Mini-Curso Teórico e Prático: Detecção de Ovos de Helmintos em Hortaliças

Segurança Alimentar:

Ranqueamento/ Codex

Alimentarius

(Parte 1) Dra. Regina Maura Bueno Franco

Laboratório de Protozoologia

Depto. de Biologia Animal - I.B.

Universidade Estadual de Campinas

(E-mail: mfranco@unicamp.br)

Mini-Curso: Parte 1

• 1. Qual impacto das Doenças Transmitidas por Alimentos?

• 2. Qual a relevância dos Parasitos?

• 3. Panorama de metodologias

• Detecção de Giardia em alfaces

(a experiencia da Unicamp)

• 4. Dificuldades ao detectar Parasitos em Alimentos.

Impacto das Doenças Veiculadas por Alimentos

Uma das principais vias de veiculação de agentes patogênicos ao ser

humano

(CDC, 2012)

Fonte: CDC, Division of Foodborne, Waterborne and Environmental Diseases. Atualizada: em 10/10/2012.

Doenças Veiculadas por Alimentos: Surtos Epidêmicos, EUA (2009-2010)

Nº de Surtos: 1.527

Fonte: Mahon, B. Foodborne Illness: a handy overview. (Medscape. Jan.24, 2011. Acesso: 16/11/2012); FoodNet 2012 DATA (www.cdc.gov). Acesso: 25/05/2013.

Quando considerando causas

de morte/ hospitalizações: 1° - Toxoplasma

gondii Nº de Casos/Doença: 29.444

Nº de Hospitalizações: 1.184

Mortes: 23

Doenças Veiculadas por Alimentos: Cenário nos EUA (2012) e 1998-2008**

Número de Casos**:

Infecções: 19.531 (273.120)

Hospitalizações: 4.563 (9.109)

Mortes: 68 (200)

•**Agentes virais, bacterianos, parasitários, toxinas, príons, etc. •CDC, 28/06/2013

Doenças Veiculadas por Alimentos: Surtos Epidêmicos, EUA (1973 - 2012)

Nº de Surtos: 29.429

Fonte:MMWR 62 (October, 2015); nº 54. Acesso em 28/08/2016.

Nº de Casos/Doença: 729.020

Doenças de Transmissão Alimentar (DTA): Surtos ocorridos de 2000 a 2015 no Brasil

03

Fonte dos Dados: SinamNet/SVS/MS. Acesso em: 13/05/2016.

11.241 surtos

07 surtos

Toxoplasma gondii

Doenças Transmitidas por Alimentos: Cenário Europeu (2011)

Nº de Surtos: 5.648

Fonte: EFSA Journal, 11(4):3129, 2013. Acesso: 25/05/2013.

Nº de Casos: 69.553

Nº de Hospitalizações: 7.125

Mortes: 93

Surtos de DTA – União Européia (2011): Principais Agentes Causadores

Agentes Número (%)

Salmonella 1501 26,6

Toxinas Bacterianas 730 12,9

Campylobacter 598 10,6

Infecções Virais 525 9,3

Escherichia coli,patog. 63 1,1

Outros Agentes* 113 2,0

Outros agentes bacterianos 47 0,8

Parasitos 31 0,5

Yersinia 17 0,3

Desconhecidos 2023 35,8

Total 5648 100

Fonte: EFSA Journal, 11(4) 3129, 2013; CDC atualizado em 28/06/13.

*Toxinas de cogumelos; biotoxinas marinhas

EUA (1998-2008):

Vírus: 45%

Bactérias: 45%

Agentes químicos ou toxinas: 9%

Parasitos: 1%

Total de Surtos: 7998

Com Etiologia Esclarecida: 5059

(63%)

Parasitos e Alimentos: Diferenças Biológicas

Parasitos diferem das bactérias transmitidas por alimentos, pois: Não se multiplicam fora do corpo do hospedeiro:

Exceção: Cryptosporidium

Não são susceptíveis à maioria dos antibióticos que matam as bactérias;

Apresentam formas de resistência (ovos, larvas, cistos e oocistos) resistentes à dessecação, desinfetantes como os derivados do cloro;

Protozoários causam infecção mesmo quando ingeridos pequeno número de cistos e oocistos.

Fonte: Newell DG. et al., Int. J. Food Microbiol., 139:S3-S15, 2010.

Critérios de Importância: Abordagem Multi-Critério (Codex Commitee on Food Hygiene, 2010)

Ranqueamento definido por: 1. Número de casos de DTA ao redor do mundo;

2. Distribuição global de infecções causadas por via alimentar;

3. Severidade (morbidade expressiva);

4. Taxa de fatalidade;

5. Potencial para aumento do número de casos de DTA;

6. Relevância do alimento ou agente parasitário no comércio internacional;

7. Impacto socioeconômico (importância em Saúde Pública).

Crítica: Não leva em consideração variações regionais.

