rotinas para impressÃo

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NORMAS E ROTINAS OPERACIONAIS DO LABORATORIO DE NALISES CLNICAS

Setor de Coleta e RecepoProcedimento Operacionais Padres (POP) 1. CADASTRO E INFORMAES 1.1 Identificar o paciente A chegar recepo do laboratrio, o paciente devera estar portanto requisio medica com os exames solicitados pelo seu medico, a recepcionista ento ir cadastra-lo, dando nfase ao nome, idade, sexo, endereo e/ou telefone. O cadastro do paciente acompanha a identificao numrico controle do laboratrio. 1.2 Identificao de amostra Cada cadastrado possui um numero de identificao, utilizando para etiquetas os recipientes de coleta. importante identificar sempre a parte lateral do frasco, e nunca a tampa, principalmente em frascos de urina e fezes para evitar trocas de material. 1.3 Identificaes dos exames a serem realizados No laboratrio as amostras so registradas em fichas internas de seus respectivos setores, nestas fichas constam a identificao numrica, o nome e a idade do paciente; em seguida as amostras e as fichas sero encaminhadas para os devidos setores. 1.4 Informaes ao paciente Na recepo do laboratrio o paciente ir receber as instrues de como deve proceder para coleta das amostras. Para dosagem bioqumica o paciente orientado sobre o perodo de jejum, sendo tambm necessrio o conhecimento dos medicamentos que o paciente possivelmente esteja tomando. Quando a coleta de sangue, orienta-se o paciente quanto ao esforo fisico, o paciente deve vir ao laboratrio totalmente descansado para evitar qualquer alteraes nos resultados de seus exames.

2 COLETA DE SANGUE O sangue colhido com o objetivo de estudar as freqncias alteraes dos seus componentes quando o organismo acometido pr doenas. No laboratrio so executados exames de vrios paciente ao mesmo tempo, torna-se imprescindvel que uma sistematizao bem organizada de trabalho seja seguida, evitando-se os erros de um modo geral, a perda de tempo e, especialmente, a troca dos resultados. Cuidados tcnicos e de assepsia so tambm necessrios a fim de evitar a contaminao do paciente, do operador e do sangue colhido. A coleta feita de preferencia pela manha, com o paciente em jejum. Muitos so os meios para obteno do sangue usado para o exame hematolgico, como pr exemplo, sangue o veneno, capilar, arterial, puno da medula ssea de ossos como o externo, tbia, ilaco e usado na maioria das vezes o venoso e o capilar. 2.1 Sangue Venoso A sua obteno feita pela funo das veias mais acessveis. As que so mais facilmente funcionadas localizam-se nas regies do antebrao (veia mediana, ceflica e baslica), do pescoo (jugulares internas e externas) e inguinais (femural). Na criana, tambm se realiza na regio da fontanela frontal (seio longitudinal). A veia a preferida nos exames rotineiros, pois apresenta freqentemente bom calibre e sua funo pouco dolorosa. Antes da puno, avalia-se a orientao do vaso pela visualizao ou pela palpao digital e fazer a agulha penetrar e aprofundar nessa direo. 2.2 Sangue capilar freqente usado em crianas quando se empregam micrometodos ou em adultos para alguns exames como estudos de plaquetas, citologia e citoquimica celular. A coleta se faz aps puno da polpa digital dos dedos ou dos grandes artelho, na criana. Pode-se ainda utilizar a regies laterais do calcanhar, nos recem nascidos.

3. RECEPO AO PACIENTE O paciente recebido com cortesia e cordialidade; explicando os procedimentos aos quais ele vai ser submetido, de modo a transmitir-lhe tranqilidade e segurana. A coleta chama o paciente para a coleta de sangue, e de acordo com seu cadastro, confirma o nome, a idade e os exames a sem realizados pelo paciente. A mesma separa e identifica, na frente do paciente os tubos que sero utilizados para o material. 3.1 Condies para a coleta Sala bem iluminada e ventilada; Pia; Cadeira reta com bracadeira regulvel ou maca; Garrote; Algodo hidrfilo; lcool etlico a 70% ou lcool iodado a 1%; Agulhas e lancetas descartveis; Sistemas a vcuo: suporte, tubo e agulhas descartveis; Tubo de ensaio com tampa; Etiquetas para identificao de amostras; Caneta; Caixa descarpack; Jaleco e mascara; Luvas descartveis; Estantes para tubos. 3.2 Identificao da amostra Identificam-se os tubos para colocao da amostra. Escreva na etiqueta os dados do paciente: nome, numero do registro, data da coleta. 3.3 Tecnica para Coleta de Amostra do Sangue Venoso

Coloca-se a agulha na seringa sem retirar a capa protetora. No tocando na parte inferior da agulha; Movimenta o embolo e pressione-o para retirar o ar; Ajusta o garrote e escolha a veia; Faz a anti-sepsia do local da coleta com algodo umedecido em lcool a 70% ou lcool iodatdo a 1%. No tocando mais o local desinfetado; Retira a capa da agulha e faz a puno; Introduz a agulha na veia mediana, basilica ou ceflica, atingida a veia, aspira o Coleta-se aproximadamente 10 ml de sangue. Em crianas coleta 2 A 5 ML; Retira o garote e em seguida a agulha; Comprime o local puncionado com algodo embebido em lcool; Retira a agulha da seringa e transfere o sangue para os tubos, quando for sangue;

transferido para um tubo contendo anticoagulante. Agita suavemente para facilitar a mistura do sangue como anticoagulante; Ao transferir o sangue para um tubo de ensaio sem anticoagulante. Escorrer delicadamente o sangue pela parede do tubo. Este procedimento evita a hemolise da amostra. Descarta as agulhas e seringas nas caixas de descarpack; Orienta o paciente a pressionar com algodo a parte puncionada, mantendo o brao estendido, sem dobr-lo; 3.4Tecnica para coleta de amostra do sangue capilar Faz assepsia da poupa digital com lcool iodado. Deixar secar. Puncionar com lanceta ou agulha descartavel, desprezando-se a primeira gota Sangue deve fluir espontaneamente, exercendo-se leve presso somente Direciona o tubo de capilar na gota para que o sangue flua ps capilaridade; Limpar o dedo com algodo e aplicar anti-sptico.

de sangue e absorvendo-a com papel de filtro ou algodo seco; quando necessrio;

Anticoagulantes. O sangue coletado com a proporo correta de Anticoagulantes utilizados. EDTA; 1 a 2 mg para cada ml de sangue. Heparina; 1 gota (5.000 U/ml) para cada ml de sangue. Oxalato de K; 1 a 2 mg para cada ml de sangue. Citrato de sdio; 0,5 ml para 4,5 ml de sangue.

3.6 Biossegurana na coleta Todo cuidado pouco na manipulao de materiais biolgicos, tais como soro, sangue, secrees, fluidos orgnicos, tecidos, etc. Redobra-se as precaues, pois esses materiais so potencialmente infectantes e muitas vezes esto contaminados com agentes estiologicos diferentes do que se esta pesquisando, ou ainda desconhecidos. Usa-se sempre Equipamento de Proteo Individual (EPI): jaleco longo de mangas compridas e punho retratil, luvas descartveis evita a formao e disperses de aerossis so micro partculas solidas e liquidas com dimenses aproximadas entre 0,1 e 0,5 micra que podem, no caso de conter microorganismos, permanecer em suspenso e plenamente viveis pr varias horas. Jamais reencapa-se agulhas. Esse procedimento uma das principais causas da contaminao de profissionais de sade por microorganismos, existentes no sangue e em outros fluidos orgnicos, como por exemplo, o vrus da Hepatite B e o HIV. Aps a coleta descartado esse material diretamente em caixas descarpack. Reduz ao mximo o manuseio de resduos, em especial os pefurocortantes. Descarta o rejeito perfurocortante diretamente em caixas descarpack. 4. EMISSAO DOS LAUDOS DOS EXAMES LABORATORIAIS Os laudos esto disponveis no prazo acertado com o paciente, se por algum motivo isto no for possvel, h uma justificativa e, sempre que possvel, o paciente informado no mais curto prazo possvel.

Em caso de laudo que possa oferecer perigo iminente vida do paciente, o laboratrio informa ao mdico assistente e/ou ao responsvel pelo paciente. O laudo datado e assinado por profissional legalmente habilitado com o seu nome completo e legvel, e o nmero do registro no conselho profissional. 4.1 Exames Nome do exame; Material utilizado; Mtodo; Intervalo de referencia com as respectivas unidades e valores de alerta; Informaes necessrias interpretao dos resultados, quando indicada; Concluses, quando indicadas. EXAMES DE SANGUE Acido urico Capac. Total de lig. do ferro Albumina Cetonemia Colesterol fracionado: HDL LDL VLDL

Aldolase Cloretos Ferro colher pela amanh Amilase Creatinina Triglicrides Bilirrubinas Eletroforese de protenas

Uria Clcio Fosfatase acida Colesterol ( sem fracionamento) Fosfatase alcalina CPK total Fsforo CK MB Frutosamina Gama GT Glicose Hemoglobina glicosilada Lipase Potssio Magnsio Sdio Mucoproteinas Transaminases: TGO/AST; TGP/ALT Velocidade de hemossedimentao (VHS) Hemograma Curva de fragilidade osmotica Plaquetas Tempo de protrombina Tempo de tromboplastina parcial ativada PTTa Reticulocitos Eletroforese de hemoglobina Pesquisa de drepancitos Alfa 1 Glicoprotena acida Fator reumatoide Grupo sangneo e fator Rh VDRL

Protenas C reativa Anti HBs Anticorpos antireoidianos: antireoglobulina antimicrossomal Fan HbeAg Toxoplasmose IgG/IgM - ELISA - IFI HAI HbsAg (Antigeno australia) Chagas (T. Cruzii): - IFI HAI ELISA HAV IgG/ IgM Anti Hbe Citomegalovrus IgG/IgM HIV 1 e 2 EXAMES DE URINA ROTINA 1) 2) 2.2 externa. 2.3 Desprezar as primeiras pores da urina e colher o restante no frasco coletor recebido do Labortorio. 2.4 Trazer imediatamente para o Laboratorio dentro do laboratrio dentro do horrio previsto para recebimento de material ( 7:30 s 10:00 hs, manh ). Obs: Paciente Os sexo feminino no devem colher urina no perodo menstrual. Entrega ao paciente um frasco etiquetado com o nmero de registro do mesmo. Da as seguintes instrues ao paciente: Antes de colher a urian, fazer um asseio com gua e sabo na genitlia - Monoteste - Paul Bunnell Davidsohn - Epstein Baar (IFI ou ELISA) - Anti VCA IgG e/ou IgM

Antiestreptolisina O

2.1 - Colher a primeira urina da manh

3) - Paciente feminino no deve coletar a urina no dia em que fizer Exame de Contedo vaginal, pois a paciente dever estar sem asseio e para a coleta de urina ter que assia-se antes. EXAMES PARASITOLGICO FEZES 1) mesmo. 2) 3) Colher o material e trazer para o Laboratorio no horrio estipulado Se houver dificuldade de colher o material pela manha no dia do exame ( 7:30 s 10:00 hs). marcado, pode colher na vspera e colocar na geladeira o frasco coletor. EXAMES DE SECREO VAGINAL E SECREO URETRAL 1) 2) 3) Se a paciente tambm tiver que realizar exame de URINA, o exame de Para fazer exame de Secreo Vaginal a paciente deve vir ao No manter relao sexual 24 hs antes da realizao do exame, Secreo devera ser realizado no outro dia. Laboratorio sem tomar banho ou sem realizar qualquer tipo de asseio. abstinncia sexual de 24 hs. 5. ENTREGA DE RESULTADO 1) 2) Os exames de paciente particulares e SUS ficam no arquivo colocados em ordem alfabtica. Os exames de paciente atendidos pelo hospital so entregues ao mesmo 3) 4) 5) Observa-se o nome completo, idade do paciente. Confere se o nome do paciente no exame com o nome que est na Retira-se o resultado e entrega ao paciente colocados no pronturio. Entrega ao paciente um frasco etiquetado com o numero de registro do

requisio.

6. EXAMES INCOMPLETOS

1) O exame s ser liberado quando o paciente trouxer o restante do material para complementar os tipos de exames que constam da requisio mdica. 2) Solicitamos ao paciente que traga no mximo ate 48 hs. Aps as analises efetuadas, o exame liberado normalmente.

