
17
variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
Referecircncias
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50
Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e
total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica
Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo
pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em
hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg
de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552
Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em
Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53
Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados
positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo
a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95
valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do
desenho(2015)54
LISTA DE QUADRO
Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999
a 2015)28
LISTA DE FIGURA
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14
ANEXOS
Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60
Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
microm Micrometro
ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico
NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase
IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina
IFN-y Interferon - gamma
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 10
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12
22 Impacto econocircmico 12
23 Hospedeiros 13
24 Ciclo de vida 14
25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16
251 Transmissatildeo horizontal 16
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17
26 Patogenia 18
261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20
27 Sinais cliacutenicos 21
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23
29 Diagnoacutestico 23
291 Diagnoacutestico cliacutenico 23
292 Diagnoacutestico Laboratorial 24
210 Controle 25
211 Prevalecircncia em bovinos 27
212 Tratamento da neosporose 28
3 REFEREcircNCIAS 30
4 OBJETIVOS
41 Objetivo Geral 39
42 Objetivos especiacuteficos 39
5 ARTIGO 40
CONCLUSOtildeES 55
10
1 INTRODUCcedilAtildeO
A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii
foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e
posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo
Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente
disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento
esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma
doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)
Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como
uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em
todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos
econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de
laticiacutenios
A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N
caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade
nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que
alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida
contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a
transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND
HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que
11
fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas
soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de
anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008
SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam
conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental
importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil
12
2 Revisatildeo de literatura
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia
Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia
Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje
reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos
equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)
Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais
semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas
neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido
com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais
entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al
1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina
22 Impacto econocircmico
O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas
reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico
da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo
relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos
indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da
produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES
2011)
As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar
porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada
ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem
da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de
forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada
pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
15
catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
16
epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
17
variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50
Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e
total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica
Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo
pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em
hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg
de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552
Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em
Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53
Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados
positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo
a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95
valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do
desenho(2015)54
LISTA DE QUADRO
Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999
a 2015)28
LISTA DE FIGURA
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14
ANEXOS
Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60
Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
microm Micrometro
ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico
NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase
IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina
IFN-y Interferon - gamma
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 10
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12
22 Impacto econocircmico 12
23 Hospedeiros 13
24 Ciclo de vida 14
25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16
251 Transmissatildeo horizontal 16
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17
26 Patogenia 18
261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20
27 Sinais cliacutenicos 21
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23
29 Diagnoacutestico 23
291 Diagnoacutestico cliacutenico 23
292 Diagnoacutestico Laboratorial 24
210 Controle 25
211 Prevalecircncia em bovinos 27
212 Tratamento da neosporose 28
3 REFEREcircNCIAS 30
4 OBJETIVOS
41 Objetivo Geral 39
42 Objetivos especiacuteficos 39
5 ARTIGO 40
CONCLUSOtildeES 55
10
1 INTRODUCcedilAtildeO
A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii
foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e
posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo
Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente
disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento
esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma
doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)
Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como
uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em
todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos
econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de
laticiacutenios
A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N
caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade
nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que
alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida
contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a
transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND
HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que
11
fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas
soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de
anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008
SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam
conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental
importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil
12
2 Revisatildeo de literatura
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia
Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia
Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje
reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos
equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)
Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais
semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas
neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido
com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais
entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al
1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina
22 Impacto econocircmico
O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas
reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico
da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo
relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos
indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da
produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES
2011)
As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar
porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada
ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem
da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de
forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada
pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
15
catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
16
epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
17
variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
microm Micrometro
ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico
NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase
IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina
IFN-y Interferon - gamma
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 10
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12
22 Impacto econocircmico 12
23 Hospedeiros 13
24 Ciclo de vida 14
25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16
251 Transmissatildeo horizontal 16
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17
26 Patogenia 18
261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20
27 Sinais cliacutenicos 21
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23
29 Diagnoacutestico 23
291 Diagnoacutestico cliacutenico 23
292 Diagnoacutestico Laboratorial 24
210 Controle 25
211 Prevalecircncia em bovinos 27
212 Tratamento da neosporose 28
3 REFEREcircNCIAS 30
4 OBJETIVOS
41 Objetivo Geral 39
42 Objetivos especiacuteficos 39
5 ARTIGO 40
CONCLUSOtildeES 55
10
1 INTRODUCcedilAtildeO
A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii
foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e
posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo
Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente
disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento
esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma
doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)
Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como
uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em
todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos
econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de
laticiacutenios
A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N
caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade
nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que
alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida
contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a
transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND
HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que
11
fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas
soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de
anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008
SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam
conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental
importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil
12
2 Revisatildeo de literatura
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia
Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia
Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje
reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos
equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)
Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais
semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas
neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido
com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais
entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al
1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina
22 Impacto econocircmico
O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas
reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico
da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo
relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos
indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da
produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES
2011)
As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar
porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada
ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem
da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de
forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada
pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
15
catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
16
epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
17
variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
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39
4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 10
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12
22 Impacto econocircmico 12
23 Hospedeiros 13
24 Ciclo de vida 14
25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16
251 Transmissatildeo horizontal 16
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17
26 Patogenia 18
261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20
27 Sinais cliacutenicos 21
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23
29 Diagnoacutestico 23
291 Diagnoacutestico cliacutenico 23
292 Diagnoacutestico Laboratorial 24
210 Controle 25
211 Prevalecircncia em bovinos 27
212 Tratamento da neosporose 28
3 REFEREcircNCIAS 30
4 OBJETIVOS
41 Objetivo Geral 39
42 Objetivos especiacuteficos 39
5 ARTIGO 40
CONCLUSOtildeES 55
10
1 INTRODUCcedilAtildeO
A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii
foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e
posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo
Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente
disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento
esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma
doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)
Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como
uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em
todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos
econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de
laticiacutenios
A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N
caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade
nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que
alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida
contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a
transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND
HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que
11
fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas
soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de
anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008
SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam
conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental
importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil
12
2 Revisatildeo de literatura
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia
Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia
Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje
reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos
equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)
Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais
semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas
neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido
com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais
entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al
1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina
22 Impacto econocircmico
O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas
reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico
da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo
relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos
indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da
produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES
2011)
As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar
porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada
ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem
da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de
forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada
pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
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catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
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epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
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variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
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- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
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ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
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Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
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INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
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O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
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propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
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O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
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A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
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Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
10
1 INTRODUCcedilAtildeO
A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii
foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e
posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo
Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente
disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento
esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma
doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)
Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como
uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em
todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos
econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de
laticiacutenios
A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N
caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade
nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que
alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida
contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a
transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND
HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que
11
fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas
soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de
anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008
SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam
conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental
importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil
12
2 Revisatildeo de literatura
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia
Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia
Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje
reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos
equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)
Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais
semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas
neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido
com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais
entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al
1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina
22 Impacto econocircmico
O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas
reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico
da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo
relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos
indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da
produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES
2011)
As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar
porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada
ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem
da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de
forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada
pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
15
catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
16
epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
17
variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
11
fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas
soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de
anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008
SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam
conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental
importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil
12
2 Revisatildeo de literatura
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia
Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia
Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje
reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos
equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)
Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais
semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas
neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido
com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais
entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al
1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina
22 Impacto econocircmico
O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas
reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico
da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo
relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos
indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da
produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES
2011)
As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar
porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada
ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem
da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de
forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada
pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
15
catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
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epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
17
variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
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39
