ricardo filipe duarte da cruz induçãoindução e recuperação...

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Universidade do Minho Universidade do Minho Universidade do Minho Universidade do Minho Escola de Ciências Ricardo Filipe Duarte da Cruz Indução Indução Indução Indução e Recuperação do S e Recuperação do S e Recuperação do S e Recuperação do Stresse tresse tresse tresse Hídrico Hídrico Hídrico Hídrico em em em em Variedades Portuguesas de Variedades Portuguesas de Variedades Portuguesas de Variedades Portuguesas de Milho Milho Milho Milho Setembro de 2006

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Universidade do MinhoUniversidade do MinhoUniversidade do MinhoUniversidade do Minho Esco l a de C iênc i as

Ricardo Filipe Duarte da Cruz InduçãoInduçãoInduçãoIndução e Recuperação do S e Recuperação do S e Recuperação do S e Recuperação do Stressetressetressetresse Hídrico Hídrico Hídrico Hídrico emememem Variedades Portuguesas de Variedades Portuguesas de Variedades Portuguesas de Variedades Portuguesas de MilhoMilhoMilhoMilho

Setembro de 2006

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Universidade do MinhoUniversidade do MinhoUniversidade do MinhoUniversidade do Minho Esco l a de C iênc i as

Ricardo Filipe Duarte da Cruz InduçãoInduçãoInduçãoIndução e Recuperação do Stresse e Recuperação do Stresse e Recuperação do Stresse e Recuperação do Stresse Hídrico Hídrico Hídrico Hídrico emememem Variedades Portuguesas de MilhoVariedades Portuguesas de MilhoVariedades Portuguesas de MilhoVariedades Portuguesas de Milho

Tese de Mestrado Biologia do Stresse em Plantas Trabalho efectuado sob a orientação de Professor Doutor Jorge Marques da SilvaProfessor Doutor Jorge Marques da SilvaProfessor Doutor Jorge Marques da SilvaProfessor Doutor Jorge Marques da Silva ProfProfProfProfessora Doutora Ana Cunhaessora Doutora Ana Cunhaessora Doutora Ana Cunhaessora Doutora Ana Cunha

Setembro de 2006

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É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA TESE É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA TESE É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA TESE É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA TESE APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE.COMPROMETE.COMPROMETE.COMPROMETE.

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“Have courage for the great sorrows of life and patience for the small ones;

and when you have laboriously accomplished your daily task,

go to sleep in peace.

God is awake.”

Victor Hugo (1802 Victor Hugo (1802 Victor Hugo (1802 Victor Hugo (1802 ---- 1885) 1885) 1885) 1885)

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Agradecimentos

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

I

AgradecimentosAgradecimentosAgradecimentosAgradecimentos

Ao Professor Jorge Marques Silva por me ter sugerido o tema deste trabalho, e me ter

acolhido prontamente na Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa. Agradeço-lhe

também a liberdade que me permitiu ao longo do trabalho e a discussão dos problemas que

foram surgindo. Agradeço-lhe ainda a leitura cuidadosa e com espírito crítico do presente

manuscrito.

À Professora Ana Cunha pela disponibilidade e pelo acompanhamento ao longo de

todo o trabalho, em especial o realizado na Universidade do Minho. Agradeço-lhe também

pela leitura cuidadosa e crítica do presente manuscrito.

Ao Professor Pedro Fevereiro e ao Engenheiro Silas Pego pelo apoio ao projecto e o

auxílio na obtenção das sementes.

À Professora Anabela Bernardes da Silva pelo auxílio prestado na determinação das

actividades da PEPC e EM-NADP.

À Professora Celeste Arrabaça pelo auxílio prestado na determinação das actividades

da RuBisCO.

Ao Banco Português de Germoplasma Vegetal, Braga, pelas sementes das diferentes

variedades portuguesas de milho.

À Ana Elisabete, à Ana Sofia, à Elsa Elias e ao André Costa pela ajuda imprescindível

que me ofereceram ao longo de todo o trabalho, quer na utilização dos aparelhos, quer na

metodologia aplicada. Também quero agradecer-lhes a amizade e o apoio ao longo do

trabalho.

À Alexandra Marques pela discussão dos problemas que foram surgindo, pela amizade

e apoio que demonstrou.

À Cátia Nunes pela ajuda preciosa na quantificação dos aminoácidos livres e prolina,

na Universidade do Minho.

À funcionária Manuela Lucas pela ajuda preciosa, pela amizade e apoio que sempre

demonstrou.

A todos os docentes da Secção de Fisiologia e Bioquímica Vegetais pelo ambiente e

apoio que demonstraram ao longo do trabalho.

Agradeço à minha família, à Leonor e a todos os meus amigos pelo apoio nos momentos de

maior dificuldade.