Setor de Lavagem e Esterilizao PROCEDIMENTO OPERACIONAIS PADRES (POP) A importancia de uma boa descontaminao de materiais (ESTERILIZAO) pea imprescindvel para um melhor desempenho dos trabalhos a serem executados em um laboratrio de analises clinicas. O processo de esterilizao o comeo de tudo, sem a mesma os resultados no sero satisfatorios. Faremos uma descrio dos mtodos que so utilizados para a esetrilizao dos materiais do laboratorio. 1 OBJETIVOS 1.1 Gerais Tomar conhecimento dos cuidados na manipulao de materiais contaminados. Devemos tambem ter o conhecimeto de lavagem, secagem empacotamento e esterilizao de materiais reaproveitaveis. 1.2 Especificos Uns dos objetivos mais importantes, o conhecimento de como se deve usar as maquinas, como: AUTOCLAVE, ESTUFA DE SECAGEM E ESTERILIZAO E TAMBM O DEIONIZADOR. 2. EQUIPAMENTO BSICOS Autoclave Estufa de secagem Estufa de esterilizao Deionizador OBS: H de se destacar tambm os materiais usados no processo de lavagem. So estes: Sabao Hipoclorito 1%

3 METODO PARA ESTERILIZAR MATERIAIS:

1. O 1 passo colocar o material contaminado (cogulos e urina) so colocados em frascos plsticos contendo hipoclorito a 1%, pr duas horas vida mdia do hipoclorito. 2. 2 passo os materiais reutilizveis ex: vidrarias so colocados no hipoclorito a 1% pr 30 minutos, 3. 3 passo sabo dextran pr mais 30 minutos, 4. 4 passo lava-se em gua corrente pr 30 minutos, 5. 5 passo mais 30 minutos de molho em gua deionizada, 6. 6 passo so colocados na estufa de secagem. Matrias da microbiologia 1. Os materiais contaminados so colocados na autoclave pr 45 minutos 121C 2. Depois que sair do autoclave, devemos seguir os mesmos passos a partir do 3 descrito acima; 3. Aps a secagem, leva o material para o balco de empacotamento e l, definitivamente separado. Ex: plstico, vidro, etc. 4. Depois de separado, o material colocado na estufa de auto preciso para esterilizao com fita teste. Deve-se salientar que materiais plsticos no devem ir para a estufa de esterilizao, pois a mesma os danificar, devido sua alta temperatura que gira em torno de 180C. O temo que o material deve ficar na estufa de esterilizao de 2 hs. E com relao ao material plstico este e embalado e colocado na autoclave de 15 a 20 minutos. OBS: Para identificarmos um material autoclavado devemos verificar a fita teste, esta deve estar com listras queimadas. Com todos esses passos, ns faremos uma boa esterilizao, pois a mesma os danificar, devido sua alta temperatura que girar em torno de 180C. O tempo que o material deve ficar na estufa de esterilizao de 2 hs. E com relao ao material plstico este e embalado e colocado na autoclave de 15 a 20 minutos.

importante compreender a importancia da esterilizao em todo o processo de trabalho em Laboratorio, bem como o uso de equipamentos essenciais (AUTOCLAVE, ESTUFA DE ESTERILIZAO E SECAGEM E DEIONIZADOR), e procedimentos de lavagem e descontaminao de materiais. 4. DESCARTE DE MATERIAL CONTAMINADO Deve haver POP para o descarte de material contaminado gerado no laboratorio, que so aqueles despejos em estado slido, semi-solido, liquido ou pastoso, apresentando caractersticas de toxidade e/ou atividade biologica, que podem afetar direta ou indiretamente os seres vivos ou causar contaminao das aguas, do ar e do solo. Procedimento para com os materiais. Agulhas (e capilares de hematcrito): Uma vez terminada a coleta do Seringas: Aps o termino da coleta do material, tambem so descartaveis em Algodao, gaze, papeis e material afins: Apos o uso devem ser descartados Swabs, especulos, espatulas, abaixadores de lingua, etc.: Proceder da Urina: Acrescentar uma parte de soluo de hipoclotito de sodio a 1%. Deixa sangue-amostra so desprezadas em caixas descarpack caixas escarpack. em sacos de lixo branco e reforados para posterior coleta pr servio especializados. forma descrita acima. em contatoo pr 2 horas descarta no esgoto sanitario. Os frascos devem ser descaratados em sacos de lixo brancos reforados para posterior coleta pr servios especializados. Fezes: descarta em saco de lixo reforados. Sangue, coagulos e semelhantes: colocar todo o sangue e seus derivados

em um recipiente de plastico resistente. Adicionar soluo de hipoclorito de sdio. Deixar em contato pr 2 horas. Devido decomposio do hipoclorito em contato com o sangue, deve-se adicionar mais hipoclorito, at no haver qualquer formao de espuma. Meios de cultura e despejos e bactriologicos: Dispensa o material o, a esterilizao em autoclave e descartar em lixo especial.

Lminas e lamnulas: No so descartas. Ao recuper-las so submetidas a

um tratamento hipoclorito de sdio a 1% pr 30 minutos. Apos o processo, proceder a lavagem e recuperao.

PROCEDIMENTO DE ROTINA HEMATOLOGIA MANUAL

HEMATOLOGIA A hematologia compreende o estudo das celulas sanguineas e coagulao. Normalmente, os constituintes do sangue (hemacias, leuccitos e plaquetas) permanecem em equilibrio sempre constante devido ao sistema hematopoitico, com funo de formao hemoltica ou de destruio das clulas sanguineas. (O. LIMA, 1992) OBJETIVOS O estudo no Laboratrio de hematologia consiste em analisar clulas sanguineas e a coagulao atraves de exames hematolgicos, podendo assim qualificar e diferenciar as clulas sanguineas. Esses testes realizados possibiltam um diagnostico mais conclusivo, auxiliando clnico no tratamento de uma patologia pr deficiencia hematologica. HEMATCRITO Consiste em determinar em porcentagem a concentrao de eritrcitos em dados volume de sangue no coagula. a razo entr o voluem deeritrcitos em relao ao volume do sangue total. (O. LIMA, 1992)

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MATERIAIS E MTODOS Tubo capilar Bico de bunsen Centrfuga para microhematcrito Tabela para microhematcrito

O tubo de microhematcrito preenchido por capilaridade at da capacidade do

capilar. A extremidade vazia vedada pela chama do bico de bunsen. Colocar os capilares na centrifuga para microhematcrito, com o cuidado de coloca a parte aberta contra o apoio de borracha para evitar quebras e extravasamentos. A ponta selada fica voltada para fora. recomendvel um centrifugao a 3.000 RPM/5 minutos. Aps a centrifugao, o tubo apresenta uma coluna de sangue, incluindo o plasma e uma coluna de eritrcitos. Devem ser medidos com o auxlio da tabela. HEMOGLOBINA (Hb) o principal componente dos eritrcitos. um conjugado de protenas que serve como transporte de O2 e CO2. (O. LIMA, 1992) MATERIAIS E MTODOS Tubos para centrfuga Padro (HiCN Cianetohemoglobina) Reagente de Drabkin Tomar 3 tubos e proceder da seguinte maneira: B 5.0uL P 20uL 5.0uL A 20 uL 5.0uL

Padro Amostra Reag. de Drabkin

Hogenizar. Descansar em temperatura ambiente por 5 minutos. Leitura a 540 nm no espectrfotmetro. Zerar com o Branco. ESFREGAO O exame de esfregao sangneo uma parte importante da avaliao hematolgica. Para obter esfregaos satisfatrio, indispensvel que se tome certas precaues: lminas devem estar limpas e desengorduradas; a gota de sangue no deve ser muito grande. Quanto maior a gota, mais espesso o esfregao. O ideal uma gota de 20uL;

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O esfregao deve ser feito rapidamente, antes que ocorre a coagulao. (O. LIMA, 1992) MATERIAIS E MTODOS Lminas limpas e desengorduradas Lminas de extenso (extensora) Colocar uma gota de sangue no final de uma lmina apoiada em uma superfcie

plana. Com o polegar e o indicador, segura-se o final da lmina de extenso contra a superfcie da primeira lminas. Empurra-se a lmina de extenso a uma velocidade moderada para frente at que o sangue tenha sido espelhado em um esfregao moderadamente delgado. As lminas devem ser secas a temperatura ambiente e depois corada para anlise ao microscpio. conveniente confeccionar vrios esfregaos ao mesmo tempo. Marcar sempre os esfregaos usando agulha ou lpis dermogrfico com o nome do paciente e a data sobre a superfcie do mesmo. COLORAO Os corantes de anilina usados em esfregaos sanguineos so de duas classes gerais: corantes bsicos, como o azul de metileno; corantes cidos, como a eosina. O ncleo das clulas toma as cores bsicas, como o azul de metileno, enquanto que os corantes bsicos agem sobre os elementos citoplasmticos. Pertencem a este grupo os corantes de Romanowsky. Os derivados mais usados do corante primitivo de Romanowsky so: Giemsa. Leishman, Wrigth entre outros. Nesse setor foi usado o corante Leishman. (O. LIMA, 1992) MATERIAL E MTODOS

- Suporte para lminas - Corante de Leishman

Colocar a lamina sobre o suporte. Verter 20 gotas do corante sobre a lamina ou o suficiente para cobri-la. O lcool metilico (metanol) da soluo corante fixa o esfregao. Deixar corar durante 15-20 minutos. Lavar em gua corrente e deixar secar. Observar ao microscpio com objetiva de imerso. CONTAGEM GLOBAL A contagem dos elementos morfolgicos do sangue (eritrcitos, leuccitos e plaquetas deve ser efetuado pala manh. Consiste em trabalhar com material aferido com a finalidade de determinar o nmero dos elementos morfolgicos. Para isso, necessrio diluir volume conhecido de sangue com determinada quantidade de lquido diluidor. Conta-se as clulas na rea reticulada da cmara destinada para cada tipo de clulas (ver Anexos) (O. LIMA, 1992) MATERIAL E MTODOS

Cmara de Contagem (Camara de Neubauer) Lquidos diluidores (hayem, Turk, Oxalato de Amnia 1%) Pipetas graduadas e automticas Lamnulas

Contagem Global de Leuccitos Valores de Referencia: 5.000 10.000 mm3 0.38 mL do lquido de Turk 20uL sangue Diluio = 1/20 Depois de homogeneizar o lquido de Turk com o sangue, umedecer a cmara de

lquido de Turk com o sangue, baixo da lamnula, inserir com auxlio da pipeta

automtica pequena quantidade da soluo diluda. Cuidado para evitar presena de bolhas. Esperar 5 minutos a fim de que os glbulos se depositem. Observar ao microscpio primeiramente com a objetiva de menor aumento e em seguida numa objetiva de 40X. Fazer a contagem nos quadrantes destinados a leuccitos. Contagem Global de Plaquetas Valores de Referncisa: 150.000 400.000 mm3 0.38 mL oxalato de amni 1% 20uL sangue Diluio = 1:20 Depois de homogeneizar o oxalato de amnia 1% com o sangue, umedecer a

cmara de Neubauer e cobri-la com lamnula. Pr baixo da lamnula, inserir com o auxilio da pipeta automtica pequena quantidade da soluo diluda. Cuidado para evitar presena de bolhas. Esperar 10 minutos a fim de que as plaquetas se depositem. Esperar em cmara mida. Observar ao microscpio primeiramente com a objetiva de menor aumento e em seguida numa objetiva de 40X. Fazer a contagem nos quadrantes destinados a plaquetas, que so os mesmo para contagem de eritrcitos. VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAO (VHS) a velocidade com o qual os glbulos vermelhos vo para o fundo do tubo. Os glbulos vermelhos que sedimentam porque a sua densidade maior que a do plasma. A velocidade com que eles sedimentam porque a sua densidade maior que a do plasma. A velocidade com que eles sedimentam varia, direta ou indiretamente com vrios fatores. (O. LIMA, 1992)

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MATERIAIS E MTODOS Tubo de Westergren

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Estante de westergren

O mtodo de Westergren modificado produz os mesmos resultados que o mtodo de Westergren original, mas emprega sangues na coagulado com EDTA ao invs de citrato. Isso permite que o VHS seja realizado com a mesma amostra de sangue que os outros estudos hematolgicos. 2 mL de sangue com EDTA bem misturados so diludos em 0.5 mL de cloreto de sdio a 0.85% ou 0.5 mL de citrato de sdio a 3.8%. Uma pipeta de Westergren completada at a marca 0 (zero) e colocada exatamente na vertical na estante temperatura ambientem, sem vibraes ou exposio direta luz solar. Aps exatamente 60 minutos, a distancia do topoo da coluna registrda em molmetros como o valor da VHS. Se a demarcao entre o plasma e a coluna de clulas vermelhas distinta, o nvel lido onde a densidade total aparece primeiro.Valores de Referncia: Homens: 3-15 mm Mulheres: 3-20 mm Crianas: 3-12 mm

CLULAS LE (Lupus Eritematoso) Um anticorpo presente na frao globulina gama do soro dos pacientes de LES, o chamado fator LE, reage com a nucleoprotena dos ncleos dos leuccitos. O ncleo do fagcito acha-se comprimido na periferia da clula. A maior parte da regio protoplasmtica ocupada pela massa nuclear transformada. O citoplasma reduz-se estreita faixa na periferia do leuccitos. Na clulas LE, a estrutura da cromatina substituda pr massa arredondada, homognea, de colorao prpura, de tamanho varivel, mas usualmente maior que a hemcia. O fagcito pode englobar mais de ncleo. (O. LIMA, 1992) MATERIAL E MTODOS Banho Maria a 37C Toma-se o sangue sem anticoagulante e coloca-se em Banho Maria a 37C/2hs. Depois realiza-se o esfregao e observa-se ao microscopio. Deve-se sempre realizar o exame FAN junto com o exame de clulas LE.

