Luciana Aramuni Gonçalves

SELEÇÃO DE COLÔNIAS DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TIPO DPRODUTORAS DE TOXINA ÉPSILON POR “DOT BLOT”

Dissertação apresentada à Universidade Federal deMinas Gerais, Escola de Veterinária, como requisitoparcial para obtenção do grau de Mestre em MedicinaVeterinária.

Área: Medicina Veterinária Preventiva

Orientador: Prof. Dr. Francisco Carlos Faria LobatoCo-orientadora: Profª. Zélia Inês Portela Lobato

Belo HorizonteUFMG – Escola de Veterinária

2004

2

G635s Gonçalves, Luciana Aramuni, 1977- Seleção de colônias de Clostridium perfringens tipo D produtorasde toxina épsilon por “Dot Blot” / Luciana Aramuni Gonçalves. – 2004. 31 p. : il.

Orientador: Francisco Carlos Faria Lobato Co-orientadora: Zélia Inês Portela Lobato Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais,Escola de Veterinária Inclui bibliografia

1. Clostridium perfringens – Teses. 2. Clostridium – Toxinas – Teses.I. Lobato, Francisco Carlos Faria. II. Lobato, Zélia Inês Portela.III. Universidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária.IV. Título.

CDD – 636.089 692

3

4

5

Dedico esta dissertação acima de tudo a Deus, meu verdadeiro Mestre.Aos meus pais por ter chegado até aqui.

À vovó Lourdes pelo exemplo de vida e por ter se dedicado tanto à nossa família sempre.

“Bendize, ó minha alma, ao Senhor, e tudo o que existe em mim bendiga o seu santo nome. Bendize, óminha alma, ao Senhor, e jamais te esqueças de todos os seus benefícios. É ele que perdoa as tuas faltas,e sara as tuas enfermidades. É ele que salva tua vida da morte, e te coroa de bondade e de misericórdia.

É ele que cumula de benefícios a tua vida, e renova a tua juventude como a da águia. O Senhor fazjustiça, dá o direito aos oprimidos. Revelou seus caminhos a Moisés, e suas obras aos filhos de Israel. O

Senhor é bom e misericordioso, lento para a cólera e cheio de clemência. Ele não está sempre arepreender, nem eterno é o seu ressentimento. Não nos trata segundo os nossos pecados, nem nos castiga

em proporção de nossas faltas, porque tanto os céus distam da terra quanto sua misericórdia é grandepara os que o temem; tanto o oriente dista do ocidente quanto ele afasta de nós nossos pecados. Comoum pai tem piedade de seus filhos, assim o Senhor tem compaixão dos que o temem, porque ele sabe de

que é que somos feitos, e não se esquece de que somos pó. Os dias do homem são semelhantes à erva, elefloresce como a flor dos campos. Apenas sopra o vento, já não existe, e nem se conhece mais o seu lugar.É eterna, porém, a misericórdia do Senhor para com os que o temem. E sua justiça se estende aos filhos

de seus filhos, sobre os que guardam a sua aliança, e, lembrando, cumprem seus mandamentos. Nos céusestabeleceu o Senhor o seu trono, e o seu império se estende sobre o universo. Bendizei ao Senhor todos

os seus anjos, valentes heróis que cumpris suas ordens, sempre dóceis à sua palavra. Bendizei ao Senhortodos os seus exércitos, ministros que executais sua vontade. Bendizei ao Senhor todas as suas obras, em

todos os lugares onde ele domina. Bendize, ó minha alma, ao Senhor” Sl.102

6

7

AGRADECIMENTOS

Ao querido Prof. Francisco Lobato pela orientação, dedicação, incentivo, confiança, carinho,amizade e por ter me “adotado” durante todo esse tempo.

À Profª Zélia Lobato pela força, incentivo, dedicação, profissionalismo, pela amizade e por serum exemplo para nós mulheres.

A Profª Vera Lúcia Viegas de Abreu pelas correções incansáveis, pelo apoio e incentivo.

Ao Nelson pelo apoio sempre constante a qualquer hora.

À Nádia pela convivência, amizade e formatações.

À todo o Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, na pessoa do querido amigo Prof.Nivaldo da Silva, em especial ao Jorge, Renata, Creuzinha, Júnia, Joãozinho, Eduardo,Leandro, Angela e Toninho.

Ao Colegiado de Pós Graduação, em especial à Profª Lygia Passos, pela assistênciaacadêmica e atenção sempre dispensada nas horas de aperto.

Àos amigos e colegas do Laboratório de Anaeróbios da EV/UFMG: Liliane, Patrícia, Andréa,Theonys, Carlos, Thiago, Michele, e em especial ao Eduardo, Formiga, Augusto, Ronnie eFelipe pelo apoio constante, convívio e amizade.

Às “meninas” do Laboratório de Bacteriologia Aplicada, Ana Cláudia, Ana Paula, Flu, Karina,Kika, Telmex, Renata, pela amizade, convivência e boas risadas; em especial ao Prof. AndreyPereira Lage, pela amizade e sempre disposição em ajudar.

Ao LARA-PL, em especial ao Ricardo Aurélio Pinto Nascimento, Pedro Motta e MaurícioBaltazar, pelo apoio, disponibilidade, doação dos camundongos e do laboratório paradesenvolvimento de boa parte das pesquisas.

Ao Dr. Luis Guilherme Heneine, pelo apoio e orientação; e a todos do Laboratório deImunologia da FUNED.

À sempre amiga Simone Renault por ter me aberto as portas da Escola de Veterinária e pelaverdadeira amizade em todos os momentos.

Aos amigos e colegas André, Giovanna, Flávia e Alcina; obrigada pela amizade.

Aos meus pais, Fernando e Fátima que eu tanto amo, pelo incentivo e paciência nas horasmais difíceis, à Mônica, ao Naninho e à Emille pela força constante e por sempre acreditaremem mim.

A toda a minha família, Berna, Mari, Tia Ré, T’Ivan, Vó Olga, e primos, por estarem sempre aomeu lado.

À vovó Lourdes que hoje é um anjinho que continua olhando por nós lá do céu.

À toda a Comunidade Mater Crucis pela amizade e orações constantes.

Ao Flávio, meu amor, pela enorme paciência e confiança. Obrigada!!!