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

II

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Resumo

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

III

ResumoResumoResumoResumo

Este trabalho teve como objectivo geral, na primeira fase, caracterizar as estratégias de

resposta ao stresse hídrico, com ênfase no metabolismo fotossintético, em seis variedades portuguesas de milho (Zea mays L.) e, na segunda fase, aprofundar o conhecimento sobre o comportamento fisiológico das duas variedades com respostas mais contrastantes. Utilizaram-se dois sistemas de indução de stress, um rápido e um lento, e recorreu-se, na primeira fase, à medição das trocas gasosas através da análise de gases por radiação infra-vermelha e de fluorescência modulada da clorofila a. Nas duas variedades seleccionadas para a segunda fase, estudou-se adicionalmente a resposta do aparelho fotossintético ao stress hídrico sob diferentes regimes de PPFD e diferentes concentrações de CO2. Analisaram-se também as actividades das principais enzimas do metabolismo fotossintético (RuBisCO, PEPC, EM-NADP) e a variação do teor em prolina.

Nos ensaios de indução lenta do stresse ocorreu uma diminuição de todos os parâmetros de trocas gasosas (A, E, gs, WUE) nas seis variedades. Destacaram-se as variedades PB260 e PB269, como aquelas onde os parâmetros sofreram uma diminuição progressiva e mais lenta, e a variedade PB369, onde os efeitos negativos do stresse hídrico se fizeram sentir de forma mais abrupta, com uma diminuição rápida dos valores. As variedades recuperaram os valores iniciais da maioria dos parâmetros após irrigação, exceptuando-se a variedade PB369 cuja recuperação se deu de forma mais lenta. Nos ensaios de fluorescência da clorofila a, verificou-se uma diminuição de vários parâmetros (Fv/Fm, ΦPSII, qP, ETR) ao longo do stresse lento e do stresse rápido. Por outro lado, qN aumentou em todas as variedades, à excepção de PB269, na qual não variou. Comparando os ensaios dos dois tipos de stresse, verificou-se que os parâmetros fisiológicos que diminuíram o fizeram de forma mais marcante no stresse rápido, em todas as variedades. As variedades PB269 e PB369 foram seleccionadas como sendo a mais e a menos tolerante ao stresse hídrico, respectivamente.

A partir das determinações dos potenciais hídricos constatou-se que a variedade PB269 conseguiu manter um potencial hídrico mais elevado do que a variedade PB369 em condições de stresse hídrico semelhantes e que possui uma parede celular mais elástica, permitindo a manutenção da turgescência até THR mais baixos apresentando-se esta como uma boa estratégia de tolerância ao stresse hídrico.

Através da decomposição do parâmetro de fluorescência qN, verificou-se que houve um aumento de qE com a intensificação do stresse hídrico, na variedade PB369. Por outro lado, na variedade PB269 houve a manutenção deste parâmetro até THR de cerca de 50%, indicando uma maior capacidade de manter activos os processos fotossintéticos sem recorrer a processos de amortecimento não-fotoquímicos.

Nos ensaios enzimáticos, observou-se que em ambas as variedades houve diminuição das actividades enzimáticas da RUBISCO, PEPC e EM-NADP com a diminuição do THR, nos ensaios de stresse lento. Contudo, nos ensaios de stresse rápido tal diminuição só aconteceu na RUBISCO, mantendo-se as actividades das outras enzimas constantes.

Os dados parecem indicar que ambas as variedades possuem uma reserva de prolina que poderá ter sido rapidamente mobilizada no período de recuperação do stresse, principalmente na variedade PB269.

No seu conjunto, os resultados obtidos parecem mostrar que existe um espectro alargado de respostas fisiológicas face ao stresse hídrico que, a ter uma base genética de elevada hereditabilidade e estabilidade, poderão constituir uma base de selecção em futuros programas de melhoramento.

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IV

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Abstract

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

V

Induction and Recovery of Water Stress in Induction and Recovery of Water Stress in Induction and Recovery of Water Stress in Induction and Recovery of Water Stress in

Portuguese Maize CultivarsPortuguese Maize CultivarsPortuguese Maize CultivarsPortuguese Maize Cultivars

AbstractAbstractAbstractAbstract

This work aims for the identification of several aspects of water stress physiological

response strategies in different Portuguese maize cultivars (Zea mays L.), in a first stage, and expand the knowledge of the most tolerant and less tolerant cultivars physiological responses to water stress. The responses were studied under two water stresse regimes – slow stress and rapid stress – relevant in field conditions, and in the recovery process after irrigation. In the first part of the work, a preliminary characterization of six cultivars was made measuring gas exchange with an infrared gas analyser and chlorophyll a fluorescence. In the second part of the work, a deeper characterization of those two cultivars was made through the study of water relations and photosynthetic metabolism under different PPFD and external CO2 conditions, the enzymatic activities (RuBisCO, PEPC, NADP-ME) and proline content variation.

