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SILVIO PIRES GOMES

Avaliação estereológica da

microestrutura do fígado em

animais desnutridos e submetidos à

renutrição protéica

São Paulo

2011

Silvio Pires Gomes

Avaliação estereológica da microestrutura do fígado em animais desnutridos e submetidos à renutrição protéica.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção

do título de Doutor em Ciências

Departamento:

Cirurgia

Área de Concentração:

Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres

Orientador:

Prof. Dr. Antonio Augusto Coppi

São Paulo

2011

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome: GOMES, Silvio Pires

Título: Avaliação estereológica da microestrutura do fígado em animais desnutridos e submetidos à renutrição protéica.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências

Data: ______ /______/______

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. ________________________________Instituição: ___________________

Assinatura: _____________________________Julgamento: ___________________

Prof. Dr.:________________________________Instituição: ___________________

Assinatura:_____________________________Julgamento: ___________________




Assinatura: _____________________________Julgamento: ___________________

Prof. Dr.:________________________________Instituição: ___________________


Testamento de um cão

Minhas posses materiais são poucas e eu deixo tudo para você...

Uma coleira mastigada em uma das extremidades, faltando dois botões, uma desajeitada

cama de cachorro e uma vasilha de água que se encontra rachada na borda.

Deixo para você a metade de uma bola de borracha, uma boneca rasgada que você vai

encontrar debaixo da geladeira, um ratinho de borracha sem apito que está debaixo do

fogão da cozinha e uma porção de ossos enterrados no canteiro de rosas e sob o assoalho

da minha casinha.

Além disso, eu deixo para você a memória, que, aliás, são muitas.

Deixo para você a memória de dois enormes e meigos olhos, marrons, de uma caudinha

curta e espetada, de um nariz molhado e de choradeira atrás da porta.

Deixo para você uma mancha no tapete da sala de estar junto à janela, quando nas tardes

de inverno eu me apropriava daquele lugar, como se fosse meu, e me enrolava feito uma

bolinha para pegar um pouco de sol.

Deixo para você um tapete esfarrapado em frente de sua cadeira preferida, o qual nunca foi

consertado com o tipo de linha certo e isso é verdade. Eu o mastiguei todinho, quando

ainda tinha cinco meses de idade, lembra-se?

Deixo para você um esconderijo que fiz no jardim debaixo dos arbustos perto da varanda da

frente, onde eu encontrava asilo durante aqueles dias de verão. Ele deve estar cheio de

folhas agora e por isso talvez você tenha dificuldades em encontrá-lo. Sinto muito!

Deixo também só para você, o barulho que eu fazia ao sair correndo sobre as folhas de

outono, quando passeávamos pelo bosque.

Deixo ainda, a lembrança de momentos pelas manhãs, quando saíamos junto pela margem

do riacho, e você me dava àqueles biscoitos de baunilha.

Recordo-me das suas risadas, porque eu não consegui alcançar aquele coelho impertinente.

Deixo-lhe como herança minha devoção, minha simpatia, meu apoio quando as coisas não

iam bem, meus latidos quando você levantava a voz aborrecida e a e minha frustração por

você ter ralhado comigo.

Eu nunca fui à igreja e nunca escutei um sermão. No entanto, mesmo sem haver falado

sequer uma palavra em toda a minha vida, deixo para você o exemplo de paciência, amor e

compreensão.

Sua vida tem sido mais alegre, porque eu estive ao seu lado!

(Autoria Desconhecida)

Indiferença

Não passe tão indiferente só porque eu não sou gente, só porque não sei falar. Também sou um ser vivente, sinto as dores que você sente mas não posso me expressar.

Sou um bicho abandonado, pela vida maltratado,

quase sempre escorraçado, até mesmo apedrejado! Vivo sedento e faminto,

ninguém quer saber o que sinto! Se ficar doente e triste

vejo logo um dedo em riste. E vem a sentença fatal:

-Melhor matar este animal! -Ele deve estar raivoso!

Para sua comodidade vive dizendo inverdade, fazendo muita maldade,

seu mentiroso. Mesmo que esteja raivoso, Você mata o próprio irmão, já foi descoberta a vacina. Mas para a sua raiva humana, ainda não existe remédio, nenhuma medicação, com toda sua evolução, na história da medicina!

Faz guerras, assalta, mata com ou sem razão,

às vezes por ambição! É bem pior que eu,

que chamam de vira-lata! Olhe bem para o meu semblante: -Estou triste, apavorado, pois, a qualquer instante, posso ser sacrificado! Mas você não se importa nem com o seu semelhante! -Você sim, está doente, egoísta, indiferente. Mas se algo ruim lhe acontece logo lembra que há Deus, chora, reza e faz prece...

Mas Deus só ajuda aquele que de todos se compadece. Lembre-se do que escreveu

São Francisco de Assis: - Quem maltrata um animal

jamais poderá ser feliz!


Conquistando o Impossível

Acredite é hora de vencer

Essa força vem

De dentro de você

Você pode

Até tocar o céu se crer...

Acredite que nenhum de nós

Já nasceu com jeito

Pra super-herói

Nossos sonhos

A gente é quem constrói...

É vencendo os limites

Escalando as fortalezas

Conquistando o impossível

Pela fé...

Campeão, vencedor

Deus dá asas, faz teu voo

Campeão, vencedor

Essa fé que te faz imbatível

Te mostra o teu valor...

Acredite que nenhum de nós

Já nasceu com jeito Pra super-herói Nossos sonhos

A gente é quem constrói..

É vencendo os limites

Escalando as fortalezas

Conquistando o impossível

Pela fé...

Campeão, vencedor


Campeão, vencedor

Essa fé que te faz imbatível Te mostra o teu valor...

Tantos recordes

Você pode quebrar

As barreiras

Você pode ultrapassar

E vencer...

Campeão, vencedor


Campeão, vencedor

Essa fé que te faz imbatível

(Autora: Jamily)

Sabor de Mel

O agir de Deus é lindo

Na vida de quem é fiel

No começo tem provas amargas

Mas no fim tem o sabor do mel

Eu nunca vi um escolhido sem resposta

Porque em tudo Deus lhe mostra uma

solução

Até nas cinzas ele clama e Deus atende

Lhe protege

Lhe defende com as suas fortes mãos

Você é um escolhido

E a tua história não acaba aqui

Você pode estar chorando agora

Mas amanhã você irá sorrir.

Deus vai te levantar das cinzas e do pó

Deus vai cumprir tudo que tem te

prometido

Você vai ver a mão de Deus te exaltar

Quem te vê há de falar Ele é mesmo escolhido.

Vão dizer que você nasceu pra vencer

Que já sabiam porque você

Tinha mesmo cara de vencedor

E que se Deus quer agir ninguém pode

impedir

Então você verá cumprir cada palavra

Que o Senhor falou,

Quem te viu passar na prova

E não te ajudou

Quando ver você na benção

Vão se arrepender

Vai estar entre a platéia

E você no palco

Vai olhar e ver

Jesus brilhando em você

Quem sabe no teu pensamento

Você vai dizer

Meu Deus como vale a pena

A gente ser fiel

Na verdade a minha prova Tinha um gosto amargo

Mas minha vitória hoje

Tem sabor de mel.

A minha vitória hoje

Tem sabor de mel.

(Autor: Agailton Silva)

Ao que sempre me mostrou o quanto é importante correr atrás dos sonhos, mesmo que os caminhos sejam longos e que mesmo que coloquem pedras em seus

caminhos, mas com muita fé podemos fazer da dor um sorriso e saber que Deus estará sempre ao nosso lado, seja qual for o caminho escolhido por nós. Ele sabe

que é muito difícil ir atrás dos sonhos, mas nunca deixa ninguém estragar tudo aquilo que conseguimos construir, pois Deus nos mantém forte mesmo quando não conseguimos nos firmar em pé. Por isso agradeço a Deus por tudo que ele me deu

até hoje, pela ajuda incondicional quando eu mais precisei dele. Pois só ele consegue olhar o herói que temos dentro de nós, pois ele nos fortalece e nos

protege. Muito Obrigado Deus por abençoar todos os dias de minha vida.

Aos meus pais Joaquim Gomes e Zulmira Pires e a minha irmã Fátima Gomes e meu cunhado Evandro Bertoncin por estarem sempre ao meu lado em todas as

horas em que mais precisei e por saber que posso contar com todos em todos os momentos de minha vida. Pois todos sabem o quanto é importante o apoio da

família para que todos os nossos sonhos possam ser realizados, pois é através da família que vencemos os obstáculos que a vida faz enfrentarmos todos os dias. E

agradeço muito a minha mãe por sempre acreditar nos meus sonhos e da força que sempre me deu para continuar a seguir em frente e conseguir trilhar o meu futuro, a ela hoje dedico a minha tese de doutorado, pois sem ela não seria o que sou hoje e

sei que ela estará muito feliz hoje aqui do meu lado para realizar mais essa conquista.

Hoje quero agradecer ao meu cachorro Xuxo onde quer que esteja, estará sempre

em meus pensamentos e que nunca será esquecido ao longo de minha vida, como o “único” e fiel amigo que transformou toda a minha vida, pois foi por conta dele que fiz

a minha graduação em Medicina Veterinária. E hoje graças a ele estou aqui conquistando mais um título que será celebrado por mim em pensamento a ele, pela

eterna gratidão que teve comigo. Ainda que tenha passado quase 10 anos, nunca me esqueci de você meu eterno amigão.

Eu Te Amo Muito.

A minha cachorrinha Odara que faz dos dias tristes de minha vida muito mais alegre

e que sei que hoje ela é o anjo da minha vida e por toda essa fidelidade e amor que ela tem por mim eu tento ao máximo retribuir com muito amor, carinho e proteção

essa amizade fraternal que tenho por você. Quero que saiba que enquanto eu estiver por aqui nada de mal irá acontecer com você. Pois por você sempre farei qualquer coisa. Amo-Te minha cachorrinha mais carente do mundo. E agradeço

também ao Hércules por ser o fiel amigo de minha cachorra e por defendê-la

sempre que ela precisar.

AGRADECIMENTOS

São em momentos de mais tristezas que paramos para pensar no que

aconteceu em nossas vidas, nas pessoas que por elas passaram; as coisas

que fizemos e tudo que aprendemos. São nesses momentos que começamos

a lembrar de grandes amizades, que sempre estiveram presentes conosco

quando precisávamos e que nunca poderíamos esquecer.


À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São

Paulo, por proporcionar meu desenvolvimento científico, profissional e

pessoal.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico -

CNPQ (141901 / 2007 - 1) pelo apoio financeiro para a realização deste

trabalho.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Antonio Augusto Coppi, pela amizade,

confiança durante todos esses anos que estivemos juntos e também pelo

aprendizado oferecido a mim e por me mostrar o quanto é importante uma

pesquisa científica séria e por estar sempre presente quando se precisa dele,

seja a qualquer hora do dia ou da noite e por ter me aceitado como seu

orientado durante todos os anos de meus estudos. Agradeço a Deus por hoje

poder ter feito e estar fazendo parte da sua equipe profissional o que me

honra muito.

Ao Laboratório de Estereologia e Anatomia Química – L.S.S.C.A., sob

orientação do Prof. Dr. Antonio Augusto Coppi pela oportunidade de fazer

parte do time de profissionais que nele estão comprometidos e pela

oportunidade do aprendizado durante a realização de minha tese.