Fonte: Robertson LJ . Et al., Trends in Parasitology, 29(3):101-103, 2013.

Ranqueamento dos Parasitos quanto às DTA: Uma perspectiva global

Posição Agente Parasitário Maiores Categorias de Alimentos Incriminados

1° Taenia solium Carne suína; vegetais frescos

2° Echinococcus granulosus Vegetais frescos

3° Echinococcus multilocularis Vegetais frescos

4° Toxoplasma gondii Carne suína, ovina, caprinos, bovina, de caça, vegetais frescos

5° Cryptosporidium spp. Vegetais, sucos de frutas, leite

6° Entamoeba histolytica Vegetais frescos

7° Trichinella spiralis Carne suína

8° Opisthorchiidae Peixes de água doce (metacercárias encistadas)

9° Ascaris spp. Vegetais frescos

10° Trypanosoma cruzi Suco de frutas

11° Giardia duodenalis Vegetais frescos

12° Fasciola spp. Vegetais frescos (solo encharcado)

13° Cyclospora cayetanensis Frutas silvestres; vegetais folhosos

14° Paragonimus spp. Crustáceos de água doce

Ranqueamento dos Parasitos quanto às DTA: Uma perspectiva global

13

Posição Agente Parasitário Maiores Categorias de Alimentos Incriminados

15° Trichuris trichiura vegetais

16° Trichinella spp. Carne de caça

17° Anisakidae Peixes marinhos, crustáceos e cefalópodes (polvos e lulas)

18° Balantidium coli Vegetais frescos

19° Taenia saginata Carne bovina

20° Toxocara spp. Vegetais frescos

21° Sarcocystis Carne bovina ou suína (dependendo da espécie)

22° Heterophyidae Peixes de água doce e salobra

23° Diphyllobothriidae Peixes marinhos e de água doce

24° Spirometra spp. Rãs, carne de cobras

Fonte: Multicriteria–based Ranking for Risk Management of Foodborne Parasites. 24/10/2012. http:www.fao.org/food/food-safety-quality/a-z-

index/foodborne-parasites/en/ te:

Ranqueamento dos Protozoários e Alimentos Relatados

Posição Protozoário Maiores Categorias de Alimentos Relatados

1° Toxoplasma gondii Carnes suínas, ovina, caprina, bovinos, leite, vegetais, mariscos

2° Cryptosporidium spp. Mariscos, vegetais, frutas cruas, leite, carnes bovinas, água mineral, água.

3° Entamoeba histolytica Frutas e vegetais

4° Trypanosoma cruzi Frutas; cana de açucar

5° Giardia duodenalis Mariscos, frutas, hortaliças, água

6° Cyclospora cayetanensis

Frutas silvestres, hortaliças

7° Balantidium coli água

8° Sarcocystis spp. Carne suína e bovina; vegetais (!?)

Fonte: Newell DG. et al. Foodborne diseases – The challenges of 20 years ago still persist while new ones continue to emerge. Int. J. Food. Microbiol., 139: S3-S15, 2010.

Alimentos e Protozoários: Vias mais comuns de Contaminação

I Oficina de Parasitos em Alimentos,

Unicamp, 28 de maio de 2013

Esterco , fezes de animais;

esgoto

Irrigação com água

contaminada

Manipulação : produtores

rurais

Equipamentos e Utensílios

Contaminados

Água de lavagem contaminada

Contato com superfícies

contaminadas

Manipulação: no preparo

Manipulação dos Alimentos

Cozidos

Exposição a Vetores

Mecânicos

Água de diluição de fungicidas

RMB Franco/Unicamp

Detecção Laboratorial: Cryptosporidium em Alimentos (Europa) - Vegetais

Fonte: Robertson LJ; Chalmers RM. Trends in Parasitology, 29 (1):3-9; 2013.

Foto: Nilson Branco

1. Eluição dos Oocistos a partir da superfície dos Alimentos (glicina 1M; pH 5.5)

2. Concentração e Separação por IMS

3. Detecção por Reação de Imunofluorescencia Direta

Base do Método sendo considerado como “ISO” (International Organization for Standarzation) com 3 etapas, a saber:

Separação Imunomagnética: Anticorpos Magnetizados para Captura de Oo/Cistos

Incubação da Amostra com Microesferas

Magnetizadas

Purificação dos Complexos Cistos+Anticorpos de

Captura+Oocistos

Imã

Dissociação térmica ou ácida

Leitura ou PCR ou ambos

Detecção Laboratorial: Cryptosporidium, Cyclospora cayetanensis e T. gondii em Vegetais

Fonte: Lalonde & Gajadhar. Food and Waterborne Parasitology, v.2 Pag.8-14, 2016.

