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BIOLOGIA CELULAR AULAS PRÁTICAS

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BIOLOGIA CELULARAULAS PRÁTICAS

1º ANO

2010/2011

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Biologia CelularProtocolos Práticos

SEGURANÇA EM LABORATÓRIO

1. INTRODUÇÃO

Embora todo o trabalho efectuado no laboratório de Biologia seja

potencialmente perigoso, e as pessoas que nele trabalham estejam sujeitas a

numerosos riscos e perigos, é importante ter a noção de que a grande a

maioria doa acidentes que ocorrem em laboratório não se devem a

procedimentos que são tecnicamente perigosos em si mesmos mas a faltas de

atenção e cuidado com o que se está a fazer.

É muito importante ter a noção de que a falta de atenção com o trabalho no

laboratório poderá muito provavelmente resultar, não só em fracos resultados

experimentais, mas também em possíveis acidentes.

O trabalho em laboratório envolve uma grande diversidade de riscos, sendo

necessário um conhecimento sério e aprofundado dos materiais, técnicas e

equipamentos utilizados assim como dos riscos que envolvem e atitudes a

adoptar de forma a minimizá-los.

O objectivo desta aula é o de alertar e familiarizar os alunos com os principais

perigos e riscos associados com o trabalho no laboratório de Biologia, assim

como com a forma de os reduzir ao mínimo através da utilização de boas

práticas de trabalho que permitam a realização de um bom trabalho de forma

segura.

2. ATITUDE A ADOPTAR NO LABORATÓRIO

Ser responsável.

Planear sempre o trabalho a realizar, conhecer bem todos os procedimentos

e estar consciente dos potenciais riscos associados, e adoptar as atitudes

adequadas de modo a evitá-los.

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Biologia CelularProtocolos Práticos

3. REGRAS DE SEGURANÇA

Não é permitido comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos no laboratório.

Manter os dedos, lápis e outros materiais afastados da boca e face.

Dentro do laboratório deve usar sempre uma bata, de forma a proteger-se a

si próprio e o seu vestiário de contaminações acidentais com culturas,

corantes ou outros produtos químicos.

Usar luvas apropriadas sempre que se manipulam produtos potencialmente

perigosos; as luvas deverão ser substituídas sempre que contaminadas ou

danificadas; deverão ser retiradas no fim do trabalho ou sempre que este for

interrompido, de modo a evitar a contaminação de objectos do laboratório ou

fora dele, como as maçanetas das portas, interruptores, telefones, etc.

No início de cada aula, proceder à desinfecção da área de trabalho,

utilizando um desinfectante impregnado em papel absorvente. Este

procedimento deve ser repetido no final do trabalho laboratorial.

Manter perto da área laboratorial somente o material estritamente necessário

(papel e lápis) para registo das observações. Conservar sempre a bancada

limpa e arrumada.

No início e no fim de cada aula lavar as mãos com um antisséptico. Proceder

da mesma forma sempre que suspeite ter contactado com materiais

contaminados.

Para pipetar, utilizar sempre um dispositivo de pipetagem. A pipetagem à

boca é proibida.

Mudar de luvas e lavar as mãos sempre que haja contaminação evidente

com o produto derramado.

Conhecer a localização e funcionamento dos sistemas de segurança

(telefone, saídas de emergência, extintores, chuveiros).

Colocar todo o material utilizado durante o trabalho nos locais apropriados:

● Material reutilizável: Em contentores apropriados para posterior lavagem

e tratamento; material contendo substâncias potencialmente perigosas

deverá ser previamente tratado de forma apropriada.

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Biologia CelularProtocolos Práticos

● Material não reutilizável:

- Vidro e metal cortante (lâminas de bisturi, agulhas de seringa): em lixo

próprio devidamente rotulado.

- Material contaminado com produtos biológicos: Em lixo próprio para

autoclavar/incinerar.

- Substâncias químicas perigosas: em locais apropriados, de acordo com o

composto em questão e em contentores devidamente rotulados.

- Não despejar nos canos qualquer material perigoso/infeccioso.

Todos os materiais para guardar ou incubar deverão ser devidamente

rotulados, com indicação de conteúdo, nome do utilizador e data.

4. PRINCIPAIS RISCOS ASSOCIADOS AO TRABALHO DE LABORATÓRIO E PRECAUÇÕES A TOMAR:

4.1 Equipamento de vidro

Riscos:

O material de vidro é o mais utilizado no laboratório, e a fonte mais comum de

acidentes, resultantes de cortes provocados por vidro partido, incluindo:

- cortes provocados pela introdução de tubos de plástico em tubos ou pipetas

de vidro

- cortes provocados por vidro partido e outros materiais cortantes colocados

de forma imprópria em contentores de lixo normal

Precauções:

- Antes de usar, inspeccionar o material de vidro de forma a garantir que se

encontra em perfeitas condições – sem quebras, falhas ou rachas.

- Colocar o vidro partido e os materiais de vidro não reutilizáveis (por ex.

Pipetas) em contentores de lixo próprios. Não utilizar os contentores de

lixo geral. Recolher vidros partidos imediatamente e de forma muito

cuidadosa.

- Não guardar ou deixar material de vidro na beira de bancadas ou prateleiras.

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Biologia CelularProtocolos Práticos

- Cuidado com o vidro quente. Colocar num local em que não possa ser

acidentalmente tocado até arrefecer.

4.2 Equipamento eléctrico

Não utilizar fichas e tomadas partidas ou danificadas.

4.3 Equipamento de aquecimento: Bicos de Bunsen, placas e banhos de

aquecimento

Riscos:

Queimaduras provocadas por superfícies e líquidos quentes, vapores ou

chamas.

Precauções:

- Todos os aparelhos de aquecimento (com excepção dos banhos) deverão

ser mantidos afastados de materiais e substâncias inflamáveis.

- Os bicos de Bunsen nunca deverão ser usados perto de contentores abertos

de líquidos inflamáveis, nem em ambientes onde estejam presentes

concentrações apreciáveis de vapores inflamáveis.

- A chama poderá não ser visível em condições de luz muito intensa. Nunca

deixar uma chama acesa sem vigilância.

- O vapor dos banhos de aquecimento poderá provocar queimaduras. Ter

atenção, especialmente quando se abrem as tampas de banhos a

temperaturas elevadas.

4.4 Fontes de luz ultravioleta

Riscos:

Queimaduras e danos graves na pele e nos olhos.

Precauções

- Utilizar protecção adequada para os olhos – óculos ou máscaras de material

opaco aos raios UV.

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Biologia CelularProtocolos Práticos

4.5 Outros Equipamentos

Relativamente a todos os equipamentos utilizados no laboratório, ler sempre o

manual de instruções cuidadosamente antes de os utilizar, tendo especial

atenção aos riscos associados e ao modo de os utilizar de modo a garantir a

segurança e a manutenção dos aparelhos em bom estado.

5. SEGURANÇA QUÍMICA

Os riscos associados à manipulação e utilização de substâncias químicas são

essencialmente de dois tipos, que se especificam em seguida:

- Riscos físicos

- Riscos para a saúde

Riscos Físicos

As substâncias químicas que representam riscos físicos são geralmente

identificadas pela presença, nos rótulos, dos seguintes símbolos e letras, que

se relacionam com as propriedades das substâncias:

- Símbolo do Fogo – “F”: Muito inflamável; “F+”: Extremamente inflamável

Substâncias que usam o símbolo do fogo: substâncias

inflamáveis, combustíveis ou piróforas. Todas estas

substâncias apresentam um risco elevado de provocar

incêndio no laboratório.