In slow stress, all the parameters of gas exchange (A, E, gs, WUE) suffered a reduction in all six cultivars. In PB260 and PB269, the reduction was made in a slower progressive way, and, in contrast, in PB369 the parameters declined abruptly. In general, the parameters recovered upon irrigation, with the exception of PB369, in which the recovery was slower. In rapid stress, the parameters responded in a similar but very fast way. PB369 was the only cultivar with a slower response. Chlorophyll fluorescence parameters (Fv/Fm, ΦPSII, qP, ETR) suffered a decrease, in slow and rapid stress. On the other hand, qN increased in all cultivars, with the exception of PB269, in which it maintained its values. Comparing slow and rapid stress, the parameters decreased faster in rapid stress, in all cultivars. PB269 and PB369 were selected as the cultivars more and less tolerant to water stress.

PB269 is able to maintain higher leaf water potential under water stress and as a more elastic cell wall that allows it to maintain turgescence at lower RWC, resulting in a good tolerance strategy to water stress.

The decomposition of the qN fluorescence parameter, showed a rise of the qE component, in PB369, with increased water stress. PB269 maintained this parameter to a RWC of 50%, indicating a suitable photosynthesis without activating major non-photochemical quenching processes. On the enzymatic assays, there was a decrease in the activities of RUBISCO, PEPC and NADP-ME, with RWC decrease, in slow stress. However, in rapid stress this decrease only occurred in RUBISCO. Both cultivars appear to have a proline reserve that could be easily mobilised during recovery, especially in PB269.

The data presented in this work appears to indicate the existence of a wide spectrum of physiological responses to water stress that, having a highly hereditable and stable genetic background, can establish the basis of future plant breeding programs.

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

VI

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Índice

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

VII

ÍndiceÍndiceÍndiceÍndice

Agradecimentos ………………………………………………………………………………………………….. I Resumo ………………………………………………………………………………………………….……... III Abstract ………………………………………………………………………………………………….…….... V Índice ………………………………………………………………………...………………………………... VII Símbolos e Abreviaturas …………………………………………………………………………………….... IX p 1. Objectivos e Abordagem do Problema ……………………………………………………………………… 1 p 2. Introdução Geral ............................................................................................................................................... 3 2.1. Descrição Botânica do Milho .……………..………………...….……………………………………….…. 3 2.2. O Milho na Economia Mundial e em Portugal ……………....…..……………….…………………….…… 4 2.3. Relações Hídricas em Plantas ……………………………………………………………………………….. 4 2.4. Stresse Hídrico nas Plantas ………………………………………………………………………………….. 6 2.4.1. Aspectos Gerais ……………...…………………………………………………………………………….. 6 2.4.2. Respostas Estomáticas ao Stresse Hídrico ……………………………………………………………….... 8 2.4.3. Metabolismo do Carbono e Efeitos do Stresse Hídrico na Fotossíntese ………………………………...… 9 2.5. Estratégias de Sobrevivência à Seca ……………………………………………………………………….. 14 2.5.1. Aspectos Gerais ……...………………………………………………………………………………….... 14 2.5.2. Modificações Anatómicas, Morfológicas e Metabólicas na Resposta ao Stresse Hídrico …………….…. 15 2.5.3. Solutos Compatíveis e Ajustamento Osmótico …………………………………………………………... 19 2.6. Técnicas de Melhoramento e Selecção para Tolerância ao Stresse Hídrico ……………...……...………… 24 p 3. Metodologia Geral ……………………………………………………………………………………..……. 29 3.1. Material Vegetal ……………………………………………………………………………………………. 29 3.2. Indução do Stresse Hídrico ………………………………………………………………………..……….. 30 3.3. Relações Hídricas ………………………………………………………………………………………...… 30 3.3.1. Determinação do Teor Hídrico Relativo da Folha …………………………………………….………… 30 3.3.2. Determinação do Teor Hídrico do Solo ………………………………………………………………….. 31 3.4. Medição das Trocas Gasosas por Análise de Gases por Radiação Infra-Vermelha (IRGA) …...………….. 31 3.5. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofila a …………...……………………...………..…………. 33 3.6. Medição da Libertação de O2 ………………………………………………………………………………. 36 3.7. Medição de Actividades Enzimáticas …………………………………………………………………….... 37 3.8. Análise Estatística ………………………………………………………………………………………….. 37 p 4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho …………………………………. 39 4.1. Introdução …………………………………………………………………………………………………... 39 4.2. Metodologia ………………………………………………………………………………………………... 39 4.2.1. Material Vegetal …………………………………………………………………………………………. 39 4.2.2. Relações Hídricas ………………………………………………………………………………………… 39 4.2.3. Medição das Trocas Gasosas …………………………………………………………………………….. 39 4.2.4. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofila a …………………………………………………..… 41 4.3. Resultados e Discussão …………………………………………………………………………………..… 42 4.3.1. Relações Hídricas ……………………………………………………………………………………….... 42 4.3.2. Trocas Gasosas ………………………………………………………………………………………...…. 47 4.3.2.1. Stresse Lento ………………………………………………………………………………………….... 48 4.3.2.2. Stresse Rápido ………………………………………………………………………………………….. 59 4.3.3. Fluorescência Modulada da Clorofila a ………………………………………………………………….. 68 4.3.3.1. Stresse Lento ………………………………………………………………………………………….... 68 4.3.3.2. Stresse Rápido ……………………………………………………………………………………….…. 75 4.4. Conclusões ……………………………………...………………………………………………………….. 83 4.4.1. Conclusões das Trocas Gasosas ………...………………………………………………………………... 83 4.4.2. Conclusões da Fluorescência Modulada da Clorofila a ………………………...………………………... 83 4.4.3. Conclusões da Fase I ……………………………………………………………….…………………….. 84 p