8

9

SUMÁRIOPág

RESUMO............................................................................................................. 11

ABSTRACT ........................................................................................................ 11

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 12

2. LITERATURA CONSULTADA ........................................................................... 13

3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 163.1. Local de realização do experimento ............................................................... 163.2. Animais utilizados............................................................................................. 163.3. Amostras............................................................................................................ 163.3.1. Meios de Cultura ................................................................................................. 163.3.2. Reconstituição das amostras e avaliação da pureza ......................................... 163.4. Diluição das amostras e obtenção de colônias isoladas ............................. 163.4.1. Seleção das colônias isoladas crescidas nas maiores diluições e inoculação

em MPT............................................................................................................... 163.5. Padronização do “dot blot” para seleção de colônias isoladas

produtoras de toxina épsilon........................................................................... 173.5.1. Utilização do “dot blot” para seleção de clones produtores de toxina épsilon.... 173.6. Seleção dos clones e titulação da toxina épsilon ......................................... 173.6.1. Titulação em camundongos................................................................................ 173.7. Determinação do limite de detecção do “dot blot” ....................................... 183.8. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)........................................................ 183.8.1. Iniciadores........................................................................................................... 183.9. Determinação da concentração celular das amostras de C. perfringens

tipo D .................................................................................................................. 183.9.1. Concentração celular das colônias isoladas medida por densidade ótica

(DO).....................................................................................................................18

3.9.2. Concentração celular das amostras medida por densidade ótica (DO) ............. 18

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 21

5. CONCLUSÕES ................................................................................................... 30

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 30

LISTA DE QUADROSQuadro 1 Toxinas produzidas e doenças causadas por Clostridium perfringens .............. 13

Quadro 2 Fatores de virulência associados com elementos genéticos móveis oufatores genéticos extracromossomais em espécies do gênero Clostridium....... 14

10

LISTA DE FIGURASFigura 1 Resumo da metodologia desenvolvida neste trabalho ....................................... 19

Figura 2 “Dot blot” de 48 colônias isoladas da amostra 1 de C. perfringens tipo D naprimeira (A) e na terceira seleção (B) ................................................................ 21

Figura 3 “Dot blot” de 48 colônias isoladas da amostra 2 de C. perfringens tipo D naprimeira (A) e na terceira seleção (B) ................................................................ 23

Figura 4 “Dot blot” de 48 colônias isoladas do clone negativo da amostra 1 de C.perfringens tipo D................................................................................................ 23

Figura 5 Titulação em camundongos dos clones das amostras de C. perfringens tipoD selecionados pelo “dot blot” ............................................................................ 24

Figura 6 Sensibilidade do “dot blot” utilizando-se toxina épsilon a partir daconcentração de 10 µg/ml (C2 e D2) .................................................................. 25

Figura 7 Gel de agarose dos produtos da PCR do clone negativo selecionado no “dotblot” ..................................................................................................................... 27

Figura 8 Correlação celular das colônias isoladas de C. perfringens tipo D apóscultivo em MPT por 8 horas a 37°C, medida pela densidade ótica (DO) a600nm ................................................................................................................. 29

Figura 9 Concentração celular das amostras 1 e 2 de C. perfringens tipo D apóscultivo em MPT por 10 horas a 37°C, medida pela densidade ótica (DO) a600 nm ................................................................................................................ 29

11

RESUMO

Para seleção de amostras de Clostridium perfringens tipo D produtoras de toxina épsilon,padronizou-se o teste de “dot blot” com toxina épsilon adsorvida em membrana denitrocelulose, anti-toxina épsilon, produzida em carneiro e anti-imunoglobulina de carneiro,produzida em coelho, marcada com peroxidase. A reação foi revelada utilizando-se KitSubstrato DAB – 3,3’ – diaminobenzidina, e a leitura foi feita visualmente de acordo com aintensidade de cor obtida em cada poço. Foram selecionados clones produtores de toxinaépsilon obtidos de unidades formadoras de colônias e, após três passagens, obteve-se títulosem dose mínima mortal (DMM) determinado em camundongos, 1000 vezes superiores aosobtidos com a amostra original. A presença do gene etx que codifica a síntese da toxina épsilonfoi verificada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e todos os clones foram positivos,mesmo aqueles negativos ao “dot blot”. O teste de “dot blot” mostrou-se eficiente paraselecionar colônias toxigênicas de C. perfringens tipo D.

Palavras chave: Clostridium perfringens, toxina épsilon, “dot blot”, gene etx, PCR.

ABSTRACT

In order to select strains of Clostridium perfringens type D producers for epsilon toxin, a dot blotwas standardized test using epsilon toxin adsorbed in nitrocellulose membrane, anti-epsilontoxin produced in sheep and anti-immunoglobulin of sheep produced in rabbit conjugated withperoxidase. The reaction was visualized using DAB Substrate Kit 3,3’ – diaminobenzidine andthe reading was made according to the intensity of color obtained in each well. Clonesproducing epsilon toxin were selected by limiting dilution and after three passages, mortalminimum dose (MMD) titres were determined in mice. Selected clones produced epsilon toxin1000 times more concentrated those the original strain. The presence of the gene etx thatencodes the synthesis of the epsilon toxin was verified by the polymerase chain reaction, and allclones were positive, including those negative at the dot blot. It was concluded that the dot blottest was efficient for selecting toxigenic colonies of C. perfringens type D.

Keywords: Clostridium perfringens, epsilon toxin, dot blot, gen etx, PCR.

12

1. INTRODUÇÃO

As bactérias do gênero Clostridium sãobastonetes Gram-positivo, anaeróbios quepodem esporular em condições adversas.São encontradas nos mais variadosambientes como solo, pastagens, águadoce e salgada, alimentos de origemvegetal e animal e podem ser habitantesnormais do trato digestivo dos animais e deseres humanos.

Dentre as espécies de importânciaveterinária, Clostridium perfringens destaca-se como causador de enterotoxemias emionecroses em bovinos, caprinos e ovinos,determinando consideráveis perdaseconômicas aos criadores.

De acordo com a produção de quatrotoxinas maiores, C. perfringens éclassificado em A, B, C, D e E. A toxina alfaé produzida pelos cinco tipos, sendo oprincipal fator de virulência de C. perfringenstipo A e tem atividade hemolítica enecrosante. A toxina beta é produzida porC. perfringens tipos B e C e tem atividadeletal e necrosante. A toxina iota é produzidapor C. perfringens tipo E e seu modo deação não está completamente esclarecido.A toxina épsilon é produzida por C.perfringens tipos B e D.

C. perfringens tipo B é o agente etiológicoda disenteria em cordeiros recém-nascidos,uma enterite com extensiva hemorragia,ulcerações no intestino delgado e de altaletalidade. O tipo B pode também estarassociado a enterites hemorrágicas emcaprinos, bovinos e eqüinos recém-nascidos.

A enterotoxemia é a principal doençacausada por C. perfringens tipo D emovinos, caprinos e bovinos, quandosubmetidos a fatores que alteram amicrobiota intestinal, como mudança bruscade alimentação e estresse pós-desmame,com morte súbita após o início dossintomas. Em ruminantes, alimentação ricaem carboidratos e com baixo teor de fibrabruta, provoca alteração da flora normal,

degeneração e calosidade das vilosidadesdo rúmen. O excesso de carboidratos noduodeno, especialmente glicose e frutose,estimula o crescimento de C. perfringensresidente e consequentemente a produçãode toxinas.

A toxina épsilon tem peso molecular de34kDa e é secretada como uma prototoxinainativa que é ativada no trato gastrintestinalpor clivagem proteolítica de 13 aminoácidosda região N-terminal. A toxina épsilon tematividade necrosante e letal, provocaaumento da permeabilidade intestinal,edema em vários órgãos, hidropericárdio elesões renais (Hunter et al., 1992).