Ao Programa de Pós-Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e

Silvestres da Universidade de São Paulo e pela oportunidade de crescer

profissionalmente me tornando um doutor em ciências.

Aos Professores Doutores do setor de Anatomia, pelo aprendizado durante

as aulas de Pós-Graduação.

Aos Professores Doutores Antonio Augusto Coppi, Francisco Blasquez,

Romeu de Souza, Márcia Machado, Laura Maifrino por ter aceitado o

convite para a minha banca de doutorado e por se deslocarem para que

pudessem me ajudar em mais essa etapa de minha vida. Meus mais sinceros

agradecimentos.

A Professora Doutora Patrícia Castelucci pela ajuda essencial durante todo o

meu mestrado e também pela ajuda oferecida durante o meu doutorado e

pela participação importantíssima durante a minha qualificação de doutorado

e pela amizade durante todos esses anos.

Ao Prof. Dr. Romeu Rodrigues de Souza pela amizade, confiança durante

todos esses anos e por aceitar o convite de participar da minha banca de

doutorado.

A minha grande amiga Tais Sasahara pela ajuda incondicional nesta minha

tese de doutorado e por mais de uma década de amizade, que fizeram com

que a nossa amizade ficasse ainda mais sincera ao longo dos anos.

Ao meu amigo Fernando Ladd por tudo que convivemos juntos durante estes

anos de L.S.S.C.A. e pela sua amizade que sempre que sempre tivemos e

que me faz acreditar que existem amigos para todas as ocasiões fora e dentro

do campo profissional. Conte comigo sempre.

A minha amiga Luciana Abrahão por ser essa amiga muito especial e que

possui um coração grandioso e saber que uma amizade sobrevive a todos os

momentos, seja qual for à circunstância e sei que hoje você se faz necessária

em minha vida. Espero poder ser seu amigo por muitos e muitos anos.

A minha amiga Andrea Almeida por tudo que vivemos juntos, por esses anos

de convivência, pelos momentos de luta, garra, força, dedicação e

descontração que passamos juntos durante todo esse tempo. Quero

agradecer pela amizade sincera que você sempre teve comigo e quero que

saiba que lhe considero muito. Obrigado pela ajuda em minha tese e pela

amizade que temos um pelo outro. Te adoro muito!!!

Ao meu amigo Demilto da Pureza pela verdadeira amizade que durante

esses anos pudemos manter sempre da maneira mais bonita que uma

amizade sincera poderia trilhar e caminhar. Pelo apoio, ajuda e por sempre

estender a mão para me ajudar em qualquer momento que eu precisar.

Amigão saiba que estarei sempre por aqui quando você precisar. Mesmo você

indo para tão longe espero que você continue a ser este meu amigo que me

honra muito.

Ao meu amigo Felipe da Roza pela amizade e pela ajuda que você sempre

me ofereceu durante todos esses anos e também pelos momentos de

descontração que é essencial em uma boa amizade.

A minha amiga Aliny Ladd pela amizade sincera e por tudo que passamos

durante essa longa caminhada. Quero lhe dizer que você é uma amiga muito

importante para mim e que tudo que você precisar pode contar comigo

sempre. Obrigado pela amizade minha amiga.

A minha fiel amiga Eliane Muniz por tudo que passamos juntos, por esses

anos de convivência, pelos momentos de luta, garra, força, dedicação e muita

descontração que passamos juntos por este pequeno período, mas que para

mim foi muito importante. Quero poder contar sempre com a sua amizade.

Pois ela é única. E tenho a certeza que ainda teremos mais pela frente nesta

nossa longa amizade.

A Ana Paula Frigo pelos momentos de descontração no L.S.S.C.A. e pela

amizade que foi construída durante este pequeno tempo de conhecimento.

Aos meus amigos e companheiros do L.S.S.C.A. (Laboratory of Stochastic

Stereology and Chemical Anatomy): pelo companheirismo e saiba que hoje

nos tornamos mais que companheiros de trabalhos, mas grandes amigos.

Obrigado também pelos momentos de descontração que vivemos durante

todos esses anos e por me aturarem arduamente durante anos.

A minha amiga Eunice Leite que durante esses 12 anos de amizade que

mostrou o quanto uma amizade pode ser valiosa e que a cada dia mais nossa

amizade se torna mais grandiosa e importante para mim.

Aos amigos de Pós-Graduação deste departamento agradeço por fazer parte

integrante dos momentos passados aqui na Anatomia, pois de uma forma

direta ou indireta fizeram parte da minha vida.

Aos funcionários da Biblioteca da FMVZ-USP.

Aos funcionários da FMVZ-USP, pela consideração, atenção e respeito dado

durante esta minha estada neste programa de Anatomia dos Animais

Domésticos e Silvestres, em especial: Maicon, Jackeline, Edinaldo (Índio),

Diogo, Ronaldo, João, Raimundo, Natália (Branca), Claudia.

.

RESUMO

GOMES, S. P. Avaliação estereológica da microestrutura do fígado em animais desnutridos e submetidos à renutrição protéica. [Stereological evaluation of

microstructure in the liver of animals denutrition of followed by proteic renutrition]. 2011. 83 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011.

A fome e a má nutrição permanecem entre os problemas mais devastadores que

enfrentam a maioria dos pobres e carentes do mundo. A desnutrição está

relacionada com o desequilíbrio do estado nutricional e ocorre sob diversas formas,

podendo afetar o fígado. A desnutrição no início da vida pode afetar profundamente

o corpo e o cérebro de ratos adultos. Alguns desses efeitos são permanentes

enquanto outros desaparecem quando os animais são submetidos ao processo de

renutrição. Sendo assim, outra maneira de interferir na regeneração hepática

fundamenta-se no fato de que os processos proliferativos do fígado podem ser

modulados por fatores alimentares. Experimentos de desnutrição protéico-energética

mostraram que o fígado de ratos desnutridos regenera-se mais lentamente após a

hepatectomia. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da desnutrição e

renutrição protéica na microestrutura dos fígados de camundongos. Foram utilizados

12 camundongos Swiss machos, subdividos nos seguintes grupos: Controle do

desnutrido (CD) (n=3), Desnutrido (D) (n=3), Renutrido (R) (n=3) e Controle do

renutrido (CR) (n=3). Os animais dos dois grupos controle e do grupo renutrido

receberam ração normoprotéica (12%) ao passo que o grupo desnutrido recebeu

ração hipoprotéica contendo (2%). Os seguintes parâmetros estereológicos do

fígado foram estimados: volume, número total e o volume menor (p= 0,001) em

relação ao CR (R= 8020 µm³ e CR= 10018 µm³). O número total de hepatócitos nos

animais desnutridos não apresentou diferença significativa (p= 0,055) em

comparação ao seu CR (D = 1.1 x 107

e CD=1.6 x 107) e o R não apresentou

diferença significativa (p= 0,055) em comparação ao seu CR (R= 2.8 x 107 e CR=

2.2 x 107). Portanto, a renutrição atenuou a atrofia do volume do hepatócito

ocasionada pelo processo de desnutrição (carência de proteína).

Palavras-chave: Estereologia. Desnutrição. Renutrição. Camundongo. Fígado.

ABSTRACT

GOMES, S. P. Stereological evaluation of microstructure in the liver of animals denutrition of followed by proteic renutrition. [Avaliação estereológica da

microestrutura do fígado em animais desnutridos e submetidos à renutrição protéica]. 2011. 83 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011.

The hunger and the malnutrition remain the most devastating problems faced by the

majority of poor and needy people in the world. The malnutrition is related to an

unbalanced nutritional condition and it occurs in different ways may affecting the

liver. In the beginning of life, the malnutrition can affect profoundly the body and the

brain in adult rats. Most of these effects are permanent while others disappear when

the animal are submitted to a renutrition process. In this way, other manner to

interfere in the hepatic regeneration is based on the fact that the liver proliferative

processes might be modulating by food factors. The energetic protein malnutrition

experiments have showed that the undernourished rat livers regenerate slower after

hepatectomy. The aim of this study was to evaluate the effects of the caloric protein

malnutrition and renutrition in the liver microstructure. In this study were used 12

Swiss male mice divided in: control of the undernourished mice (UC) (n=3),

undernourished (U) (n=3), renourished (RN) (n=3) and control of the renourished

(RNC) (n=3). The animals from both control groups and the undernourished group

received normal protein food (12% protein) and the undernourished group received

hypoprotein food (2% protein). The following stereological parameters were

estimated: volume, total number and mean volume of the hepatocytes. The mean

volume of U was significantly lower (p=0.001) than the UC (U= 23.57 mm³ e UC=

46.5 2mm³) and RN was lower (p=0.001) than the RNC (RN= 38.89 mm³ e RNC=

52.03 mm³).The mean volume of hepatocytes in undernourished animals was lower

(p=0.001) in comparison with the respective control (U= 4505 µm³ e CD= 8170.13

µm³) and the RN was lower (p= 0.001) in relation to the RNC (RN= 8020 µm³ e

RNC= 10018 µm³). The total number of hepatocytes in undernourished animals did

not presented significant difference (p= 0.055) in comparison with the respective

control (U = 1.1 x 107

e UC= 1.6 x 107). So, the renutrition attenuated the hepatocyte

volume atrophy caused by the malnutrition process (protein deficiency).

Keywords: Stereology. Malnutrition. Renutrition. Mice. Liver.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 26 2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 29

2.1 OBJETIVO PRINCIPAL ........................................................................................... 29 2.1.1 Estudo qualitatitvo .............................................................................................. 29 2.1.2 Estudo histoquantitativo (Estereológico) ....................................................... 29

2.2 OBJETIVOS SECUNDÁRIOS ................................................................................. 30 3 REVISÃO SISTEMÁTICA DA LITERATURA ........................................................... 32

3.1 ASPECTOS MORFOFUNCIONAIS DO FÍGADO .................................................. 32 3.2 ASPECTOS NUTRICIONAIS .................................................................................. 35 4 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................... 41

4.1 MATERIAIS .............................................................................................................. 41 4.1.1 Animais ................................................................................................................. 41

4.2 MÉTODOS................................................................................................................ 42 4.2.1 Rações .................................................................................................................. 42 4.2.2 Indução da desnutrição ..................................................................................... 43 4.2.3 Recuperação nutricional.................................................................................... 44 4.2.4 Obtenção de amostras de sangue ................................................................... 44

4.2.4.1 Sangue total ....................................................................................................... 44 4.2.4.2 Realização do hemograma ............................................................................... 44 4.2.4.3 Análises bioquímicas ......................................................................................... 45 4.2.5 Estudo histológico .............................................................................................. 45 4.2.6 Estudo estereológico ......................................................................................... 46

4.2.6.1 Estudo morfoquantitativo (estereológico) do fígado ........................................ 46 4.2.6.1.1 Volume do fígado (Vref) ................................................................................. 46 4.2.6.1.2 Coeficiente de erro ......................................................................................... 48 4.2.6.1.3 Número total de hepatócitos (N) .................................................................... 49

4.2.6.1.4 Volume médio dos hepatócitos ( Nv ) ............................................................. 50 5 ANÁLISE ESTATÍSTICA INFERENCIAL ................................................................. 52 6 RESULTADOS ............................................................................................................ 54 6.1 PESO CORPORAL .................................................................................................. 54 6.2 PESO DO FÍGADO .................................................................................................. 55 6.3 MICROESTRUTURA ............................................................................................... 56 6.4 VOLUME DO FÍGADO (Vref) .................................................................................. 57 6.4.1 Princípio de cavalieri .......................................................................................... 57