CONTAGEM DE RETICULCITOS Os reticulcitos so clulas vermelhas imaturas no nucleadas que contm RNA e continuam a sintetizar hemoglobina aps a perda do ncleo. O sangue incubado rapidamente em uma soluo de azul cresil brilhante ou azul metileno. No RNA precipitado como um complexo corante ribonucleoprotenas. O complexo aparece microscopicamente como uma rede azul escura ou grnulos azuis escuros que permitem a identificao e contagem de reticulcitos. (O. LIMA, 1992) MATERAIS E MTODOS Esfregao sangneo Conta-se o nmero de reticulcitos em 10 campos diferentes. O esfregao feito a partir de 100uL de sangue + 1 gota de azul cresil brilhante. Valores de Referncias: 0.5 - 2.0% 10 campos = total / 10 = nmero % COAGULOGRAMA Tempo de Sangria (TS) o tempo necessario para a cessao da hemorragia, ocasionando por pequena inciso, de dimenso padronizada, praticada artificialmente. (O. LIMA, 1992) MATERIAL E MTODOS Equipamento para puno digital Papel de filtro Cronmetro Faz-se a assepsia da polpa digital ou do lbulo da orelha com a lanceta, fazer a inciso e deixar o sangue fluir espontaneamente. Marcar no cronometro o incio no momento do aparecimento da primeira gota. Com o papel de filtro absorver de 30 em 30 segundos a gota de sangue formada sem tocar a inciso. Quando cessar o

fluxo de sangue, parar o cronmetro. Quando cessar o fluxo de sangue, parar cronmetro. O intervalo decorrido entre o aparecimento da primeira e da ultima gota representa do tempo de sangria.

Valores de referncia: 1 6 minutos Tempo de Protrombina Ativada (TAP) a prova de escolha para investigao do sistema extrnseco da coagulao sangnea. uma prova de grande valor na demonstrao de deficincia dos fatores de coagulao I, II, V, VII, X. (O. LIMA, 1992) MATERIAL E MTODOS Plasma citratado do paciente Soluo de tromboplastina Banho Maria a 37C Tubos de ensaio Soluo de cloreto de clcio a 0.025M Coloca-se 100uL do plasma citratado do paciente + 100uL da suspenso de tromboplastina no tubo de ensaio. Homogeneiza, adicionar rapidamente 100uL da soluo de cloreto de clcio. Neste instante, acionar o cronmetro. Retirar o tubo do BM e agit-lo suavemente, de 2 em 2 segundos, at o aparecimento do cogulo, parando simultaneamente o cronmetro. O tempo consumido em segundos constitui o TAP. Valores de Referncia: 11 13 segundos Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA)

a melhor prova para investigar as alteraes do mecanismo da coagulao sangnea. Fatores que participam do sistema intrnseco esto envolvidos, com exceo das plaquetas e do fator XIII, bem como do fator VII, do sistema extrnseco. (O. LIMA, 1992) MATERIAL E MTODOS Plasma citratado do paciente Soluo de tromboplastina parcial Banho Maria a 37C Cronmetro Tubos de ensaio Soluo de cloreto de clcio a 0.025 M Coloca-se 100uL de cefalina + 100uL plasma citratado do paciente. Homogeneiza e encuba em Banho Maria a 37C/3 min. Aps esse tempo, adicionar rapidamente 100uL da soluo de cloreto de clcio. Neste instante, acionar o cronmetro. Agitlo suavemente, de 5 em 5 segundos. Ao fim de 30 segundos, retirar o tubo do BM e agit-lo suavemente, observando o aparecimento do cogulo, parando simultaneamente o cronmetro. O tempo consumido em segundos constitui o TTPA. Valores de Referncia: 35 45 segundos CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCCITOS Consiste em determinar a proporo existente entre as distintas variedades de leuccitos. A contagem diferencial de leuccitos dos mais valiosos mtodos entre os exames citolgicos do sangue. (O. LIMA, 1992) MATERIAL E MTODOS Esfregaos corados Deve-se observar a lmina prximo cauda o esfegao onde quase no se encontra roleaux e facilita a contagem. Total de 100 clulas.

FIBRINOGNIO MATERIAIS E MTODOS Tubo capilar Plasma Microcentrfuga Tabela de Hct Banho Maria a 56

Aspira-se o plasma no tubo capilar e encuba-se em Banho Maria a 56C/15 minutos. Leva-se centrfuga para microhematcrito por 5 minutos / 3000 RPM. Faz-se a leitura na tabela para Hct e multiplica o resultado por 92. Valores de Referncia: 200 400 mg/dL INDCES HEMATIMTRICOS VCM = Hct / Hem x 100 u3 HCM = Hb/ Hem x 100 pg CHCM = Hb / 100%

PROCEDIMENTO DE ROTINA SOROLOGIA MANUAL

SOROLOGIA O melhor diagnstico de um processo infeccioso a demonstrao do patgeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos biolgicos do hospedeiro. Nem sempre possivel essa prtica pela ausncia do agente infeccioso ou pela pocua sensibilidade dos mtodos ou por longos perodos exigidos para uma resposta laboratorial. Mtodos parasitolgicos ou microbiolgicos so deficientes para diagnstico de algumas patologias. So utilizados mtodos imunolgicos, sorolgicos ou imunoensaios. So tcnicas para a deteco e quantificao de Ag ou Ac, podendo utiliza-se de reagentes marcados ou no. Comumente so utilizados marcadores radiotaivos, enzimpaticos, fluorescentes e quimioluminescentes. Os testes sorolgicos so feitos atravs de pesquisas de anticorpos pu antgenos, sendo a reao Ag Ac, visualizada pr alguns mtodos como aglutinao, precipitao, floculao e outros. Esses testes de pesquisa de Ag Ac desempenham uma importante funo de diagnstico laboratorial clnico como complemento de outros testes e provas, desde que sejam respeitadas suas indicaes e limitaes. OBJETIVO No setor de sorologia, o principal demonstrar aos estagirios os princpios das tcnicas mais usadas nos testes sorolgicos, assim sua importncia e identificao. A alta sensibilidade dos testes utilizados garante um importancia no setor de triagem sorolgica para seleo de pacientes que podem vir a ser doadores e recptores de orgos, evitando transtornos ps-transfusionais. A Cincia Sorologia tem como principal objetivo pesquisar anticorpos especficos auxiliando, assim, no diagnstico individual de determinadas patologias com tambm diferenciando as fases da doena.

Imunodifuso Radial Simples Prncipio Antgeno ou Anticorpo permanecem fixados ao suporte e o outro se difunde, at haver um halo de precipitao formado pr reao de Ag com o Ac ao redor da inoculao. - Materiais e Mtodos Toma-se uma placa com gel (gar misturado com a diluio apropriada de Ag especfico para Ac determinado) contendo orifcios onde, com ajuda da micropipeta, ser adicionado 5uL do soro. Fecha a placa e guarda em forma invertida em cmara mida, para que mantenha o meio mida, pr 48h a 72h. Valores de Referncia: IgG: 710 1520 mg/dL IgM: 90 310 mg/dL AGLUTINAO A reao de aglutinao caracterizada pela formao de agregados visveis como resultado da interao de anticorpos especficos e partculas insolveis que contm determinantes antignicos em sua superfcie. A aglutinao pode ocorrer tanto com particulas que apresentam determinadas antignicos naturais em sua superfcie (hemcias, bactrias, protozorios, etc.) como com partculas inertes (ltex, poliestireno, etc.), ou mesmo com clulas antigenicamente no relacionadas (hemcias, bactrias) s quais se absorvem ou se fixam antgenos solveis. As reaes podem ser de aglutinao direta ou indireta. A) TESTE DA AGLUTINAO DIRETA Princpio Aglutinao de partculas antignicas insolveis, em sua forma ntegra ou fragmentada, na deteco de anticorpos especficos. Teste bastante utilizado para classificao sanguinea, mononucleose infecciosa e brucelose. - Materiais e Mtodos

Bruceloso (Antgeno Rosa Bengala): uma suspenso de bacilozs em colorao rosa, mistura o bacilo com amostras de pacientes e complexo Ag Ac se aglutina. Mononucleose: Toma-se uma placa de vidro e mistura-se uma gota do soro do paciente com o reagente que contm hemcias de cavalo (ag para mononucleose mais Ac heterfilos). Observa-se a presena de aglutinao. Como os anticorpos heterfilos, que no so especficos para o vrus Epstein-Barr, podem aglutinar as hemcias de cavalo, para o teste positivo realiza-se uma Segunda etapa. Nesta, mistura o soro com clulas renais de cobaia, as quais removam quase todos os anticorpos heterfilos da mononucleose infecciosa. B) TESTE DA AGLUTINAO INDIRETA - Princpio As hemcias e as partculas inertes podem ser sensibilizadas por adsorso passiva, devida aos contatos direto com os Ag solveis. So utilizados como suportes na adsoro de protena solvel e Ag polissacardeos, funcionando como sistema indicador da reao Ag-Ac. AGLUTINAO DO LTEX PCR (Protena C Reativa): reao de aglutinao em lminas, a qual particulas de latex sensibilizadas com Ac anti-PCR estabilizadas so aglutinadas em presena da Protena C Reativa. Materiais e Mtodos a) Determinao Qualitativa: Numa lmina de vidro, com reas para diferentes testes, depositar sucessivamente em 3 subdivises, 1 gota de soro positivo, 1 gota de soro negativo e 1 soro do soro a testar. Adicionar a cada uma delas 1 gota do reativo ltex anti-PCR. Homogeneizar. Fazer movimentos suaves de rotao procedendo a leitura aps cinco minutos. b) Determinao Semi-Quantitativa: Em casode amostra positiva, realizar sucessivas diluio do soro at que se encontre a maior diluio que ainda fornece aglutinao. O procedimento da anlise o mesmo do teste qualitativo, porm, utiliza-

se as amostras diludas. Sendo a sensibilidade do teste de 7UI/mL, o clculo semi quantitativo realizado da seguinte forma: [ ] = 7 x (maior diluio positiva)

FR (Fator Reumatide) - Materiais e Mtodos a) Determinao Qualitativa: Pipetar 1 gota do soro do paciente em uma rea da lmina e , sobre ela, 1 gota da suspenso de ltex sensibilizado com IgG humana altamente purificada e estabilizada e suspensa em tampo glicina. Proceder da mesma forma com os soros controle positivo e negativo. Fazer movimentos suaves de rotao, sob uma boa fonte de luz, durante 2 minutos. Observar a formao de aglutinao. b) Determinao Semi-Quantitativa: Em caso de amostra positiva, realizar sucessivas diluies do soro at que se encontre a maior diluio positiva. O clculo semi quantitativo realizado da seguinte forma: [ ] = 25 x (maior diluio positiva) ASLO (Anti-Estreptolisina O): Reao de aglutinao em lminas, a qual partculas de ltex sensibiladade com estreptolisina O estabilizada so aglutinadas em presena de anti-estreptolisina. O reativo padronizado pr comparao com o padro da OMS. Materiais e Mtodosa) Determinao Qualitativa: Numa lmina de vidro, com reas para diferentes testes, depositar sucessivamente em 3 subdivises, 1 gota de controle positivo, 1 gota de controle negativo e1 gota do soro a testar. Adicionar a cada uma delas 1 gota do latex sensibilidade com ASO. Homogeneizar. Fazer movimentos suaves de rotao. Proceder a leitura em exatamente 2 minutos. b) Determinao Semi-Quantitativa: Em caso de amostra positiva, a partir da diluio 1/20, realizar sucessivas diluies de razo 2 a t 2560 em tampo glicocola. O procedimento da anlise diludas. O ttulo de Ac ASO calculado da seguinte forma:

UI/mL = inverso da ltima diluio positiva x 10. HEMAGLUTINAO INDIRETA Hemcias esto entre os melhores suportes de Ag para os testes de aglutinao, pois uma serie de Ag que pode ser ligada sua superfcie para fornecer um sistema indicador sensvel na deteco de Ac, porm, sua superfcie complexa, facilitando a ligao de muitos Ag e, frequentemente, acarreta a presena de Ac heterfilos que devem ser removidos antes da execuo do teste. CHAGAS - Princpio Eritrcitos de aves estabilizados, sensibilizados com compontes antignicos Trypanossoma cruzi altamente purificados, mostram aglutinao quando reagem com Ac contra esses antgenos presentes no soro do paciente. - Materiais e Mtodos a) Determinao Qualitativa: Colocar a placa sobre um pano mido para neutralizar as foras eletrostticas. Usar 1 cavidade da placa pr amostra, incluindo sempre os controles positivo e negativo. Usar diluio do soro 1/32 com a soluo diluente com os controles positivo e negativo. Transferir 25uL da suspenso homognea de hemcias placa. Adicionar 25uL da suspenso homognea de hemcias em cada cavidade. Agitar a placa pr vibrao mecnica pr 4 minutos. Deixar em repouso por 1 a 2 horas temperatura ambiente, em locar livre de vibraes. Fazer a leitura. Reao positiva como um tapete e reao negativa quando se depositam no fundo da cavidade formando um boto. b) Determinao Quantitativa: Em caso de amostra positiva, deve-se realizar sucessivas diluies (titulao) a partir da diluio do soro de 1/32. Pipetar 25uL da soluo diluente com 2-Mercaptoetanol, a partir da Segunda cavidade da placa, at a diluio que se pretende estudar. Titular sempre deixando 25uL da diluio, desprezar os ltimos 25uL. Pipetar 25uL da suspenso homognea de hemcias em todas as cavidades. Agitar a placa pr vibrao mecnica por 4 minutos. Deixar em repouso pr 1 a 2 horas temperatura ambiente, em local livre de vibraes. Fazer a leitura.

TOXOPLAMOSE - Princpio Eritrcitos de aves estabilizados, sensibilizados com componentes antignicos do Soxoplasma gonddi altamente purificados, mostram aglutinao quando reagem com Ac contra esses antgenos presentes no soro do paciente.

- Materiais e Mtodos a) Determinao Qualitativa: Colocar a placa sobre um pano mido para neutralizar as foras eletrostticas. Usar cavidade da placa por amostra, incluindo sempre os controles positivo e negativo. Usar diluio do soro 1/16 com a soluo diluente com 2-Mercaptonol. Fazer o mesmo com os controles positivo e negativo. Transferir 25uL da diluio 1/16 de cada amostra e controles para as respectivas cavidades da placa. Adicionar 25uL da suspenso homognea de hemcias em cada cavidade. Agitar a placa pr vibrao mecnica pr 4 minutos. Deixar em repouso por 1 a 2 horas temperatura ambiente, em local livre de vibraes. Fazer a leitura. Reao positiva quando as hemcias de depositam no fundo da cavidade como um tapete e reao negativa quando se depositam no fundo da cavidade formando um boto. b) Determinao Quantitativa: Em caso de amostra positiva, deve-se realizar sucessivas diluies (titulao) a partir da diluio do soro de 1/32. Pipetar 25uL da soluo diluente com 2-Mercaptoetanol, a partir da Segunda cavidade da placa, at a diluio que se pretende estudar. Titular sempre deixando 25uL da diluio, desprezar os ltimos 25uL. Pipetar 25uL da suspenso homognea de hemcias em todas as cavidades. Agitar a placa por vibraes mecnicas pr 4 minutos. Deixar em repouso pr 1 a 2 horas temperatura ambiente, em local livre de vibraes. Fazer a leitura. FLOCULAO (VDRL) O teste de VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) emprega cristais de colesterol que so sensibilizados com cardiolipina para a pesquisa de Ac na sfilis. classificado como um teste no treponmico, usado como triagem ou controle da cura.

- Princpio Reao imunolgica de floculao utilizando antgeno de cardiopina, lecitina e colesterol em soluo alcolica, onde as partculas de Ag floculam ao entrar em contato com o soro ou plasma (reagina). - Materiais e Mtodos a) Determinao Qualitativa: Tem como objetivo a triagem e eliminao dos soros no reagentes. Para isso, toma-se uma placa de Kline com suas cavidades devidamente identificadas para cada reao. Pipetar 50uL da amostra a ser analisada e dos soros controle positivo e negativo. Adicionar-se 25uL da suspenso antignica cada cavidade, que ir reagir com os Ac presentes. Colocar lmina em agitador mecnico pr 4 minutos. Fazer leitura em microscpio com objetiva de 10x. b) Determinao Semi - Quantitativa: Tem como objetivo reduzir a pequenos intervalos a quantidade de Ac presentes na amostra. Para tanto, dever ser feita diluio da amostra em soluo salina. Proceder cada diluio do mesmo modo como no teste qualitativo. O ttulo da amostra ser o da ltima diluio onde ainda se visualiza a presena de agregados. UROANLISE Com a anlise da urina, iniciou-se a medicina laboratorial. Foram encontrados hierglifos egpcios com desenhos de mdicos examinado frascos de urina em forma de bexiga. Muitas vezes, esses mdicos nunca viam o paciente, apenas sua urina. Embora no contasse com os sofisticados mtodos atuais, eram capazes de obter informaes diagnsticas a partir de observaes bsicas como cor, turvao, odor, volume, viscosidade e at mesmo presena de acar, ao observarem que certas amostras atraam formigas. interessante notar que essas mesmas caractersticas urinrias ainda so relacionadas plos laboratrios hoje em dia. Contudo os modernos mtodos de uroanlise ampliam seu campo de ao, abrangendo no s o exame fsico mas tambm a anlise bioqumica e o exame microscpico do sedimento urinrio. (STRASINGER, 1998) Analisaremos tambm o LCR (Lquido Cefalorraquidiano). Trata-se de um sistema fisiolgico destinado a distribuir nutrientes pelo tecido nervoso, retirar resduos

metablicos e servir de barreira mecnica para amortecimento dos traumatismos que porventura atinjam o encfalo e a medula espinhal. (STRASINGER, 1998). Por fim, faremos tambm uma anlise do lquido seminal. Com exceo da urina, o lquido recebido com mais freqncia em laboratrios de anlises clnicas. As duas principais razes para sua analise so avaliaes de casos de infertilidade e do estado ps-vasectomia. (STRASINGER, 1998)

MATERIAIS E MTODOS COLETA (STRASINGER, 1998) URINA A amostra deve ser colhida em recipiente limpo e seco. Recomenda-se o uso de recipientes descartveis por serem econmicos e pr eliminarem a possibilidade de contaminao decorrente de lavagem incorreta. O recipiente de amostra deve ser devidamente etiquetado, contendo data e nome do paciente. As etiquetas devem ser postas sobre o recipiente e no sobre a tampa. A amostra deve ser entregue imediatamente ao laboratrio e analisada dentro de uma hora. A amostra que no puder ser entregue ou analisada dentro desse tempo devera ser refrigerada ou receber conservante qumico apropriado. LCR O LCR normalmente colhido por puno lombar entre L3 e L4 ou entre L4 e L5. As amostras geralmente so colhidas em tubos estreis, marcados 1,2 e 3, na ordem em que so obtidos. O tubo 1 usado par anlises bioqumicas e sorolgicas, o tubo 2 destina-se contagem celular e o tubo 3 em geral usado par a microbiologia, por ser o que menos probabilidade tem de conter clulas introduzidas acidentalmente pelo procedimento de puno espinhal. SMEN - Como a composio das fraes do smen varivel, sua coleta deve ser bem feita para que a avaliao da fertilidade masculina seja precisa. Para isso, os pacientes devem ser bem orientados. As amostras devem ser colhidas em recipientes estreis aps trs dias de abstinncia sexual. No recomendvel o uso de preservativos o uso de preservativos na coleta de amostras para os exames de fertilidade, pois podem conter substancias espermaticidas. Sempre que possvel, a

amostra deve ser colhida em laboratrio, mas se isso no for vivel, dever ser mantida em temperatura ambiente e entregue em at uma hora ao laboratrio. Dever ser anotada a hora da coleta e no do recebimento. CONSERVAO (STRASINGER, 1998) URINA - O mtodo de conservao mais utilizado a refrigerao, capaz de evitar a decomposio bacteriana da urina pelo perodo de uma noite. preciso deixar que a amostra volte temperatura ambiente antes da anlise qumica com fitas reativas. Existem vrias conservantes qumicos que podem ser utilizados, portanto impossvel escolher aquele que se ajuste melhor s necessidades da anlise solicitada. LCR - Amostras destinadas a outras anlises bioqumicas e sorolgicas devem ser congeladas. O lquor da seo de hematologia dever ser refrigerado se no for possvel fazer contagem celular do mesmo em uma hora; o da microbiologia mantido temperatura ambiente e analisado o mais depressa possvel. URINA TIPO I (STRASINGER, 1998) TCNICA - Num tubo uroanlise, colocar 10 mL de urina. - Passar a fita reativa e anotar os resultados. Onde for positivo, colocar a alterao. - Calibrar o tubo e centrifugar a 2500 RPM por 5 minutos. - Inverter o tubo no container at que reste 1 ml. - Contar na cmara de Neubauer. EXAME FSICO E FITA REATIVA Analisa-se macroscopicamente alguns aspectos da urina. Mergulha-se a fita na urina e atravs de uma reao de cor analisada-se os seguintes itens: - Cor: Varia de amarelo claro a mbar. - Aspecto: Varia de levemente turvo a fortemente turvo.

- pH: Embora

um indivduo sadio geralmente produza a primeira urina da

manh com pH ligeiramente cido, entre 5.0 e 6.0, o pH normal das outras amostras do dia podem varias de 4.5 a 8.0. - Densidade: uma medida da densidade das substncias qumicas dissolvidas na amostra. Geralmente medida na fita reativa ou pelo refratmetro. A densidade normal da urina varia de 1.010 a 1.030. - Protenas: A constatao de protenas nem sempre significa doena renal, mas sua presena realmente exige a realizao de outras anlises para verificar a normalidade ou anormalidade do quadro. - Glicose: devido sua utilidade na deteco e no controle do Diabetes melito, o teste de glicosria a anlise bioqumica realizada com maior freqncia na urina. - Corpos cetnicos: Normalmente no aparecem em quantidades mensurveis na urina, pois toda gordura metabolizada completamente degradada e convertida em dixido de carbono e gua. - Sangue: Pode estar presente na forma de hemcias ntegras ou de hemoglobina. Se encontrar Hemoglobina e mioglobina na cmara, ter que aparecer na fita. Da pesquisa-se sangue oculto. - Bilirrubina: Sua presena pode ser a primeira indicao de hepatopatia, e muitas vezes detectada bem antes do desenvolvimento de ictercia. - Urobilinognio: um pigmento biliar resultante da degradao da hemoglobina. Aparece na urina porque, ao circular no sangue a caminho do fgado, pode passar pelos rins e ser filtrado plos glomrulos. - Nitrito: um mtodo rpido de detectar infeces do trato urinrio. EXAME QUMICO E SEDIMENTOSCOPIA Na cmara de Neubauer, conta-se os 4 quadrantes laterais (eritrcitos) e multiplica por 250 ou conta 1 quadrante e multiplica por 1000. Este ltimo mais utilizado. Faz-se isso para contagem de hemcias e leuccitos. Procura-se por: - Hemcias - Leuccitos - Clulas