O gene da toxina épsilon etx de C.perfringens tipo D pode ser encontradoextracromossomal em plasmídios deamostras dos tipos B e D. A recenteclonagem e caracterização do etx propiciounovas informações sobre a estrutura efunção da toxina e pode ser a base para ageração de vacinas baseadas em toxinasrecombinantes ou toxóides. Estudosrecentes demonstraram que os genes quecodificam a produção de toxinas têm difusãoem elementos genéticos móveis comotransposons, plasmídios e bacteriófagos.

O controle das enterotoxemias deve sebasear em medidas de manejo e emvacinações sistemáticas dos rebanhos, jáque os animais estão em constante contatocom os agentes e fatores que podemdesencadeá-las.

A eficiência das vacinas clostridiaisrelaciona-se à natureza dos antígenossendo essas bacterinas e/ou toxóides. Asvacinas comerciais existentes sãocompostas por múltiplos antígenos e sãoutilizadas como estratégia frente à umavariedade de agentes e toxinas que podemparticipar das enfermidades. A produção devacinas múltiplas é um grande desafiotecnológico para a indústria uma vez que setorna necessário colocar um número maiorde antígenos num mesmo volume de dose,mantendo-se a mesma eficiência (Mozzer,2004).

13

A produção de toxinas por Clostridia é umdos aspectos mais importantes a serconsiderado na linha de produção detoxóides eficientes. As amostras sementesutilizadas, a composição dos meios decultura, pH, tempo, temperatura, eatmosfera de incubação são fatoresimportantes e devem ser rigorosamentecontrolados para uma efetiva produção devacina (Lobato et al., 2000). SegundoMozzer (2004), o Brasil possui umacapacitação tecnológica limitada na área decultivo industrial de microrganismosanaeróbios patogênicos.

O objetivo deste trabalho foi selecionarclones de Clostridium perfringens tipo D eavaliá-los quanto à produção da toxinaépsilon in vitro após passagens sucessivas,utilizando-se a técnica de “dot blot”. Osobjetivos específicos foram: desenvolver e

padronizar a técnica de “dot blot” paradetecção da toxina épsilon de C. perfringenstipo D; verificar a relação existente entre apresença da região gênica que codifica aprodução de toxina e a síntese da toxina,através da técnica da PCR; analisarquantitativamente a produção de toxinaépsilon pelos clones, a cada passagem,utilizando-se o teste “dot blot” comparado àtitulação em camundongos.

2. LITERATURA CONSULTADA

Enterotoxemias têm sido relatadas comosendo uma das mais importantes causas dedoenças entéricas em animais domésticos.Os clostrídios patogênicos são usualmenteidentificados baseando-se nascaracterísticas das toxinas produzidasconforme mostra o Quadro 1.

Quadro 1 – Toxinas produzidas e doenças causadas por Clostridium perfringens

Tipo Toxinas maiores Doenças em animais domésticosA α Mionecroses, enterite necrótica em aves, enterotoxemia em ovinos

e bovinos, enterocolite necrótica suína, colite eqüina, gastrenteritehemorrágica canina.

B α, β, ε Disenteria, enterite crônica em cordeiros, enterotoxemiahemorrágica em ovinos, enterite hemorrágica em eqüinos ebovinos.

C α, β Enterite necrótica em aves, enterotoxemia necrótica ouhemorrágica neonatal (ovinos, suínos, bovinos, caprinos, eqüinos),enterotoxemia ovina.

D α, ε Enterotoxemia (cordeiros e bezerros), enterocolite caprina eenterotoxemia bovina.

E α, ι Enterotoxemia bovina e ovina, enterite em coelhos.Fonte: Adaptado de Songer, 1997.

A multiplicação de C. perfringens tipos B e Dleva à produção da toxina épsilon e suaabsorção pelo intestino causa toxemia comleve enterite, efusões peritoneal epericardial são típicas. A toxina épsilon afetao sistema nervoso central e outros tecidosresultando em morte súbita, alguns animaisapresentam opistótono e convulsões antesda morte. Hiperglicemia e glicosúria sãodetectadas e o rim polposo, nome comumda doença, derivado da autólise pós-mortecomumente encontrada e que ocorre

rapidamente nos tecidos renais lesados pelatoxina (Songer, 1997).

Dentre as clostridioses, as enterotoxemiassão as que mais chamam a atenção deprodutores e veterinários. Nasenterotoxemias dos caprinos e ovinos, alémda pesquisa de toxinas nos fluidosintestinais, alguns achados podem darsuporte ao diagnóstico definitivo daenfermidade. Em caprinos, a enterotoxemiaé principalmente caracterizada pela

14

ocorrência de enterocolites. Nos ovinos, atoxina épsilon de C. perfringens tipo Dproduz alterações nas células endoteliais docérebro que levam ao aumento dapermeabilidade vascular, produzindo edemacerebral. A alteração histológica maisprecocemente observada comoconseqüência a esse processo, é o edemaproteináceo perivascular. Quando osanimais sobrevivem por períodos superioresa 24 horas, pode-se observar malácia que,em casos severos, pode ser observadamacroscopicamente, caracterizandoencefalomalácia simétrica focal (Uzal eKelly, 1998). Um fator de grande discussãono campo, diz respeito ao diagnóstico daenterotoxemia bovina. Pelo fato de C.perfringens ser um comensal do tratointestinal, apenas o isolamento domicrorganismo não é suficiente para odiagnóstico. Estudos têm sido publicadostentando correlacionar a presença, noconteúdo intestinal, de C. perfringens,carreando diferentes genes codificadores detoxinas, com a doença.

O critério mais aceito para estabelecer umdiagnóstico definitivo de enterotoxemia é adetecção da toxina no conteúdo intestinal(Uzal et al., 1997). O diagnóstico definitivoda infecção em animais domésticos requer

avaliação de sinais clínicos, achados denecropsia, cultura bacteriana, detecção datoxina no conteúdo intestinal e nosobrenadante de culturas. A detecção datoxina por métodos in vivo como aneutralização em camundongos éamplamente utilizada e métodos alternativoscomo citotoxidade baseada nasusceptibilidade de linhagens celularesMadin-Darby Canine Kidney (MDCK) (Paynee Oyston, 1997) e imunodiagnósticos comoELISA, têm sido amplamente utilizadoscomo alternativa para a substituição dautilização de animais de laboratórios (ElIdrissi e Ward, 1992; Uzal e Kelly, 1998;Parreiras e Lobato, 2001). Nagahama et al.(1991) padronizaram um ELISA para rápidadetecção de toxinas de C. perfringens ecomprovaram a alta sensibilidade do testecapaz de detectar pouco mais de 1,0 ηg/mlde toxina beta purificada e 0,1 ηg/ml detoxina épsilon purificada.

Alguns genes que codificam para as váriastoxinas clostridiais estão localizados embacteriófagos lisogênicos não integrativosou em plasmídios. Outros estão inseridos nocromossomo ou são localizados embacteriófagos lisogênicos que residemextracromossomalmente no citoplasmaconforme descrito no Quadro 2.

Quadro 2 – Fatores de virulência associados com elementos genéticos móveis ou fatoresgenéticos extracromossomais em espécies do gênero Clostridium.