4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
12
2 Revisatildeo de literatura
21 Classificaccedilatildeo e Etiologia
Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia
Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje
reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos
equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)
Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais
semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas
neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido
com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais
entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al
1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina
22 Impacto econocircmico
O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas
reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico
da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo
relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos
indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da
produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES
2011)
As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar
porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada
ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem
da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de
forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada
pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
15
catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
16
epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
17
variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
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Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
13
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN
2001)
O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave
neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes
do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas
soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados
Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais
probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado
leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados
detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos
imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose
congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em
problemas reprodutivos
23 Hospedeiros
Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com
N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves
roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos
e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns
hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de
rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES
2011)
Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo
(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM
et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o
lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos
provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos
(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente
eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam
esporulados (DUBEY et al 2002)
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
15
catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
16
epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
17
variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
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39
4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
14
Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto
animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos
caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais
silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes
dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)
Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros
tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos
esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
24 Ciclo de vida
O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos
cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)
(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)
O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um
hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os
15
catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
16
epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
17
variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
15
catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N
caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)
Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo
assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros
intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos
taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido
totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos
Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a
invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro
e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos
caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da
famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)
Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou
em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de
crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)
Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5
minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no
citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON
WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de
resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua
causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos
animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas
macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos
tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos
dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro
de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda
natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS
PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas
dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo
de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros
intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados
com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a
parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no
16
epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
17
variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
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WILLIAMS D J L et al Neospora caninum-associated abortion in cattle the time of experimentally-induced parasitaemia during gestation determines foetal survival Parasitology London v 121 n 4 p 347-358 Oct 2000
WILLIAMS DJL HARTLEY CSBJOumlRKMAN C TREES AJ Endogenous and exogenous transplacental transmission of Neospora caninum - how the
38
route of transmission impacts on epidemiology and control of disease Parasitology ndash Cambridge University 136 1895-1900 2009
WOUDA W BRINKHOF J VAN MAANEN C DE GEE AL MOEN AR Serodiagnosis of neosporosis in individual cows and dairy herds A comparative study of three enzyme-linked immunosorbent assays Clinical Diagnotic Laboratory Immunological v5 p711-716 1998
39
4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
16
epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo
de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)
Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro
coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de
bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso
central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA
2006)
Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso
(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo
esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos
bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula
espinhal (MCALLISTER et al 1998)
Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo
enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a
formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem
aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro
esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes
dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio
ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo
Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
251 Transmissatildeo horizontal
Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de
hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam
os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de
animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros
infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por
ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos
sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave
17
variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
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39
4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
17
variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo
preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua
e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de
transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)
A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios
mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila
de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de
debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos
(ANDREOTTI et al 2003)
252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria
A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando
os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo
(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume
papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees
congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente
infectados (SARTOR et al 2005)
N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por
via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos
e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY
SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N
caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita
Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e
observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser
esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum
Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria
endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando
haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio
ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da
infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES
ORTEGA-MORA 2007)
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
18
26 Patogenia
A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os
taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do
equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas
e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al
2002)
N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e
ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo
comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)
Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto
tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o
parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou
causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam
luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode
ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos
vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma
insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006
DUBEY SCHARES 2011)
A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos
adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O
evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa
afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como
consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da
ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento
ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na
superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do
parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)
O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando
uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma
resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-
alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees
ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros
tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
19
preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas
fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos
como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)
Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em
poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas
podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e
provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas
neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade
dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)
Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se
transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos
teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute
mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma
sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o
periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa
imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em
taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda
Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute
imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente
sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a
partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto
e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000
DUBEY SCHARES 2011)
Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados
mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda
nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006
RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas
podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e
abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute
em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros
persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)
Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que
ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto
frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
20
assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de
sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)
261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum
Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser
infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA
2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a
uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo
da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)
Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra
o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial
agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N
caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo
de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et
al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo
observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune
celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1
(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum
o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a
uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave
resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)
O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo
fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos
em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na
gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o
feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema
imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria
nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o
crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e
infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro
trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave
infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que
fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
21
(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo
(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)
Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo
mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um
aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que
durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e
que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais
propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas
com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram
baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)
Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade
gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo
transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de
anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo
relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)
verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas
durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez
durante a gestaccedilatildeo
27 Sinais Cliacutenicos
O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas
adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A
infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de
vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento
de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente
natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto
Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo
no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas
infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da
produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior
probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados
em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais
neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas
congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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39
4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
22
infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na
sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia
para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar
(MCALLISTER et al 2000)
Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado
em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg
mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos
adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal
poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem
abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995
WOUDA et al1998)
A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou
mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em
algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente
e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem
ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia
completa e debilidade
A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer
apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)
80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados
sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho
Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada
incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados
apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia
Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na
degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha
cardiacuteaca (DUBEY 2003)
Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de
dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo
congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores
flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem
ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e
deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
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30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
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INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
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O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
23
embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES
2011)
28 Abortamento endecircmico e epidecircmico
O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico
ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais
dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute
considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem
durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo
primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados
com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro
agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator
capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos
ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos
infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo
contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem
nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de
transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do
nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos
animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva
(Dubey et al 2006)
Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria
das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento
contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de
um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave
infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN
et al 2007)
29 Diagnoacutestico
291 Diagnoacutestico Cliacutenico
A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de
um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos
podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de
forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
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RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
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296 (co)
304 (le)
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Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
24
existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou
descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)
292 Diagnoacutestico Laboratorial
O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro
(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos
animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no
feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem
abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE
FARIA 2008)
Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N
caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in
vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou
em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a
observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos
indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio
imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que
podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA
1999 DUBEY 2003)
Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil
Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos
abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito
mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal
confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como
prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do
leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise
mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga
escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA
de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no
taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma
primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia
(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
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39
4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
25
As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)
utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo
(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2
mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a
99 (MOTA FERRE FARIA 2008)
A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais
importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no
diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do
DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N
caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do
parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo
geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e
especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)
Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em
infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO
et al 1997)
210 Controle
O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e
desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a
adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-
MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)
As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo
basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais
congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de
infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO
CONRAD 2000)
O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as
particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o
sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de
transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser
considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes
diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
26
ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e
reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)
As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta
enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as
medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos
de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al
2003)
A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico
(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes
soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os
avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle
desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no
rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma
estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)
A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo
apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para
animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos
econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas
infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo
vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa
praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante
disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma
alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em
meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo
introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de
matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de
controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)
O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas
exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se
controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como
placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal
cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por
oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos
centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
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30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
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INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
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O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
27
com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de
aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros
Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade
por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de
catildees (MONTEIRO 2010)
Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute
a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para
prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum
(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute
altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)
211 Prevalecircncia em bovinos
No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum
em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI
Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos
testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo
apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)
Diversos pesquisadores fizeram levantamentos
sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143
(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme
Quadro 01
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
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39
4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
28
Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015
Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de
positivo
Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409
Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)
Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)
Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178
Ragozo et al 2003 MT MG PR e
RJ RIFI ge 25 236
PR RIFI ge 25 222
262 (le)
191 (co)
Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)
ELISA 305 (le)
Guimaracirces Jr et al
2004 PR RIFI ge 25 143
151 (HPB)
77 (cru)
Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12
Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)
355 (le)
Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304
296 (co)
304 (le)
433 (mi)
Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)
Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535
Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242
Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425
Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24
Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)
Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)
212 Tratamentos da neosporose
Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e
efetividade para o tratamento da neosporose
Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado
efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros
(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em
outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
30 Referecircncias
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
29
curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo
lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)
VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina
e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum
Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses
quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por
longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos
(DUBEY SCHARES 2011)
30
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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ANEXOS
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4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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39
4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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39
4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
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Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
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INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
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O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
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propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
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O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
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A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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ANEXOS
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39
4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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38
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39
4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
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39
4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
39
4 OBJETIVOS
41 Objetivo geral
- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de
propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr
42 Objetivos especiacuteficos
-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees
- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos
e catildees pertencentes a este ecossistema
- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
Referecircncias
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ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
40
ARTIGO
Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades
produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f
RESUMO
A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos
Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos
Bovino de leite Soropositivo Aborto
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Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
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INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
41
Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
42
INTRODUCcedilAtildeO
A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo
mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico
endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas
consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-
WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da
pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto
econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos
com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de
lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de
animais (THURMOND HIETALA 1996)
Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado
por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de
animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees
Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum
em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute
A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho
bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas
reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos
nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos
com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos
custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de
leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida
produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e
diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007
MONTEIRO 2010)
O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a
detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes
para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)
Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e
efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees
sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle
da infecccedilatildeo
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
43
O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em
soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de
Ivaiporatilde Pr
MATERIAL E MEacuteTODOS
Caracterizaccedilatildeo do local de estudo
O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na
mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea
de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul
e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES
2015)
O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash
subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios
inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC
verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de
concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca
definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm
anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)
De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748
cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se
dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C
Amostras
Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas
Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo
meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de
problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta
e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o
semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas
suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo
concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses
alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
44
propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou
poccedilos artesianos
Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o
Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo
de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de
bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20
propriedades escolhidas aleatoriamente
As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10
de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de
venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com
tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a
retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg
identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do
teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do
DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em
todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue
foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras
foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular
utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes
e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado
em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -
20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram
utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR
Questionaacuterio epidemioloacutegico
Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20
propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos
relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a
autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo
Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais
Sorologia
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
45
O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N
caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)
Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno
de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas
da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os
quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em
temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG
foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros
foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi
fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os
bovinos e ge 50 para os catildees
Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA
PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia
proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram
submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para
detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo
descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram
externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash
CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG
NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT
Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose
a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA
foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou
de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi
incluiacutedo em cada teste
Comitecirc de eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de
Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de
nuacutemero 00914
Anaacutelise Estatiacutestica
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
46
A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-
quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5
utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6
Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do
ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos
tiacutetulos de anticorpos com as idades
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram
positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um
animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave
1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8
(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem
de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o
resultado da PCR dos bovinos
Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na
prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees
entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES
2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no
Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534
(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)
verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al
(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram
uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste
Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por
causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de
estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)
Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose
bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se
tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento
Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila
de anticorpos anti-N caninum em bovinos
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
Referecircncias
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
47
Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila
estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo
similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil
Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma
evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos
estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo
et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo
significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a
frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo
mantida por transmissatildeo vertical
Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA
observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos
sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior
(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade
maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator
de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum
Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de
problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto
(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto
natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para
Neospora caninum
Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo
dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se
soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini
et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais
probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo
congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto
bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)
Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos
abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais
soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas
soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em
vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
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Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
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Referecircncias
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60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
48
soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de
vacas soronegativas
Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que
N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da
gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais
Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-
concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que
confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas
infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para
conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode
ocorrer
A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho
reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos
apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse
agente (CAMILLO et al 2010)
O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo
que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de
criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais
tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e
concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste
estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo
superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e
destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas
variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)
Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais
eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo
aguda
As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de
Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA
mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e
especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas
(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
Referecircncias
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SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870
60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
49
detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes
tecidos de animais infectados
Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras
de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees
soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de
anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia
Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila
de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando
comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela
4)
Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram
positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais
positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600
sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1
(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela
05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e
maacutexima em cada propriedade dos catildees
No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram
soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do
estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi
obtido no presente estudo
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
Referecircncias
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ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
50
Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em
bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)
Propriedad
e Rebanho
Total
coletado()
RIFI Titulo PCR
reag() neg min maacutex pos neg
1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19
2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20
3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20
4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20
5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20
6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20
7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19
8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20
9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20
10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20
11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20