- Símbolo de Explosão – “E”: Explosivo

- Símbolo “O” em chamas – “O”: Oxidante

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Biologia CelularProtocolos Práticos

Riscos para a Saúde

Uma substância química é considerada nociva para a saúde quando existem

evidências de que pode provocar efeitos nocivos, crónicos ou agudos, em

pessoas ou animais expostos a esse produto.

Os produtos perigosos para a saúde, apenas representam um risco quando

entram em contacto com o organismo, o que pode ocorrer, para as substâncias

químicas, por três vias:

- Inalação

- Absorção pela pele ou entrada através de feridas

- Ingestão

Os efeitos provocados pelas substâncias químicas no organismo relacionam-se

com a sua toxicidade (capacidade de uma substância causar um efeito nocivo)

e com a dose (quantidade) a que o organismo é exposto.

CLASSIFICAÇÃO DOS PRODUTOS QUÍMICOS DE ACORDO COM OS PRINCIPAIS TIPOS DE RISCOS PARA A SAÚDE:

Corrosivos – “C” – Podem queimar, irritar ou atacar

destrutivamente os tecidos vivos.

Prejudiciais (“Xn”)/Irritantes (“Xi”) – Por contacto causam

vermelhidão ou inchaço da pele ou olhos, mas não causam

danos tecidulares permanentes (prejudiciais – danos menores

que produtos tóxicos; irritantes – danos menores que produtos

corrosivos) .

Sensibilizantes – Provocam reacção alérgica cutânea ou respiratória.

Tóxicos (“T) / Muito tóxicos - venenos (“T+”) – Causam a

morte ou danos muito graves, mesmo em doses reduzidas.

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Biologia CelularProtocolos Práticos

Carcinogéneos – Podem provocar cancro.

Teratogéneos – Afectam o desenvolvimento embrionário normal, podendo

causar malformações congénitas ou morte do feto.

Radioactivos – Estes produtos representam uma classe especial de produtos

químicos, cuja utilização apresenta riscos específicos pelo que requer um

conhecimento e preparação técnica especiais. Nunca deverão ser utilizados

antes de adquiridos esses conhecimentos.

6. PREVENÇÃO DE INCÊNDIOS

A prevenção de incêndios é tão importante como o desenvolvimento de meios

de os combater. É essencial ter a noção da necessidade de evitar práticas

perigosas no laboratório e dos perigos colocados por um fogo que atinge

proporções descontroladas.

6.1 Medidas de Prevenção

- Conhecer a localização dos alarmes de incêndio, extintores e mangueiras

- Trabalhar com produtos inflamáveis em hotes

- Utilizar fósforos, fontes de aquecimento, aparelhos eléctricos e outras

possíveis fontes de ignição de forma cuidadosa

6.2 Medidas de emergência em caso de incêndio

- Activar o sistema de alarme e ligar o 112

- Ajudar qualquer pessoa que se encontre em perigo, desde que tal não

ponha em risco a sua própria segurança

- Evacuar o edifício o mais rápido possível, de forma calma e ordenada

- Não usar os elevadores

- Fechar as portas e se possível as janelas, à medida que se abandonam as

salas

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Biologia CelularProtocolos Práticos

7. PRIMEIROS SOCORROS

7.1 Queimaduras químicas

No caso de queimaduras provocadas pelo contacto de produtos químicos

nocivos com a pele ou olhos, seguir os seguintes procedimentos:

- Utilizar protecção adequada de modo a não ser também afectado

Pele:

- Remover qualquer peça de roupa que cubra a zona afectada

- Lavar a zona afectada com água abundante durante pelo menos 15 minutos

- Não aplicar gorduras nas zonas afectadas

- Cobrir com um penso seco e estéril

- No caso de a área afectada cobrir uma extensão larga, ligar 112 e pedir

ajuda

Olhos

- Abrir as pálpebras de modo a assegurar uma lavagem eficaz

- Lavar com água abundante no sentido do nariz para a orelha durante pelo

menos 15 minutos

- Remover lentes de contacto tão depressa quanto possível

- Ligar 112

7.2 Ingestão de produtos químicos

- Ligar 112

- Se a vítima estiver consciente e for capaz de engolir, dar-lhe a beber água

ou leite

7.3 Inalação de produtos químicos

- Evacuar a área e mover a vítima para local arejado

- Ligar 112

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Biologia CelularProtocolos Práticos

8. MSDS

Todos os produtos químicos são acompanhados de um folheto denominado

MSDS (Material Safety Data Sheet), elaborado de modo a fornecer tanto a

quem os utiliza como ao pessoal de emergência todas as informações

referentes aos procedimentos adequados para a utilização e manuseamento do

produto em questão. Os MSDS incluem informações como propriedades físicas

e químicas, toxicidade, perigos para a saúde, primeiros socorros, reactividade,

armazenamento, detritos, equipamento de protecção e procedimentos de

emergência. Todas estas informações são essenciais para trabalhar em

condições de segurança, assim como em caso de acidente.

Os MSDS acompanham sempre os produtos comercializados e deverão ser

mantidos no laboratório de forma acessível a todos os que trabalhem com os

produtos em questão.

Qualquer pessoa que manuseie qualquer produto químico deverá ler o MSDS

correspondente, de modo a familiarizar-se com os perigos e precauções que

deverá ter ao utilizá-lo.

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Biologia CelularProtocolos Práticos

Aula 2

MICROSCÓPIO ÓPTICO

INTRODUÇÃO

O limite inferior para o olho humano distinguir dois objectos é da ordem dos 0,1

mm. É compreensível, por isto mesmo, a revolução que o microscópio induziu

na biologia, uma vez que permitiu descobrir um novo mundo. Tal como é visível

na Figura 1.1, o microscópio óptico, ou de campo claro, permite-nos visualizar

células com tamanhos na ordem de 1 µm (10-6 m), e distinguir detalhes nessas

células na ordem dos 250 nm (0,25 µm).

Figura 1.1 - Limites de utilização de diversos tipos de microscópios

O microscópio óptico é composto por um sistema de lentes de vidro distribuído

de modo a que a luz emitida pela fonte de luz se concentre no plano da

amostra e depois seja de novo concentrada e ampliada de forma a ser

visualizada no olho do observador. Para tal, como é descrito no diagrama da

Figura 1.2, o condensador, situado após a fonte de luz e antes da amostra,

concentra a luz que vai incidir sobre esta. O sistema objectiva - ocular é

responsável pela ampliação e projecção da luz que atravessa a amostra para o

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Biologia CelularProtocolos Práticos

olho. Por esta razão, a ampliação obtida é dada pelo produto da ampliação

descrita na objectiva e da ampliação descrita na ocular.