Espécies de Clostridium Fatores de Virulência Elementos genéticosextracromossomais

C. perfringens CPE Grande plasmídioC. perfringens toxina épsilon PlasmídioC. perfringens toxina lambda PlasmídioC. botulinum tipos C e D toxina C3 Fago lisogênico não-integrativoC. botulinum tipos C e D BoNT/C e BoNT/D Fago lisogênico não-integrativoC. botulinum tipos C e D HÁ/C, D Fago lisogênico não-integrativoC. botulinum tipo G(C. argentinense)

BoNT/G Plasmídio

C. botulinum tipo G(C. argentinense)

HÁ/NTNH Plasmídio

C. butyricum BoNT/E Fago lisogênico e/ou plasmídioC. tetani TeNT Grande plasmídioC. novyi toxina alfa Fago lisogênico

CPE: Enterotoxina de C. perfringens; BoNT: neurotoxina botulínica; HÁ: hemaglutinina; NTNH, nãohemaglutinina não tóxica; TeNT, neurotoxina tetânica. FONTE: Adaptado de Johnson, 1997.

15

A presença de genes para fatores devirulência em elementos extracromossomaisresultam em propriedades fenotípicas comoinstabilidade genética e capacidade datoxinogenicidade ser dispersada portransferência gênica horizontal paraorganismos não toxigênicos (Bentancor etal., 1999a).

O gene etx codifica o maior fator devirulência de C. perfringens tipo D, a toxinaépsilon, residente num grande plasmídioque difere de tamanho em amostrasdiferentes (Petit et al., 1999) o etx é ligado aum elemento de inserção conhecido comoIS1151. Esse elemento de 1696 pares debases foi identificado a 96 pares de basesanteriores ao gene etx em amostras de C.perfringens tipos B e D isoladas. O IS1151foi caracterizado por conter duas regiõesterminais de 23 pares de bases queconstituem uma perfeita repetição invertida.Seqüências homólogas do elemento deinserção IS1151 foram encontradas emalgumas amostras que não produzem toxinaépsilon (Daube et al., 1993).

As diferenças encontradas na seqüência denucleotídeos anterior ao gene etx, emamostras distintas de C. perfringens tipo D,contribuem para a variação na produção datoxina épsilon (Havard et al., 1992). Alémdisso, a localização do elemento deinserção IS1151 próxima ao gene estruturaletx sugere alguma relação com atransferência gênica da virulência emamostras isoladas, interferindo diretamentena produção de toxina (Lyras e Rood,1997).

Bentancor et al. (1999b) correlacionaram aprodução de toxina épsilon de amostras deC. perfringens tipo D com a presença dogene etx e confirmaram a presença do geneem todas as amostras testadas. A diferentelocalização dos genes de virulência emoutras espécies do gênero Clostridiumsugerem a possível associação entre o nívelde expressão de toxina e a localização dogene etx. O gene etx foi encontradosomente em plasmídios de alto pesomolecular. Essa associação écorrelacionada com o nível de produção detoxina épsilon e com a estabilidade da

expressão durante várias passagens in vitro.Foi observado que em diferentes amostras,o peso molecular dos plasmídios quecarreiam o gene etx é variável e o nível deexpressão de toxina sugere uma possívelrelação com outros genes de virulência ouainda, que o gene pode estar envolvido emvários mecanismos de repressão/indução,dependendo de sua localização.

A localização do etx em plasmídios podeestar associada com a produção da toxinaépsilon e com a estabilidade da expressãodurante várias passagens in vitro. Para aobtenção de vacinas e outros produtosbiológicos é necessário selecionar amostrasque possuem alta e persistente produção detoxina (Bentancor et al., 1999a).

A reação em cadeia da polimerase baseadana amplificação de DNA dos genes para astoxinas alfa, beta, épsilon e iota de C.perfringens tem sido desenvolvida para arápida e precisa tipagem destemicrorganismo (Uzal et al, 1996; Miserez etal, 1998). Gkiourtzidis et al. (2001)demonstraram que o método de PCR paratipagem dos genes das toxinas é aplicávelpara a análise de grandes números deamostras bacterianas e tem mostrado serum método rápido e eficiente parainvestigações epidemiológicas de doençasclostridiais em animais. Yoo (1997)padronizou uma PCR multiplex paratipagem de C. perfringens na tentativa desubstituir o método clássico desoroneutralização em camundongos edemonstrou a alta sensibilidade do teste.

Gaber e Kapil (1999) desenvolveram um“dot blot” para detecção rápida de proteínasvirais sendo considerado um métodosensível e específico, podendo testar umgrande número de amostrassimultaneamente. Panigrahi et al. (1987)padronizaram um “dot blot” para detecçãode enterotoxinas em amostras bacterianasobtendo alta sensibilidade, rapidez e sendodispensável a utilização de equipamentosespecializados.

A vacinação é amplamente utilizada nocontrole da enterotoxemia causada por C.perfringens. Entretanto, a qualidade das

16

vacinas varia enormemente entre os paísese indústrias produtoras, e essas vacinas nãosão sempre transportadas, estocadas e/ouadministradas corretamente. Em adição,variações individuais nas respostas deanticorpos ocorrem freqüentemente entre osanimais (Uzal et al., 1997). As vacinascomerciais contra clostridioses sãocombinadas ou compostas por múltiplosantígenos e são usadas como estratégiafrente a uma grande variedade de agentese/ou suas toxinas que podem participar dasenfermidades.

Azevedo (1997) verificou que a obtenção detoxóides eficientes está diretamenterelacionada com o título de toxina obtido invitro. Variações na composição do meio decultura, escolha da amostra a ser utilizada etempo de incubação têm sido avaliados pordiversos pesquisadores na produção detoxinas.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Local de realização do experimento

O experimento foi realizado no Laboratóriode Anaeróbios da Escola de Veterinária daUniversidade Federal de Minas Gerais (EV-UFMG), no Laboratório de Imunologia daFundação Ezequiel Dias (FUNED) e noLaboratório Regional de Apoio Animal doMinistério da Agricultura, Pecuária eAbastecimento (LARA/PL) em PedroLeopoldo/MG.

3.2. Animais utilizados

Foram utilizados camundongos de ambosos sexos da raça Swiss, linhagem Webster,pesando entre 17 e 22 gramas, cedidos peloLARA/PL.

3.3. Amostras

Foram utilizadas duas amostras deClostridium perfringens tipo D pertencentesà bacterioteca do Laboratório de Anaeróbiosda EV-UFMG, sendo a amostra 1, doadapelo Instituto Nacional de TecnologiaAgropecuária (INTA), Bariloche – Argentinae a amostra 2, obtida de um isolado decampo. As amostras previamente tipificadase identificadas pela técnica de PCR,

segundo a metodologia descrita por Uzal etal. (1996), foram mantidas liofilizadas a–20°C.

3.3.1. Meios de cultura

Foram utilizados caldo Brain Heart Infuse –(BHI) (Difco Laboratories, E.U.A.),Perfringens Selective Agar – Sulfite-Polymyxin-Sulfadiazine – (SPS) (DifcoLaboratories, E.U.A.), Agar Sangue baseMuller-Hinton com 5% de sangue de eqüinoe Meio para Produção de Toxinas – (MPT),pH 7,2 (Lobato et al., 2000).