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Índice

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

VIII

5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico …..... 85 5.1. Introdução ………………………………………………………………………………………………..…. 85 5.2. Metodologia ………………………………………………………………………………………………... 85 5.2.1. Material Vegetal ………………………………………………………………………………………….. 85 5.2.2. Relações Hídricas ……………………………………………………………………………………….... 85 5.2.2.1. Determinação do Teor Hídrico Relativo da Folha ……………………………………….…………….. 85 5.2.2.2. Determinação do Potencial Hídrico das Folhas ………………………………………………………... 86 5.2.2.3. Estabelecimento de Curvas Pressão/Volume …………………………………………………………... 86 5.2.3. Medição das Trocas Gasosas …………………………………………………………………………...… 87 5.2.3.1. Curvas A/PPFD ………………………………………………………………………………………… 87 5.2.3.2. Curvas A/CO2a ………………………………………………………………………………………….. 87 5.2.3.3. Determinação da Libertação de O2 …………………………………………………………...………… 88 5.2.4. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofila a …………………………………………………..… 88 5.2.5. Determinação de Clorofilas e Carotenóides ……………………………………………………………… 89 5.2.6. Determinação de Actividades Enzimáticas ………………………………………………………………. 89 5.2.6.1. Extracção ……………………………………………………………………………………………….. 90 5.2.6.2. Ribulose-1,5-Bisfosfato Carboxilase/Oxigenase (RuBisCO) ………………………………………..… 90 5.2.6.3. Fosfoenolpiruvato Carboxilase (PEPC) ……………………………………………………………...… 91 5.2.6.4. Enzima Málica Dependente de NADP (EM-NADP) …...…………………………………………….... 91 5.2.7. Quantificação de Proteína Solúvel …………………………………………………………………….…. 91 5.2.8. Quantificação de Solutos Compatíveis …………………………………………………………………... 92 5.2.8.1. Extracção ……………………………………………………………………………………………….. 92 5.2.8.2. Quantificação de Aminoácidos Livres e Prolina ……………………………………………………….. 92 5.3. Resultados e Discussão …………………………………………………………………………………….. 93 5.3.1. Relações Hídricas ……………………………………………………………………………………….... 93 5.3.2. Trocas Gasosas ………………………………………………………………………………………...…. 96 5.3.2.1. Curvas A/PPFD ………………………………………………………………………………………… 96 5.3.2.2. Curvas A/CO2a ………………………………………………………………………………………. 105 5.3.2.3. Libertação de O2 ………………………………………………………………………………………. 112 5.3.3. Fluorescência Modulada da Clorofila a ……………………………………………………………….... 114 5.3.4. Clorofilas Totais e Carotenóides ………………………………………………………………………... 125 5.3.5. Metabolismo do Carbono ……………………………………………………………………………… 128 5.3.5.1. Ribulose-1,5-Bisfosfato Carboxilase/Oxigenase (RuBisCO) ………………………………………… 129 5.3.5.2. Fosfoenolpiruvato Carboxilase (PEPC) ………………………………………………………………. 133 5.3.5.3. Enzima Málica Dependente de NADP (EM-NADP) ……...………………………………………….. 136 5.3.6. Solutos Compatíveis …………………………………………………………………………………..… 137 5.3.6.1. Aminoácidos Livres ………………………………………………………………………………… 138 5.3.6.2. Prolina ………………………………………………………………………………………………. 140 5.3.7. Conclusões da Fase II ………………………………………………………………………………….... 142 p 6. Conclusões Gerais …………………………………………………………………………………………. 145 p 7. Referências Bibliográficas ……………………………………………………………………………….... 147 p

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Símbolos e Abreviaturas

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

IX

Símbolos e AbreviaturasSímbolos e AbreviaturasSímbolos e AbreviaturasSímbolos e Abreviaturas