Ampliação total = Ampliação da objectiva x Ampliação da ocular

Figura 1.2 – Esquema de formação da imagem no microscópio óptico. A imagem observada é ampliada, invertida e virtual

Estando a ampliação total do microscópio dependente das ampliações parciais

da objectiva e da ocular, era legítimo afirmar que a capacidade de aumento do

microscópio óptico seria virtualmente infinita. No entanto, a ampliação útil é na

realidade na ordem das 1000 X. Este facto é compreensível com a introdução

do conceito de resolução. Para melhor compreender este conceito observe a

Figura 1.3. Verifica-se que, apesar de teoricamente ser possível ampliar

indefinidamente a imagem, a partir de determinados limites essa ampliação não

é acompanhada por melhoria de resolução, deixando de ser útil. Uma lente

pode ampliar uma imagem sem aumentar a sua resolução.

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Biologia CelularProtocolos Práticos

Figura 1.3 - Efeito da ampliação e da resolução na imagem obtida

É possível calcular o limite de resolução (r) de um microscópio recorrendo à

equação,

r=0 ,61× λA .N .

em que é o comprimento de onda (c.d.o.) da luz incidente e A.N. é a abertura

numérica definida pela equação,

A .N .=N⋅senU

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Biologia CelularProtocolos Práticos

com N o índice de refracção do meio compreendido entre a amostra e a

objectiva e U o semi-ângulo de abertura do cone luminoso que após passar

pela amostra atinge a objectiva (Figura 1.4).

Figura 1.4 - Representação gráfica do significado dos parâmetros N e U para o cálculo da Abertura Numérica

Assim para a luz visível, cujo c.d.o. varia entre 400 nm e 700 nm, e para a

maior abertura numérica teórica (1,5) o limite de resolução seria de cerca de

160 nm. Na prática, o valor de A.N. máximo é de 1,3 ficando o limite de

resolução com o valor de 250 nm para um c.d.o. de 550 nm.

Para aprender a trabalhar com o microscópio convém saber a localização e

nome dos seus principais constituintes (Figura 1.5).

Figura 1.5 - Principais constituintes do microscópio óptico

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Biologia CelularProtocolos Práticos

PARTE EXPERIMENTAL

Observações microscópicas

Ligar a fonte luminosa

Colocar a amostra na platina (lamela para cima)

Com o auxílio do condensador e do diafragma obter uma boa iluminação

(Subir o condensador para a objectiva de imersão em óleo ou baixar para

objectivas de baixa ampliação)

Rodando o parafuso macrométrico aproximar a platina o mais perto possível

da objectiva de 10X

Rodando novamente o parafuso macrométrico, puxar a platina para baixo até

obter uma imagem nítida da amostra

Depois da amostra estar focada com a objectiva de 10X, focar com a

objectiva de 40X. Com o auxílio do parafuso micrométrico podem-se obter

diferentes planos das estruturas a observar

Se pretender utilizar a objectiva de 100X, rodar a objectiva de 40X e, sobre a

preparação, colocar uma gota de óleo de imersão. Focar, já com a objectiva

de 100X, utilizando o parafuso micrométrico. O uso de óleo de imersão

melhora o valor da Abertura Numérica por influenciar o valor de N obtendo-

se uma maior resolução na observação da amostra (Figura 1.7).

Figura 1.7 - Efeito da adição do óleo de imersão sobre a dispersão da luz

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Biologia CelularProtocolos Práticos

OBJECTIVOS:

Compreender o âmbito de aplicação da microscopia óptica (noção de

escala microscópica).

Conseguir nomear os principais constituintes do m. o. e saber utilizá-lo.

Saber descrever o funcionamento do microscópio óptico (m. o.).

Compreender os factores que influenciam a ampliação e a resolução.

Perceber a utilização do óleo de imersão.

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Biologia CelularProtocolos Práticos

Aula 3

MEDIÇÃO COM OCULAR MICROMÉTRICA

Medições em preparações microscópicas

As observações em microscopia envolvem muitas vezes a medição do objecto

de estudo. A medição pode ser realizada após calibração, de cada objectiva,

com auxílio de uma ocular micrométrica e uma lâmina graduada.

Calibração

Figura 1.6 - Representação esquemática da calibração

Colocar a ocular micrométrica em posição no tubo do microscópio e instalar a

lâmina graduada na platina do microscópio.

Rodar a ocular micrométrica de modo a que as escalas da ocular e da lâmina

fiquem paralelas e se sobreponham parcialmente (ver Figura 1.6).

Deslocar a lâmina para que o início da graduação das duas escalas se

sobreponha (0 e 0,0).

Verificar em que outro ponto do campo as escalas se sobrepõem igualmente.

No exemplo da Figura 1.6, verifica-se que 80 divisões da ocular

correspondem a 0,45 mm (450 m) da lâmina, i.e., 1 divisão = 450/80 = 5,6

m. Este valor só é válido para a objectiva utilizada, sendo pois necessário

proceder à calibração para cada uma das outras objectivas.

(mm)

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Biologia CelularProtocolos Práticos

Para a medição de um objecto desconhecido, determina-se primeiro o número

de divisões, por ex. 4, e multiplica-se pelo valor micrométrico previamente

determinado, por ex. 5,6, obtendo-se a dimensão 22,4 m.

OBJECTIVOS:

Saber fazer medições ao m. o. recorrendo a uma ocular micrométrica e

lâmina graduada.

Saber converter as Unidades de medida (µm, nm, Å).

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Biologia CelularProtocolos Práticos

Aula 4

DIVERSIDADE CELULAR

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIAL

- Zaragatoa ou palito- Pinça- Bisturi- Lâminas e lamelas- Soro fisiológico- Solução de azul de metileno- Escherichia coli- Saccharomyces cerevisiae- Bolbo de cebola- Folha de Elodea

Notas importantes:

Antes de efectuar cada preparação limpe bem a lâmina e a lamela com

álcool

Para cada desenho a efectuar não se esqueça de indicar:

a) a ampliação com que observou a preparação

b) a legenda, com indicação da amostra observada, os pormenores

relevantes e sempre que possível, as dimensões

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

1. Cultura de Escherichia coli

Colocar uma gota da cultura de E. coli que lhe foi fornecida sobre uma lâmina,

cobrir com uma lamela e observar ao microscópio (ver Figura 2.1)

Figura 2.1 - Colocação da lamela

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Biologia CelularProtocolos Práticos

Começar por focar a preparação com a objectiva de 10 X e em seguida mudar

para a objectiva de 40 X e voltar focar. Rodar o revólver no sentido da

objectiva de 100 X e colocar uma gota de óleo de imersão sobre a lamela.

Lenta e cuidadosamente, rodar a objectiva de 100 X até esta ficar na

posição correcta e focar a preparação – usar apenas o parafuso

micrométrico e fazendo pequenos movimentos

Desenhar o que observa.

2. Células de Saccharomyces cerevisiae (fermento de padeiro)

Com a ajuda de um palito colocar uma pequena amostra de S. cerevisiae

sobre uma lâmina. Juntar uma gota de soro fisiológico e misturar bem.

Colocar uma lamela e observar

Desenhar o que observa com a objectiva de 100X.

3. Epiderme interna da escama do bolbo da cebola ( Allium cepa )

Separar duas escamas carnudas que formam o bolbo da cebola e com a

ajuda de uma pinça destacar um pequeno quadrado da epiderme interna

que recobre a parte côncava que ficou a descoberto. Proceder como

indicado na Figura 2.2

Figura 2.2 - Recolha da epiderme do bolbo de cebola

Colocar sob uma gota de soro fisiológico em cima de uma lâmina. Cobrir com

uma lamela. Observar ao microscópio, primeiro com a objectiva de 10X,

depois com a objectiva de 40X. Repetir o processo, mas desta vez com azul

de metileno.