3.3.2. Reconstituição das amostras eavaliação da pureza

As amostras foram reconstituídas em 1ml decaldo BHI semeadas em duplicata, em tubosde ensaio (16X160mm) com tampa de roscacontendo 9ml de caldo BHI e incubadas emanaerobiose a 37ºC por 24 horas. Todas asincubações foram feitas em jarras deanaerobiose contendo mistura gasosa (10%de CO2, 10% de H2 e 80% de N2). Apóscrescimento observado por intensaprodução de gás e turvação do meio, asamostras foram semeadas em placas deagar sangue com 5% de sangue de eqüinoe em placas de agar SPS e reincubadas emanaerobiose a 37ºC por 24 horas. Foramfeitas coloração pelo Gram e provasbioquímicas como fermentação da glicose,maltose e sacarose, para avaliação dapureza das amostras.

3.4. Diluição das amostras e obtenção decolônias isoladas

As amostras inicialmente cultivadas emcaldo BHI foram diluídas (fator de diluição10) em salina peptonada 1 % e 100µl dasdiluições 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 e 10-9 foramsemeados em placas de agar SPS com alçade Drigalski esterilizada. As placas foramincubadas em anaerobiose a 37ºC por 24horas.

3.4.1. Seleção das colônias isoladascrescidas nas maiores diluições einoculação em MPT

Foi feita a contagem do número de colôniasisoladas por diluição e em seguida 48

17

colônias das maiores diluições, foramtransferidas uma a uma, com auxílio depalito estéril, para cada poço de duas placasde cultura de célula de 24 poços contendo2ml de MPT. As placas foram incubadas emanaerobiose a 37ºC por 8 horas, e emseguida centrifugadas a 8000 x g por 15minutos a 4ºC.

3.5. Padronização do “dot blot” paraseleção de colônias isoladas produtorasde toxina épsilon

Para padronização do “dot blot” foi utilizadatoxina épsilon produzida e purificada deacordo com a metodologia descrita porParreiras et al (2002), anti-toxina épsilonproduzida em carneiro (Parreiras e Lobato,2001) e conjugado anti-imunoglobulina decarneiro produzido em coelho, marcado comperoxidase (Sigma-Aldrich, E.U.A.), testadosem diferentes diluições. Como controlepositivo foi utilizada toxina épsilon produzidae purificada de acordo com a metodologiadescrita por Parreiras et al. (2002) naconcentração de 10µg/ml diluída em MPT; ecomo controle negativo foi utilizado MPT.

3.5.1. Utilização do “dot blot” para seleçãode clones produtores de toxina épsilon

Membrana de nitrocelulose 0,45µm (Bio-Rad Laboratories, E.U.A.), umedecida emtampão “Tris Buffer Saline” – (TBS) (0,02Mde Tris, 0,5M de NaCl, pH 7,5) foisensibilizada com 200µl do sobrenadante decada poço das placas de cultura de célulacentrifugadas. Após fixação na membranaforam adicionados 100µl de soluçãobloqueadora contendo “Bovine SerumAlbumin” – (BSA) (Sigma-Aldrich, E.U.A.)1% em TBS. Foram feitas três lavagenssucessivas utilizando-se “Tris Tween BufferSaline” – (TTBS) (0,02M de Tris, 0,5M deNaCl, 50% de Tween 20, pH 7,5) e foramadicionados 100µl de solução de anti-toxinaépsilon diluída em BSA 1% (1:300).Novamente foram feitas três lavagenssucessivas utilizando-se TTBS e foramadicionados 100µl do conjugado anti-imunoglobulina de carneiro, diluído em BSA1% (1:3000). A reação foi reveladautilizando-se o Kit DAB – 3,3’-

diaminobenzidina (Vector Laboratories,E.U.A.) preparado conforme asrecomendações do fabricante, e após cincominutos lavado com água destilada.

3.6. Seleção dos clones e titulação datoxina épsilon

As 48 colônias isoladas e selecionadas dasmaiores diluições das amostras 1 e 2 foramcultivadas por 8 horas em anaerobiose emMPT a 37°C e submetidas ao teste de “dotblot”. Foram selecionados clones positivos enegativos de acordo com a intensidade decor observada. Foram feitas três seleçõesconsecutivas sendo escolhidos dois clonespositivos a cada teste. Um clone negativo foiselecionado apenas da amostra 1,subcultivado em BHI, reclonado, eselecionado para titulação em camundongoe teste de PCR.

Os clones selecionados foram repicados emBHI e a produção de toxina épsilon paratitulação foi realizada segundo Azevedo etal. (1998) transferindo-se 5ml do inóculoobtido em caldo BHI diretamente para 500mldo MPT e incubado em anaerobiose a 37ºC,por 8 horas. Após incubação, o cultivo foicentrifugado a 8000 x g, por 15 minutos a4ºC e o sobrenadante coletado paratitulação da toxina épsilon por bioensaio emcamundongos.

Os clones positivos que apresentaram maiortítulo de toxina épsilon foram novamentesemeados em BHI e diluídos para obtençãode novas colônias isoladas e seleção denovos clones toxigênicos repetindo-se asclonagens por mais três vezes.

3.6.1. Titulação em camundongos

O sobrenadante das culturas foi ativado comsolução de tripsina segundo a metodologiadescrita por Sebald e Petit (1997) durante30 minutos em banho-maria a 37ºC e apóseste período, os tubos contendo ossobrenadantes foram colocados em banhode gelo e diluições decimais foram feitas emsalina peptonada a 1% para a determinaçãoda dose mínima mortal – DMM (menorquantidade de toxina que mata 100% dos

18

animais inoculados). Para cada diluição,foram inoculados dois camundongospesando entre 17 e 22 gramas, com 0,2mlpor via endovenosa e os animais foramobservados por 72 horas. Cada titulação foirepetida uma vez e os resultados dos doistestes foram acumulados para efeito decálculo da DMM (Sebald e Petit, 1997).

3.7. Determinação do limite de detecçãodo “dot blot”

Para se estabelecer o limite do método “dotblot” na detecção de toxina épsilon foramutilizadas 18 diluições (fator de diluição 2)da toxina épsilon partindo-se daconcentração inicial de 10µg/ml até7,5ηg/ml. Como diluente e como controlenegativo foi utilizado MPT. A leitura foi feitavisualmente de acordo com a intensidadede cor obtida em cada poço.

3.8. Reação em Cadeia da Polimerase(PCR)

Os clones positivos e negativosselecionados das duas amostras foramsubmetidos à PCR para verificar a presençado gene etx. A PCR foi realizada de acordocom a técnica descrita por Uzal et al. (1996)utilizando-se como controle positivo umaamostra de referência de C. perfringens tipoD (A.T.C.C. – 3629) e como controlenegativo todos os reagentes da PCR sem oDNA.

3.8.1. Iniciadores

Foram utilizados os seguintes pares deiniciadores – senso: 5’–TACTCATACTGTGGGAACTTCGATACAAGC–3’ e anti-senso: 5’–CTCATCTCCCATAACTGCACTATAATTTCC–3’; para um produto amplificado de 403pares de bases (bp).