A taxa fotossintética

A/CO2a taxa fotossintética em função da concentração externa de CO2

A/PPFD taxa fotossintética em função da densidade de fluxo fotónico fotossintético

ABA ácido abcísico

Apot potencial fotossintético

ATP adenosina trisfosfato

ATPase ATP sintase

C3 metabolismo fotossintético cujo primeiro composto estável formado possui 3

átomos de carbono

C4 metabolismo fotossintético cujo primeiro composto estável formado possui 4

átomos de carbono

Ca clorofila a

Ca2+ ião cálcio

Cb clorofila b

Ca+b clorofila total

CA1P 2-carboxiarabinitol-1-fosfato

Ci concentração interna de CO2

CO2 dióxido de carbono

CO2a concentração externa de CO2

Cx+c carotenóides totais

DMSO dimetilsulfóxido

DTT ditiotritol

E taxa transpiratória

EDTA ácido etilenodiamina tetracético

EM-NADP enzima málica dependente de NADP

Eq. equação

ETR taxa de transporte de electrões no PSII

Fm fluorescência máxima

Fm’ fluorescência máxima medida à luz

Fo fluorescência basal

Fo’ fluorescência basal medida após iluminação

Fv fluorescência variável

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Símbolos e Abreviaturas

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

X

Fig. figura

gs condutância estomática

H2O água

H2O2 peróxido de hidrogénio

HCl ácido clorídrico

HEPES ácido N-(2-hidroxietil) piperazina N’-2-etanosulfónico

IRGA infra-red gas analyser (analisador de gases por radiação infra-vermelha)

K+ ião potássio

Kcat constante de catálise

KCl cloreto de potássio

KOH hidróxido de potássio

LHCII complexo antena do PSII

M molar

MDH malato desidrogenase

MPa mega Pascal

Mg2+ ião magnésio

MgCl2 cloreto de magnésio

mV milivolt

N2 azoto molecular

NADH nicotinamida adenina dinucleótido reduzida

NADP fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido

NADP+ fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido oxidado

NADPH fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido reduzido

NaHCO3 hidrogenocarbonato de sódio

NaH14CO3 hidrogenocarbonato de sódio marcado radioactivamente

NPQ amortecimento não-fotoquímico

O2 oxigénio molecular

p probabilidade

P5CS ∆1-pirrolina-5-carboxilato sintetase

PAM pulse amplitude modulated (amplitude de pulso modulada)

PDH prolina desidrogenase

PEG polietilenoglicol

PEP fosfoenolpiruvato

PEPC fosfoenolpiruvato carboxilase

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Símbolos e Abreviaturas

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

XI

Pf peso fresco

pH logaritmo do inverso da concentração hidrogeniónica

PPFD densidade de fluxo fotónico fotossintético

ppm partes por milhão

PRK fosforibulocinase

Ps peso seco

PSII fotossistema II

Pt peso túrgido

PVP polivinilpirrolidona

QA quinona A

QB quinona B

QAC composto quaternário de amónio

qE coeficiente de amortecimento do estado de alta energia

qI coeficiente de amortecimento fotoinibitório

qN coeficiente de amortecimento não-fotoquímico

qP coeficiente de amortecimento fotoquímico

qT coeficiente de amortecimento de transição de estado

QTL quantitative trait loci (loci de características quantitativas)

r2 coeficiente de determinação

rbcS subunidade menor da RUBISCO

ROS reactive oxygen species (espécies reactivas de oxigénio)

RuBisCO ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase

RuBP ribulose-1,5-bisfosfato

SLA área foliar específica

SnCl2.H2O cloreto de estanho hidratado

THR teor hídrico relativo

THS teor hídrico do solo

V volt

WUE eficiência do uso da água

ΦΦΦΦPSII rendimento quântico efectivo do PSII

ΨΨΨΨg potencial gravítico

ΨΨΨΨp potencial de pressão

ΨΨΨΨs potencial osmótico

ΨΨΨΨw potencial hídrico

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

XII

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1. Objectivos e Abordagem do Problema

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

1

1. Objectivos e Abordagem do Problema1. Objectivos e Abordagem do Problema1. Objectivos e Abordagem do Problema1. Objectivos e Abordagem do Problema

O milho (Zea mays L.) é originário da América Central, tendo sido rapidamente

distribuído pelos quatro cantos do Mundo através das viagens marítimas do século XVI. Ao

longo de gerações, a agricultura produziu numerosas variedades locais de milho.

Actualmente, estas variedades voltam a adquirir elevada importância, mas num contexto de

valorização dos produtos regionais. A diversidade genética das variedades portuguesas de

milho constitui um recurso valioso para o melhoramento da espécie e, além disso, a

comparação de variedades com diferentes capacidades de resistência ao stresse pode fornecer

informações importantes sobre os mecanismos fisiológicos que a conferem.