- Cilindros: Pode ocorrer em exerccios fsicos intensos. Conta-se os 4 quadrantes e multiplica por 110. Os mais encontrados so os epiteliais e os hialinos. Se tem cilindros, tem protenas. - Bactrias: Podem apresentar bactrias nitrificantes e no nitrificantes. Se tem bactrias, tem leuccitos. - Leveduras: Ocorre quase sempre em glicosria e conta-se em cruzes de 1a 4. - Muco - Cristais: Caso encontrados, soltar resultados em cruzes de 1 a 4. Em RN comum encontrar cristais de urato. - Outros - Parasitas, espermatozides, clculos, artefatos, etc. TESTES BIOQUMICOS - Proteinuria 2 mL de Ac. Sulfossaliclico a 3% 0,5 mL de urina Homogeneizar. Resultado: + Formao de turvao - Protena de 24 hs (Quantitativo) Homogeneizar a amostra e medir o volume com preciso. cido Sulfossaliclico gua destiliada Amostra Branco 2.0 mL 0.5 mL Amostra 2.0 mL 0.5 mL

Homogeneizar, aguardar 10 minutos em TA e verificar a Abs. em 560 nm. Resultado: Ptn 24 hs: volume 24 hs x Fator (1.74) x Abs. A V.R.: at 150 mg/dL - Protena Ortosttica ou Postural

Ocorre em paciente que permanece, longos perodos sentados ou em p, onde os rins so comprimidos pelos rgos superiores - diminuio da reabsoro de protena - proteinuria. Coleta-se um amostra aps o paciente ter permanecido um perodo sentado (2 hs) - RESULTADO POSITIVO. Para confirmao, coleta-se uma outra amostra, a primeira da manh RESULTADO NEGATIVO - Ptn Ortosttica ou Postural. - Protena de Bence Jones Mieloma mltiplo - Proliferao dos plasmcitos - Liberao de microglobulinas (Bence Jones) - Baixo peso molecular - Proteinuria. Levar cerca de 5 mL de urina ao BM 50 - 60C e levar ao BM 100 por 5 minutos. Se ficar lmpida, confirma-se Protenas de Bence Jones. Se continuar turvo, pode ser qualquer outro tipo de protena. Caracterstica: Desnatura aos 50-60 C e torna-se lmpida aos 100 C. Se der positivo, confirmar com eletroforese ou contraimunoeletroforese. - Glicosria 2 mL de Reativo de Benedict 4 gotas de urina Homogeneza. Coloca em banho fervente por 5 minutos. + Resultado: Marron Tijolo: ++++ Verde com sedimento amarelo: +++ Verde sem sedimento amarelo: ++ Verde claro: + Azul: Negativo - Corpo Cetnicos 1 mL de urina 6 gotas de Reativo de Imbert

Homogeneizar Acrescentar 1 mL de hidrxido de Amnia vagarosamente pelas bordas do tubo. Resultado Formao de halo roxo entre duas fases. URINA TIPO II (STRASINGER, 1998)

Faz-se a anlise tipo II geralmente em casos de cirrose, hepatopatias, anemia hemoltica. Pesquisa-se: PESQUISA DE HCG (STRASINGER, 1998) - Gravidez com resultado negativo Estgio inicial Gravidez ectpica Trimestre final da gravidez - Ausncia de gravidez com resultado positivo (raro) Menopausa - gonadotrofina hipofisria Endocrinopatias LH

-Resultado positivo com taxa elevada de HCH Doenas trofoblsticas: Mola hidatiforme Coriocarcinoma Observaes: - Esse hormnio aparece primeiramente no soro e, depois da sobrecarga sangunea, excretado na urina. Reao de aglutinao em ltex Imunocromatocrfico (Ac monoclonal)

- No trimestre final pode ocorrer HCG negativo em caso de aborto, com a placenta inativa. - Doenas trofoblsticas liberam grande concentrao de HCG. - Pesquisa de HCG em homens: suspeita de CA de testculo.

- Urobilinognio 2,5 mL de urina 0,5 mL reativo de Erlich Positivo se forma colorao vermelha. Caso de positivo, realizar diluio sucessivas, comeando com 1,0 mL de urina + 9,0 mL de gua destilada. Diluio de 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160. Adiciona 1,0 mL de reativo de Erlich. Resultado: Urobilinognio: 1/? EU (Unidade Erlich) - Pigmentos Biliares 1,0 mL cido ntrico 1,0 mL de urina, pelas bordas do tubo, vagarosamente. Positivo se formar um halo verde. - Pesquisa de Sangue Oculto Centrifugar 10 mL de urina a 2000 RPM pr 5 minutos. Desprezar todo o sobrenadante Acrescentar 6 gotas do Reativo de Benzidina Positivo se formar um colorao de azul a verde. Reativo de Benzidina: Uma porode Benzina 1,0 mL H2O2

1,0 mL de cida actico 50% Homogeneizar Preparar o reativo somente na hora do uso. HCG de 24 horas

Sucessivas diluio a comear de 1 / 2. Resultado: Volume de 24 hs x ultima diluio positiva x 2,5 = ? UI/24 horas

LQUIDO CORPORAIS (STRASINGER, 1998)

- ANLISES DO LCR A) Exame fsico Aspecto: Antes de centrifugar: vermelho / turvo Depois de centrifugar: deve diferenciar o LCR Para diferenciar Puno Traumtica de hemorragia Intracraniana. 1) Aps centrifugao PT: forma sedimento (boto de hemcias e sobrenadante lmpido) HI: no forma sedimento. 2) Distribuio desigual de sangue nos tubos PT: a quantidade de sangue vai diminuindo nos tubos. HI: Os trs tubos permanecem vermelho por igual. 3) Formao de cogulo PT: no forma cogulo HI: forma cogulo B) Exames microscpico a) Contagem Global - Leuccitos:--- mm - Hemcias: 0-5 / mm; RN.: at 100/mm

Homogeneizar o material e preencher a cmara de Fuchs Rosenthal. Contar todos os quadrantes e dividir o nmero de clulas contadas por 3. b) Contagem Diferencial Concentrar o material e fazer esfregao com a cmara de Suta. Corar com Leishman, Wright ou Giemsa. Contar 100 Clulas: - neutrfilos (Meningite bacteriana) - linfcitos (Menegite viral) - eosinofilos (Neurocisticercose) - moncitos (Meningite turbelosa e fngida) C) Exame qumico Glicose (60% glicose plasmtica) Protena: 15 - 40 mg/dL - ESPERMOGRAMA A) Fases 1 fase: Liquefao primria ou virtual 2 fase: Coagulao (durao at 30 minutos) 3 fase: Liquefao secundaria. Ausncia dessa fase INFERTILIDADE B) Contagem Global Homogeneizar a amostra e diluir em 1/40 (3.9 mL solvente fisiolgico + 100uL de esperma). Preencher a cmara de Neubauer. Contar SPTZ em objetiva de 40 X nos quadrantes laterais e central, multiplicar o nmero o contado por 80.000. Se a quantidade de SPTZ for muito elevado, contar apenas o quadrante central e multiplicar por 400.000. Resultados expressos em mL. V.R.: 60 milhes/mL

C) Viabilidade Em um tubo, colocar uma gota de esperma e acrescentar 2 gotas de eosina + 2gotas de nigrosina. Confeccionar esfregao e secar rapidamente. Verificar a quantidade de SPTZ vivos (brancos) e mortos (vermelhos) - Objetiva de imerso. Vivos: mais do que 70% Mortos: menos do que 30%

PROCEDIMENTO DE ROTINA PARASITOLOGIA

EXAME PARASITOLOGIA DE FEZES O exame utilizado no diagnstico das parasitoses intestinais e tem como objetivo o encontro de trofozotas e cistos de protozorios e ovos ou larvas de helmintos. Um resultado parasitolgico negativo no exclui a possibilidade de infeco por parasitas, levando em considerao a idade da infeco e as "fases negativas" de determinados parasitas, como a Girdia lamblia, por exemplo. Os ovos de Taenia sp. (solitria) e Enterobius vermicularis (oxirus) raramente so encontrados nas fezes, sendo mais comumente encontrados na regio perianal. Os seguintes parasitas intestinais so patognicos e devem ser erradicados: - Ascaris lumbricoides - Capillaria heptica - Clonorchis sinensis - Blastocystis hominis - Cyclospora - Cryptosporidium (quando em imunodeprimidos) - Dientamoeba fragilis - Dipylidium caninum - Diphyllobotrium latum - Entamoeba hispolytica - Enterobius vermiculares - Girdia lamblia - Hymenolepis diminuta

- Hymenolepis nana - Isospora belli - Isospora spp. - Microspordia - Progonimus westermani - Strongyloides stercoralis - Trichuris trihiura - Schistosoma mansoni - Ancilostomideos No necessria medio quando so encontrados os seguintes parasitas no patognicos: - Chilomastix mesnili - Cryptosporidium (quando em imunocompetendes) - Endolinax nana - Entamoeba coli - Entamoeba hartmani - Iodanoeba btschlii MATERIAL / AMOSTRA A amostra fecal deve ser colhida diretamente no frasco ou em um urinol, ou ainda em jornal ou papel limpo, e transferidas diretamente para o frasco coletor. O frasco coletor deve estar livre de anti-spticos, agentes germicidas, de gotas de leo e de urina, para evitar a destruio de formas vegetativas dos parasitas. Fezes obtidas de vasos sanitrios no podem ser utilizadas. Cada amostra dever apresentar no mnimo, as seguintes informaes: nome do paciente, nmero de identificao, nome do mdico, data e horrio da colheita, e dever vir acompanhada do pedido mdico indicando qual o procedimento laboratorial a ser seguido.

Os recipientes com amostras fecais recebidos de pacientes com AIDS devero ser protegidos por um invlucro de plstico e identificados com etiquetas vermelha ou HIV positivo. O ideal para a certeza diagnstica a realizao de exames em trs amostras obtidas em dias alternados. O uso de laxantes s indicado caso haja uma srie de exames negativos em pacientes com suspeita clnica. Nestes casos administrar laxantes salinos. leos minerais (nujol etc.) e compostos de bismuto e magnsio no devem ser empregados por interferirem no resultado dos exames. As fezes obtidas por uso de laxantes devem ser levadas imediatamente ao laboratrio. O tempo de colheita da amostra fecal influncia diretamente na identificao dos parasitas. Por essa razo amostra fecais diarricas e pastosas devem ser levadas ao laboratrio aps no mximo, 30 minutos aps a evacuao. As amostras fecais slidas devem ser entregues no laboratrio at 2 horas sem refrigerar e no mximo at 14 horas se mantidas sob refrigerao (no congelar!). Quanto ao uso de medicamentos, o ideal no ter usado anti-parasitrios e antibiticos nas ltimas 3 semanas e antidiarricos e antiinflamatrios nas 72 horas que antecedem a coleta. METODOS - Tcnicas de concentrao: mtodos de Faust (centrifugao-flutuao em soluo saturada de sulfato de zinco) e mtodo de Lutz sedimentao espontnea em gua) - Exame direto fresco: realizado se a amostra for diarrica ou se apresentar muco, pus ou sangue. - Exame quantitativo para contagem de ovos de helmintos nas fezes: mtodos de KatoKatz. - Tcnica de isolamento de larvas de nematdeos: mtodos de Rgai. PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES ou Hoffman, Pons Er Janes)

O teste realizado no auxilio ao diagnstico de leses sangrantes da mucosa de pores baixas do trato digestrio (especialmente leses dos clons) e como mtodos de triagem no diagnostico precoce do cncer dos clons em indivduos acima dos 40 anos. A pesquisa de sangue oculto nas fezes deve ser precedida de dieta rigorosa por quatro dias, da qual se excluem as carnes, os vegetais verdes (clorofila) e os medicamentos base de ferro; e deve ser feita em amostra fecal recentemente emitida. MTODO DE EXAME DIRETO FRESCO Um procedimento simples e eficiente para o estudo das fezes, permitindo observar as formas trofozotas vivas dos protozorios. Os esfregaos com fezes frescas e no fixadas so preparados com solues salina fisiolgica a 0,85% e de Iodo de Lugol, separadamente. Os esfregao devero ser sistemticos e completamente examinados atravs de objetiva de microccpio de pequeno aumento (10x) e com pequena intensidade de luz. A confirmao dos parasitas deve ser realizada com objetiva de grande aumento (40 x). SOLUO SALINA FISIOLGICA A 0,85% Cloreto de sdio (NaCI) ---------------------------------------------------------------------------- 8,5 g gua destilada-deionizada ----------------------------------------------------------------------1000 ml MTODO DE CENTRFUGO-FLUTUAO EM SOLUO DE SULFATO DE ZINCO (MTODO DE FAUST et al., 1938) Procedimento utilizado para diagnostico de cistos de protozorios e ovos de larvas de helmintos, ovos grandes de trematdeos, de cestdeos e infrteis de Ascaris lumbricoides no so concentrados por este mtodo, devido sua densidade ser maior do que a da soluo ser sulfato de zinco utilizada, no permitindo sua flutuao. um mtodo imprprio para fazer contendo grande quantidade de gordura. Colocar 1 ou 2 g de fezes coletadas de vrias partes do boldo fecal em frasco contendo 10 mL de gua corrente.