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Biologia CelularProtocolos Práticos

Desenhar o que observa.

Nota: especímenes não corados são muitas vezes melhor visualizados com

menos luz. Tente reduzir a iluminação ajustando o diafragma do microscópio.

Examine então com a objectiva de maior ampliação.

4. Folha de uma planta aquática ( Elodea canadiensis )

Destacar uma folha de Elodea e fazer um pequeno corte na epiderme

superior da folha com o auxílio do bisturi. Adicionar uma gota de soro

fisiológico. Cobrir com uma lamela

Desenhar o que observa com as objectivas de 40X e 100X.

5. Células de gengiva

Friccionar ligeiramente a gengiva 3 a 4 vezes com a ponta de uma zaragatoa.

Aplicar sobre uma gota de azul de metileno, espalhando bem. Cobrir com

uma lamela e desenhar o que observa.

OBJECTIVOS:

Compreender o conceito de célula.

Diferenciar células procariotas de eucariotas.

Diferenciar células animais e vegetais.

Compreender os limites de resolução do microscópio óptico e do

microscópio electrónico.

Saber escolher a ampliação adequada ao objecto que pretende observar.

Saber registar e legendar a observação realizada.

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Biologia CelularProtocolos Práticos

Aula 5

CITOQUÍMICA E HISTOQUÍMICA

INTRODUÇÃO

A observação de células ao microscópio óptico de fundo claro apresenta dois

problemas: as pequenas dimensões das células e a ausência de contraste

entre os constituintes celulares. Outro obstáculo à qualidade da observação é a

opacidade da amostra à luz. De forma a superar estes factores, utilizam-se as

técnicas denominadas técnicas citológicas ou técnicas citoquímicas, que

permitem uma melhor visualização dos componentes celulares.

I. TIPOS DE PREPARAÇÕES

1. Preparações temporárias ou extemporâneas

Destinam-se à observação momentânea de uma amostra de material biológico

no seu estado natural. Para tal, a amostra é colocada num ambiente o mais

semelhante possível às condições nas quais ela se encontra in vivo (água doce

ou salgada, soro fisiológico, etc) e depois colocada entre lâmina e lamela. Este

tipo de líquidos que não alteram as condições do material a observar

designam-se líquidos indiferentes. Embora evitem a formação de artefactos

na amostra, este tipo de preparação não permite observar estruturas celulares

com grande detalhe.

Estas preparações podem contudo ser contrastadas com substâncias que não

alteram as características do material biológico. Estas substâncias são

denominadas corantes vitais (azul de metileno, vermelho neutro, vermelho

Congo, Sudão III, etc.) e a sua utilização permite a coloração de estruturas

celulares mantendo as funções vitais da célula durante algum tempo.

A coloração de preparações temporárias pode fazer-se de dois modos:

Imersão: o corante é adicionado ao meio de montagem

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Biologia CelularProtocolos Práticos

Irrigação: o meio de montagem com a amostra entre lâmina e

lamela é substituído por capilaridade. Esta técnica permite também

proceder à substituição de um meio de montagem por outro em

preparações temporárias.

2. Preparações definitivas

Permitem conservar o material biológico entre lâmina e lamela durante longos

períodos de tempo.

De modo a permitir esta conservação, o material biológico é submetido a uma

sequência de tratamentos destinados a desidratar e a fixar as células a ser

observadas.

Fixação: tratamentos físicos (calor, frio) ou químicos (metanol, ácido

acético, etc.) tendo como finalidade preservar as estruturas do material a

observar.

Desidratação: usualmente obtida através da passagem do material

biológico por álcoois ou acetonas de concentração crescente (este

tratamento visa a remoção da água dos tecidos a observar). É

fundamentalmente utilizada na obtenção de preparações definitivas de

tecidos, não tendo igual importância no caso de se tratar de células

isoladas.

Inclusão e corte: processo normalmente utilizado em histoquímica.

Consiste na inserção da amostra numa matriz de um material que a

mantenha estável e sem deformações. A substância mais utilizada como

matriz é a parafina fundida. Depois de solidificada, a amostra é cortada

em sucessivas camadas muito finas utilizando um micrótomo. Essas

finas “fatias” são então montadas em lâmina.

Coloração: os cortes são tratados com corantes.

Fase final de montagem: após a coloração, as amostras são de novo

desidratadas e cobertas com um meio de montagem (usualmente o

Bálsamo do Canadá).

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Biologia CelularProtocolos Práticos

II. COLORAÇÃO

Uma das técnicas mais usadas para incrementar o contraste das preparações

biológicas é a coloração. Utilizam-se substâncias, geralmente de natureza

orgânica, que coram estruturas celulares em geral ou em particular - corantes.

No estudo de células isoladas, este método é designado como citoquímica. Se

estiverem em estudo tecidos, designa-se como histoquímica.

Coloração simples: utilização de um único corante para pôr em

evidência estruturas celulares (ex: azul de metileno).

Coloração combinada: utilização de diferentes corantes para pôr em

evidência e distinguir estruturas celulares diferentes (ex: hematoxilina -

eosina).

Coloração diferencial: envolve o uso, no processo de coloração de

um agente de diferenciação que permite distinguir diferentes

composições da mesma estrutura celular (ex: coloração Gram).

As especificidades dos corantes são variadas, assim como os mecanismos de

ligação às moléculas biológicas:

a) Forças electrostáticas: corantes com carga positiva podem ligar-se a

estruturas celulares com carga negativa e vice-versa.

b) Acidofilia: os corantes acidófilos são substâncias de natureza básica

que se ligam a estruturas celulares ácidas (ácidos nucleicos, proteínas).

c) Basofilia: os corantes basófilos são substâncias de natureza ácida que

se ligam a estruturas celulares básicas.

d) Mordentes: substâncias que favorecem a ligação de corantes sem

carga eléctrica a determinadas estruturas celulares, possibilitando ou

aumentando a eficácia da coloração. Alguns mordentes utilizados em

citoquímica são o cobre, o ferro, o iodo.

Exemplos de corantes utilizados em microscopia óptica

23

Page 25: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

Corantes gerais

Básicos:

Hematoxilina

Fucsina básica

Violeta de cresilo

Ácidos:

Eosina

Laranja G

Azul de anilina

Corantes para citoquímica

Ácido periódico-Schiff: corante para glúcidos

Corante de Feulgen: DNA e RNA

Negro Sudão (Sudão III): lípidos

Enzimas

Corantes para imunocitoquímica

Fluoresceína

Rodamina

Enzimas

Ouro coloidal

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIAL

- Culturas em meio sólido de Escherichia coli- Corantes: violeta cristal e safranina- Lugol- Álcool a 95%- Óleo de imersão- Soro fisiológico estéril- Lâminas para microscópio- Palitos- Pinças

24

Page 26: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

- Bico Bunsen- Microscópio- Varetas de vidro- Pipeta de Pasteur- Pompete

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

1. Preparação de esfregaços

Marcar a lâmina, no lado oposto onde é efectuado o esfregaço, com as

iniciais do organismo a testar e o nome do grupo

Flamejar a lâmina, arrefecer e transferir duas gotas de soro fisiológico estéril

para o centro da lâmina

Recolher com o auxílio de uma ansa, (esterilizada à chama e arrefecida), uma

pequena quantidade de massa bacteriana e colocar na lâmina

Espalhar de forma a obter uma distribuição homogénea. Evitar fazer

esfregaços densos

Deixar secar e fixar a preparação à chama, para de seguida se executar a

coloração.