O stresse hídrico é a mais importante limitação à produtividade vegetal. O

desenvolvimento de variedades resistentes à seca assume particular importância no panorama

de alterações climáticas, em que o aumento da temperatura prolonga o período de restrições

hídricas das plantas (Bruce et al., 2002; Taiz e Zeiger, 2002; Chaves et al., 2002, 2003). Para

contrariar a influência destas alterações na produtividade, deverá ser desenvolvido um

programa de selecção para uma maior tolerância ao stresse hídrico, mantendo uma boa

eficiência do uso da água e da capacidade fotossintética, de modo a garantir um aumento de

produção nestas condições.

Para melhor compreender as limitações fisiológicas e bioquímicas da fotossíntese,

torna-se necessário elucidar aspectos fundamentais do metabolismo fotossintético e da gestão

da água ao nível celular e da planta inteira e, assim, avançar no conhecimento dos

mecanismos de resposta ao stresse.

A tolerância é o resultado duma resposta integrada, determinada por múltiplos genes.

Deste modo, a identificação de um elevado número de alterações de valor adaptativo reveste-

se de enorme importância para o planeamento de estratégias de melhoramento da resistência à

seca de espécies de interesse agrossilvícola.

Existem ainda lacunas de conhecimento sobre os mecanismos que afectam a fisiologia

e o metabolismo em condições de stresse hídrico, nomeadamente sobre a contribuição relativa

dos processos estomáticos e não-estomáticos (ou metabólicos) na redução da fotossíntese

(Lawlor e Cornic, 2002). Sob stresse moderado parecem predominar as limitações

estomáticas, mas, em certas circunstâncias, à medida que o stresse se intensifica, as limitações

não-estomáticas (como a alteração da actividade e estrutura das enzimas do metabolismo

fotossintético do carbono) ganham peso (Marques da Silva e Arrabaça, 2004a). A extensão de

cada variação, contudo, é desconhecida. Foi sugerido ser possível incluir diferentes espécies

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1. Objectivos e Abordagem do Problema

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

2

em dois grupos com respostas ao stresse distintas: nas plantas do tipo I, as limitações ao nível

do mesófilo aumentam linearmente com a intensidade do stresse, enquanto que, nas plantas

do tipo II, não há limitações do mesófilo até um determinado nível de stresse hídrico, mas,

uma vez atingido o limiar, observa-se um rápido aumento dessas limitações (Lawlor e Cornic,

2002). Não se conhecem as razões porque uma espécie responde da forma I ou II e se

comporta de forma distinta, em diferentes circunstâncias, admitindo-se, no entanto, que a

velocidade de imposição do stresse poderá ser relevante. Deste modo, também a forma como

cada variedade responde ao stresse é determinante para seleccionar a estratégia de

melhoramento.

Uma resposta quase universal ao défice hídrico é a acumulação de solutos

osmoticamente compatíveis com o metabolismo celular (Bohnert e Shen, 1999). Esta resposta

pode conduzir a um ajustamento osmótico e à manutenção de um estado hídrico favorável

para o metabolismo e, neste caso, os solutos denominam-se osmorreguladores. Noutros casos,

a síntese de certos solutos compatíveis pode ter um papel fundamental na protecção de

proteínas (nomeadamente enzimas), na estabilização de membranas celulares e na

sequestração de espécies reactivas de oxigénio (ROS, do inglês reactive oxygen species)

(Bohnert e Shen, 1999), cuja produção aumenta em condições de défice hídrico (Iturbe-

Ormaetxe et al., 1998). Neste caso, designam-se os solutos de osmoprotectores. Vários

estudos revelam que a produção de solutos compatíveis permitiu uma maior actividade de

enzimas do ciclo de Calvin em condições de défice hídrico (Shen et al., 1997b; Heuer, 2003).

Dada a importância de conhecer a influência do stresse hídrico no desenvolvimento,

crescimento e produtividade das plantas agrícolas, tornou-se necessário o desenvolvimento e

aplicação de técnicas que forneçam parâmetros com os quais seja possível avaliar os efeitos

do stresse ambiental. Algumas dessas metodologias serão aqui abordadas, nomeadamente a

medição da fluorescência da clorofila a e das trocas gasosas por análise de gases na banda do

infra-vermelho (IRGA).

Neste trabalho, proceder-se-á à análise de seis variedades portuguesas de milho através

destas técnicas, isolando as duas que mais se distinguem, positiva e negativamente, em termos

de tolerância ao stresse hídrico. Ulteriormente, a investigação seguirá novas abordagens

dessas duas variedades, de modo a identificar características que permitam explicar algumas

diferenças entre a variedade mais tolerante e a variedade mais susceptível ao stresse hídrico,

nomeadamente actividades de enzimas-chave do metabolismo do carbono e quantificação de

solutos compatíveis, como a prolina.

