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SEQSEQÜÜENCIAMENTO DE DNA:ENCIAMENTO DE DNA:MMÉÉTODOS E PRINCTODOS E PRINCÍÍPIOSPIOS

Cristiane Kioko Shimabukuro Dias

Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Departamento de Morfologia

Instituto de Biociências – UNESP – Botucatu (SP)

Pós-doutorado - FAPESP

E-mail: [email protected]

Seqüenciamento de DNA

DEFINIDEFINIÇÇÃOÃO

Determinar a seqüência de nucleotídeos

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HISTHISTÓÓRICORICO

1953 - Watson e Crick

Modelo dupla hélice do DNA



HISTHISTÓÓRICORICO

Década de 70

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• Maxam e Gilbert - método de degradação química

Tratamento com substâncias químicas que cortam a

molécula de DNA em nucleotídeos específicos

• Sanger et al. - método enzimático, dideoxi ou de

término da cadeia

Síntese enzimática de uma fita complementar, cujo

crescimento é interrompido pela adição de um

dideoxinucleotídeo

1977 – Seqüênciamento de DNA

MMÉÉTODOS CLTODOS CLÁÁSSICOSSSICOS



MMÉÉTODO DE DEGRADATODO DE DEGRADAÇÇÃO QUÃO QUÍÍMICAMICA

enzima de restrição X

XX

aquecimento e purificação

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PiperidinaPiperidinaÁlcaliA>C

PiperidinaPiperidinaHidrazina + álcaliC

PiperidinaPiperidinaHidrazinaC+T

PiperidinaÁcidoÁcidoA+G

PiperidinaPiperidinaDimetilsulfatoG

Químico usado para a

clivagem da fita

Químico usado para

remoção de bases

Químico usado para

alteração de bases

Especificidade

de bases






G A+G C+T C

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MMÉÉTODO ENZIMTODO ENZIMÁÁTICOTICO

DNA fita simples

DNA polimerase

primer

Animação


MMÉÉTODO ENZIMTODO ENZIMÁÁTICOTICO

XX


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• Métodos de seqüenciamento manual

• Método enzimático – mais utilizado, seqüenciamento de

genomas, automação

• Método de degradação química – substâncias químicas,

caracterização de oligonucleotídeos ou no seqüenciamento

de estruturas ricas em GC


SEQSEQÜÜENCIAMENTO MANUALENCIAMENTO MANUAL

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SEQSEQÜÜENCIAMENTO AUTOMENCIAMENTO AUTOMÁÁTICOTICO


• Anos 80 – seqüenciador semi-automático

• Substituição das técnicas de detecção por radioatividade pelo

uso de marcadores fluorescentes

•Radioisótopos – danosos à saúde, dificuldade de automação

•Fluorófos – sistema de detecção que permite a leitura automática das

seqüências

• Preparação do gel e aplicação das amostras

• Utilização ddNTPs fluorescentes lidos automaticamente

durante a eletroforese

• Corantes fluorescentes – reações no mesmo poço no gel


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Seqüenciamento em ciclos ou por amplificação linear



animação

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Anos 90 - Seqüenciadores de capilares

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• Seqüenciadores automáticos – avanço para a genômica,

poucas centenas de pb

• Seqüenciadores de capilares - duas vezes mais rápidos,

completamente automatizados

• Associação de capilares preenchidos com gel a um sistema de

detecção através de fluorescência confocal excitada por laser




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• Eliminação da montagem da placa e preparação do gel

• Aplicação das amostras por eletroinjeção

• Alta velocidade e resolução na separação das amostras

• Eliminação do retraqueamento


OUTRAS TOUTRAS TÉÉCNICAS DE SEQCNICAS DE SEQÜÜENCIAMENTOENCIAMENTO

•Piroseqüenciamento

•Seqüenciamento por hibridação

•Colônias da polimerase

•Seqüenciamento por nanoporos

•Espectrometria de massa

•Massively Parallel Signature Seuqencing

•Determinação de SNP, reseqüenciamento, análise da

expressão gênica

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Piroseqüenciamento – tempo real, seqüenciamento por síntese

Método rápido, seqüências menores, genotipagem de SNP, tipagem microbiana,

reseqüenciamento de genes para doenças e determinação da seqüência de

DNA com estruturas secundárias complexas



SBH – complementariedade de pares de bases da molécula de DNA

Seqüenciamento de DNA, reseqüenciamento de DNA, seqüenciamento de novo

e análise da expressão gênica

(4n=5) = 1024

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Colônias da polimerase – colônias de DNA de 1 µm de diâmetro que crescem

numa lâmina para microscopia

Estágio inicial, redução de custos; genotipagem e haplotipagem

•Produção das polônias•Denaturação do DNA imobilizado•Hibridação de um primer universal•Primeira reação de extensão•Microscópio de fluorescência de varredura•Fluorescência removida•Ciclos sucessivos•Seqüência de cada polônia paralelo


Fago phiX174 (Sanger et al., 1977)

APLICAAPLICAÇÇÕESÕES

Análise genômica

Haemophilus influenzae (1995)

Homo sapiens (2003)

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Estudo sistemático dos genomas

Avanço das técnicas de seqüênciamento

Automação

Equipamentos sofisticados e precisos

Grande quantidade de dados



Genoma completo: 28 archebactérias, 357 bactérias e

22 eucariotos

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Ciência forense

Análise filogenética



Epidemias virais

Conservação de espécies

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• DNA barcoding

•Genômica comparada

•Descoberta de drogas

• Screening genético



OBRIGADA!

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