2. Método de Coloração: coloração diferencial de Gram

Cobrir o esfregaço com violeta cristal. Deixar actuar durante 30 segundos

Retirar o excesso de corante com água destilada, mantendo a lâmina em

posição oblíqua, segura pela pinça

Cobrir a lâmina com lugol (Gram's Iodine) e deixe actuar durante 1 minuto

Lavar a preparação com água

Descorar a lâmina com álcool etílico 95%, durante 10 a 20 segundos, até

desaparecimento completo da cor

Lavar a preparação com água

Aplicar o corante de contraste, safranina e deixar actuar durante 30 segundos

Lavar com água e deixar secar

25

Page 27: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

Colocar uma gota de óleo de imersão e observar a preparação ao

microscópio na objectiva de imersão

Registar as formas e cores das células observadas.

3. Observação de preparações definitiva

Observar as diferentes preparações definitivas, registando os tipos de células

e componentes celulares observados, assim como as cores associadas.

OBJECTIVOS:

Compreender o que é a Citoquímica e qual a sua utilidade.

Distinguir preparações temporárias de definitivas. Saber enumerar os

passos necessários à elaboração destes dois tipos de preparações.

Conhecer os métodos de coloração de preparações temporárias (imersão e

irrigação).

Distinguir os vários tipos de coloração (simples, combinada e diferencial).

Diferenciar os vários corantes quanto aos mecanismos de ligação às

moléculas biológicas e classificá-los quanto à sua natureza.

Conhecer a técnica de preparação de esfregaços

Saber executar a coloração de Gram, perceber em que se baseia e qual a

sua utilidade.

Inferir sobre a vantagem da utilização de corantes (comparação das

preparação de E. coli corada com a realizada na aula anterior).

Distinguir cocos de bacilos.

26

Page 28: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

Aula 6

OSMOSE

INTRODUÇÃO

A célula tem necessidade de trocar substâncias com o meio exterior e com

outras células, de forma a assegurar o seu metabolismo. As trocas realizam-se

através da membrana plasmática, que separa o meio intracelular do

extracelular.

De uma forma geral, as células vivas são constituídas por 75-85% de água,

pelo que a compreensão dos mecanismos de difusão (movimento de solutos a

favor do gradiente de concentração) e osmose (movimento de água através de

uma membrana semi-permeável) é fundamental para o estudo da biologia

celular.

Osmose - passagem de água através de uma membrana semi-permeável

que separa duas soluções com concentrações diferentes. A água movimenta-

se da solução com menor concentração de soluto (i.e., aquela em que existe

maior número de moléculas de água) para a solução com maior concentração

(i.e., menor número de moléculas de água).

A pressão osmótica de uma solução é a pressão que deve ser aplicada para

impedir que a entrada de água por osmose ocorra (Figura 5.1).

Figura 5.1 - Determinação da pressão osmótica

27

Page 29: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia Celular

Hipotónica Isotónica Hipertónica

Protocolos Práticos

A pressão osmótica é determinada pelo número de partículas em solução,

independentemente da sua natureza (moléculas ou iões). O número de

partículas por unidade de volume (litro) é dado pela osmolaridade. O termo

osmol designa a concentração em número de partículas.

Meio hipertónico - quando comparado com outro, tem maior concentração de

soluto (em número de partículas).

Meio hipotónico - quando comparado com outro, tem menor concentração de

soluto (em número de partículas).

A. Em células animais

A ausência de parede celular torna as células animais mais vulneráveis ao

fenómeno da osmose. Assim, em meio hipotónico, a água tende a entrar e as

células aumentam de volume, podendo mesmo “rebentar” – lisar (Figura 5.2).

O fenómeno inverso ocorre em meio hipertónico, com as células perdendo

água e ficando “encolhidas” – crenadas (Figura 5.2). Daqui a importância de se

manter as células animais sempre em meio isotónico.

Figura 5.2 - Preparações de glóbulos vermelhos em soluções comdiferentes osmolaridades

28

Page 30: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia Celular

Meio hipotónico Meio hipertónico

Protocolos Práticos

B. Em células vegetais

Em meio hipotónico, a célula vegetal tende a absorver água e a acumulá-la no

vacúolo, ficando túrgida. A parede celular impede que a célula aumente de

volume e rebente. Esta turgidez origina a rigidez mecânica característica da

maioria das plantas. Quando colocadas em meio hipertónico, as células

perdem água (através do vacúolo), ocorrendo o fenómeno de plasmólise

(Figura 5.3).

Figura 5.3 – Comportamento de uma célula vegetal em soluções comdiferentes osmolaridades

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIAL

- Folhas frescas de Elodea- Lâminas- Lamelas- Soro fisiológico - NaCl 0,5M- NaCl 0,4M- NaCl 0,3M- NaCl 0,2M- NaCl 0,1M

29

Page 31: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia Celular

Solução NaCl Lamela Papel

Lâmina

Protocolos Práticos

- NaCl 0,05M- Papel absorvente- Pipetas Pasteur- Microscópio

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Colocar uma folha de Elodea sobre uma lâmina, cobrir com uma gota de soro

fisiológico e montar com uma lamela. Observar ao microscópio

Utilizando o método de irrigação (Figura 5.4), substituir o meio de montagem

por cada uma das soluções de NaCl que lhe foram fornecidas (0,5M; 0,4M;

0,3M; 0,2M; 0,1M e 0,05M)

Observar cada preparação ao microscópio

Para cada solução utilizada, registar as alterações que observar, fazendo um

esquema legendado

Deverá determinar e indicar, para cada caso, se a solução utilizada é

hipotónica, hipertónica ou isotónica.

Figura 5.4 - Técnica da irrigação: O primeiro meio de montagem é retirado por absorção com papel, ao mesmo tempo que se coloca a nova solução de montagem, com o auxílio de uma pipeta de Pasteur

30

Page 32: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

OBJECTIVOS:

Distinguir osmose de difusão simples.

Compreender o conceito pressão osmótica.

Distinguir meios hipotónicos, isotónicos e hipertónicos.

Perceber as alterações produzidas em células animais e vegetais quando

colocadas em meios de diferentes osmolaridades.

Compreender a técnica utilizada (irrigação) na determinação da solução

isotónica para as células de Elódea.

31

Page 33: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

Aula 7

MITOSE

INTRODUÇÃO

O ciclo celular consiste na sequência contínua e ordenada de processos que

ocorrem numa célula desde o crescimento até à sua divisão em duas células

filhas. Este ciclo pode ser dividido em Interfase e Mitose.

A interfase representa a maior parte do ciclo celular (fases G1, S e G2). Nesta

fase, o ADN encontra-se descondensado (cromatina interfásica) e dá-se o

processo de replicação (fase S).

A mitose (fase M) é o processo celular que rege a repartição do material

genético entre células eucarióticas em divisão. Ao entrar na mitose, o ADN é

condensado, os cromossomas individualizam-se e inicia-se um processo que

garante a distribuição do material genético de uma célula (que foi duplicado na

fase S) em partes iguais para as células filhas.

