serial analysis of gene expression (sage) greice andreotti de molfetta, phd

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  • Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) Greice Andreotti De Molfetta, PhD
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  • SAGE Vantagens: Sistema aberto todos os transcritos podem ser identificados; Acuracia na deteco dos transcritos; Banco de dados digital; Informao quantitativa e qualitativa; Desvantagens: Caracterizao de novos transcritos computacionalmente complicada a partir de sequencias pequenas (tags); Especificidade da Tag (aumentou para 21 bp); Existncia de transcritos que no contem o stio da enzima NlaIII; Sensitividade baixa da detecao de variantes de splicing alternativo;
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  • TAGS TAGS ou ETIQUETAS: Seqncias pequenas mas exclusivas de um determinado gene. NO SE REPETEM EM OUTROS GENES AAAAAAAAA CATG AAAAAAAAA 10 pares de bases Banco de dados grande e validado
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  • TAGS TAGS de 10 pb - identificam unicamente um transcrito; TAGS ligados uns aos outros facilitam clonagem e seqenciamento de todos os transcritos da amostra; Anlise: os tags so separados e identificados atravs de seus stios de reconhecimento CATG; Velculescu et al, 1995
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  • SAGE e Tags Baseando-se na existncia das tags e na sua identificao: Anlise em srie ( Grande escala): Anlise em srie ( Grande escala): Identificao de um nmero maior de genes Identificao de um nmero maior de genes Transcriptoma completo de um organismo Transcriptoma completo de um organismo Custo e tempo menores Custo e tempo menores Quantificao da expresso gnica (contagem dos tags) Quantificao da expresso gnica (contagem dos tags)
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  • DITAGS Localizado entre as sequncias CATG Ditags apresentam 20-26 pb entre cada sequencia CATG Descartar os ditags duplicados - incluindo aqueles da fita reversa da PCR Descartar as sequnicas linker Contabilizar a ocorrencia de cada tag
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  • Como um resultado de SAGE?
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  • SAGE 1- Obteno do RNAm (poli-A); 2- Sntese do cDNA com o uso de oligo (dt) biotinilado; 3- Ligao do cDNA (cauda poliA) partculas magnticas revestidas com Streptavidina; 4- Clivagem com uma enzima de ancoragem (NlaIII) que reconhea 4 pb (CATG); 5- Ligao de adaptadores (contendo um stio de reconhecimento para a enzima de etiquetagem, e stios para os primers A e B) aos cDNAs; 6- Clivagem com a enzima de etiquetagem (TE) (BsmF1), uma enzima do tipo 2 que reconhece o stio do Adaptador (adjacente ao cDNA) clivando aproximadamente 14 pares de bases adiante, liberando um tag especfico para o cDNA; 7- Ligao dos tags para formao de ditags; 8- Amplificao dos ditags por PCR com os primers A e B; 9- Isolamento dos ditags utilizando a enzima de ancoragem para retirada dos adaptadores; 10- Recuperao dos ditags; 11- Formao dos concatmeros pela ligao dos ditags; 12- Clonagem e seqenciamento dos concatmeros, que formam a biblioteca de SAGE.
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  • SAGE Esquema da abordagem experimental adotada pela tcnica de SAGE (figura obtida do protocolo original, disponvel em www.sagenet.org).www.sagenet.org
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  • 1 2 3 28 S 18 S 4 S SAGE Extrao RNA :
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  • Sntese da dupla fita. A) Representao esquemtica da sntese da dupla fita de cDNA; B) RT-PCR: linhas 1 e 2 so amplificaes com, GAPD da amostra linhagem granuloctica (1) e amostra da linhagem ertitrocitria (2); linhas 3 e 4 so amplificaes com EEF1A1 da amostra linhagem granuloctica (3) e amostra da linhagem eritrocitria. SAGE
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  • Digesto com a enzima Nla III. Representao esquemtica da digesto em seguida da captura da regio de interesse. B) PCR usando primers especficos para GAPDH (linha 2) e EEF1A1 (linha 4). Aps a digesto, um stio de ligao do primer GAPDH perdido (linha 3), enquanto os stios para EEF1A1 continuam intactos (linha 5). SAGE
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  • Ligao do adaptador nos pools A (linhagem granuloctica) e B (linhagem eritride). A) representao esquemtica da ligao. B) PCR usando primers especficos de cada adaptador e para o gene EEF1A1. As linhas 1 e 3 correspondem ao produto de PCR com o conjunto de primers correto, DTP-1 com o pool A e DTP-2 com o pool B. As linhas 2 e 4 correspondem ao produto de PCR com o conjunto de primers trocados SAGE
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  • Formao dos tags. A) representao esquemtica da clivagem com BsmFI. B) Produto da amplificao para verificar a eficincia da digesto. Linhas 1 e 3, e linhas 2 e 4 representam amplificao do pool A e B antes e depois da digesto, respectivamente. SAGE
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  • Ligao e expanso dos ditags. A) Representao esquemtica. B) Amplificao dos ditags nas diluies 1:20 (1), 1:40 (2), 1:80 (3); controle positivo (4), controle negativo sem ligase (5) e branco (6). C) Produtos precipitados da amplificao em grande escala com a diluio 1:120. SAGE
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  • Digesto e purificao dos ditags. A) Representao esquemtica da digesto com NlaIII para liberao dos ditags. B) Gel de poliacrilamida com os fragmentos resultantes da digesto enzimtica. O fragmento de 26 pb foi purificado para a formao dos concatmeros. SAGE
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  • Ligao dos ditags e formao dos concatmeros. A) Representao esquemtica. B) Gel de poliacrilamida com o perfil de fragmentos de concatmeros; o marcador utilizado para orientar no isolamento dos fragmentos a serem clonados. SAGE
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  • Est. VermelhoNormal Est. Branco 10.633 2.191 9.230 2.0402.224 15.809 4.234 SAGE total de tags sequenciadas: 60.000
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  • Genes + expressos estmulo branco