3.9. Determinação da concentraçãocelular das amostras de C. perfringenstipo D

3.9.1. Concentração celular das colôniasisoladas medida por densidade ótica (DO)

Para verificar a homogeneidade naconcentração celular das colônias isoladascrescidas nas placas de 24 poços foimedida a densidade ótica (DO) a 600 nm.As colônias crescidas por 8 horas, foramressuspendidas em MPT e lidas diretamenteem espectofotômetro. Os valores foramanotados e a média e o desvio padrãocalculados através do programaMicrosoftExcell versão 97.

3.9.2. Concentração celular das amostrasmedida por densidade ótica (DO)

Um inóculo de 5ml das duas amostras de C.perfringens tipo D estudadas, foiinicialmente cultivado em BHI conforme oitem 3.3.2. foi transferido para 500ml deMPT e incubado em anaerobiose a 37ºC por10 horas. Foram coletadas alíquotas de 5mldas amostras a cada hora e a concentraçãocelular quantificada através da medida dadensidade ótica (DO) em espectofotômetroa 600nm. As amostras foram lidasdiretamente até valores de absorbância deaproximadamente 0,7, acima destesvalores, foram diluídas 1:10 em meio decultura estéril antes de se proceder a leitura.O valor lido foi multiplicado pelo fator dediluição para fornecer a medida daconcentração celular segundo ametodologia descrita por Mozzer (2004).

19

Reconstituição das amostras de C. perfringens tipo D (3.3.2.)

Diluição na base 10 em salina peptonada e obtenção de colônias isoladas(3.4.)

Seleção de 48 colônias isoladas crescidas nas maioresdiluições, inoculação em placas com MPT e incubação (3.4.1.)

Centrifugação a 8000 x g, 4°C, 15 minutos Determinação da concentraçãocelular (3.9.)

Transferência de 200µl doSobrenadante para o “dot blot” (3.5.1.)

Seleção de dois clonespositivos e um clone negativo (3.5.2.) Crescimento do clone

negativo (3.6.) para titulaçãoem camundongos (3.6.1.) ePCR (3.8.)

Crescimento dos dois clonespositivos (3.6.) para titulaçãoem camundongos (3.6.1.) e PCR (3.8.)

Nova clonagem

Seleção da melhor colônia toxigênicapara nova clonagem.

Figura 1 – Resumo da metodologia desenvolvida neste trabalho.

20

21

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

As amostras utilizadas neste experimentoapós semeadas em agar sangue por 24horas, apresentaram colônias lisas ebrilhantes de cor acinzentada, rodeadas poruma zona de dupla hemólise. À coloraçãopelo Gram foram vistos apenas bastonetesGram-positivo confirmando a pureza dasamostras. No agar SPS houve crescimentode colônias negras características deagentes sulfito redutores tais como C.perfringens. Nas provas de fermentação daglicose, maltose e sacarose, as amostrasforam positivas.

As diluições dos reagentes previamentepadronizados para o teste de “dot blot”foram de 1:300 para a anti-toxina épsilon e1:3000 para a anti-imunoglobulina decarneiro peroxidase, escolhidas de acordocom a intensidade de cor obtida em cadapoço inclusive no controle negativo. A toxina

épsilon purificada foi utilizada como controlepositivo na concentração de 10µg/ml.

As Figuras 2 e 3 mostram os resultados dos“dot blots” das amostras 1 e 2,respectivamente, nas diferentes seleções.

Na primeira seleção da amostra 1 (Figura2A) foram considerados 10 clones positivose 38 clones negativos. Na terceira seleção(Figura 2B) 48 clones foram consideradospositivos.

Na primeira seleção da amostra 2 (Figura3A) foram considerados quase todos osclones negativos, podendo ser observadona linha G, clones fracamente positivos, queforam selecionadas. Na terceira seleção(Figura 3B) 48 clones foram consideradospositivos.

A B

Figura 2 – “Dot blot” de 48 colônias isoladas da amostra 1 de C. perfringens tipo D na primeira(A) e na terceira seleção (B). Na Figura 2A os controles positivos são: 2G, 3G, 4G e 5G; e oscontroles negativos: F10, F11, G6, G7, G8, G9, G10 e G11. Na Figura 2B os controles positivossão: G7, G8, G9, G10 e G11; e os controles negativos: F10, F11, G2, G3, G4, G5 e G6.

22

23

A B

Figura 3 – “Dot blot” de 48 colônias isoladas da amostra 2 de C. perfringens tipo D na primeira(A) e na terceira seleção (B). Na Figura 3A os controles positivos são: B2, C2, D2 e E2; e oscontroles negativos: B3, C3, D3 e E3. Na Figura 3B os controles positivos são: 3B G7, G8, G9,G10 e G11; e os controles negativos: B11, C11, D11, E11 e F11.

O clone negativo selecionado no primeiro “dot blot” da amostra 1 foi novamente clonado e oresultado mostrado na Figura 4.

Figura 4 – “Dot blot” de 48 colônias isoladas do clone negativo da amostra 1 de C. perfringenstipo D. Os controles positivos são B2, C2 e D2, e os controles negativos E2, F2 e G2.

Os resultados do “dot blot” do clonenegativo da amostra 1 foram consideradosnegativos de acordo com o controle, porém,observaram-se variações entre ascolorações das colônias isoladas. Esteresultado pode ser justificado pelo clonenegativo ter sido selecionado de umaamostra inicialmente toxigênica e sugere aheterogeneidade das amostras de C.perfringens tipo D. Considerando que asamostras bacterianas representam umamistura de populações heterogêneas,algumas produzindo títulos variáveis de

toxina épsilon, outras não apresentandonenhum título e a seqüência gênica etx quecodifica para síntese de toxina épsilon élocalizada em um grande plasmídio. Atransferência lateral desse plasmídio e/ousua perda para o meio contribuem paramudanças toxinotípicas observadas emalgumas amostras (Petit et al., 1999).

24

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Antes daseleção

1ª seleção 2ª seleção 3ª seleção

Títu

lo e

m D

MM

/ml

Amostra 1

Amostra 2

Neste trabalho não foi avaliada a perda deplasmídios pelos clones selecionados. Aspassagens sucessivas in vitro podem tornaras amostras menos toxigênicas devido aperda do plasmídio sendo necessáriasperiódicas seleções de clones produtores detoxina. Estes resultados confirmam osachados de Bentancor et al., (1999a).

A seleção de amostras pelo “dot blot”mostrou-se eficiente para obtenção declones toxigênicos. Essa toxigenicidadepode estar relacionada a seleção de clonesque possuíam plasmídios de alto pesomolecular que carreiam o gene etx.

No bioensaio em camundongos dos cultivosobtidos dos clones selecionados pelo “dotblot”, a amostra 1 tinha título inicial de 1000DMM/ml e após a terceira seleção o título foide 3650 DMM/ml, o que representou umaumento de 3,65 vezes. A amostra 2 sóprovocou a morte dos camundongosquando inoculada pura, mas após a terceiraseleção o título foi de 1000 DMM/ml,representando um aumento de título 1000vezes maior que a amostra inicial (Figura 5).