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

3

2222.... Introdução Geral Introdução Geral Introdução Geral Introdução Geral

2.12.12.12.1.... Descrição Botânica Descrição Botânica Descrição Botânica Descrição Botânica do Milho do Milho do Milho do Milho

Durante séculos os investigadores interrogaram-se sobre a origem geográfica do

milho. Actualmente, todos estão de acordo que a região de origem desta espécie é o Novo

Mundo, seja no México, na América Central ou na América do Sul.

A espécie de milho que hoje utilizamos é incapaz de sobreviver sem a intervenção do

Homem, uma vez que não possui mecanismos de disseminação, nem órgãos de resistência. É

uma espécie relativamente recente, com alguns milhares de anos, tendo surgido

provavelmente a partir do período em que o Homem iniciou o desenvolvimento da

agricultura.

O milho pertence à Divisão Magnoliophyta, Classe Liliopsida, Ordem Poales, e

Família das Poaceae (também conhecida como Gramineae).

É uma espécie muito polimórfica, apresentando populações muito precoces, em que a

maturação é atingida em 60-70 dias, e populações muito tardias, que exigem 10 a 11 meses.

Também o número de folhas por planta pode variar entre 8 e 48, a altura do caule entre 60

centímetros e 6 metros e a dimensão da espiga entre 2,5 e 30 centímetros (Floyd et al., 2002).

Embora existam grandes diferenças morfológicas entre as populações de milho, todas

as variedades cultivadas têm características morfológicas comuns, nomeadamente os órgãos

vegetativos (raízes, caule, folhas) e os órgãos reprodutores (panícula e espigas).

No milho, existem dois sistemas radiculares: um seminal ou provisório e um coronário

ou definitivo. As raízes seminais são as primeiras a formar-se permitindo à planta

desenvolver-se até formar as raízes coronárias, as quais permitem também fixar a planta ao

solo (Floyd et al., 2002).

O caule do milho é formado por nós e entrenós, variando o número de nós entre 8 e

48. Ao nível de cada nó estão inseridos uma folha e um gomo axilar. Quando os gomos

axilares da base do caule se desenvolvem dão origem a rebentos que, tal como o pé principal,

também são formados de caule, folhas e inflorescências (Floyd et al., 2002).

Num pé de milho as folhas apresentam dimensões diferentes. As folhas da base são

pequenas. O engrossamento do caule provoca a ruptura dos vasos que as alimentam fazendo

com que elas deixem de ser funcionais. As folhas inseridas na zona mediana do caule (ao

nível da inserção das espigas) são as mais longas e mais largas. No terço superior do caule, as

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

4

folhas vão diminuindo de dimensão à medida que a sua inserção se aproxima da panícula

(Floyd et al., 2002).

2.2.2.2.2.2.2.2. O Milho na Economia MO Milho na Economia MO Milho na Economia MO Milho na Economia Mundial e em Portugalundial e em Portugalundial e em Portugalundial e em Portugal

Actualmente, o milho é cultivado em diversos pontos do planeta, desde países como

Canadá e Rússia até ao Brasil e países africanos; desde locais situados abaixo do nível do mar

junto do Mar Cáspio até aos 3600 metros de altitude nos Andes peruanos; desde zonas semi-

áridas onde a precipitação anual não ultrapassa 250 milímetros até às regiões onde ela

ultrapassa os 1000 milímetros; em regiões com Verão muito curto (Canadá) e nas de Verão

permanente (Equador). Nenhuma outra cultura tem uma distribuição geográfica tão vasta

(CIMMYT, 2001).

Depois do trigo e do arroz, o milho é o cereal mais cultivado, com uma produção de

mais de 400 milhões de toneladas por ano, sendo os EUA o maior produtor mundial, com

cerca de 40% da produção (CIMMYT, 2001).

Em Portugal, a área cultivada é de cerca de 180.000 hectares. Os milhos mais

cultivados são os híbridos, calculando-se que ocupem cerca de 71,4 % da área global da

cultura. A cultura do milho decorre no período da Primavera-Verão, quando as temperaturas

são mais elevadas, sendo a temperatura óptima para o crescimento do milho de 24 a 30ºC

(Syngenta, 2004). Este facto levanta sérios problemas ao cultivo de milho, dado que estas

temperaturas, associadas ao aumento da evapotranspiração e à diminuição dos recursos

hídricos no solo, limitam a água disponível para a planta durante o seu desenvolvimento o que

é determinante para garantir uma boa produtividade.

2.32.32.32.3. Relações Hídricas em P. Relações Hídricas em P. Relações Hídricas em P. Relações Hídricas em Plantaslantaslantaslantas

A água é o líquido mais abundante à face da Terra, tendo uma função muito

importante nas plantas como responsável pela dissolução e transporte de iões e moléculas e

influenciando também a estrutura de proteínas, ácidos nucleicos, polissacáridos e outros

constituintes da membrana celular. A água forma o ambiente no qual ocorre a maioria das

reacções celulares, e participa directamente em muitas reacções bioquímicas (Taiz e Zeiger,

2002).