Foto: Nilson Branco

2. Água de lavagem dos vegetais: concentrada por centrifugação 2000 x g/15min.

3. 3 mL do sedimento: Flutuação com solução saturada de sacarose (sp. gr. 1,26)

4. Líquido flutuado recuperado: extração do DNA dos protozoários (inibidores: pectina, fenóis, etc)

35 ± 0,5 g de folhas: Lavadas com glicina (1M; pH 5,.5) em Agitador ou Stomacher.

Detection of Cryptosporidium oocysts on spinach plants utilizing an LSCM and

fluorescein-labeled monoclonal antibodies.

Macarisin D et al. Appl. Environ. Microbiol. 2010;76:555-

559

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2. Investigação da Ocorrência de cistos de Giardia em hortaliças da Regional Agrícola de Campinas

• Levantamento Censitário de Unidades de Produção Agrícola (UPA) do “cinturão verde” de Campinas:

- 808 Unidades de Produção Agrícola;

- Área total: 39.267 hectares.

21

Ocorrência de Cryptosporidium e Giardia em hortaliças da RMC.

• 15 UPAs sorteadas para inclusão no estudo (G.P.S.); características:

• 100% aplicavam adubação natural (“cama de frango”);

• 80% dos proprietários cursaram ensino médio;

• 100% irrigavam com sistema de aspersão convencional semi-portátil; 33% contavam com fossa séptica;

• 93% havia a presença de animais (aves e cães); coleta de lixo em 26%.

22

Delineamento do Estudo

• 1. Coleta de Hortaliças - 2 anos consecutivos, sendo:

• Meses de fevereiro, março, abril: sazonalidade de Cryptosporidium

• Junho, julho e agosto: estiagem e uso das águas de irrigação:

• Alface (Lactuca sativa L. – Fam. Asteraceae);

• Rúcula (Eruca sativa L. – Fam. Brassicaceae)

• 2. Análise Parasitológica das Águas de Irrigação:

• reservatórios e poços;

• Técnica de filtração em membranas (47 mm)

• 3. Questionário estruturado sobre condições sanitárias nas UPAs

Material e Método: Água de Irrigação

• Metodologia: Técnica de Filtração em Membranas (4L/min.), com membranas de ésteres mistos de celulose: 3 µm de porosidade nominal.

• Eluição dos organismos-alvo com Tween 80 (0,1%) a partir da superfície da membrana; centrifugo-concentração (1050 x g; 10 min.)

• Visualização com Anticorpos monoclonais anti-Cryptosporidium e anti-Giardia - Reação de Imunofluorescencia Direta.

24

Metodologia para Detecção de Cistos de Giardia em alface e rúcula

Solução de Tween 80 (0,1%) para Eluição:

Literatura:

25

Ocorrência de Cryptosporidium e Giardia em hortaliças da RMC: Resultados

• Analisadas 60 alfaces e 60 rúculas: - Cryptosporidium: não detectado;

- 1º e 3º períodos de colheita: 20 % e 13,3% das UPAs com alfaces contendo cistos.

- 2º e 4º períodos de colheita: ambos os protozoários não foram detectados.

-Densidade de parasitos: - 180 a 230 cistos/50 g de alface - 180 cistos/50 g de rúcula

- Método de Faust: não revelou a presença de parasitos nas hortaliças;

- Água de irrigação: não houve detecção dos protozoários nas 60 amostras examinadas.

I Oficina de Parasitos em Alimentos,

Unicamp, 28 de maio de 2013

Dificuldades nas Investigações de Surtos: Fatores Influenciadores

Tamanho do pellet;

Fluorescência residual de muitas das sujidades presentes no líquido de eluição dos vegetais;

Microscopia é demorada e trabalhosa

Organismos-like: necessidade de um microscopista bem treinado;

Longo período de incubação das protozooses (ex: Cryptosporidium – 7 dias): investigações retrospectivas

DESAFIOS: Parasitologia aplicada a Área de Alimentos

I Oficina de Parasitos em Alimentos,

Unicamp, 28 de maio de 2013

Dificuldades na Obtenção das

Amostras

Métodos de Detecção:

Necessidade de Padronização

Interferentes:

Composição da matriz

alimentar; sujidades

Ações em Saúde Pública

Diagnóstico Ambiental

Detecção dos Casos

Re-Valorização da Parasitologia

Avanços na Legislação

OBRIGADA!

• Agradecimentos aos meus Orientandos: • Nilson Branco (Mestre)

• Mirna Pereira (Doutora)

• Diego A. G. Leal (Doutorando)

• Maurício Durigan (Bolsista IC– CNPq; Doutorando)

• Romeu Cantusio Neto (Doutor)

I Oficina de Parasitos em Alimentos,

Unicamp, 28 de maio de 2013

Profa. Regina Maura Bueno Franco E-mail: mfranco@unicamp.br