Figura 5 – Titulação em camundongos dos clones das amostras de C. perfringens tipo Dselecionados pelo “dot blot”.

A Figura 5 representa o aumento no títulodas amostras antes do “dot blot” até aterceira seleção. As seleções foram feitasbaseando-se nos resultados encontrados, aamostra 1, apresentou pequeno aumento dasegunda para a terceira seleção e naamostra 2, o título se manteve na segunda ena terceira seleção.

Assim como o clone da amostra 1 negativoao “dot blot”, apresentou na segundaseleção título de 600 DMM/ml e foiselecionado de uma amostra sabidamentetoxigênica. O aumento da toxigenicidadedas amostras 1 e 2 pode estar relacionadocom a seleção de colônias cada vez maishomogêneas a cada passagem ou aindacom fatores relacionados à expressão dogene etx.

25

A sensibilidade do “dot blot” para detecçãode toxina épsilon verificada nesteexperimento foi menor que a obtida porNagahama et al. (1991) que padronizaramum ELISA para detecção rápida de toxinasde C. perfringens obtendo sensibilidade de0,1ng/ml de toxina épsilon purificada.

O “dot blot” foi capaz de detectar até 9ηg/mlde toxina épsilon diluída em MPT (Figura 6).Este resultado foi satisfatório para seleçãode colônias produtoras de toxina épsiloncom maiores títulos.

Figura 6 – Sensibilidade do “dot blot” utilizando-se toxina épsilon a partir da concentração de10µg/ml (C2 e D2). C11, D11, E11 e F11, controles negativos.

A utilização do teste de “dot blot” paraseleção de colônias produtoras de toxinaépsilon pode ser uma alternativa paraobtenção de cultivos com altos títulos detoxina, que são de grande importânciaprincipalmente na produção de vacinasmúltiplas, que é um dos desafios para aindústria veterinária, pela necessidade de secolocar um número cada vez maior deantígenos no mesmo volume da dosevacinal.

O “dot blot” é um teste subjetivo sendocapaz de selecionar característicasfenotípicas das amostras dependendo doobservador, porém, demonstrou-sesuficiente para os objetivos desteexperimento.

A confirmação da presença do gene etx quecodifica a síntese da toxina, e a suaexpressão, são medidas importantes para aseleção de amostras vacinais.

Todas as amostras testadas pela PCRforam positivas ao gene etx inclusive asnegativas no “dot blot” (Figura 7). Esteresultado comprova que a presença dogene etx é um fator necessário mas nãosuficiente em função da quantidade equalidade de toxina épsilon produzida poruma amostra de acordo com Bentancor etal. (1999a) ou que o “dot blot” não foisensível o suficiente para detectarpequenas quantidades da toxina épsilonproduzida pelos clones consideradosnegativos, de acordo com a intensidade dacor observada, tendo como referência ocontrole negativo utilizado.

1 2 3 4

26

27

Figura 7 – Gel de agarose dos produtos daPCR do clone negativo selecionado no “dotblot”: 1) marcador de peso molecular; 2)controle negativo; 3) clone positivo; 4) clonenegativo.

Fatores de transcrição, tradução,terminação e secreção do complexoprotéico condicionam a produção efetiva detoxina e precisam ser estudadosfuturamente.

Miserez et al. (1998) utilizaram a PCR paradiagnóstico de enterotoxemia causada porC. perfringens tipo D e observaram quetodas as amostras de todos os animais comsinais patológicos de enterotoxemia tinham

o gene etx enquanto apenas duas dasamostras de 13 animais aparentementesaudáveis continham o gene da toxinaépsilon. Esses resultados estão de acordocom os achados neste experimentoconfirmando que em todos os clonesselecionados, inclusive no negativo, foidetectada a presença do gene etx,consequentemente houve produção detoxina épsilon por todas as amostras, aindaque com baixo títulos.

Os resultados da PCR para detecção de C.perfringens produtores de toxina épsilondemonstraram um produto amplificado de403 pares de bases. O mesmo resultado foiobtido por Uzal et al. (1996) associado aalta sensibilidade que variou de 1,4 x 102 a1,4 x 103 UFC.g-1 de fezes ou conteúdointestinal.

O estudo da concentração celular dasamostras de C. perfringens tipo D foiimportante para comprovar que a variaçãona quantidade de toxina produzida edetectada no “dot blot” não era devida à umnúmero maior ou menor de célulasbacterianas presentes em cada poço dasplacas de cultura.

A média das leituras das 48 colôniasisoladas da amostra 1, foi de 1,034 sendo odesvio padrão de 0,062 e o coeficiente devariação igual a 6,4%. A Figura 8 demonstraa correlação em DO das 48 colôniasisoladas da amostra 1.

403pb

28

29

Figura 8 – Correlação celular das colônias isoladas de C. perfringens tipo D após cultivo emMPT por 8 horas a 37°C, medida pela densidade ótica (DO) a 600nm.

Esta pequena variação na DO observadaentre as 48 colônias isoladas selecionadasmostra que as mesmas apresentaramcrescimento homogêneo após 8 horas deincubação culminando com um númerosemelhante de células bacterianas. Assimcomprova-se que a diferença da intensidadede cor observada no “dot blot” se deve à

capacidade de cada uma das colôniasclonadas produzirem toxina épsilon.

A correlação entre a concentração celularmedida pela densidade ótica (DO) a cadahora de incubação das amostras 1 e 2 foideterminada e os resultados mostrados naFigura 9.

Figura 9 – Concentração celular das amostras 1 e 2 de C. perfringens tipo D após cultivo emMPT por 10 horas a 37°C, medida pela densidade ótica (DO) a 600 nm.

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

2,4

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tempo (horas)

Cor

rela

ção

celu

lar D

O (A

BS 6

00nm

) Amostra 1

Amostra 2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46Con

cent

raçã

o ce

lula

r DO

(ABS

600

nm)

Colônias isoladas

30

As amostras 1 e 2 apresentaram a mesmaconcentração celular no tempo de 8 horasde incubação porém títulos diferentes detoxina épsilon no sobrenadante das culturas(Figura 5). C. perfringens tipo D produztoxinas na fase exponencial de crescimentocorrespondendo a um período de incubaçãode 3 a 9 horas, sendo 8 horas um períodosuficiente para produção de toxina épsilon,conforme comprovado por Azevedo (1997).Contudo, apenas a medida da concentraçãocelular não é suficiente para determinar otempo de produção de toxina pelasamostras. É necessário que se faça umestudo individual de cada amostra a serutilizada para se determinar o melhor tempode produção de toxinas independentementeda concentração de células bacterianas nomeio.

5. CONCLUSÕES

• O teste de “dot blot” padronizado éeficiente para selecionar colôniastoxigênicas de C. perfringens tipo D.

• Os títulos dos clones selecionados dasamostras de C. perfringens tipo D, emdose mínima mortal, foramsignificativamente mais altos.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AZEVEDO, E.O. Avaliação de vacinascontra Clostridium perfringens tipo C e D.1997. 57f. Dissertação (Mestrado emMedicina Veterinária) – Escola deVeterinária, Universidade Federal de MinasGerais, Belo Horizonte.