Os acontecimentos que ocorrem na mitose são classicamente divididos em

cinco fases, das quais as quatro primeiras correspondem à divisão nuclear e a

última à divisão do citoplasma.

Profase Metafase

2

1

32

Page 34: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

Anafase Telofase

Figura 7.1 - Fases da Mitose

Na Profase, dá-se a condensação dos cromossomas (cada um com dois

cromatídeo), o desaparecimento da membrana nuclear e a formação do fuso

mitótico.

Na Metafase, dá-se o alinhamento dos cromossomas no plano equatorial do

fuso mitótico, ao nível do centrómero. Cada cromatídeo fica ligado a um dos

polos do fuso mitótico (é aqui que se garante a divisão do material genético em

duas partes iguais).

Na Anafase, a interação dos centrómeros com o fuso mitótico leva à migração

de cada cromatídeo para um dos polos da célula. Formam-se dois conjuntos de

cromossomas idênticos. É a fase mais curta da mitose.

Na Telofase, os cromossomas descondensam-se, o fuso mitótico desaparece

e a membrana nuclear reconstitui-se em torno de cada um dos dois conjuntos

de cromossomas. Dá-se o aparecimento do nucléolo.

Na Citocinese, ocorre a divisão do citoplasma com a distribuição dos

organelos e outros constituíntes celulares pelas duas células filhas. Este

processo tem início durante a telofase.

Nas plantas, a divisão nuclear e celular ocorre em áreas específicas,

meristemas, localizados nas extremidades de caules e raízes e no câmbio. O

meristema apical é a região que contém a maior percentagem de células em

mitose.

34

33

Page 35: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

Figura 7.2 - Secção longitudinal da extremidade de uma raíz

PARTE EXPERIMENTAL

1. Observação de figuras de mitose em ápices radiculares de Allium cepa

MATERIAL

- Microscópio óptico- Lâminas- Pinça de madeira- Bico de Bunsen- Ápices radiculares de Allium cepa (cebola)- HCl 1N- Orceína acética

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Colocar o ápice radicular de Allium cepa em HCl 1N, durante 3min

Adicionar 3 gotas de orceína acética e deixar repousar 5 min

Região de divisãoRegião de divisão celularcelular

34

Page 36: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

Aqueçer suavemente até concentrar o corante em torno do ápice, sem deixar

secar

Repitir a operação, mais duas vezes, após adicionar uma gota de orceína

acética

Transferir o material para uma lâmina limpa, adicionar uma gota de orceína

acética e colocar a lamela. Com a ponta do dedo aplicar uma pequena

pressão sobre a lamela, de forma a obter uma única camada de células.

2. Observação de figuras de mitose em preparações definitivas de cortes

histológicos de Ascaris

MATERIAL

- Microscópio óptico- Preparação definitiva de cortes histológicos de Ascaris corados com azul de

toluidina

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Ligar o microscópio

Colocar a preparação definitiva na platina

Focar a uma ampliação 100X e observar a 400X ou 1000X. Use as imagens

da Figura 7.1 como ajuda para identificar as fases do ciclo celular nas quais

se encontram as células

Desenhar e legendar uma célula em cada fase

Contar em diferentes campos de observação o número de células que se

encontra em cada fase da mitose e apontar os dados na Tabela 7.1

Considerando que o número de células em cada fase da mitose é

directamente proporcional ao tempo que cada célula passa em cada uma

destas fases, determinar a fracção de tempo (%) que as células do tecido

35

Page 37: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

observado passam em cada fase do ciclo celular que observou. Anotar os

valores obtidos na Tabela 7.1

Tabela 7.1

Fase da

MitoseNúmero de células

% de tempo

em cada fase

Interfase ____________%

Profase ____________________________________________ ____________%

Metafase ____________________________________________ ____________%

Anafase ____________________________________________ ____________%

Telofase ____________________________________________ ____________%

Total ____________________________________________ 100%

OBJECTIVOS:

Compreender o processo da mitose e a sua integração no ciclo celular.

Perceber a função da mitose e em que células ocorre.

Descrever as várias fases da mitose. Identificá-las em preparações de

células animais e vegetais.

Compreender o cálculo da duração relativa de cada uma das fases do ciclo

celular.

36

Page 38: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

AULA 8

MEIOSE

INTRODUÇÃO

A meiose constitui um tipo de ciclo celular especializado, através do qual os

organismos produzem células com metade do material genético (haplóides “n”)

destinadas à reprodução sexual.

O ciclo celular meiótico, à semelhança do ciclo celular mitótico, engloba a

interfase meiótica, que se subdivide nas fases G1, S e G2, e a meiose. Durante

a meiose ocorrem duas divisões sucessivas - meiose I e meiose II – sem a

ocorrência de uma fase S intercalar. Apesar de cada uma das divisões

meióticas ser também formalmente dividida em profase, metafase, anafase e

telofase, os acontecimentos que têm lugar durante cada uma das divisões

meióticas I e II são distintos.

A meiose I compreende a profase I, que é a fase mais longa e complexa, a

metafase I, a anafase I e a telofase I. Nesta primeira divisão ocorrem os

processos de recombinação entre cromossomas homólogos: formam-se os

bivalentes, estruturas que garantem a diversidade genética de todos os

organismos sexuados através do mecanismo de “crossing-over”. No final da

meiose I cada par de cromossomas homólogos da célula-mãe (2n) é

separado, de modo a dar origem a duas células haplóides (n) cada uma delas

com 23 cromossomas. A meiose I denomina-se por isso divisão reducional.

A meiose II compreende a profase II, a metafase II, a anafase II e a telofase

II. Corresponde a uma divisão equacional, em que ocorre a separação dos

cromatídeos das células resultantes da meiose I originando 4 células haplóides.

Nos animais superiores, a meiose ocorre nos órgãos sexuais tanto masculinos

como femininos, num processo que se denomina respectivamente

espermatogénese e oogénese. A fertilização é o processo que resulta da fusão

de duas células sexuais haplóides. A combinação da meiose e da fertilização

no ciclo de vida é a base da reprodução sexuada.

37

Page 39: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularMe

i ose

I

Me

I ose

II

Protocolos Práticos

Figura 8.1 - Representação esquemática da meiose

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIAL

- Microscópio e Preparações definitivas de Lilium sp.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Identificar e desenhar (ampliação de 400X) células em cada uma das fases da

meiose. Para tal, guie-se pelas fotografias da Figura 8.2:

Profase I Metafase I Anafase I Telofase I

38

Page 40: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

Intercinese Metafase II Anafase II Telofase II

Figura 8.2 - Fases da meiose

OBJECTIVOS:

Distinguir meiose e mitose quanto a) à função, b) ao tipo de células em que

ocorre e c) fases que a compõem.

Distinguir células haploides de diploides.

Compreender o fenómeno de “crossing-over” e suas consequências.

Conhecer as causas do aumento da variabilidade genética em organismos

com reprodução sexuada versus assexuada.

Identificar as diferentes fases da meiose nas preparações observadas na

aula.