Homogeneizar e filtrar a suspenso atravs de gaze dobrada quatro vezes, e receber o filtrado em um tubo cnico de centrfuga de 15 mL. Adicionar gua corrente at completar 2/3 da capacidade do tubo. Centrifugar a 2.500 r.p.m por 60'. Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 mL de gua corrente ao sedimento, antes de ressuspend-lo. Completar com gua corrente 2/3 do volume do tubo, agitar e centrifugar. Repetir a etapa anterior at que o sobrenadante apresente-se relativamente claro. Depois que o ltimo sobrenadante descartado, adicionar a 1 a 2 mL de soluo de sulfato de zinco (d= 1,18 g/mL) e ressuspender o sedimento. Completar com o mesmo reagente at 0,5 cm da borda do tubo e centrifugar. Cuidadosamente, remover o tubo da centrifuga e, sem agitao, coloc-lo em uma estante em posio vertical. Com uma ala de arame (dimetro de 5 e 7 mm) tocar o centro da membrana formada na superfcie, transferindo varias aladas para uma lmina de microscpica. Colocar 1 gota de Lugol e lamnula. Examinar no microscpio ptico em aumento de 100x.

SOLUO DE SULFATO DE ZINCO (d= 1,18 g/mL) - sulfato de zinco (ZnSo4) ------------------------------------------------------------------------- 330 g - gua destilada-deionizada --------------------------------------------------------------------- 670 mL Ajustar a densidade da soluo com densitmetro pela adio de sal ou gua e filtrar em papel-filtro. MTODO DE SEDIMENTAO ESPONTNEA EM AGUA (MTODO DE LUZTZ, 1919; HOFFMAN, PONS E JANER, 1934) Mtodo indicado para pesquisa de ovos e larvas de helmintos e cistos de protozorios. Fundamenta-se na sedimentao espontnea em gua, havendo uma

necessidade mnima de vidrarias e sendo dispensvel o uso de reagentes e centrifugao. - Colocar cerca de 5g de fezes, coletados de vrias partes do bolo fecal, em um corpo graduado ou em bequer de 250 mL. Completar o volume de 50 a 60 mL com gua corrente e homogeneizar. - Preparar a suspenso adicionando 100 mL de gua corrente. - Filtrar essa suspenso de gaze dobrada quatro vezes, recolhendo-se em clices de sedimentao com capacidade de 125 mL. - Se necessria adicionar gua corrente at completar aproximadamente 3/4 do volume do clice cnico. Deixar a suspenso em repouso durante 1 a 2 horas. - Com uma longa pipeta capilar ou em canudo plstico, colher uma pequena poro do sedimento e depositar sobre uma lmina de microscpica. Se o sedimento estiver muito espesso, diluir com uma gota de soluo salina a 0,85% ou gua corrente. - Colocar 1 gota de Lugol e cobrir com lamnula. Examinar no microscpio ptico em aumento de 100 x. OBS: A amostra pode ser sedimentada por um tempo maior, a fim de aumentar a concentrao de cistos de protozorios e ovos leves de helmintos no sedimento. MTODO MODIFICADO DE KATO-KATZ (KATO, 1960; KATZ, CHAVES & PELLEGRINO, 1972) um mtodo de esfregao espesso em celofane, amplamente utilizado na rotina para determinar quantitativamente o nmero de ovos por grama de fezes (OPG). - Colocar a amostra fecal sobre papel absorvente. - Comprimir a tela metlica (60 ou 80 malhas) ou de nilon (105 malhas) sobre as fezes, fazendo com que parte passe atravs das malhas. - Remover as fezes que passam atravs das malhas e transferi-las para o orifcio de um carto retangular (3 cm x 4 cm x 1,37 mm, com orifcio central de 6 mm de dimetro), colocado sobre uma lmina de microscpica.

- Depois de preencher o orifcio do carto com a amostra, remov-lo com cuidado, deixando as fezes na lmina. - Cobrir as fezes com uma lamnula de celofane, invertendo e pressionando a lmina sobre o papel absorvente. - Deixar a preparao em repouso para clarificao da amostra durante 30 minutos a 34 - 40C ou temperatura ambiente por 1 a 2 horas. - Examinar a preparao no microscpio ptico em aumento de 100 x. - Contar o nmero de ovos. - O nmero de ovos presentes na preparao multiplicado pelo fator 23 dar o nmero de ovos por grama (OPG) de fezes.

SOLUO AQUOSA GLICERINADA DE VERDE MALAQUITA - soluo aquosa de verde malaquita a 3% (m/v) ------------------------------------------- 1 mL - soluo aquosa de fenol a 6% (m/v) -------------------------------------------------------- 100 mL - glicerina -------------------------------------------------------------------------------------------- 100 mL

MTODO PARA ISOLAMENTO DE LARVAS DE NEMATIDEOS (MTODO DE RUGAI, MATTOS & BRISOLA, 1954) Este mtodo fundamenta-se no termo e hidrotropismo positivo das larvas de nematdeos, indicado para pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis. - Estender, sobre a abertura de um recipiente contendo fezes, gaze dobrada quatro vezes, e repuxar as extremidades para trs. - Encher, com aproximadamente 70 a 100 mL de gua corrente aquecida a 40 - 50 C, um clice cnico de sedimentao (capacidade 125 mL). - Transferir o recipiente com as fezes para o interior do clice de sedimentao, de modo que o lquido alcance toda a extenso da abertura do recipiente, cuidando para no haver formao de bolhas de ar. - Deixar em repouso durante 60 minutos.

- Colher o sedimento entre lmina e lamnula no menor aumento do microscpio ptico, ou em um vidro de relgio, com auxilio de uma lupa. COPROTEST - Princpio: Centrfugo-sedimentao. - Finalidade: Pesquisa de ovos, cistos e larvas. Abra o frasco cuidado cuidadosamente para no derramar o contedo; Colher a amostra e colocar na cavidade do coletor; Agite o frasco vigorosamente por mais ou menos 2 minutos; Em um tubo graduado, colher 7 mL da amostra, acrescentando 1 gota de detergente e 3 ml de acetato de etila comercial; Tampe o tubo, agite e centrifugue a 1.500 RPM/ 2 minutos; Despreze o sobrenadante com cuidado; Acrescente 1 gota de lugol e 1 gota de soluo fisiolgica ao sedimento; Ressuspenda o sedimento, colha 1 gota na lmina e cubra com lamnula; Observar ao microscpio com aumentos de 10X e 40X.

PROCEDIMENTO DE ROTINA MICROBIOLOGICA

MICROBIOLOGIA Nos Molecular. No campo da Microbiologia Geral, enormes progressos foram realizados com referncia anatomia qumica e morfolgica da clula bacteriana, biossntese da macromolcula e gentica de m. o. Tudo isso contribui fundamentalmente Gentica Moderna. (BIER, 1990). OBJETIVOS O objetivo dos estudos no setor de Microbiologia demonstrar aos alunos estagirios uma viso ampla das principais tcnicas e mtodos dentro de um laboratrio, com fins diagnsticos. Observa-se tambm uma padronizao e simplificao da metodologia utilizada na identificao desses microorganismos. MEIOS DE CULTURA ltimos 30 anos, a Microbiologia e Imunologia evoluram

extraordinariamente como cincia multidisciplinares, em relao estreita com a Biologia

Para o cultivo de bactrias podem ser utilizados meios lquidos, slidos ou semi-slidos. Meios lquidos permitem o crescimento indiferenciado de todas as bactrias contidas na amostra promovendo turvao do meio. Meios slidos possibilitam crescimento de amostras de bactrias puras. Sua consistncia slida devido adio de gar e o simi-slido contm menor quantidade gar e utilizado geralmente para verificar a motibilidade das bactrias. Meio slido 1.5% de agar Meio semi-slido 0.4% de agar

Classificao - Meio Diferencial Permitem a distino entre 2 ou mais tipos de bactrias pela simples observao das caractersticas apresentadas pelas colnias que nele se desenvolvem. Ex: gar Sangue; Meio de MacConkey. - Meio Seletivo Meios que contm substancia capazes de inibir o crescimento de determinados grupos de bactrias sem restringir o crescimento de outras. Ex: gar Sangue; Meio de MacConkey. - Meio de Enriquecimento Rico em nutrientes que proporcionam o aumento do nmero de bactrias. Preparo de Meios Forma preparados meios de cultura, para utilizao durante o estagio, seguindo a formula indicada pelo fabricante de cada meio. Tcnicas de Semeadura - Esgotamento Consiste em espalhar o material biolgico com auxilio da ala, fazendo estrias prximos at o esgotamento do material, para que haja um bom isolamento das bactrias. - Atapetamento Geralmente utilizado para contagem de bactrias de amostra urinaria, onde utiliza-se a ala da Dirigalsky.

- Espalhamento Utilizado para espalhar todo o material biolgico por toda a placa, com auxlio da ala de platina em, pelo menos, 3 sentidos. - Semeadura em tubos Podem apresentar-se em forma de gar inclinado, lquidos ou semi-slidos. Para a inoculao, usa-se a ala bacteriolgica e na transferncia de cultura pura e placas para tubos usa-se agulha bacteriolgica. Colorao de GRAM A maioria das amostras colhidas, quando se suspeita de infeco bacteriana, deve se aplacada a lminas de vidro, coradas pelo Gram e examinadas ao microscpio. - A lmina fixada e tratada com soluo de cristal violeta 1 a 2 minutos; - Lavar com gua e escorrer; - Descorar rapidamente pelo lcool a 95%; - Lavar com gua e escorrer; - Cobrir com soluo de fucsina, durante 30 segundos para contra corar; - Lavar com gua, secar com papel de filtro, observar na objetiva de imerso (100x).

Diferenciao de Bactrias Para bactrias Gram positivas faz-se a prova da catalase, onde reao positiva indentifica Staphylococcus e a reao negativa identifica Streptococcus. 1) Identificao de Bacterias - PROVA DA CATALASE Os staphylococcus produzem a enzima catalase

(peroxidase) que capaz de decompor o perxido de hidrognio (H2O2) em O2O. Execuo: preparar um suspenso do crescimento bacteriano em H 2O destilada na superfcie da lmina e adicionar 1 a 2 gotas de H2O2 a 3%. O aparecimento de bolhas indica reao positiva. O aparecimento de bolhas indica reao positiva. Para a diferenciao entre as espcies de Staphylococcus, necessrio proceder s provas bioqumicas, a partir de amostra isolada.