6.5 COEFICIENTE DE ERRO DO VOLUME DO FÍGADO (CE) ................................. 58 6.6 NÚMERO TOTAL DE HEPATÓCITOS (N) ............................................................ 60

6.7 VOLUME MÉDIO DOS HEPATÓCITOS ( Nv ) ...................................................... 60 6.8 AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS ................................................................................. 61 7 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 65

7.1 MODELOS DE DESNUTRIÇÃO PROTÉICA ......................................................... 65 7.2 VOLUME DO FÍGADO (Vref) .................................................................................. 67 7.3 NÚMERO TOTAL DE HEPATÓCITOS (N) ............................................................ 68

7.4 VOLUME MÉDIO DOS HEPATÓCITOS ( Nv ) ....................................................... 70 7.5 AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS ................................................................................. 71 8 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 74

REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 76

LISTA DE TABELA

Tabela 1- Composição Percentual da Ração. Ração controle I e Ração

hipoproteíca II. ...........................................................................................43

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Secção do fígado de animal controle do desnutrido. Sistema de pontos utilizado para a estimativa do volume do fígado a partir do Princípio de

Cavalieri. Escala de barra: 20 cm .................................................................48 Figura 2 - Fotomicrografia do fígado de um camundongo do grupo controle do

desnutrido mostrando a aplicação do disector óptico para estimativa do número total de hepatócitos. Técnica de coloração: Hematoxilina de

Mayer. Escala de barra: 20µm ......................................................................50 Figura 3 - Fotomicrografia do fígado de um camundongo do grupo desnutrido

mostrando a estimativa do volume médio dos hepatócitos pelo método rotator planar. Técnica de coloração: Hematoxilina de Mayer. Escala de

barra: 20µm ....................................................................................................51 Figura 4 - Foto macrografia mostrando comparativamente os fígados dos

camundongos dos grupos CD, D, R, CR. Escala de barra = 2 cm ............55 Figura 5 - Fotomicrografia mostrando a microestrutura do fígado de A: Controle do

desnutrido, B: Desnutrido, C: Renutrido e D: Controle do renutrido, exibindo perfis dos hepatócitos, onde: Núcleo (a) e Hepatócito (b).

Técnica de Coloração: Hematoxilina de Mayer. Escala de Barra: 20µm...57

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 - Peso dos Animais (p= 0, 001*) dos grupos controle do desnutrido, desnutrido, renutrido e controle do renutrido. Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos .............................................................................. 54

Gráfico 2 - Peso dos Fígados (p= 0, 001*) dos grupos controle do desnutrido, desnutrido, renutrido e controle do renutrido. Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos .............................................................................. 55

Gráfico 3 - Volume dos Fígados estimados pelo Princípio de Cavalieri (p= 0, 001*) dos grupos controle do desnutrido, desnutrido, renutrido e controle do renutrido. Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos ............................... 58

Gráfico 4 - Coeficiente de erro dos fígados (à esquerda) e respectivos intervalos de confiança (à direta) estimados para os grupos Controle do Desnutrido (A e B) e Desnutrido (C e D) ................................................ 59

Gráfico 5 - Coeficiente de erro dos fígados (à esquerda) e respectivos intervalos de confiança (à direta) estimados para os grupos Renutridos (E e F) e Controle do Renutrido (G e H) ............................................................. 59

Gráfico 6 - Número total de hepatócitos (p= 0, 055*) dos grupos controle do desnutrido, desnutrido, renutrido e controle do renutrido. Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos .............................................................. 60

Gráfico 7 - Volume médio dos hepatócitos (p= 0, 001*) dos grupos controle do desnutrido, desnutrido, renutrido e controle do renutrido. Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos .............................................................. 61

Gráfico 8 - Hemograma para os grupos CD, D, R e CR. Número de hemácias (A). A diferença entre os grupos para este parâmetro foi altamente significativa (p= 0, 001). Hematócrito (B). A diferença foi estatisticamente significativa (p= 0, 001). Hemoglobina (C). A diferença entre os grupos foi estatisticamente significativa (p= 0, 001). Leucócitos (D). Foi detectada diferença estatística entre os grupos (p= 0, 002). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos ....................... 62

Gráfico 9 - Função hepática para os grupos CD, D, R e CR. Proteína total (A). Albumina (B). Globulina (C). ALT (D). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos ....................................................................................................... 63

Gráfico 10 - Função hepática e glicose para os grupos CD, D, R e CR. FA (A), GGT (B). AST (C). Glicose (D). Foi detectada diferença estatística entre os grupos (p= 0, 038). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos..... 63

Introdução

26

Gomes, SP Introdução

1 INTRODUÇÃO

De acordo com o Fundo das Nações Unidas para a Infância (UNICEF), a

desnutrição infantil é um problema de dimensões alarmantes em boa parte do

mundo. Associada à pobreza e à desigualdade, é um expressivo fator de

mortalidade de crianças nos países em desenvolvimento, apesar dos esforços

realizados nas últimas décadas para reduzir esse índice (UNICEF, 2006).

A desnutrição, segundo a Organização Mundial de Saúde, é um quadro de

carência protéico-calórica, que abrange formas graves de doenças, como o

marasmo (suprimento calórico insuficiente) e o Kwashiorkor (Privação protéica

grave), além de fases e formas moderadas (WHO, 1992).

A desnutrição infantil continua a ser um dos problemas mais importantes da

saúde pública do mundo atual, devido a sua magnitude e conseqüências

desastrosas para o crescimento (MONTE, 2000). A OMS estima que mais de 20

milhões de crianças nasça com baixo peso a cada ano, cerca de 150 milhões de

crianças com menos de 5 anos têm baixo peso para sua idade (ACC/SCN, 2000).

A desnutrição protéico-calórica é um dos maiores problemas de saúde pública

no mundo, representando nas nações subdesenvolvidas cerca de 40% das causas

dos pacientes hospitalizados. Considerando que o processo normal metabólico

precisa de proteínas, acredita-se que todos os tecidos serão afetados por um estado

precário de nutrição protéica embora não apresentem o mesmo grau e severidade

de modificação (SANT’ANA et al., 1997).

Em países industrializados também são descritos casos de desnutrição,

porém com maior acometimento de idosos (REDMOND et al., 1991b,c).

A desnutrição protéico-calórica acomete desde crianças provenientes de

comunidades carentes, até pacientes idosos, potencializando processos infecciosos

e aumentando o número de óbitos (CHANDRA, 1999).

A desnutrição protéico-energética é de longa data, considerada um problema

social, sendo inclusive apontada como um marcador de pobreza (ISSLER et al.,

1996), medida também através de habitações precárias, baixos salários,

analfabetismo, desemprego ou empregos mal remunerados (AZEREDO et al.,

1999).

27

Gomes, SP Introdução

A desnutrição no início da vida pode afetar profundamente o corpo e o

cérebro de ratos adultos. Alguns desses efeitos são permanentes enquanto outros

desaparecem quando os animais são submetidos ao processo de renutrição

(YUCEL; WARREN; GUMUSBURUN, 1994).

É sabido que o tamanho do fígado é influenciado pelo estado nutricional.

Sendo assim, outra maneira de interferir na regeneração hepática fundamenta-se no

fato de que os processos proliferativos do fígado podem ser modulados por fatores

alimentares. Experimentos de desnutrição protéico-energética mostraram que o

fígado de ratos desnutridos regenera-se mais lentamente após a hepatectomia

parcial (DOYLE; WILSON; HARTROFT, 1968).

Seu peso (órgão) em animais desnutridos chega a reduzir-se em 27%, por

hipoplasia e atrofia do mesmo (PARRA et al., 1995).

O fígado é um órgão-alvo na terapia gênica por ser uma região de muitas

alterações metabólicas. Ultimamente a transferência de genes estáveis aos

hepatócitos pode compensar deficiências que afetam suas funções (MACHADO et

al., 2002).

Analisando a literatura especializada verifica-se que embora os autores

mencionados acima, realizando experimentos em animais submetidos à desnutrição,

têm demonstrado algumas preocupações com a incidência desta condição durante o

período de gestação e lactação, mencionando seus efeitos na glândula hepática.

Constata-se uma carência principalmente de publicações enfocando os efeitos da

desnutrição, principalmente no que tange aos seus aspectos morfoquantitativos.

Desta forma o estudo da estrutura hepática de camundongos, sob os

aspectos quantitativos, estereológicos e morfométricos, durante estados de

desnutrição e renutrição protéica será fundamental apara aferir objetivamente (e não

empiricamente) os possíveis danos ocasionados pela mesma no fígado.

Ainda, o conhecimento destas informações quantitativas pode ser útil no

entendimento da patogênese hipoprotéica hepática e conseqüentemente no seu

tratamento, melhorando a qualidade de vida de pacientes animais e humanos.

Objetivos

29

Gomes, SP Objetivos

2 OBJETIVOS

Os objetivos foram divididos em: objetivo principal e objetivos secundários.

2.1 OBJETIVO PRINCIPAL

O objetivo deste estudo foi descrever os efeitos de uma dieta hipoprotéica

assim como da renutrição na microestrutura do fígado de camundongos.

2.1.1 Estudo qualitatitvo

Caracterização morfológica do fígado

2.1.2 Estudo histoquantitativo (Estereológico)

Volume do fígado (Vref)

Coeficiente de erro do volume do fígado (CE)

Intervalo de confiança para o volume do fígado

Número total de hepatócitos (N)

Volume médio dos hepatócitos ( Nv )

30

Gomes, SP Objetivos

2.2 OBJETIVOS SECUNDÁRIOS

Com o intuito de caracterizar o modelo experimental da desnutrição

hipoprotéica e da renutrição, os seguintes parâmetros foram avaliados:

Hemograma

Avaliações bioquímicas: (1) Proteína total; (2) Albumina; (3)

Globulina; (4) Alamina aminotransferase (ALT); (5) Fosfatase

alcalina (FA); (6) Gama glutamil transpeptidase (GGT); (7)

Aspartato aminotransferase (AST); (8) Glicose.

Revisão sistemática da literatura

32

Gomes, SP Revisão sistemática da literatura

3 REVISÃO SISTEMÁTICA DA LITERATURA

A literatura consultada para embasamento científico mais relevante será

discorrida a seguir:

3.1 ASPECTOS MORFOFUNCIONAIS DO FÍGADO

O fígado é o maior órgão sólido do corpo, constituído aproximadamente de

2% a 5% do peso de um homem adulto. Pode exercer até 100 funções diferentes, a

maioria das quais é exercida pelos hepatócitos (ROUILLER, 1964; GUYTON; HALL,

2002; GARTNER; HIAT, 2003; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).

O fígado é o maior tecido glandular do organismo, situado no quadrante

superior direito da cavidade abdominal, abaixo do diafragma. É um órgão

multifuncional e dentre suas principais funções destacam-se a síntese e a secreção

protéica, a secreção biliar, a regulação dos níveis glicêmicos e a metabolização de

drogas e carboidratos. Seu parênquima é constituído por hepatócitos, que perfazem

cerca de 80% da população celular (MACHADO et al., 2002).

São células altamente diferenciadas e estáveis, ou seja, apesar do baixo

índice mitótico, entram em divisão celular mediante estímulo tanto de natureza física,

quanto infecciosa, como tóxica. A lesão do parênquima hepático induzida por

quaisquer estímulos desencadeia o processo de reparação, que começou ser

elucidado com o advento da biologia molecular, cujas técnicas permitem maiores

esclarecimentos dos eventos que promovem e controlam a divisão celular, tão

importantes no prognóstico e patogênese das mais freqüentes doenças do órgão

como hepatite, cirrose e hepatomas (MACHADO et al., 2002).