AULA 9

EXTRACÇÃO DE DNA PLASMÍDICO

INTRODUÇÃO

39

Page 41: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

O DNA genómico bacteriano é geralmente circular com tamanho que varia

entre algumas centenas de kb (1 kb = 1000 pares de bases) e

aproximadamente 10000 kb, contendo cada célula uma cópia. Na bactéria,

além do DNA genómico, existem outros elementos genéticos como

plasmídeos, transposões e vírus. Os plasmídeos de ocorrência natural

apresentam uma variação de tamanho entre 1 kb e algumas centenas de kb. A

maioria são circulares e possuem replicação autónoma, sendo repartidos entre

as células quando há divisão celular (transmissão vertical). Os plasmídeos

podem ainda ser transferidos por conjugação ocorrendo a sua passagem de

uma célula para a outra (transmissão horizontal).

Os plasmídeos contêm genes essenciais para a sua manutenção na célula e

ainda genes que em determinados ambientes, conferem vantagem selectiva ao

hospedeiro. Esta vantagem pode ser conferida através de genes de resistência

a antibióticos, por processos de virulência, pela produção de toxinas, por

processos de restrição / modificação, entre outros.

Em laboratório, os plasmídeos são frequentemente utilizados como vectores de

clonagem, permitindo a expressão de genes de outros organismos pela

bactéria (ex. produção de insulina).

O objectivo desta aula prática, é a extracção de DNA plasmídico (plasmídeo

pBR322 que confere resistência ao antibiótico ampicilina - ver Figura 10.1) de

uma estirpe de Escherichia coli recorrendo à técnica de lise alcalina.

40

Page 42: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIAL

- Cultura de Escherichia coli em meio LB líquido com ampicilina.

- Solução 1: Glucose 50 mM EDTA 10mM TrisHCl 25 mM (pH 8)

- Solução 2 (preparar no momento): NaOH 0,2 M SDS 1%

- Solução 3: KAc 3 M (pH 4,8 ajustado com ácido acético glacial)

- Etanol absoluto.- Etanol 70%.- Tampão TE (com RNase) Tris HCl 10mM (pH8)

EDTA 1 mM RNAse 20 g / ml

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Inocular a estirpe de E. coli contendo o plasmídeo em 10 ml de meio LB

com ampicilina e incubar durante a noite a 37ºC com agitação.

Pipetar 1 ml para um tubo eppendorf e centrifugar 1 min a 15000 rpm, a

4ºC. Remover completamente o sobrenadante, com micropipeta, e adicionar

100 l de solução 1. Ressuspender e incubar 3 min em gelo.

Adicionar 200 l de solução 2. Misturar suavemente por inversão e manter

durante 3 min à temperatura ambiente.

Adicionar 150 l de solução 3. Misturar por inversão e colocar em gelo

durante 3 min.

Centrifugar o lisado durante 5 min a 15000 rpm, a 4ºC. Transferir o

sobrenadante para novo tubo e adicionar 900 µl de etanol absoluto (a -20ºC).

Deixar 15 min a -20ºC. Centrifugar 15 min a 4ºC e remover o sobrenadante.

Lavar o sedimento de DNA plasmídico com 500 µl de etanol a 70%

(-20ºC).

Centrifugar 3 min a 15000 rpm. Remover o sobrenadante e secar o pellet

de DNA plasmídico a 60ºC, 5 min.

41

Page 43: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

Ressuspender o sedimento de DNA em 50 µl de TE com RNase.

Conservar a -20ºC.

OBJECTIVOS:

Perceber que os plasmídeos fazem parte do genoma extracromossomático.

Compreender a função dos plasmídeos nas bactérias que os possuem.

Saber que a sua transmissão além de vertical é também horizontal.

Perceber a importância dos plasmídeos em processos como a clonagem.

Saber executar e explicar cada uma das etapas do protocolo de extracção

de DNA plasmídico.

42

Page 44: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

AULA 10

DIGESTÃO DE DNA PLASMÍDICO E

ELECTROFORESE EM GEL DE AGAROSE

INTRODUÇÃO

As endonucleases são enzimas que reconhecem sequências de bases no DNA

sendo capazes de hidrolisar (digerir) as cadeias de DNA em locais específicos.

Estas enzimas são quase exclusivamente produzidas por procariotas sendo-

lhes imputada uma função protectora ‘in vivo’ contra ácidos nucleicos invasores

como é, por exemplo o caso dos bacteriófagos.

Em laboratório, as endonucleases são ferramentas importantes em processos

de clonagem de genes, execução de mapas físicos e outros.

O objectivo desta aula prática é a digestão do plasmídeo pBR322 com a

enzima de restrição XmnI. Este plasmídeo possui dois locais contendo a

sequência de bases que XmnI reconhece (5'- GAANN NNTTC- 3') (ver Figura

10.1), produzindo-se, após a hidrólise, dois fragmentos lineares de DNA com

1.9 Kb e 2.4 Kb, respectivamente. A separação e visualização destes

fragmentos serão feitas por electroforese.

Figura 10.1- Mapa de restrição do plasmídeo pBR322 com a enzima XmnI.

pBR3224.3 Kb

XmnI

XmnI

1.9 Kb

Amp R

43

Page 45: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

A electroforese é uma técnica capaz de separar moléculas com carga (pela

aplicação de um campo eléctrico) em função do seu peso molecular e/ou carga

eléctrica das moléculas. A separação de ácidos nucleicos que se encontram

carregados negativamente (grupos fosfato) é geralmente efectuada em géis de

agarose. A agarose forma uma matriz porosa (cujo tamanho do poro pode ser

controlado) através da qual migram as moléculas de ácidos nucleicos. A

velocidade de migração depende da massa (função do número de pares de

bases (pb)), da conformação das moléculas, da concentração da matriz de

agarose utilizada, do campo eléctrico aplicado ao sistema e ainda da

composição do tampão utilizado na electroforese. Após a electroforese, os

ácidos nucleicos no gel de agarose tornam-se visíveis por acção do brometo de

etídeo (adicionado previamente ao gel de agarose). Este composto intercala-se

nas cadeias de ácidos nucleicos e fluoresce quando submetido à radiação

ultravioleta.

Quando se faz uma electroforese de ácidos nucleicos em gel de agarose é

indispensável a utilização de um marcador de pesos moleculares para o cálculo

do peso molecular da amostra. Um marcador de pesos moleculares é

constituído por uma série de fragmentos de DNA de peso conhecido; por

interpolação é possível relacionar o peso molecular da amostra com as bandas

do marcador.

B

Figura 10.2- (A) Marcador de pesos moleculares; (B) esquema da electroforese realizada

com o produto da digestão de pBR322 com XmnI

A

44

Page 46: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIAL

- DNA plasmídico (pBR322) (extraído na aula anterior)

- Tampão de enzima 10 X

- BSA 10 X

- Enzima XmnI 5U / l

- Agarose

- Tampão TAE 50 X: 242 g Tris base

57,1 ml ácido acético glacial

100 ml EDTA 0,5 M (pH 8.0)

H2O até perfazer 1l

Ajustar pH a 8,0

- Brometo de etideo

- Marcador de pesos moleculares

- Solução STOP (tampão de aplicação):

Sacarose 40%

Azul de bromofenol 0,25%

Xilenocianol 0,25%

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

1. Digestão de DNA plasmídico com a enzima de restrição XmnI

Fazer a mistura de digestão (em tubo eppendorf) adicionando cada um dos

reagentes indicados na tabela pela ordem apresentada.