- PROCA DA COAGULASE A coagulase ligada esta localizada na superfcie da parede clulas e reage com caldeias e do fibrinognio plasmtico, provocando a formao de cogulo visvel, resultando em uma reao positiva. Coagulase + - S. aureus Coagulase - - S. epidemeridis ou S. saprophyticus - PROVA DA DNASE Determina a atividade da enzima desoxirribonuclease produzida por amostras de S. aureus. Execuo: Semeadura da amostra em gar DNAase. Incubar a placa a 35 37C / 18-24 hs. Cobrir a placa com soluo de cido clordrico a 1N. Resultado positivo se d pela formao de um halo ao redor da colnias e resultado negativo evidencia truvao uniforme em toda superfcie do meio. - TESTE DE SENSIBILIDADE NOVOBIOCINA Diferencia os staphylococcus coagulase negativos de importncia mdica. Execuo: Semeia-se o microorganismo em gar sangue e aplica-se disco de Novobiocina. Incuubar a placa a 35 37 C / 18-24 hs. Formando-se um halo de sensibilidade caracteriza-se presena de S. epidermidis. ESQUEMA: Catalase + - Staphylococcus Catalase - - Staphylococcus

Coagulase DNAase Sensibilidade Novobiocina

S. aureus + + Sensvel

S. epidermidis Sensvel

S. saprophyticus Resistente

2) Identificao de Streptococcus A designao mais utilizada tem por base os tipos de hemlise em placas de gar sangue: - Hemlise total - -hemoltico - Hemlise parcial hemoltico - Ausncia de hemlise Y hemoltico As colnias podem ser repicadas para caldo HBI por 6 a 8 horas ou retiradas do crescimento inicial em gar sangue para realizao das provas de identificao. - TESTE CAMP Principio dado pela atividade hemoltica do staphylococcus produtor de beta lisina em eritrcito fundamentada por um fator extracelular, de constituio protica, produzida pelo estrephytococcus de grupo B, chamado fator CAMP. Uma reao beta-hemoltica acentuada quando estes m.o. reagem sinergicamente, em placas de gar sangue. Execuo: Semeia-se uma estria de Staphylococcus aureus produtor de beta lisina no centro de uma placa de gar sangue feita com sangue de carneiro. Estria, perpendicularmente, o strephytococcus a ser identificado, de modo que as estrias no se toquem. Incubar a placa a 37C/ 24hs. Um alargamento da zona do lise no ponto de interseo entre as duas estrias, que toma a forma de ponta de lana, evidencia-se prova positiva para S. agalactiae, strephytococcus Hemoltico do grupo B. - PROVA DA BILE ESCULINA Os strephylococcus do grupo D em meio com bile na concentrao de 4%, hidrolisam a esculina, originando a esculitina a qual reage com citrato frrico contido no meio, provocando o escurecimento do meio em torno das colnias. Execuo: Semeia-se 2 a 3 colnias, da placa de gar sangue, em tubo com gar bile esculina esculinado. Incubar a placa a 37 C/24hs. O escurecimento em torno do crescimento evidencia-se prova positiva.

- PROVA DE TOLERNCIA A 6.5% DE NACL Os strephytococcus do grupo D em meio contendo 6.5% de NaCl e modificam sua colorao so classificados como enterococos , os negativos so os no enterococos. Execuo: Inocula-se 2 a 3 colonias suspeitas em caldo HBI contendo 6.5% de NaCl, 1% de glicose e um sistema indicador de pH. Incubar a placa a 37C/24hs. O crescimento com conseqente mudana de colorao do meio indica se tratar de amostras E. faecalis. - TETE BA BACITRACINA Em concentrao de 0.04 mg, a bacitracina age seletivamente sobre os strephytococcus hemoltico do grupo A de Lacenfield inibindo a sntese do peptidoglicano e alterando a seletividade da membrana celular. Com isso, impedindo que as bactrias se desenvolvam na regio do meio de cultivo onde houve a difuso do sal, acarretando a formao de um halo de inibio. Execuo: Inocular na superfcie de uma placa de gar sangue colnias suspeitas, vindas do caldo HBI ou da placa incial. Aps secagem, aplica-se o disco de bacitracina no centro da rea semeada, pressionando levemente para conferiir aderncia. Incubar a placa a 37C/24hs. Resultado positivo para S. pyogens do grupo A conferido com o aparecimento de um halo de inibio. - TESTE DA OPTOQUINA A optoquina (cloridrato de estilhidrocuprena) altera seletivamente a membrana celular do S. pneuminiae, servindo como os estrephytococcus ao grupo viridans. Execuo: Semear de 2 a 3 colonias da bactrias suspeita em plac de gar sangue. Aps secagem, aplica-se o disco de optoquina, na concentrao de mg no centro da rea semeada, pressionando levemente para conferir aderncia. Incubar a placa a 37 C/24Hs, em jarra com vela. Crescimento de halo de inibio de 14 a 18 mm indica sensibildade caracterisitca de S. pneumoniae. Em caso de resitencia optoquina com bile sculina negativa, trata-se de S. viridans. Enterobacteias (bastonetes Gram negativos)

Os bastonetes Gram negativos encontrados em laboratrios so classificados em 2 grupos: - Produo de cidos a partir da oxidao da glicose. Principais gneros: Pseudomonas, Alcaligenes e Acinetobacter. - Produo de cidos a partir da fermentao da glicose. Principais genereos: famlia enterobacteriaceae (oxidase negativos) e os no pertencentes a essa famlia (oxidase positivos). PROVAS BIOQUMICAS - URIA Determina a capacidade de um m. o. em degradar enzimaticamente molculas de uria do meio, formando carbonato de amnia. A hidrlise catalisada de forma especifica pela urase produzindo 2 molculas de amnia. O vermelho de fenol que funciona como indicador, torna o meio rosa-avermelhado quando a reao for positiva. - MILI a) LISINA Baseia-se na produo de lisina descarboxilase e liberao de gs sulfdrico. A reao positiva favorecida com o aparecimento de cor prpura, que coincide com a cor inicial do meio. Reao negativa caracterizada por uma colorao amarelada. A produo de H2S evidenciada pelo aparecimento de um precipitado negro. b) MOTILIDADE Caracterizada pelo aparecimento de turvao uniforme em toda extenso do meio. Bactrias imveis crescem apenas no local da inoculao. c) INDOL evidenciado aps degradao do aminocido triptofano pelas triptofanases. A positividade conferida pela adio do Reativo de Kovacs, onde se forma um anel vermelho na camada superficial do meio. - CITRATO Baseia-se na utilizao do citrato como nica fonte de carbono. Utiliza-se o bromotimol como indicador de pH, que oferece colorao amarela em meio cido e azul em meio alcalino.

- TSI Determina a habilidade de um m. o. em utilizar carboidratos especficos existentes no meio bsico com ou sem produo de gs ou H2S. a) FERMENTAO DA GLICOSE Observa-se no fundo do tubo a degradao protica que insuficiente para reverter o pH cido estabelecido, mantendo o meio amarelo. b) FERMENTAO DA LACTOSE E SACAROSE o tubo permanece amarelo no pice do meio devido a alta concentrao de cidos produzidos. c) PRODUO DE GS Evidencia-se o aparecimento de bolhas ou rachaduras no meio. d) PRODUO DE H2S- Reao com sulfato ferroso contido no meio, resultando em um precipitado negro. - FENILALANINA Para se fazer a leitura, deve-se adicionar 4 gotas de cloreto frrico que reage com o cido fenilpirvico. Se positivo, promove colorao verde. Se negativo, promove colorao amarela. - VM Para se fazer a leitura, acrescenta-se 5 gotas de vermelho de metila, eu por ser um indicador cido, indica o grau de acidez por modificao de cor. Reao positiva dada por cor vermelha (pH = 4.5) e negativa com cor amarela (pH= 6.0). - VP Evidencia a capacidade da bactria em produzir compostos neutros, a partir da fermentao da glicose. UROCULTURA - Coleta Faz-se assepsia no local antes da coleta. Coleta-se o segundo jato usando frasco estril.

- Conservao Manter o material na geladeira pra inibir o crescimento bacteriano. Meios de Cultura a) CLED Meio no seletivo, diferencial para fermentao da lactose, formando colnias azuis quando lactose negativa. Utiliza-se como tcnica de semeadura o mtodo da ala calibrada de 0.01uL ou 0.001 uL, para que se possa fazer a contagem das colonias e posteriormente diagnosticar se h infeco ou no. - abaixo de 10.000 ufc/mL contaminao - entre 10.000 e 100.000 ufc/mL suspeita - acima 100.000 ufc/mL infeco TESTE DE SENSIBILIDADE ANTIMICROBIANOS I Preparo do Inoculo Com o auxilio da ala, toca-se em uma colnia tranferindo-as pra um tubo de soluo salina ou em caldo BHI para novo crescimento e depois em soluo salina. Posteriormente compara essa turvao com a escala 0.5 de Mac Farland. II Semeadura Umedecer o swab estril no inoculo aferido e aplic-loo em varias direes na placa com meio Mueller Hinton, obtendo cresciemnto uniforme. III Tcnica Colocar os discos, com o auxilio de uma pina, pression-los levemente contra a superfcie do meio, mantendo uma distancia de 20 mm da boda e de 30 mm entre eles. Incubar a placa em posio invertida a 37C/ 18hs. A leitura deve ser feita com halmetro ou rgua atravs do fundo da placa.

CULTURA DE SECREO VAGINAL E URETRAL A coleta da secreo vaginal e da uretral feita no laboratrio, se utilizado de cureta (para a vaginal) ou ala de platina (para a uretral). Uma parte do material colocado em 1 mL de soluo salina estril, e outra parte olocada na forma de esfregao na regio central de uma lamina para microscpio. Este material, em lmina, observado em microscpio ptico ao aumento de 1000 vezes com leo de imerso e descrito: bactria (morfologia e Gram); leveduras; parasitas; muco; clulas epiteliais; flora aplobionte. Para essa observao utiliza-se a Colorao de Gram, que realizada nesse esfregao aps o mesmo ter sido fixado passando-se lmina 3 vezes por sobre a chama do bico de busen. Feito isso, em um suporte prprio, cobre-se a lmina com uma camada de corante cristal violeta por aproximadamente 1 minuto; aps, recobre-se a lmina com uma nova camada de lugol a 5% por mais 1 minuto. Em seguida despreza-se o material que esta sobre a lmina e recobre-se a lmina com lcool acetona, formando uma camada por sobre a lmina, por 1 minuto. Aps, enxaguar em gua corrente. Em seguida, recobre-se, novamente, a lmina com fucsina para a

Colorao de Gram por mais 1 minuto. A seguir, lavar em gua corrente, colocar em suporte prprio para escorrer e secar. Aps feita a observao e determinados os parmetros, seguir o esquema descrito abaixo:

ESTREPTOCOCOS NO BETAHEMOLITICO

Caldo glicosado

gram

Calatase (+)estafilococo Verificar registro de hemlise no g arsangue primario

(-)estreptococo

Alfa ou gama hemolitico

Verificar origem do material para originar provas

Streptococcus sp

(R) optoquina bile-esculina (-)

(S) optoquina bile solvel

Bile-escilina (+)

antibiograma

S. pneumoniase

grupo D (S. faecalis e outros)

(R) a 6,5% (S) a 6,5% NaCI CULTURANaCIFEZES (COPROCULTURA) DE (R) penicilia (S) penicilia

Para a realizao desse exame, as fezes so recolhias em recipiente prprio e estril e entregues ao laboratrio num perodo Maximo de 2 horas aps a coleta. No setor, com uma ala de platina, coletado uma poro das fezes e colocada em caldo selenito, que vai estufa a 37 C por um perodo de 24 horas. Aps este perodo, com uma ala de platina, recolhe-se parte desse caldo e semeia-se em estufas a 37C por 24 horas. Havendo crescimento, faz-se o Gram e as provas bioqumicas pertinentes conforme o esquema abaixo:

FEZES

CALDO SELENITO

BEM

SS

GRAM

COCCOS

BACILOS

NEG

POS

NEG

POS

Tubo Rugai TSI Mili Citrto

Sem importancia clnica, provavelmente contaminao

Tubo Rugai TSI Mili Citrato

Calase VM, VP Plasmaco Halo de hemlise

Indol

Indol

Nitrito TSI

Citrato + = meio torna-se azul TSI H2 S + = meio torna-se negro; - Gs ++ aparecimento de bolhas no meio; - Lactose += A/A ou A/K (+)= K/K K= alcalina=vermelho A= cido=amarelo

Mili motilidade ++ observa-se o caminho da bactria no local da picada; - lisina += o meio torna-se amarelo; - indol += o reativo de Kovacs torna-se vermelho

CULTURA DE ESCARRO Para a cultura do escarro, podemos encontrar apenas solicitaes de bacterioscopia como, por exemplo, pesquisa de BK; mas quando a solicitao for de cultura de escarro, devemos proceder como na cultura de secrees (exceto a coleta); Nas pesquisa de BK fazemos um esfregao, na regio central de uma lmina, de poro do escarro rica em material sanguinolento (hemoptase). Aps secar esse esfregao com a lmina por sobre o a chama do bico de bunsen por 3 vezes, realizamos a colorao de ziehl Neelsen que se rezume em: cobrir o esfregao com uma camada de corante fucsina de ziehl e aquecer 5 minutos esta lmina em chama do bico de bunsen sem deixar ferver o corante )retirar frequentemente da chama. Aps isso, cobre-se a lmina com lcool cido por aproximadamente 1 minuto; enxaguar em gua corrente e, depois, cobrir a lmina com azul de metileno por aproximadamente 1 minuto. Lavar, novamente, em gua corrente. Observar em microscpio ptico em aumento de 1000 vezes, utilizando leo de imerso. PESQUISA DE FUNGOS Aps coletar parte do material atravs de descamao com o bisturi ou coletar atravs de bipsia parte do material obtido, colocar em uma lmina, cobrir KOH a 10% e sobre-por uma lamnula . Deixar por 10 minutos e observar ao microscpio ptico no aumento de 100 a 400 vezes: Hifas; Miclio reprodutor; Miclio vegetativo.