12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20
13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20
14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20
15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20
16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20
17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20
18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20
19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20
20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20
Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800
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Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
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Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
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Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
Referecircncias
AGUIAR DM CAVALCANTE GT RODRIGUES AAR LABRUNA MB CAMARGO LMA CAMARGO EP GENNARI SM Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in cattle and dogs from Western Amazon Brazil in association with some possible risk factors Veterinary Parasitology v 142 n 1-2 p 71-77 2006 ANDREOTII R BARROS JC PEREIRA AR OSHIRO LM CUNHA RC NETO LFF Associaccedilatildeo entre soropositividade para Neospora caninum e o desempenho reprodutivo de novilhas de corte no Pantanal Sul-Mato-Grossense Brasil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria 201019119-23 ANDREOTTI R PINCKNEY RD PIRES PP SILVA EA Evidence of Neospora caninum in beef cattle and dogs in the State of Mato Grosso do Sul Center-Western region Brazil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p 129-131 2004
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BENETTI AH SCHEIN FB SANTOS TR TONIOLLO GH COSTA AJ MINEO JR LOBATO J SILVA DAO GENNARI SM Pesquisa de anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos leiteiros catildees e trabalhadores rurais da regiatildeo sudoeste do estado de Mato Grosso Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria Jaboticabal v 18 p 29-33 2009
CAVIGLIONE JH KIIHLL R B CARAMORI P H OLIVEIRA D Cartas climaacuteticas do Paranaacute IAPAR Londrina 2000
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COLLANTES-FERNAacuteNDEZ E ZABALLOS A AacuteLVAREZGARCIA G ORTEGA-MORA L M Quantitative detection of Neospora caninum in bovine aborted fetuses and experimentally infected mice by real-time PCR Journal of Clinical Microbiology v40 p 1194-1198 2002
CORBELLINI LG DRIEMEIER D CRUZ CFE GONDIN LFP WALD V Neosporosis as a cause of obortion in dairy cattle in Rio Grande do Sul southern Brazil Veterinary Parasitology 103 195-202 2002
CONRAD P A BARR B C SVERLOW K W ANDERSON M DAFT B KINDE H DUBEY J P MUNSON L amp ARDANS A In vitro isolation and characterization of a Neospora sp from aborted foetuses Parasitology v 106n 3 p 239-249 1993
57
DUBEY JP Review of Neospora caninum and neosporosis in animals Korean Journal of Parasitology v 41 n 1 p 1-16 2003
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KAMGA-WALADJO AR GBATI OB KONE P LAPO RA CHATOGNON G BAKOU SN ET AL Seroprevalence of Neospora caninum antibodies and its consequences for reproductive parameters in dairy cows from Dakar-Senegal West Africa Tropical Animal Health Production 201042953-9
LANGONI H ET AL Avaliaccedilatildeo soroloacutegica para Neospora caninum em propriedades de bovinos leiteiros com alteraccedilotildees reprodutivas Veterinaacuteria e Zootecnia 2013 mar 20(1) 124-130
LANDMANN JK GUNN AA OrsquoDONOGHUE PJ TRANTER WP MCGOWAN MR Epidemiology and impact of Neospora caninum infection in three Queensland tropical dairy cattle Reproduction in Domestic Animals 46 734-737 2011
58
LOCATELLI-DITTRICH R THOMAZ-SOCCOL V RICHARTZ RRTB GASINO-JOINEAU ME VAN DER VINNE R PINCKNEY RD Isolamento de Neospora caninum de feto bovino de rebanho leiteiro no Paranaacute Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p103-109 2004
MACALDOWIE C MALEY SW WRIGHT S BARTLEY P ESTEBAN-REDONDO I BUXTON D ET AL Placental pathology associated with fetal death in cattle inoculated with Neospora caninum by two different routes in early pregnancy Journal of Comparative Pathology 2004131142-56
MELO C B LEITE R C SOUZA G N amp LEITE R C Frequumlecircncia de infecccedilatildeo por Neospora caninum em dois diferentes sistemas de produccedilatildeo de leite e fatores predisponentes agrave infecccedilatildeo em bovinos em Minas Gerais Revista Brasileira Parasitologia Veterinaacuteria v 10 n 2 p 67-74 2001
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OLIVEIRA VSF AacuteLVAREZ-GARCIA G ORTEGA-MORA LM BORGES LMF SILVA AC Abortions in bovines and Neospora caninum transmission in an embryo transfer center Veterinary Parasitology 173 206-210 2010
PAREacute J HIETALA SK THURMOND MC An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serological diagnosis of Neospora sp infection in cattle Journal of Veterinary Diagnostic Investigation v7 p352-359 1995 PITEL P H PRONOST S CHATAGNON G TAINTUNIER D FORTIER G amp BALLET J J Neosporosis in bovine dairy herds from the west of France detection of Neospora caninum DNA of abortes fetuses seroepidemiology of Ncaninum in cattle and dogs Veterinary Parasitology v 102 n 4 p 269-277 2001 ROMANELLI PR FREIRE RL VIDOTTO O MARANA ERM OGAWA L DEPAULA VSO GARCIA JL NAVARRO IT Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms Paranaacute State Brazil Research in Veterinary Science v 82 n 2 p 202-207 2007 RITTA NETO A S Anaacutelise da conjuntura agropecuaacuteria ndash Agrometeorologia ndash Safra 201011 ndash PARANAacute SEABDERAL 2010
59
SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870
60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
51
Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p
RIFI
Idade (meses)
Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117
Novilhas (12-24) 2298 2244
Vacas (acima de 24) 46212 2169
Total 80400
() corrigido pelo efeito do desenho
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
Referecircncias
AGUIAR DM CAVALCANTE GT RODRIGUES AAR LABRUNA MB CAMARGO LMA CAMARGO EP GENNARI SM Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in cattle and dogs from Western Amazon Brazil in association with some possible risk factors Veterinary Parasitology v 142 n 1-2 p 71-77 2006 ANDREOTII R BARROS JC PEREIRA AR OSHIRO LM CUNHA RC NETO LFF Associaccedilatildeo entre soropositividade para Neospora caninum e o desempenho reprodutivo de novilhas de corte no Pantanal Sul-Mato-Grossense Brasil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria 201019119-23 ANDREOTTI R PINCKNEY RD PIRES PP SILVA EA Evidence of Neospora caninum in beef cattle and dogs in the State of Mato Grosso do Sul Center-Western region Brazil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p 129-131 2004
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57
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OLIVEIRA VSF AacuteLVAREZ-GARCIA G ORTEGA-MORA LM BORGES LMF SILVA AC Abortions in bovines and Neospora caninum transmission in an embryo transfer center Veterinary Parasitology 173 206-210 2010
PAREacute J HIETALA SK THURMOND MC An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serological diagnosis of Neospora sp infection in cattle Journal of Veterinary Diagnostic Investigation v7 p352-359 1995 PITEL P H PRONOST S CHATAGNON G TAINTUNIER D FORTIER G amp BALLET J J Neosporosis in bovine dairy herds from the west of France detection of Neospora caninum DNA of abortes fetuses seroepidemiology of Ncaninum in cattle and dogs Veterinary Parasitology v 102 n 4 p 269-277 2001 ROMANELLI PR FREIRE RL VIDOTTO O MARANA ERM OGAWA L DEPAULA VSO GARCIA JL NAVARRO IT Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms Paranaacute State Brazil Research in Veterinary Science v 82 n 2 p 202-207 2007 RITTA NETO A S Anaacutelise da conjuntura agropecuaacuteria ndash Agrometeorologia ndash Safra 201011 ndash PARANAacute SEABDERAL 2010
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SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870
60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
52
Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho
em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio
ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015
Propriedade Tamanho (hectares)
Ndeg de Animais
Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)
Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio
Ndeg de Abortos
Ndeg de Retenccedilatilde
o de Placenta
1 931 48 480 7 2 0
2 1694 59 520 10 1 2
3 2784 82 755 15 5 4
4 726 28 210 2 0 2
5 3414 69 800 15 3 3
6 242 29 160 10 2 0
7 2904 34 180 5 3 2
8 1089 43 150 4 2 2
9 121 46 400 10 2 2
10 242 69 600 12 3 4
11 121 32 80 2 1 3
12 1331 75 350 10 6 2
13 5445 70 640 8 3 3
14 859 32 330 20 4 1
15 482 20 80 2 1 1
16 1689 37 150 5 1 0
17 1452 46 160 2 0 1
18 121 43 400 10 2 4
19 242 41 270 15 1 0
20 726 36 200 8 1 1
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Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
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10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
Referecircncias
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59
SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870
60
ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
61
62
63
53
Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)
Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade
Sim 946 196 144 04129 - 50563
00854
Natildeo 3746 8043
54
Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)
Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
9 2 0 0(000) _ _
10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
12 3 2 0(000) _ _
13 2 1 1(10000) 400 400
14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
55
CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
Referecircncias
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ANEXOS
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61
62
63
54
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Propriedade Ndeg
Catildees Total
coletado
RIFI Titulo
reag min maacutex
1 8 6 0(000) _ _
2 4 3 1(3300) 50 50
3 5 3 0(000) _ _
4 2 2 1(5000) 6400 6400
5 6 6 1(2000) 3200 3200
6 2 1 0(000) _ _
7 4 1 1(10000) 800 800
8 3 0 0(000) _ _
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10 6 2 1(5000) 400 400
11 4 2 0(000) _ _
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14 4 4 1(2500) 100 100
15 2 1 0(000) _ _
16 5 3 0(000) _ _
17 6 5 1(2000) 50 50
18 1 1 0(000) _ _
19 4 2 1(5000) 200 200
20 4 1 0(000) _ _
Total 77 46 9(1960) 50 6400
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CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
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soropositividade em catildees e bovinos
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presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
56
Referecircncias
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ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
Fonte Wikipeacutedia
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CONCLUSOtildeES
- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os
catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar
parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa
- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a
soropositividade em catildees e bovinos
- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo
presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute
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Referecircncias
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ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
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SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870
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ANEXOS
Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr
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SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870
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