Água 10,5 µl

Tampão de enzima 10 X 2 µl

BSA 10X 2 µl

DNA plasmídico 5 µl

Enzima de restrição XmnI 0,5 µl

45

Page 47: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

Misturar cuidadosamente e incubar a 37ºC durante 1h.

Retirar os tubos da estufa e adicionar 2 µl de solução STOP a cada tubo.

Conservar a 4ºC.

2. Visualização dos produtos de digestão por elecroforese em gel de

agarose.

Preparar um gel de agarose 0,8% em tampão TAE 1X. Para tal pesar a

agarose necessária para um volume final de 50 ml e colocar num recipiente

adequado. Adicionar o tampão (TAE 1X) até atingir o volume desejado. Ferver em

microondas até obter uma mistura homogénea. Deixar arrefecer a mistura líquida

até atingir aproximadamente 50ºC e adicionar 1 l de brometo de etídeo.(MUITO

IMPORTANTE usar luvas para manipular este reagente). Deitar a agarose dentro do

molde contendo um pente adequado ao volume e número de amostras que

pretende aplicar. Deixar solidificar 30 min.

Remover o pente e colocar o gel na tina de electoforese. Adicionar tampão

(TAE 1X) à tina de electroforese até cerca de 1 mm acima da superfície do gel.

Aplicar 5 l do marcador de pesos moleculares no primeiro poço e 5 l no

último poço do gel.

Iniciar a electroforese por aplicação de um campo eléctrico (100 V 20 min).

Após a corrida retirar o gel da tina e colocar em cima do transiluminador (fonte

de radiação ultravioleta). MUITO IMPORTANTE usar óculos de protecção contra UV.

Fotografar o gel.

OBJECTIVOS:

Perceber o que são endonucleases (enzimas) de restrição. Saber qual a

sua função ‘in vivo’ e perceber a sua utilização ‘in vitro’ (ferramentas

moleculares).

Compreender a técnica de electroforese.

Saber para que serve um marcador de pesos moleculares e como permite

calcular o peso molecular das bandas da amostra.

Perceber o processo utilizado para a visualização de ácidos nucleicos em

gel de agarose.

46

Page 48: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

Saber realizar uma reacção de digestão de um DNA plasmídico. Conhecer

as condições óptimas de actuação das enzimas de restrição.

Conseguir interpretar um perfil de digestão de DNA plasmídico.

47

Page 49: Sebenta_praticas_biologia_celular_2010-11 (1)

Biologia CelularProtocolos Práticos

AULA 11

QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

INTRODUÇÃO

As proteínas encontram-se envolvidas na maioria dos processos biológicos que

ocorrem dentro da célula, sendo por vezes necessário quantificá-las.

A espectrofotometria nas regiões visível e ultra-violeta, é uma técnica que

permite determinar a concentração de substâncias em solução. Esta técnica

baseia-se na proporcionalidade directa existente entre a quantidade de luz

absorvida por uma dada solução e a sua concentração, definida pela Lei de

Lambert-Beer:

A = C l

A: Absorvância

: Coeficiente de extinção molar

C: concentração da solução absorvente

l: Percurso óptico na solução absorvente

Para avaliar a concentração de uma substância, determina-se a relação entre

as concentrações conhecidas de várias soluções dessa substância e as

absorvâncias registadas a um dado comprimento de onda (construção da

curva de calibração).

Para traçar a curva de calibração e determinar a equação da recta, procede-se

da seguinte forma:

1. Soluções padrão: preparar diferentes soluções de concentrações conhecidas

2. Executar o procedimento experimental escolhido para quantificar a

substância padrão

3. Traçar em papel milimétrico o gráfico “Absorvância vs. (concentração da

solução padrão)”

4. Determinar a gama de concentrações onde é válida a Lei de Lambert-Beer

(onde há proporcionalidade directa entre A e C)

5. Calcular a equação da recta resultante (regressão linear)

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Biologia CelularProtocolos Práticos

A = m. C + b

Quantificação de proteínas

Existem vários métodos para quantificar as proteínas presentes em amostras

biológicas ou em soluções de proteínas preparadas no laboratório. Alguns

desses métodos baseiam-se na formação de complexos corados entre

reagentes específicos e as ligações peptídicas ou determinados aminoácidos.

Outros métodos exploram as propriedades espectroscópicas intrínsecas das

proteínas (absorvância a 280 nm).

O método de Bradford baseia-se na formação de interacções iónicas ou

hidrofóbicas entre um corante (azul de Coomassie G-250) (Figura 11.1) e

alguns aminoácidos, originando um complexo azul, que apresenta uma

absorvância máxima a 595 nm.

Figura 11.1 - Azul Coomassie G250 (forma desprotonada)

O método de Bradford é suficientemente sensível para detectar quantidades de

proteína de 1 µg/mL, sendo um método rápido e simples, permitindo num curto

espaço de tempo analisar várias amostras.

Para amostras com maior concentração de proteína pode usar-se o Método de

Lowry (mg/dL) ou Método do Biureto (g/dL).

PARTE EXPERIMENTAL

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Biologia CelularProtocolos Práticos

MATERIAL

- Espectrofotómetro- Cuvettes para espectrofotómetro- Micropipetas- Papel milimétrico- Calculadora- Solução de albumina sérica bovina (BSA) a 0,1 mg/mL- Reagente de Bradford- Amostra desconhecida

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

1. Construção da curva de calibração

O método de Bradford apresenta uma resposta linear numa gama de concentrações de proteína entre 1 e 20 µg/mL. A construção de uma curva que relacione a concentração de proteína com a absorvância a 595 nm, permite determinar a concentração de proteína existente numa amostra.

Preparar 7 tubos com a seguinte composição:

Tubo

(número)

Volume de solução

BSA 0.1 mg/mL (µL)

Volume de água

(µL)

[BSA]

(mg/L)1 (Branco) 0 800 0

2 10 790 1.253 20 780 2.54 50 750 6.255 100 700 12.56 200 600 257 250 550 31.25

Adicionar 200 µL do reagente comercial de Bradford a cada tubo

Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. Medir a absorvância de cada tubo

a 595 nm

Representar graficamente a absorvância medida a 595 nm versus a

concentração de proteína em µg/mL e traçar a correspondente curva de

calibração

Calcular a equação da recta da zona linear da curva de calibração

A (595nm) = m . [proteína] + b

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Biologia CelularProtocolos Práticos

2. Quantificação da concentração de proteínas numa amostra desconhecida

Pipetar para um tubo (nº 8) 800 µL da amostra desconhecida

Adicionar 200 µL do reagente comercial de Bradford

Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. Medir a absorvância a 595 nm

Determinar a concentração de proteína na amostra, utilizando a equação que

determinou.

OBJECTIVOS:

Compreender a importância de quantificar proteínas.

Perceber sumariamente o funcionamento da técnica de espectrofotometria.

Compreender e aplicar a lei de Lambert-Beer.

Conhecer os conceitos de branco e solução padrão.

Saber elaborar uma curva de calibração. Compreender a necessidade da

sua utilização.

Identificar a gama de concentrações onde é válida a lei de Lambert-Beer.

Saber calcular a equação da recta que expressa a relação entre a

absorvância e a concentração de proteína.

Saber usar a equação da recta para calcular a concentração de proteína

duma solução desconhecida.

Saber executar o método de Bradford. Compreender qual o seu fundamento

e as suas limitações.

Conhecer outros métodos de quantificação de proteínas.

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