Em seguida, semia-se em gar sabouraud por 48 a72 horas e, aps o crescimentom observam-se morfologia, textura da colnia e fungos. Aps isso, para a identificao, realizao, realiza-se o auxograma e o zimograma conforme o esquema abaixo: OUTROS PLEURAIS Para estes casos a coleta feita pelo mdico que encainha os materiais slidos em saliva e os lquidos em recipiente estril. Com a chegada da matria, faz-se uma lmina para Gram e segue-se o esquema para secrees vaginal e uretral. Em todos os exames acima descritos (exceto as pesquisas de fungos e as bacteroscopias), devemos realizar o antibiograma feito em uma placa grande gar Nueller Hinton com 11 discos de antimicrobianos, padronizados a critrio do diretor clnico do hospital. Estes discos devem estar dispostos na placa de forma a apresentarem uma distncia maior que 2 cm entre os seus centros e distarem 1 cm da borda de vidro da placa de petri. Efetuar a leitura dos balos de inibio de crescimento utilizando um halmetro e tabela prpria do fabricante dos discos, observando as faixas de I (intermediria), S (sensvel) e R (resistente). PREPARO DA SUSPENSO DE HEMCIAS LAVADAS (5%) 1. Coloque em um tubo de ensaio (12 x 75) previamente identificado 0,5 mL de sangue total 2. Encha o tubo com soluo salina (0,9%) at 1 cm da borda do tubo. 3. Centrifugue durante 30 seg/3400 RPM. 4. Esvazie o tubo por inverso, homogenize o sedimento de hemcias, e repita conforme os itens 2 e 3 por mais duas vezes 5. Aps a terceira lavagem, retire completamente o sobrenadante 6. Em outro tubo de ensaio coloque 3 ml de soluo salina (0,9%) e adicione 0,15 ml do concentrado de hemcias lavadas. MATERIAIS: SECREO DE LESES, LQUIDOS SINOVIAIS E

CLASSIFICAO DO GRUPO SANGUINEO ABO A tipagem ABO dever ser realizado obrigatoriamente atravs de dois testes: classificao direta e classificao reversa. 1. Classificao direta (TUBO): Identificao de aglutingeos presentes na membrana das hemcias, atravs de soros contendo anticorpos especficos: Anti-A, ANTI-B e ANTI-AB; TECNICA: 1.1 Prepare um suspenso de hemacias lavadas (5%) do sangue a ser classificado. 1.2 Identifique 3 tubos de ensaio: A, B e AB. 1.3 Coloque nos tubos, 1 gota dos soros reagentes: Anti-A, Anti_B e Anti-AB, respectivamente; 1.4 Adicione a cada tubo, 1 gota da suspenso de hemcias lavadas (5%) a classificar; 1.5 Homogenize e centrifugue 15 seg/3400 RPM 1.6 Proceda a leitura ressuspendendo o boto de hemcias delicadamente, sobre um fundo iluminado (aglutinoscopio); 2. Classificao reversa (tubo): identificao de anticorpos presentes na amostra de soro a ser testado, atravs da utilizao de duas suspenses de hemcias conhecidas: hemcias A1 e Hemcias B; TECNICA: 2.1 Identifique 2 tubos de ensaio: H e HB; 2.2 Coloque em cada tubo 2 gotas do soro a testar;

2.3 Adicione ao tubo H, 1 gota de hemcias A1 e ao tubo HB, 1 gota de hemcias B; 2.4 Homogenize e centrifugue 15 seg./3400 RPM; 2.5 Proceda leitura ressuspendendo o boto de hemcias delicadamente; INTERPRETAO DOS RESULTADOS DA CLASSIFICAO ABO DIRETA ANTI A 0 +4 0 +4 ANTI-B 0 0 +4 +4 ANTI-AB 0 +4 +4 +4 ANTI-A1 0 + 0 + H A1 +4 0 +4 0 REVERSA HB +4 +4 0 0 HO 0 0 0 0 GRUPO O A1 B AB

DISCREPNCIA DIRETA ANTI A +4 +4 +4 +4 ANTI-B 0 0 +4 +4 ANTI-AB +4 +4 +4 +4 ANTI-A1 0 + 0 + H A1 0\+ + 0\+ + HB +4 +4 0 + REVERSA HO 0 + 0 + GRUPO A* A** AB** AB**

A*\AB** PROVAVEL SUBGRUPO DE A A**\AB** PROVAVEL ANTI-CORPO FRIO NOTAS: 1. Nas determinaes ABO de recm nascido no se realiza prova reversa; 2. Podem ocorrer discrepncias entre as provas e reversa, neste caso deve-se considerar a ocorrncia de anticorpos frios, subgrupos ou erro tcnico;

DETERMINAO DO FATOR Rh (D) Na determinao Rh so utilizados os reagentes: soro reagente Anti-D e controle e de Rh; 1. Prepare uma suspenso de hemcias lavadas (5%), do sangue a ser classificado; 2. Identifique 2 tubos de ensaio: D e CTL; 3. Coloque em cada um dos tubos 2 gotas dos soros: Anti_D e controle de Rh; 4. Adicione a cada tubo, 1 gota de suspenso de hemcias lavadas (5%), a classificar; 5. Homogenize e centrifugues 15 seg. 3400 RPM; 6. Proceda a leitura ressuspendendo o boto de hemcias delicadamente, sobre um fundo iluminado (aglutinoscpio).

INTERPRETAO DO RESULTADO DA DETERMINAO Rh: ANTI A + 0 + CONTROLE Rh 0 0 + RESULTADO Rh POSITIVO Rh NEGATIVO ***

*** No deve ser considerado Rh positivo, provvel sensibilizao das hemcias por auto-anticorpo. Realizar o teste com Anti-D Salino conforme recomendaes tcnica do fabricante. NOTAS: 1. Os resultados Rh negativos devem ser submetidos pesquisa do antgeno D fraco. Deve-se pesquisar em paralelo a presena dos antgenos: E e C, utilizando-se o soro Anti- CDE.

PESQUISA DOS ANTIGENOS: D FRACO 1. Repita os procedimentos: 1.A 5. Da determinao do fator Rh. 2. Leve ao banho maria 37 C\30 minutos; 3. Centrifugues durante 15 seg\3400 RPM; 4. Proceda leitura, ressuspendendo o boto de hemcias delicadamente, sobre aglutinoscpio; 5. Encha o tubo de ensaio com soluo salina (0,9%) ate 1 cm da borda do tubo; 6. Centrifugues durante 30 seg\3400 RPM; 7. Esvazie o tubo por inverso, e repita a operao conforme itens 5 e 6 por mais 2 vezes, escorrendo o sobrenadante em um pano; 8. Adicione a cada tubo, 2 gotas de soro reagente anti-globulina humana poliespecifica; 9. Centrifugue durante 15 seg\ 3400 RPM 10. Proceda leitura, ressuspendendo o boto de hemcias delicadamente, sobre aglutinoscpio.

PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (P.A.I) (COOMBS INDIRETO) A pesquisa de anticorpos irregulares, demonstra anticorpos antieritrocitrios irregulares, livres no soro ou plasma de doadores e pacientes, que possam provocar reaes ps-transfusionais. Deve ser realizada tambm no soro de gestantes, como forma de preveno da doena hemoltica do recm nascido. A pesquisa deve ser realizada com soro fresco (no inativo). So utilizadas suspenses de hemcias de triagem do grupo sanguneo O, previamente fenotipadas e que apresentam a maioria dos antgenos de importncia na clnica transfusional. INTERPRETAO DOS RESULTADOS DA P.A.I 1. A positividade em qualquer tubo, em qualquer fase do teste indica provvel presena de anticorpo (s) irregulares (es); 2. Sempre que a pesquisa de anticorpos apresentar positividade, o (s) anticorpo )s) deve (m) ser identificados (s), atraves da utilizao de um painel de hemcias fenotipadas.

TESTE DE COMPATIBILIDADE (Prova cruzada maior) A prova cruzada maior tem a finalidade de prevenir reaes transfusionais e garantir o aproveitamento mximo das transfuses de concentrados de hemcias, por demonstrar a presena de anticorpos capazes de destruir as hemcias do doador proposto. O teste realizado in vitro, colocando-se soro do receptor em contato com uma suspenso de hemcias do doador, proporcionando condies adequadas de reatividade para todos os anticorpos clinicamente significantes. Deve-se utilizar amostra de soro fresco (no inativo), tendo a amostra validade de 48 horas a contar do horrio da coleta. Vencido o prazo de validade, esta amostra no deve ser mais utilizada nos testes de compatibilidade, porem armazena-se a amostra pelo prazo de sete dias.

TESTE DE COMPATIBILIDADE (PROVA CRUZADA MAIOR ) TECNICA: ALBUMINA BOVINA 22% 1 FASE 1. Prepare suspenses de hemcias lavadas (5%): do concentrado de hemacais a ser transfundido e do paciente (recepto); 2. Identifique 2 tubos: Prova cruzada e AC (Auto controle); 3. Coloque em cada tubo 2 gotas do soro do paciente (receptor); 4. Adicione 1 gota da suspenso de hemcias do concentrado a ser transfundido ao tubo de prova cruzada e 1 gota da suspenso de hemcias do paciente ao tubo AC; 5. Homogenize e centrifugue durante 15 seg\3400 RPM; 6. Proceda a leitura, ressuspendendo o boto de hemcias delicadamente sobre aglutinoscpio e anote os resultados. 2 FASE 1. Adicione a cada tubo 2 gotas de albumina bovina 22%; 2. Homogenize e centrifugue 15 seg\3400 RPM; 3. Proceda leitura e anote os resultados. 3 FASE 1. Incube os tubos: prova cruzada e AC, em banho maria 37C\30 min; 2. Aps incubao, centrifugue os tubos 15 seg.\3400 RPM; 3. Proceda leitura e anote os resultados. 4 FASE 1. Encha os tubos com soluo salina (0,9%) ate 1 cm da borda; 2. Centrifuge os tubos durante 30 seg\3400 RPM;

3. Esvazie os tubos por inverso e repita as operaes dos itens da 4 fase (1 e 2) por mais 2 vezes, escorrendo o sobrenadante em um pano; 4. Adicione a cada tubo 2 gotas do soro reagente antiglobulina humana poliespecifica. 5. Homogenize e centrifugue 15 seg.\3400 RPM; 6. Proceda a leitura e anote os resultados; 7. Adicione 1 gota de suspenso de hemcias controle de COOMBS, centrifugue e proceda leitura.

INTERPRETAO DOS RESULTADOS DO TESTE DE COMPATIBILIDADE

1. A positividade apenas no tubo de prova cruzada em qualquer fase do teste indica presena de anticorpos (s) irregular (es); 2. A positividade no tubo AC (Auto controle) indica provvel presena de auto anticorpo. 3. Sempre que a prova cruzada apresentar incompatibilidade, ou seja, apresentar positividade, o (s) anticorpo (s) deve (m) ser identificado (s); 4. Suspenso de hemcias controle de COOMBS deve apresentar aglutinao, caso contrario a prova de compatibilidade deve ser invalidada.

OBS: No confundir a positividade do teste controle de COOMBS, com a ltima fase da prova de comaptibilidade.

TESTE DE COOMBS DIRETO O teste de COOMBS direto demonstra hemcias sensibilizadas por anticorpos ou complemento, utilizado no estudo de: Anemia hemoltica auto-imune, doenas hemoltica do recm nascido e reao hemoltica transfusional. Procedimento tcnico: 1. Prepare uma suspenso de hemcias lavadas (5%), do sangue a ser testado; 2. identifique um tubo de hemlise CD; 3. Coloque no tubo 1 gota da suspenso de hemcias (5%); 4. Adicione a este tubo 2 gotas do