AZEVEDO, E.O.; LOBATO, F.C.F.; ABREU,V.L.V.; et al. Avaliação de vacinas contraClostridium perfringens tipo C e D. Arq BrasMed Vet Zootec, v. 50, n. 3, p. 239–242,1998.

BENTANCOR, A.B.; FERMEPIN, M.R.;BENTANCOR, L.D.; et al. Detection of theetx gene (ε-toxin inducer) in plasmids of highmolecular weight in Clostridium perfringenstype D. FEMS Immun Med Microbiol, v. 24,p. 373–377, 1999a.

BENTANCOR, A.B.; FERMEPIN, M.R.;SKIRMUNTT, V.; et al. Detección del genetx (toxina epsilon) de Clostridiumperfringens para optimizar la formulación devacunas. InVet, v. 1, n. 1, p. 67–74, 1999b.

DAUBE, G.; SIMON, P.; KAECKENBEECK,A. IS1151 an IS-like element of Clostridiumperfringens. Nucl Acids Res, v. 21, n. 2,p.352, 1993.

EL IDRISSI, A.H.; WARD, G.E.Development of double sandwich ELISA forClostridium perfringens beta and epsilontoxins. Vet Microbiol, v. 31, n. 1, p. 89–99,1992.

GABER, F.; KAPIL, S. Development of naantigen spot test for detection of coronavirusin bovine fecal samples. Clin Diag LabImmun, v. 6, n. 4, p.542–544, 1999.

GKIOURTZIDIS, K.; FREY, J.; BOURTZI-HATZOPOULOU, E.; et al. PCR detectionand prevalence of α-, β-, β2-, ε-, ι- andenterotoxin genes in Clostridium perfringensisolated from lambs with clostridialdysentery. Vet Microbiol, v. 82, n. 1, p.39–43, 2001.

HAVARD, H.L.; HUNTER, S.E.; TITBALL,R.W. Comparison of the nucleotidesequence and development of a PCR testfor the epsilon toxin gene of Clostridiumperfringens type B and type D. FEMSMicrobiol Lett, v. 76, n. 1-2, p. 77–81, 1992.

HUNTER, S.E.C.; CLARKE, I.N.; KELLY,D.C., et al. Cloning and nucleotidesequencing of the Clostridium perfringensepsilon toxin gene and its expression inEscherichia coli. Inf Imun, v. 60, n. 1, p.102–110, 1992.

JOHNSON, E.A. Extrachromosomalvirulence determinants in the Clostridia. In:ROOD, J. I.; MCCLANE, B. A.; SONGER, J.G.; et al. The Clostridia: molecular biologyand pathogenesis. San Diego: AcademicPress, 1997. Cap. 3, p. 35–48.

31

LOBATO, F.C.F.; MORO, E.; UMEHARA,O.; et al. Avaliação da resposta deantitoxinas beta e épsilon de Clostridiumperfringens induzidas em bovinos e coelhospor seis vacinas comerciais no Brasil. ArqBras Med Vet Zootec, v. 52, n. 4, p. 313–318, 2000.

LYRAS, D., ROOD, J.I. Transposablegenetic elements and antibiotic resistancedeterminants from Clostridium perfringensand Clostridium difficile. In: ROOD, J. I.;MCCLANE, B. A.; SONGER, J. G.; et al.The Clostridia: molecular biology andpathogenesis. San Diego: Academic Press,1997. Cap. 6, p. 73–92.

MISEREZ, R.; FREY, J.; BUOGO, C.; et al.Detection of α- and ε- toxigenic Clostridiumperfringens type D in sheep and goats usinga DNA amplification techinique (PCR). LettAppl Microbiol, v. 26, n. 5, p. 382–386,1998.

MOZZER, O.D. Cultivo do Clostridiumbotulinum tipo D em alta densidade visandoà fabricação de vacinas veterinárias. 2004.149f. Tese (Doutorado em Interunidades emBiotecnologia). Instituto de CiênciasBiológicas, Universidade de São Paulo, SãoPaulo.

NAGAHAMA, M.; KOBAYASHI, K.; OCHI,S.; et al. Enzyme-linked immunosorbentassay for rapid detection of toxins fromClostridium perfringens. FEMS MicrobiolLett, v. 68, n. 1, p.41–44, 1991.

PANIGRAHI, D.; BURKS, M.; HARIHARAN,H.; et al. Evaluation of immuno-dot-blotassay for detection of cholera-relatedenterotoxin antigen in Salmonellatyphimurium. J Clin Microbiol, v. 25, n. 4,p.702–705, 1987.

PARREIRAS, P.M.; LOBATO, F.C.F. ELISAcompetitivo para detecção deimunoglobulina antiprototoxina épsilonproduzida pelo Clostridium perfringens tipoD. 2001. 44 fl. Dissertação (Mestrado emMedicina Veterinária) – Escola deVeterinária, Universidade Federal de MinasGerais, Belo Horizonte.

PARREIRAS, P.M.; LOBATO, F.C.F.;HENEINE, L.G.D.; et al. Production andpurification of epsilon prototoxin producedby Clostridium perfringens type D. Arq BrasMed Vet Zootec, v. 54, n. 3, p. 328–330,2002.

PAYNE, D.; OYSTON, P. The Clostridiumperfringens ε-toxin. In: ROOD, J. I.;MCCLANE, B. A.; SONGER, J. G.; et al.The Clostridia: molecular biology andpathogenesis. San Diego: Academic Press,1997. Cap. 25, p.439–447.

PETIT, L.; GIBERT, M.; POPOFF, M.R.Clostridium perfringens: toxinotype andgenotype. Trends Microbiol, v. 7, n. 3, p.104–109, 1999.

SEBALD, M.; PETIT, J.C. Laboratorymethods anaerobic bacteria and theiridentification. 2. ed. Paris: Institut Pasteur,1997. p.189–197.

SONGER, J.G. Clostridial diseases ofanimals. In: ROOD, J. I.; MCCLANE, B. A.;SONGER, J. G.; et al. The Clostridia:molecular biology and pathogenesis. SanDiego: Academic Press, 1997. Cap. 3, p.154–182.

UZAL, F.A.; PLUMB, J.J.;BLACKALL, L.L; etal Detection by polymerase chain reaction ofClostridium perfringens producing epsilontoxin in faeces and in gastrointestinalcontents of goats. Lett Appl Microbiol, v. 23,n. 1, p.13–17, 1996.

UZAL, F.A.; NIELSEN, K.; KELLY, W.R.Detection of Clostridium perfringens type Depsilon antitoxin in serum of goats bycompetitive and indirect ELISA. VetMicrobiol, v.51, n. 2–3, p.223-231, 1997.

UZAL, F.A.; KELLY, W.R. ExperimentalClostridium perfringens type Denterotoxemia in goats. Vet Pathol, v. 35, n.2, p.132–140, 1998.

YOO, H.S.; LEE, S.U.; PARK, K.Y.; et al.Molecular typing and epidemiological surveyof prevalence of Clostridium perfringenstypes by multiplex PCR. J Clin Microbiol,v.35, n.1, p.228-232, 1997.