A organização funcional do fígado reflete em extraordinárias funções. A maior

função do fígado envolve a degradação de aminoácidos, carboidratos, lipídios, e

vitaminas e seu subseqüente estoque, conversão metabólica, e liberação para o

sangue e bile. A bile desempenha um importante papel na digestão de lipídeos.

Todavia, muitas das funções do fígado estão inter-relacionadas, o que se torna

particularmente evidente quando surge anormalidade do fígado, visto que muitas de

33


suas funções são afetadas simultaneamente (ROUILLER, 1964; GUYTON; HALL,

2002; GARTNER; HIAT, 2003; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).

A anatomia macroscópica do fígado divide o órgão em lobos, delimitados por

sulcos ou fissuras, elementos anatômicos facilmente identificáveis na superfície da

glândula. (ROUILLER, 1964; GUYTON; HALL, 2002; GARTNER; HIAT, 2003;

JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).

O fígado possui funções específicas, está interposto entre o trato digestivo (e

o baço) e o resto do corpo. Por essa interposição, o fígado é provido com um

suplemento duplo, pois ele recebe sangue da veia porta e da artéria hepática. A

principal função deste órgão é envolver eficientemente a captação de aminoácidos,

carboidratos, lipídeos e vitaminas, assim também fazendo seu armazenamento,

conversão metabólica e liberação no sangue e bile (BERK; POTHER; STREMME,

1987).

O fígado também faz a biotransformação hepática, que converte substâncias

hidrofóbicas insolúveis em água, que podem ser excretadas pela urina e bile (BERK;

POTHER; STREMME, 1987).

E por causa das funções metabólicas e secreção no sangue, o fígado é

considerado uma glândula endócrina. Ao mesmo tempo, a produção de bile e

secreção o faz também ser descrito como uma glândula exócrina (POPPER, 1988).

Histologicamente, o lóbulo hepático apresenta forma hexagonal, com uma

veia centro-lobular e com as tríades portais nas extremidades desse hexágono

imaginário. As colunas de hepatócitos dispõem-se lado a lado, a partir da veia

central e entre elas estão situados os sinusóides hepáticos, que transportam o

sangue que chega pelos ramos da veia porta e da artéria hepática e os chamados

espaços de Disse. Há ainda os canalículos biliares que transportam a bile até os

ductos biliares, nos espaços porta (GERBER; THUNG, 1983).

As células que compõe o fígado, hepatócitos, derivam do epitélio do intestino

primitivo (ALBERTS et al., 2004). São poliédricas, com seis ou mais superfícies,

variam de 12 a 25 μm de diâmetro. Contêm um e às vezes dois núcleos

arredondados que apresenta em seu interior uma rede e um ou dois nucléolos

refringentes. Alguns núcleos são poliplóides, contendo múltiplos do número haplóide

de cromossomos. Núcleos poliplóides são caracterizados pelo seu tamanho maior,

que é proporcional a ploidia (GOSS, 1988; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).

34


Aproximadamente 75% de sangue hepático vêm diretamente das vísceras

gastrointestinais e baço através da veia de porta. O sangue proveniente do sistema

porta traz drogas absorvidas diretamente pelo intestino para o fígado em forma

concentrada. Os hepatócitos são responsáveis pela síntese, pela degradação e pelo

armazenamento de um imenso número de substâncias, enzimas droga-

metabolizantes tem papel de desintoxicar muitos compostos, mas ativa a toxicidade

de outros (JAESCHKE; GORES; CDDERBAUM et al., 2002; ALBERTS; JOHNSON;

LEWIS et al., 2004).

Weibel et al. (1969) descreveram os dados morfométricos normais em fígado

de ratos. Segundo os autores, estudos pela microscopia de luz demonstraram que

96% do volume hepático dos ratos são constituídos pelo parênquima lobular, isto é,

pelos hepatócitos, sinusóides, espaços de Disse e capilares biliares, enquanto os

4% restantes constituem o parênquima não lobular, ou seja, espaços portais, veias

centro-lobulares e ramos da veia hepática.

O fígado possui outras funções não relacionadas com a digestão, como por

exemplo, a hematopoiese, a coagulação sanguínea, a fagocitose e a desintoxicação

(GUYTON; HALL, 2002).

Todas as células hepáticas (hepatócitos, células endoteliais, de Kupffer, de Ito

e ductais) proliferam para substituir a perda de tecido hepático. No entanto, os

hepatócitos são os primeiros a proliferar, sendo que as maiorias dos estudos

focalizam estas células por elas constituírem cerca de 90% da massa hepática e

60% do número total de células (RAMALHO et al., 1993; DIHEL; RAI, 1996;

MICHALOPOULUS; DEFRANCES, 1997).

Sendo o fígado o maior órgão sólido do corpo humano, o mesmo é constituído

por aproximadamente 2 a 5% do peso corpóreo em adultos e 5% nos recém-

nascidos. A anatomia do fígado em humanos constitui-se por dois lobos principais

(direito e esquerdo) e dois acessórios (quadrado e caudado). Já o fígado de ratos e

camundongos possui lobo lateral esquerdo, lateral direito, medial direito, medial

esquerdo, dois processos papilares e o processo caudado, e sendo assim em

camundongos há a presença da vesícula biliar. Os três últimos são considerados

lobos caudados. Entretanto, hoje os médicos gastroenterologistas dão mais enfoque

a anatomia vascular funcional do fígado (BISMUTH, 1988).

No histológico do fígado, podemos observar que o fígado é um órgão

multicelular, composto de hepatócitos e outras populações de células não

35


parênquimais. Além de três subpopulações de células sinusóides bem conhecidas

(células de Kupffer, células endoteliais e células estreladas hepáticas), existem

também células epiteliais dos ductos biliares e células mesoteliais da cápsula de

Glisson (GRISHAM, 1980, 1983).

No lóbulo, as células hepáticas dispõem-se em placas orientadas

radicalmente. Cada placa é constituída por células dispostas em uma só camada.

Essas placas são perfuradas e, freqüentemente, anastomosam-se, resultando num

labirinto complexo, que dá ao lóbulo um aspecto esponjoso. O espaço entre as

placas hepatocitárias é ocupado por capilares sinusóides, denominadas sinusóides

hepáticas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999).

3.2 ASPECTOS NUTRICIONAIS

A desnutrição no início da vida pode afetar profundamente o corpo e o

cérebro de ratos. Alguns desses efeitos são permanentes enquanto outros

desaparecem durante o período de reabilitação nutricional (YUCEL; WARREN;

GUMUSBURUN, 1994).

A subnutrição de ratos durante o início da vida é conhecida como causadora

de déficits permanentes no número total de células cerebrais determinados por

arranjos bioquímicos do conteúdo do DNA cerebral. Se isso é devido a uma perda

de neurônios ou uma falha de proliferação de células gliais permanece incerto a

partir dessas medidas bioquímicas (BEDI, 1991).

Pesquisas em animais revelaram que uma nutrição inadequada no período

pré-parto, como por exemplo, uma restrição severa de comida para a mãe, redução

severa do conteúdo em proteína da dieta da mãe, conduz a deficiências nutricionais

a um aumento de liberação de noradrenalina no cérebro de animais (ZANIN et al.,

2003).

O estado nutricional é determinado por um balanço entre o suprimento de

nutrientes e a utilização destes pelo organismo. A desnutrição está relacionada com

o desequilíbrio do estado nutricional e ocorre sob diversas formas, podendo ter

conseqüências reversíveis ou irreversíveis. Estudos específicos sobre os efeitos da

desnutrição nos neurônios evidenciaram uma redução de 27% no número de

36


neurônios no intestino delgado de ratos cujas mães sofreram restrição protéica

durante as duas últimas semanas de gestação (ZANIN et al., 2003).

Recentemente desenvolvidos, os métodos estereológicos têm sido usados em

experimentos para examinar os efeitos de dois níveis de renutrição durante o início

da vida pós-natal no número total de células granulares de ratos (BEDI, 1991).

Segundo Castelucci et al. (2002), a privação protéica da mãe durante a

gravidez, e dos recém-nascidos nos primeiros 21 dias reduziu o peso dos filhotes em

aproxidamente 50%.

Pode-se observar que durante o período pré-natal, após o nascimento, após o

desmame, os filhotes foram removidos de suas mães e após 21 dias sob dieta

controlada de proteínas, ou mudado de uma dieta hipoprotéica para uma dieta

normal (grupos renutridos). Os animais renutridos apresentaram um peso 20% a

baixo do controle (CASTELUCCI et al., 2002).

Segundo Castelucci et al.(2002), em uma análise quantitativa os animais do

grupo controle tiveram pesos corpóreos quase dobrados em relação àqueles

privados de proteínas aos 21 dias após o nascimento.

O peso do corpo dos animais controle foi de aproximadamente 60% maior do

que o grupo subnutrido aos 42 dias, contudo realimentando os ratos subnutridos

entre 21 dias e 42 dias reestabeleceu-se o peso em 20% do normal aos 42 dias

(CASTELUCCI et al., 2002).

De acordo com o protocolo de Castelucci et al. (2002); Brandão et al. (2003);

Gomes et al. (2006); Gomes et al. (2009) foram utilizados em seus experimentos

animais que recebiam uma dieta protéica de 20% de proteína-caseína (animais

nutridos) e um dieta protéica de 5% de proteína-caseína (animais desnutridos), a

partir do primeiro dia de gestação desses animais e após os mesmos seus filhotes

terem nascidos, os mesmo começaram a receber a mesma dieta utilizada pelas

fêmeas gestantes. Os animais por eles utilizados não possuíam os mesmos

parentescos e após seus 21 dias de vida, os filhotes foram escolhidos em cada

grupo sistematicamente aleatórios.

De acordo com Gomes et al. (2009) os animais privados de proteína-caseina

a 5% e os animais que receberam proteína-caseina a 20% tiveram seus pesos

corpóreos com significância e seus volumes altamente significativos em comparação

entre os grupos estudados.

37


As dietas dos ratos continham fibras, misturas de salina equilibrada e vitamina

na mesma quantidade. O grupo controle recebeu uma dieta com 20% de proteína e

o grupo desnutrido uma dieta hipoprotéica purificada de apenas 4% (REEVES;

NIELSEN; FAHEY, 1993). A fonte de proteína utilizada foi à caseína. Com exceção

do teor de proteínas, as duas dietas foram idênticas e isocalóricas. Ratos

alimentados com dieta hipoprotéica consumiram menos alimentos, em comparação

aos ratos do grupo controle, resultando em consumo reduzido de proteínas, perda

de peso corporal e uma diminuição da proteína plasmática, albumina e pré-albumina

(FOCK et al., 2008; VINOLO et al., 2008). O grupo controle recebeu uma dieta

adequada de proteínas e do grupo controle receberam uma dieta deficiente em

proteínas, mas o grupo de desnutridos teve uma ingestão alimentar

significativamente menor e experimentou uma perda de 20,2% em peso do corpo em

um período de 14 dias após a introdução da dieta hipoprotéica (FOCK et al., 2008).

Em uma dieta fazendo uso de suplementos glutamínicos para o grupo de

camundongos nutridos e outra dieta livre de suplementos glutamínicos para o grupo

de camundongos desnutridos, pode-se observar também uma diferença de peso

corpóreo entre os grupos. E em uma renutrição pode-se observar uma reversão do

quadro para o grupo dos animais nutridos (ROGERO et al., 2008).

Em outro experimento feito por Fock et al. (2007), os camundongos do grupo

controle utilizaram uma dieta do grupo controle de 20% de proteína e o grupo

desnutrido de 4% de proteína e pode-se averiguar que os camundongos do grupo

controle para o grupo desnutridos teve uma perda acentuada de 22% de massa

corporal quando comparados ao grupo nutrido, pela baixa porcentagem de proteína

em sua ingestão alimentar e observou-se uma anorexia aparente desses animais.

Walrand et al. (2000), submeteu ratos adultos de a um programa de

restrição alimentar, sendo um grupo de animais submetidos a uma desnutrição com

23% de proteína e 1,6 gramas de caseína e um grupo de animais renutrido com 27%

de proteína e 3,2 gramas de caseína, para poder investigar as alterações da

indução dessa dieta e também observar nos animais renutridos as alterações que

esta dieta causou no metabolismo desses animais. E pode ser observado que o

resultado obteve um P< 0, 005.

De acordo com Cruz-Orive (2005), tem que se haver uma variância geral

entre as fatias obtidas para o uso do Método de Cavalieri. As seções de Cavalieri

38


são amplamente utilizadas em estereologia para estimar as fatias do estudo a ser

realizado.

Considerando o uso do Cavalieri para estimar qualquer outra medida

geométrica, sejam células ou números de partículas. A variação de seus

estimadores corresponde dependendo do seu interesse de estudo. As observações

deste estudo são sistemáticas, portanto dependentes como um todo (CRUZ-ORIVE,

2005). E também foi publicado para contar as seções do Cavalieri por Cruz-Orive e

García-Fiñana (2005); e as fatias do Cavalieri por Cruz-Orive e Geiser (2004).

Segundo Marcos, Monteiro e Rocha (2007), o mesmo salienta que as

estimativas numéricas baseadas em métodos diferentes utilizados nas pesquisas,

devem sempre ser comparados com aqueles baseados em estereologia (quando

disponível). Considerando a natureza imparcial da última geração de métodos

estereológicos, estas estimativas devem ser sempre consideradas como excelência,

para fins de quantificação, ou seja, para apoiar, ou não, as estimativas derivadas de

métodos mais indiretos.

Com o número de hepatócitos obtidos na estereologia, é fundamentalmente

diferente das que são obtidas pela análise de imagem, porque os perfis dos

hepatócitos são simples (não corrigida) e são contadas as seções que aparecem,

enquanto na estereologia faz-se uma contagem de células tridimensional, em sua

proporção real - independentemente do seu tamanho, número, forma ou distribuição

espacial (HOWARD; REED, 2005).

Os dados de uma abordagem estereológica devem ser considerados como

padrão de excelência para os fins práticos, sendo que seus valores provenientes de

outros métodos de contagem ou potencialmente tendenciosos devem ser

comparados entre seus resultados (HOWARD; REED, 2005).

Para Halici et al. (2009), a estereologia utiliza-se dos princípios matemáticos e

é utilizado para avaliar as propriedades imparciais das estruturas existentes no

espaço 3D à partir de seções 2D do microscópio. O método estereológico da

dissecção óptica também pode ser efetivamente usado para estimar o número de

objetos conhecidos em lâminas histológicas. Também pode ser útil para examinar as

mudanças no número de quaisquer objetos de estudo e como um indicador de

eficácia terapêutica ou tratamentos com drogas tóxicas. A mesma teve como

objetivo de estudo estimar a densidade numérica dos hepatócitos para determinar se

esta é afetada pelo tratamento haloperidol em ratos. Neste estudo, foi utilizado o

39


método do “disector óptico” e também para analisar as amostras

histopatologicamente, tanto na microscopia de luz e da microscopia eletrônica.

Uma nova geração de métodos estereológicos vem sendo desenvolvidos

desde 1984, permitindo uma maior precisão: de uma precisa e eficiente estimativa

para a contagem total do número de células (HOWARD; REED, 1998). Por último,

duas abordagens imparciais estão disponíveis: o fracionamento através do

fractionator óptico (WEST; GUNDERSEN, 1991) e da precisão da técnica para o

volume (PAKKENBERG; GUNDERSEN, 1996). O último é uma análise em duas

etapas, envolvendo estimativas separadas e imparciais do volume referência e da

densidade numérica das partículas, e assim através dessas estimativas podemos

achar também o número total de partículas (MARCOS; MONTEIRO; ROCHA, 2004).

Garcia-Fiñana et al. (2002), utiliza-se para a contagem de partículas a técnica

da contagem de pontos baseada no Princípio de Cavalieri. Sendo que esta técnica

requer de seções histológicas planas onde sobre estas seções foi sobreposto um

sistema de pontos.

Em alguns estudos os coeficientes de erros do Princípio de Cavalieri são

estimados de acordo com Gundersen et al., (1999). Já outros coeficientes de erros

do princípio de Cavalieri são estimados de acordo com Garcia-Fiñana et al. (2002),

onde as fórmulas desse coeficiente de erro são baseados em modelos para uma

estrutura de covariância de dados sistemáticos, e eles são apenas aproximações -

em oposição ao projeto de estimadores imparciais. Dados este que indicam que os

coeficientes de erros foram utilizados baseando-se em um melhor parâmetro,

considerando sempre oportuno para verificá-los para uma reamostragem empírica

em um conjunto de dados completos.

Materiais e métodos

41

Gomes, SP Materiais e métodos

4 MATERIAIS E MÉTODOS

Os materiais utilizados e os métodos empregados neste trabalho serão

apresentados em detalhes abaixo.

4.1 MATERIAIS

O seguinte material foi empregado neste estudo:

4.1.1 Animais

O desenvolvimento da presente pesquisa foi realizado de acordo com os

princípios éticos de experimentação animal da Comissão de Ética da Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, sob o protocolo nº

1521/2008.

Foram utilizados até o momento 12 fígados provenientes de Camundongos

Swiss machos, com 90 dias de idade (grupos controle dos desnutridos (CD) e

desnutridos (D)) e 120 dias de idade (grupos renutridos (R) e controle dos renutridos

(CR)) machos. De acordo com o tratamento empregado e o tipo de dieta

disponibilizada, os animais foram divididos em 4 grupos:

a) Controle dos Desnutridos (CD) com 3 animais, tendo peso médio de 51,63

g (Desvio Padrão = 1,8)

b) Desnutridos (D) com 3 animais, tendo peso médio de 24,96 g (Desvio

Padrão = 1,7)

c) Renutridos (R) com 3 animais, tendo peso médio de 45,9 g (Desvio Padrão

= 3,4)

d) Controle dos Renutridos (CR) com 3 animais, tendo peso médio de 64,46 g

(Desvio Padrão = 1,9)

42


Os animais foram provenientes do Departamento de Análises Clínicas do

Biotério da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.

4.2 MÉTODOS

Os seguintes métodos serão empregados neste estudo:

4.2.1 Rações

Os animais receberam ração controle contendo 12% de proteína (Tabela 1,

Ração Controle I) e ração normoprotéica contendo 2% de proteína (Tabela 1, Ração

Hipoprotéica II), sendo que ambas serão preparadas no Laboratório Hematologia da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas/USP na forma granulada e conservada a 4ºC

até o uso. Ambas as rações são isocalóricas e diferem apenas no conteúdo protéico,

sendo que foram preparadas de acordo com as recomendações de 1993 do Instituto

Americano de Nutrição para Camundongos adultos (REEVES; NIELSEN; FAHEY,

1993). A fonte de proteína que será utilizada é a caseína, sendo a concentração

protéica da caseína e das rações determinadas pelo método Micro-Kjeldahl

(INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 1985). O teor de fosfato da mistura salínica que será

utilizada no preparo das rações será corrigido de acordo com a concentração

protéica de cada lote de caseína (controle e hipoprotéica) para se adequar aos

valores normais recomendados (REEVES; NIELSEN; FAHEY, 1993).

43


Tabela 1- Composição Percentual da Ração. Ração controle I e Ração hipoproteíca II.

COMPOSIÇÃO RAÇÃO CONTROLE I

(G/KG RAÇÃO)

RAÇÃO

HIPOPROTÉICA II

(G/KG RAÇÃO)

Proteína 120 20

Sacarose 100 100

Celulose 50 50

Óleo de Soja 40 40

Mistura Salínica1 35 35

Mistura Vitamínica1 10 10

L-Cistina 1,8 0, 257

Bitartarato de Colina 2,5 2,5

Tert-butilhidroquinona 0, 008 0, 008

Amido (q.s.p.) 1000 1000

1 As misturas salínica e vitamínica serão preparadas sob encomenda de acordo com as

recomendações de 1993 do Instituto Americano de Nutrição para camundongos adultos (REEVES, 1993).

4.2.2 Indução da desnutrição

Os animais foram alocados em gaiolas metabólicas individuais e foram

mantidos sob as mesmas condições ambientais, com ciclo de luz de 12h,

temperatura de 2210%, onde passaram por um período de adaptação aos

gaioleiros de 15 a 20 dias. Neste período, todos os animais receberam ração

normoprotéica e água ad libitum e tiveram seu peso avaliado. Após o período de

adaptação, tendo os animais atingido as estabilidades do peso, estes foram

separados em 2 grupos: controle do desnutrido e desnutrido. O grupo desnutrido

passou a receber ração hipoprotéica, enquanto o grupo controle do desnutrido

continuará a receber ração normoprotéica. Durante este período será realizada a

cada 48 horas a pesagem dos animais e o consumo de ração. Este tratamento

permaneceu durante 1 mês, quando então, os animais do grupo desnutrido foram

separados em 2 subgrupos: um foi eutanasiado, enquanto o outro foi submetido ao

processo de renutrição. O grupo controle também foi separado em dois subgrupos:

um deles foi eutanasiado simultaneamente ao grupo desnutrido; o outro continuou a

receber ração controle, acompanhando o grupo renutrido (BORELLI et al, 2007).

44


4.2.3 Recuperação nutricional

O processo de renutrição foi mantido por 30 dias, sendo que ao final deste

período, os animais dos grupos renutridos e controle do renutrido foram

eutanasiados. Durante o período da renutrição, os animais receberam água e ração

ad libitum (BORELLI et al, 2007).

4.2.4 Obtenção de amostras de sangue

As seguintes amostragens são empregadas neste estudo:

4.2.4.1 Sangue total

Amostras de sangue total foram obtidas por punção do plexo axilar de

camundongos previamente anestesiados com xilazina (16 mg/kg de peso corporal) e

cetamina (120 mg/kg de peso corporal), utilizando-se EDTA 10% (sal sódico) como

anticoagulante, na proporção de 50 µL de EDTA para cada 1,0 mL de sangue.

4.2.4.2 Realização do hemograma

Amostras de sangue total obtida de acordo com o descrito no item 4.2.4.1

foram utilizadas para a determinação do Número Total de Hemácias, Hematócrito,

Hemoglobina e Leucócitos. Estas análises foram realizadas no analisador

automático de células sangüíneas ABC Vet (ABX DIAGNOSTICS), o método e as

medições utilizadas foram: impedância, fotometria (BORELLI et al, 2007).

45


4.2.4.3 Análises bioquímicas

Amostras de sangue totais obtidas de acordo com o item 4.2.4.1 foram

utilizado os soros para a determinação dos seguintes parâmetros: proteína total,

albumina, globulina, alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina (FA), gama

glutamil transpeptifase (GGT), aspartato aminotransferase (AST) e glicose. Estas

análises foram realizadas no analisador clínico randômico Metrolab 2300 plus da

Wiener® Lab Group, o método utilizado foi através do colorímetro (SANTOS, 2009).

4.2.5 Estudo histológico

Aos 90 dias os animais do grupo controle do desnutrido e desnutrido foram

eutanasiados com uma sobredose de 100 mg/kg de Ketamina e 10 mg/kg de

Xilazina (DONOVAN; BROWN, 1991; FLECKNELL, 1996) ambas pela via

intramuscular e aos 120 dias os animais do grupo renutrido e controle do renutrido

também foram eutanasiados de acordo com o grupo de animais controle do

desnutrido e desnutrido.

Após a constatação do óbito dos animais, a cavidade torácica foi aberta e

uma cânula inserida dentro do ventrículo esquerdo do coração até atingir a aorta

ascendente. Primeiramente 100 ml de uma solução de lavagem composta de

tampão fosfato salino (PBS) (0.1M, pH7,4) e 2% de heparina foi perfundida.

Posteriormente, foram perfundidos 100 ml de solução fixadora composta por 4%

formoldeído em tampão fosfato de sódio (PSB) (0.1M, pH7,4). A perfusão sistêmica

(via aorta ascendente) foi conduzida utilizando-se uma bomba perfusora digital

(Masterflex) sob um fluxo pulsátil de 8 ml/min. Para promover uma melhor fixação

do fígado, uma perfusão retrógrada foi realizada a partir da aorta abdominal.

Para evidenciação do fígado foi promovida uma celiotomia pré-umbilical e

paracostal de ambos os lados para a retirada da musculatura abdominal (músculo

oblíquo externo, músculo oblíquo interno, músculo transverso abdominal e reto do

abdômen. Uma vez identificado o fígado, este foi retirado sob o microscópico

cirúrgico Leica®

M651 (6-40x).

46


Os fígados foram removidos dos animais e pesados antes que fossem

imersos na mesma solução fixadora e armazenados a temperatura de 4°C durante

uma semana.

Subseqüentemente, o fígado foi verticalizado no seu eixo longo, com a ajuda

do bar rotator “VUR section” (BADDELEY; GUNDERSEN; CRUZ-ORIVE, 1986),

embebidos em uma solução aquosa de ágar (10%) e seccionados exaustiva e

seriadamente em micrótomo de lâmina vibratória (vibrótomo) Leica® (VT 1000S) com

40μm de espessura. As secções foram coradas com Hematoxilina de Mayer por 1

minuto. As secções histológicas foram então desidratadas em concentrações

crescentes de etanol, diafanizadas em xilol e montadas com DPX sobre lâmina e

sob lamínula.

4.2.6 Estudo estereológico

As secções histológicas foram observadas usando o Microscópio Leica® DMR

equipado com câmera digital Olympus DP72 e analisadas usando o software NEW

CAST da Visiopharm Integrator System, versão 3.6.5.0.

4.2.6.1 Estudo morfoquantitativo (estereológico) do fígado

Os seguintes estudos através dos métodos estereológicos serão amostrados

neste estudo:

4.2.6.1.1 Volume do fígado (Vref)

O volume do fígado foi estimado usando-se o Princípio de Cavalieri

(MAYHEW e OLSEN, 1991; HOWARD e REED, 2005).

47


O fígado foi seccionado seriadamente em fatias de 40 µm de espessura.

Sobre estas fatias foi sobreposto um sistema de pontos (a/p= 0.378mm2), no

aumento de 1.0x, com a ajuda do estereomicroscópico Leica®

M165C (0.73 -12x)

(Figura 1).

Em cada fatia foi contado o número de pontos que tocavam o fígado

(parênquima e estroma). Para se estimar o volume do fígado, a partir do princípio de

Cavalieri, foi aplicada a seguinte fórmula (RIBEIRO et al., 2004; MAYHEW E

OLSEN,1991):

V = Σp x a/p x t

Onde:

V: Volume do fígado

∑p: Somatória dos pontos que tocam o fígado

a/p: Área associada a cada ponto do sistema teste

t: Espessura média das secções do fígado

48


Figura 1 - Secção do fígado de animal controle do desnutrido. Sistema de pontos utilizado

para a estimativa do volume do fígado a partir do Princípio de Cavalieri. Escala de barra: 20 cm

4.2.6.1.2 Coeficiente de erro

O coeficiente de erro do Princípio de Cavalieri foi estimado de acordo com a

recente literatura de Gundersen et al. (1999); García-Fiñana (2000); García-Fiñana e

Cruz-Orive (2000a) e García-Fiñana et al. (2002), aplicando a seguinte fórmula:

PnabV )(0724,0ˆ ;

2log2

1ˆ q ;

0ˆ q ;

121)( q ;

2

210

2 )()4)ˆ(3()()ˆ( iPccvcqVce ;

49


QCE

1

22 )(ˆ)

~( ipc PvVce ;

)~

()ˆ()~

( 222 VCEVCEVCE PC .

4.2.6.1.3 Número total de hepatócitos (N)

O número total de hepatócitos do (N) foi estimado multiplicando-se o número

total de partículas contadas pelo inverso das frações amostradas (MAYHEW, 1991)

(Figura 2).

ssfhsfasfQN

1.

1.

1.

Onde:

Q- é o número de partículas contadas pelo método do disector óptico que,

neste caso, são hepatócitos

ssf é a fração da amostragem das secções

asf é a fração das áreas amostradas para contagem

hsf é a fração da espessura do corte efetivamente utilizada para contagem

E para calcular o coeficiente de erro, utilizamos a seguinte fórmula

(PAKKENBERG; GUNDERSEN, 1988):

50


Figura 2 - Fotomicrografia do fígado de um camundongo do grupo controle do desnutrido mostrando a aplicação do disector óptico para estimativa

do número total de hepatócitos. Técnica de coloração: Hematoxilina de Mayer. Escala de barra: 20µm

4.2.6.1.4 Volume médio dos hepatócitos ( Nv )

O volume do fígado foi estimado pelo método do rotator planar. Este método

permite estimar o volume médio e a distribuição volumétrica das partículas

independentemente da sua forma, distribuição ou orientação (VEDEL, JENSEN e

GUNDERSEN, 1993) (Figura 3).

A seguinte fórmula foi utilizada para a estimativa do volume do fígado:

i

2

l. t . i

Nv onde, l2

i é uma distância medida a partir de um ponto fixo

da célula ou fora dela, até uma borda arbitrariamente escolhida na mesma.

51


Figura 3 - Fotomicrografia do fígado de um camundongo do grupo desnutrido mostrando a estimativa do volume médio dos

hepatócitos pelo método rotator planar. Técnica de coloração: Hematoxilina de Mayer. Escala de barra: 20µm

52

Gomes, SP Análise estatística inferencial

5 ANÁLISE ESTATÍSTICA INFERENCIAL

A distribuição de freqüência dos parâmetros estereológicos e bioquímicos

foram analisadas pelo “one-way” ANOVA, realizada por meio do software MINITAB®

16 (2010). Quando diferenças significativas entre grupos foram detectadas (p˂ 0,05),

o teste post-hoc de Tukey foi utilizado para comparações múltiplas.

Os resultados são expressos pela média seguida pelo coeficiente de variação

(CV) calculado pela razão entre o desvio padrão e a média.

Resultados

54

Gomes, SP Resultados

6 RESULTADOS

Os resultados são oriundos de quatros grupos (animais controle do

desnutrido, desnutrido, renutrido e controle do renutrido). Desta forma os métodos

empregados serão relacionados neste capítulo.

6.1 PESO CORPORAL

Os pesos corporais dos animais foram: 51,63 gramas (Desvio Padrão= 1,8),

24,86 gramas (Desvio Padrão= 1,7), 45,90 gramas (Desvio Padrão= 3,4) e 64,46

gramas (Desvio Padrão= 1,9), respectivamente para os grupos CD, D, R e CR.

(Gráfico 1).

O peso corporal dos animais foi maior no CR em relação ao CD, D e R (p=

0,001).

Gráfico 1 - Peso dos animais (p= 0,001*) dos grupos controle do desnutrido,

desnutrido, renutrido e controle do renutrido. Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos

55


6.2 PESO DO FÍGADO

Os pesos dos fígados foram: 3,49 gramas (0,021), 1,21 gramas (0,095), 3,04

gramas (0,068) e 4,16 gramas (0,064), respectivamente para os grupos CD, D, R e

CR. (Figura 4 e Gráfico 2 ).

O peso do fígado dos animais foi maior no CR em relação ao CD, D e R (p= 0,

001).

Figura 4 - Foto macrografia mostrando comparativamente os fígados dos camundongos dos grupos CD, D, R, CR. Escala de barra = 2 cm

Gráfico 2 - Peso dos fígados (p= 0,001*) dos grupos controle do desnutrido, desnutrido, renutrido e controle do renutrido. Os triângulos representam

os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos

56


6.3 MICROESTRUTURA

Histologicamente, o lóbulo hepático apresenta forma hexagonal, com uma

veia centro-lobular e com as tríades portais nas extremidades desse hexágono

imaginário. As colunas de hepatócitos (Figura 5) dispõem-se lado a lado, a partir da

veia central e entre elas estão situados os sinusóides hepáticos, que transportam o

sangue que chega pelos ramos da veia porta e da artéria hepática.

A estrutura do fígado (distribuição dos hepatócitos) não foi modificada nos

grupos avaliados, somente o volume que foi menor nos animais desnutridos e

renutridos.

Podemos observar que o fígado é um órgão multicelular, composto de

hepatócitos e outras populações de células não parênquimas. Além de três

subpopulações de células sinusóides bem conhecidas (células de Kupffer, células

endoteliais e células estreladas hepáticas), existem também células epiteliais dos

ductos biliares e células mesoteliais da cápsula de Glisson.

57


Figura 5 - Fotomicrografia mostrando a microestrutura do fígado de A: Controle do desnutrido, B: Desnutrido, C: Renutrido e D: Controle do renutrido, exibindo perfis dos hepatócitos, onde: Núcleo (a) e Hepatócito (b). Técnica de Coloração: Hematoxilina de Mayer.

Escala de Barra: 20µm

6.4 VOLUME DO FÍGADO (Vref)

O seguinte método para estimar o volume será empregado:

6.4.1 Princípio de cavalieri

O volume do fígado foi estimado sendo que os animais do grupo controle dos

desnutridos apresentaram um volume de 46.52 mm3 (0,023). O grupo dos animais

desnutridos apresentou um volume de 23.57 mm3 (0,040). O grupo dos animais

renutridos apresentou um volume de 38.89 mm3 (0,050). O grupo dos animais

controle dos renutridos apresentou um volume de 52.03 mm3 (0,023) (Gráfico 3).

58


O volume do fígado dos animais foi maior no CR em relação ao CD, D e R (p=

0,001).

Gráfico 3 - Volume dos fígados estimados pelo Princípio de Cavalieri (p= 0,001*) dos grupos controle do desnutrido, desnutrido, renutrido e controle do

renutrido. Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos

6.5 COEFICIENTE DE ERRO DO VOLUME DO FÍGADO (CE)

O coeficiente de erro do volume do fígado e os intervalos de confiança para o

volume do fígado foram estimados sendo que os animais do grupo controle dos

desnutridos apresentaram um coeficiente de erro do volume de 1,15%. O grupo dos

animais desnutridos apresentou um coeficiente de erro do volume de 1,74%. O

grupo dos animais renutridos apresentou um coeficiente de erro do volume de 1,2%.

E o grupo dos animais controle dos renutridos apresentou um coeficiente de erro do

volume de 1,02% (Gráficos 4 e 5).

59


Gráfico 4 - Coeficiente de erro dos fígados (à esquerda) e respectivos intervalos de

confiança (à direta) estimados para os grupos Controle do desnutrido (A e B) e Desnutrido (C e D)

Gráfico 5 - Coeficiente de erro dos fígados (à esquerda) e respectivos intervalos de confiança

(à direta) estimados para os grupos Renutridos (E e F) e Controle do renutrido (G e H)

60


6.6 NÚMERO TOTAL DE HEPATÓCITOS (N)

O número total de hepatócitos foi de 1.1 x 107

(0,086) para o grupo controle

do desnutrido. Tendo seu coeficiente de erro de 8,43%. Sendo que para o grupo

desnutrido o número total foi de 1.6 x 107 (0,094). Tendo seu coeficiente de erro de

6,93%. O número total para o grupo renutrido foi de 2.8 x 107 (0,176). Tendo seu

coeficiente de erro de 7,0%. Enquanto que para o grupo controle do renutrido o

número total foi de 2.2 x 107 (0,514). Tendo seu coeficiente de erro de 7,53%.

O grupo R foi maior em relação ao CD e o D (diferença significativa “border

line”, p= 0, 055) (Gráfico 6).

Gráfico 6 - Número total de hepatócitos (p= 0,055*) dos grupos controle do desnutrido, desnutrido, renutrido e controle do renutrido. Os triângulos

representam os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos

6.7 VOLUME MÉDIO DOS HEPATÓCITOS ( Nv )

O volume médio dos hepatócitos foi de 8.170,13 µm3

(0,094) para o grupo

controle do desnutrido. Sendo que para o grupo desnutrido o volume médio foi de

61


4.505,00 µm3

(0,065). O volume médio para o grupo renutrido foi de 8.020,34 µm3

(0,025). Enquanto que para o grupo controle do renutrido o volume médio foi de

10.017,81 µm3 (0,065).

O volume médio dos hepatócitos nos animais foi maior no CR em relação ao

CD, D e R (p= 0, 001) (Gráfico 7).

Gráfico 7 - Volume médio dos hepatócitos (p= 0,001*) dos grupos controle do desnutrido, desnutrido, renutrido e controle do renutrido. Os triângulos

representam os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos

6.8 AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS

Os resultados das amostras de sangue total encontram-se logo abaixo no

gráfico 6, os valores médios entre os grupos estudados, sendo eles: controle dos

desnutridos, desnutridos, renutridos e controle dos renutridos.

As hemácias, os hematócritos, as hemoglobinas e os leucócitos foram

menores nos animais D em relação ao CD, R e CR (p= 0,001). (Gráfico 8).

62


Gráfico 8 - Hemograma para os grupos CD, D, R e CR. Número de hemácias (A). A

diferença entre os grupos para este parâmetro foi altamente significativa (p= 0,001*). Hematócrito (B). A diferença foi

estatisticamente significativa (p= 0,001*). Hemoglobina (C). A diferença entre os grupos foi estatisticamente significativa (p= 0,001*). Leucócitos (D). Foi detectada diferença estatística entre os grupos (p= 0,002*). Os

triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos

Os resultados das amostras através do soro encontram-se abaixo nos

gráficos 9 e 10, dos grupos: controle dos desnutridos, desnutridos, renutridos e

controle dos renutridos.

A diferença para o número de proteína total para os grupos avaliados não

apresentou diferença significativa (p= 0,44). Para a albumina não houve diferença

entre os grupos avaliados (p= 0,28). Para globulina não foi observada diferença

entre os grupos (p= 0,60). Para ALT também não houve diferença significativa entre

os grupos (p= 0,07). Na FA a diferença foi significativa para os grupos avaliados (p=

0,021). No GGT não houve diferença entre os grupos (p= 0,22). Na AST também

não há diferença entre os grupos (p= 0,59). E finalmente, para a glicose a diferença

também apresentou a significância entre os grupos (p= 0,038).

63


Gráfico 9 - Função hepática para os grupos CD, D, R e CR. Proteína total (A).

Albumina (B). Globulina (C). ALT (D). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos

Gráfico 10 - Função hepática e glicose para os grupos CD, D, R e CR. FA (A), GGT

(B). AST (C). Glicose (D). Os triângulos representam os valores individuais e as barras horizontais mostram as médias dos grupos

Discussão

65

Gomes, SP Discussão

7 DISCUSSÃO

A desnutrição é um problema de saúde pública de grande prevalência em

Países Subdesenvolvidos e tem sido foco de diversos estudos. Assim o objetivo do

presente estudo foi de estudar os efeitos da dieta hipoprotéica e da renutrição no

fígado de camundongos.

Sendo que o principal achado deste trabalho foi de que a renutrição consegue

atenuar às disfunções do fígado em decorrência da desnutrição.

7.1 MODELOS DE DESNUTRIÇÃO PROTÉICA

O que se pode encontrar na literatura, foram publicações relacionadas ao

sistema nervoso entérico em animais submetidos à desnutrição utilizando

quantificação morfométrica para calcular a densidade por área, e com diferentes

protocolos para induzir a desnutrição. E essa desnutrição fez com que houvesse

uma diminuição de 45% no intestino delgado do animal (BRANDÃO et al., 2003).

Muitos modelos usados eram eficientes e os animais no grupo nutridos

pesavam aproximadamente 60% a mais do que os ratos desnutridos, segundo

Castelucci et al. (2002).

Segundo Gomes et al. (2009), a dieta aplicada em seu estudo para a

verificação do pesos dos animais em comparação do grupo nutrido ao grupo

desnutrido chegou a ser de quase 4,63 vezes maior do grupo nutrido para o grupo

desnutrido, vale ressaltar que neste estudo o modelo de desnutrição foi diferente do

aplicado nesta pesquisa, onde Gomes et al. (2009), utilizou o protocolo de

desnutrição pré e pós natal, sendo que o animal nutrido recebia uma dieta protéica

de 20% proteína-caseína e para os desnutridos uma dieta hipoprotéica de 5% de

proteína-caseína.

De acordo com Gomes et al. (2009), através do uso de ferramentas com

design baseado na estereologia, pode-se encontrar resultados mais apurados

utilizando a mesma dieta utilizada por Castelucci et al. (2002).

66


Neste trabalho foi utilizada uma dieta com 2% de proteína oferecida aos

animais do grupo desnutridos e 12% de proteína para o grupo dos animais nutridos.

E pode-se notar que de acordo com as dietas utilizadas por Vinolo et al. (2008), o

estudo atual procurou compensar a ração menor da ingestão fornecida para os

animais desnutridos. E em conseqüência embora os animais ingerissem uma

quantidade mais baixa de alimentos, a dieta que foi preparada obteve os nutrientes

mínimos para os ratos adultos, com a exceção da porcentagem da proteína. E o

mesmo pode concluir que as diferenças observadas entre os grupos experimentais e

dos controles são predominantes por conta da redução da entrada de energia

ingerida pelos mesmos. Nesta dieta Vinolo et al. (2008), fez uso de uma dieta

contendo 20% de proteína para o grupo controle e 4% para o grupo desnutridos.

Segundo Nunes et al. (2002), os resultados obtidos em seu estudo

demonstraram que o paradigma de desnutrição aplicado é efetivo, pois

precocemente já é possível detectar diferença significativa de peso entre os animais

do grupo nutrido e desnutrido. O paradigma proposto, restrição de acesso ao

alimento, assemelha-se ao processo de desnutrição que ocorre em famílias

carentes, no qual a ingesta é inadequada, entre outras razões, pela não

disponibilidade de alimentos. Os possíveis efeitos do stress nos filhotes, pela

separação da mãe, foram minimizados pelo controle de condições ambientais

adequadas, entretanto esse efeito certamente pode ser extrapolável à condição da

desnutrição humana. Pode também ganho de peso constante durante a reabilitação

nutricional, entretanto os ratos do grupo desnutrido permaneciam com peso

significativamente inferior aos do grupo controle.

O uso de uma dieta para animais desnutridos com 23% de proteína e 27%

para o grupo de animais nutridos e o efeito da duração dessa dieta por 6 semanas

fez com que os animais neste estudo proposto pode ser observado que o resultado

obteve um P< 0,005 (WALRAND et al., 2000).

Em outro experimento feito por Fock et al. (2007), os camundongos do grupo

controle utilizaram uma dieta do grupo controle de 20% de proteína e o grupo

desnutrido de 4% de proteína e pode-se averiguar que os camundongos do grupo

controle para o grupo desnutridos teve uma perda de 22% de massa corporal

quando comparados ao grupo nutrido, pela baixa porcentagem de proteína em sua

ingestão alimentar e pode-se observar uma anorexia aparente desses animais.

67


E neste estudo proposto, podemos observar que tanto os pesos dos animais

e o peso dos fígados foram altamente significativos (vide resultados), dessa maneira

a dieta proposta de 2% de proteína para o grupo desnutrido e 12% para o grupo

controle está de acordo também com os trabalhos publicados por autores

supracitados a cima. Onde o peso corporal dos animais nutridos para os desnutridos

foram aproximadamente 2 vezes maior, e em comparação ao nutrido com o

renutrido foi aproximadamente de 1,14 vezes maior. E o peso do fígado dos animais

nutridos para os desnutridos foram aproximadamente 2,88 vezes maior, e em

comparação ao renutrido foi de aproximadamente 1,14 vezes maior.

O estado nutricional é determinado por um balanço entre o suprimento de

nutrientes e a utilização destes pelo organismo. A desnutrição está relacionada com

o desequilíbrio do estado nutricional e ocorre sob diversas formas, podendo ter

conseqüências reversíveis ou irreversíveis (ZANIN et al., 2003).

7.2 VOLUME DO FÍGADO (Vref)

O volume do fígado apresentou-se 49,3% menor nos animais desnutridos em

relação aos animais nutridos. E 16,4% menor em comparação aos animais

renutridos para os nutridos, atenuando a atrofia observada nos animais desnutridos.

Segundo Zanin et al. (2003), uma nutrição inadequada no período pré-parto,

com uma restrição severa de proteína para a mãe, conduz com a deficiências

nutricionais irreversíveis. Sendo assim, neste caso, o volume do fígado, é menos

tanto nos animais desnutridos e renutridos em relação ao que obteve uma dieta rica

em proteínas (animais controles).

Segundo Castelucci et al. (2002), em uma análise quantitativa os animais do

grupo normalmente alimentados tiveram pesos corpóreos quase dobrados em

relação àqueles privados de proteínas aos 21 dias após o nascimento.

Para avaliar o volume do fígado neste estudo foi usado o Princípio de

Cavalieri, que segundo Duran et al. (2007) também usou para poder avaliar o

volume do lobo direito do fígado para uma contagem baseada na técnica de pontos.

Mesmo que o Método de Cavalieri demande um maior tempo para a sua

execução, como foi realizado neste estudo, ele tem sido reportado como sendo um

68


método eficiente e acurado (GUNDERSEN; JENSEN, 1987; GUNDERSEN et al.,

1988; GRAVES; DOMMETT, 2000; VAN VRÉ et al., 2007) e neste trabalho em

particular obtivemos o volume do fígado feito no órgão todo. E podemos perceber

que houve uma diferença estatística entre os quatros grupos analisados e estudados

tamanha acurácia do método.

7.3 NÚMERO TOTAL DE HEPATÓCITOS (N)

Pudemos observar que a variabilidade entre os grupos foi pequena, o que nos

permitiu encontrar diferenças para os parâmetros estereológicos, e para o número

total de hepatócitos tivemos do que se chama de “border line”, onde a variabilidade

nos grupos R e CR estava um pouco mais alta e obtivemos p= 0,055.

E por estes motivos esperaremos que com a inclusão de mais dois animais

em cada grupo para o artigo científico possa possivelmente detectar um p< 0,05

para o número total de hepatócitos.

Segundo Odaci et al. (2009), para quantificar o número de hepatócitos foi

utilizado em seu estudo o método disector óptico para estimar tanto o número total

e densidade numérica dos hepatócitos nos fígados de ratos (GUNDERSEN et al.,

1988). Hepatócitos foram contados de acordo com as regras imparciais na apuração

dos disector óptico (HOWARD; REED, 1998). Foram utilizados frações para a

realização destes procedimentos para análise estereológica sendo que foram

aplicados vários estágios para uma subamostragem. Para cada efeito, uma

amostragem. O nosso experimento também baseou-se neste mesmo método para

que a acurácia do método utilizado nos números totais fossem mais próximo com o

número real do órgão.

Segundo Odaci et al. (2009), a densidade média numérica e o número total de

hepatócitos foram calculados para ambos os grupos experimenais e o grupo

controle, sendo que nos resultados encontrou uma diferença significativa apenas no

número total de hepatócitos.

Nos resultados obtidos por Odaci et al. (2009), encontrou-se um total de

hepatócitos de 1,57 x 106, e na nossa pesquisa encontramos para o número total

69


uma média de 1,1 x 107 para os animais controle do desnutrido de 90 Dias e para os

animais controle do renutrido um total médio de 2,2 x 107.

Sendo que neste experimento foi utlizado camundongos Swiss. E no

experimento do Odair et al., (2009) foram utilizados ratos Wistar.

No experimento feito Por Karbalay-Doust et al. (2008), foi utlizado o método

disector óptico (Howard et al., 1998) para estimar o número total de núcleos dos

hepatócitos, sendo que no estudo feito foi utilizado o rato controle quando

comparado ao animal tratado, obteve um aumento de 20%. Obtendo assim um

resultado para o número total no valor de 5.3 x 108. Ocasionado por uma hiperplasia.

E neste caso tivemos um aumento de 35,51% quando comparado o grupo controle

do grupo tratado.

Segundo o estudo desenvolvido por Marcos et al. (2006) foi utilizado para

estimar o número total de hepatócitos igualmente utilizado em nosso estudo da

amostragem sistemática e uniformemente aleatória, espera-se que a contagem

atinja todas as áeras dos cortes durante o experimento, para que não haja nenhum

desvio do material e não dê erro na estimativa final do número total.

O material, neste caso o fígado, utilizado no experimento de Marcos et al.

(2006), os materiais foram emblocados em parafina, já em nosso experimento o

fígado foi embebido em ágar, para que não houvesse uma retração final que

pudesse comprometer o resultado final do número total de hepatócitos.

Carthew et al. (1998) obteve um achado de 20% no animal controle e estimou

uma médio para o número total de 1,52 x 109. As diferenças em relação ao número

total que fora obtidas poderia ser atribuída à cepa de ratos diferentes e também pela

abordagem técnica e pelo plano de amostragem.

Todas as amostras por ele prevista para a obtenção de uma estimativa do

número total o seu coeficiênte de erro deu inferior a 10% (SCHMITZ et al., 2000). No

caso do nosso do estudo, obtivemos um coeficiênte de menos que 10%.

Recentemente desenvolvidos, os métodos estereológicos têm sido usados em

experimentos para examinar os efeitos de dois níveis de subnutrição durante o início

da vida pós-natal no nímero total de células de ratos (BEDI, 1991).

Os resultados obtidos no trabalho são provenientes de apenas três animais

por grupo. Embora não seja considerado um número suficiente para estatística

clássica, na estereologia a eficiência dos métodos de amostragem (SURS)

(GUNDERSEN et al., 1999) que são aplicados nos variados níveis hierárquicos do

70


volume do fígado, nos permite gerar dados com grau de confiabilidade e precisão

mesmo que ainda se tenha um número pequeno de indivíduos analisados por grupo

(CD, D,R e CR).

7.4 VOLUME MÉDIO DOS HEPATÓCITOS ( Nv )

Os hepatócitos dos animais desnutridos tiveram uma diminuição de 44,86%

em relação ao seu controle e no caso dos animais renutridos ao se controle teve

uma diminuição de 19,93%, atenuando a atrofia observada nos animais desnutridos.

No trabalho realizado por Karbalay-Doust (2008), também foi realizado o

método do nucleador, um estimador eficiente de volume no número de partículas

médio ponderadas, a seleção de células de acordo com sua densidade numérica.

Em nosso estudo também calculamos o volume médio só que usando o método do

rotatorA média do volume encontrada por Karbalay-Doust. (2008), foi de 5.30 µm

3,

sendo que nos camundongos de nosso experimento encontrou-se um volume médio

de 8.1 µm3, obtendo um aumento significante em relação ao grupo dos animais

acometidos.

Segundo Jack et al. (1990), o método nucleador, uma nova abordagem

estereológica, forneceu uma estimativa eficiente, imparcial do volume celular médio

de lesões focais e áreas extrafocal. Ele também forneceu uma amostra imparcial das

células para estimar o volume nuclear do hepatócito e da porcentagem de células

binucleadas. Os resultados mostraram um aumento no volume médio de células

mononucleares de 4700 µm3, demonstrando o efeito hipertrófico. Medições de

volume nuclear dos hepatócitos mononucleares e binucleadas foram utilizados para

avaliar a aploidia.

Já neste trabalho realizado usando o “one-way” ANOVA, usando o software

MINITAB® 16, obtivemos diferenças altamente significantes.

Uma vez que métodos estereológicos são utilizados para estimar volumes de

partículas sem assumir forma, tamanho, orientação ou distribuição das células

(GUNDERSEN et al., 1988). E o volume médio se revela muito mais acurado do que

71


a estimativa de tamanho baseado simplesmente em uma área seccional (TANDRUP,

2004).

7.5 AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS

Uma vez que a desnutrição afeta preferencialmente tecidos com alta taxa de

proliferação, o comprometimento da hemopoese nessas condições tem sido descrito

por diversos estudos (BORELLI; MARIANO; BOROJEVIC, 1995; BARON, 1997,

BORELLI et al., 2007). Como conseqüência, indivíduos desnutridos apresentam

tanto anemia (redução do número de hemácias, volume hematócrito e concentração

de hemoglobina), como leucopenia (IDOHOU-DOSSOU et al., 2003; BACHOU et al.,

2006), sendo o quadro hematológico um importante fator indicativo de desnutrição

(BACHOU et al., 2006). A presença de anemia e leucopenia nos animais desnutridos

reflete o comprometimento do tecido hemopoético frente à desnutrição. Uma análise

maior dos leucócitos presentes no sangue desses animais mostra que a leucopenia

encontrada é, principalmente, à custa de neutropenia e linfocitopenia.

Neste estudo, o que se pode notar foi que, todos os grupos, comparados ao

controle do desnutrido, apresentaram elevação da ALT, fato este que pode

evidenciar as alterações funcionais do fígado levada pela desnutrição utilizada neste

trabalho. Os índices dos animais do grupo desnutrido foram elevados, o que poderia

indicar um processo inflamatório mais intenso, esperado nos animais deste grupo

(COUTINHO, 2004).

Em relação à AST houve mais que o dobro da ALT, o que poderia exprimir

uma maior gravidade e profundidade da lesão. Essa elevação simultânea de AST e

FA no grupo controle desnutrido e renutrido leva-se a suposição de que há um

processo de colestase, sendo que o mesmo foi causado pela tensão contínua e

compressão focal nos ductos, que foram bem mais acentuadas (BARRETO, 1971).

Níveis altos de FA, como podem observar neste trabalho, mesmo no controle

do desnutrido e no controle do renutrido, tem sido encontradas nos resultados do

Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

(USP, 2004).

72


A concentração sérica das aminotransferases informa o grau de

comprometimento hepático, uma vez que a sua liberação no soro pode significar

morte celular.

As concentrações sérica de ALT é bem mais indicada para a avaliação da

integridade celular do fígado que a AST (AWADALLA et al, 1975). As alterações de

FA relaciona-se diretamente à obstrução biliar de causas intra e extra hepáticas, ou

uma lesão hepatocelular (LIMA et al., 2001).

Sabe-se que a desnutrição causa uma deterioração das funções hepáticas,

com alterações sorológicas relacionadas à ALT, AST e FA (ONYENEKE et al, 2003).

A hipoalbuminemia ocorreu apenas em função da desnutrição, uma vez que

essa alteração protéica não alterou a função hepática.

Enfim, podemos observar que a desnutrição pode interferir nos níveis e nos

fatores das funções hepáticas, porém, pode-se notar que essas alterações das

funções hepáticas foi muito mais importante quando mostrou-se que na renutrição

os índices continuam afetados.

De modo geral, os resultados deste trabalho indicam comprometimento dos

setores granulocítico, linfóide e eritróide, que pode decorrer não só da ausência de

proteínas, como também de alterações nos fatores que controlam a proliferação, a

diferenciação e a liberação das células do compartimento central para o

compartimento periférico, bem como dos fatores que regulam a saída destas células

do compartimento periférico para o compartimento extravascular (no caso dos

leucócitos) (BORELLI; MARIANO; BOROJEVIC, 1995; VITURI et al., 2000).

Com relação ao comportamento hematológico dos animais desnutridos,

observou-se uma diminuição significante do número de hemácias, da concentração

de hemoglobina e do volume hematócrito, bem como do número de leucócitos,

linfócitos e neutrófilos segmentados em relação aos animais desnutridos CD, R e

CR.

Esses resultados indicam reversão das alterações hematológicas encontradas

na desnutrição após retorno à ração normoprotéica. Os resultados obtidos para os

animais do grupo renutrido estão de acordo com achados na literatura e indicam que

o retorno à alimentação adequada tende a normalizar os parâmetros hematológicos

(WALRAND et al., 2000; VÁSQUEZ-GARIBAY et al., 2002; DEWAN et al., 2009),

sendo novamente o hemograma usado como indicativo do estado nutricional.

Conclusões

74

Gomes, SP Conclusões

8 CONCLUSÕES

Com base nos métodos empregados e nos resultados obtidos, podemos

concluir que os animais desnutridos apresentaram uma alteração no fígado com

uma redução em seu volume (atrofia), bem como uma perda do número total de

hepatócitos e uma atrofia dos mesmos. Nos renutridos houve atenuação da atrofia

do volume do fígado e no tamanho dos hepatócitos. Esta reversão foi de 83,6%.

Será que se esta renutrição perdurasse por mais um ou dois meses essa atenuação

seria de 100% ?

Referências

76

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silvio pires gomes - usp€¦ · até tocar o céu se crer... acredite que nenhum de nós já...

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