As células vegetais, quando completamente desenvolvidas, possuem um enorme

vacúolo constituído de uma solução aquosa de natureza diversa, restando apenas 5 a 10% do

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

5

volume celular para o citoplasma. A água constitui cerca de 80 a 95% da massa dos tecidos

vegetais em crescimento. Por outro lado, estruturas como a madeira, constituída

essencialmente por células mortas, contém quantidades baixas de água. As sementes possuem

5 a 15% de água, estando entre os tecidos vegetais com menor quantidade de água, embora na

germinação necessitem de absorver enormes quantidades (Taiz e Zeiger, 2002).

As plantas estão continuamente a absorver e a perder água, grande parte dela perdida

por transpiração foliar, através dos estomas, à medida que o CO2, necessário para a

fotossíntese, é absorvido da atmosfera.

O fluxo de água também é um meio importante de adquirir os minerais existentes no

solo através da absorção nas raízes. O movimento de água é conduzido por difusão simples ou

fluxo de massa, ou através de uma combinação destes dois mecanismos de transporte, em

resposta a uma diferença de potencial hídrico (Steudle e Peterson, 1998; Steudle, 2000). A

difusão acontece devido ao constante movimento térmico das moléculas, que ocorre na

presença de um gradiente de concentrações. Por outro lado, existe o movimento em fluxo de

massa, ao longo do contínuo solo-planta-atmosfera (Wei et al., 1999; Lawlor, 2002).

Actualmente, a manutenção deste fluxo é explicada por dois modelos complementares, o

modelo da pressão radicular, segundo o qual a água ascende na planta devido a uma pressão

provocada pela entrada de água nas raízes, e o modelo de tensão-coesão-adesão, segundo o

qual a coluna de água ascende devido às propriedades específicas das moléculas de água,

referidas no nome do modelo (Kramer e Boyer, 1995).

A água é absorvida pelas raízes e o seu movimento pode ocorrer através de duas vias

possíveis: apoplástica (ao longo dos espaços intercelulares) e simplástica (atravessando

paredes celulares e membranas plasmáticas e depois difundindo-se pelos plasmodesmos)

(Steudle e Peterson, 1998). No caso das células, designa-se por osmose a difusão de água

através de membranas, dependendo de um gradiente da energia livre da água através da

membrana, normalmente medido como diferença de potencial hídrico (Taiz e Zeiger, 2002).

A concentração de solutos no citosol e vacúolo e a pressão hidrostática exercida pela

membrana plasmática na parede celular são os dois factores principais que afectam o

potencial hídrico, embora, à medida que a distância vertical aumenta, a gravidade também

possa desempenhar um papel importante. Os componentes do potencial hídrico (Ψw) podem

ser resumidos na expressão Ψw = Ψs + Ψp + Ψg, onde Ψs corresponde ao potencial osmótico

(efeito dos solutos na energia livre da água), Ψp corresponde à pressão hidrostática ou de

turgescência, e Ψg corresponde ao efeito da gravidade no movimento da água (nas plantas de

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

6

maiores dimensões aumenta cerca de 0,1 MPa / 10 m) (Taiz e Zeiger, 2002). O potencial

hídrico é normalmente um bom indicador do estado hídrico da planta.

Ao contrário das células animais, as células vegetais podem suportar uma elevada

pressão intracelular, denominada pressão de turgescência, resultante da presença da parede

celular. Esta pressão é necessária para diversos processos fisiológicos, nomeadamente a

elongação celular, as trocas gasosas nas folhas, o transporte floémico, e diversos processos de

transporte membranar. A pressão de turgescência também contribui para a manutenção da

rigidez e da estabilidade mecânica em tecidos vegetais não-lenhificados.

2.42.42.42.4. Stresse . Stresse . Stresse . Stresse HHHHídrico nídrico nídrico nídrico nas Pas Pas Pas Plantaslantaslantaslantas

2.42.42.42.4....1. 1. 1. 1. Aspectos GeraisAspectos GeraisAspectos GeraisAspectos Gerais

As plantas estão frequentemente expostas a stresses ambientais que podem resultar em

défice hídrico, toxicidade por cálcio e outros metais, deficiência em iões e fotoinibição, entre

outras.

A reduzida disponibilidade de água é um dos factores ambientais mais importantes na

regulação do crescimento e desenvolvimento das plantas e uma das principais causas para a

redução do rendimento das colheitas que afectam a maioria das zonas cultivadas por todo o

mundo. À medida que os recursos hídricos para utilização agronómica se vão tornando cada

vez mais limitantes, o desenvolvimento de linhas de plantas tolerantes à seca tem surgido

como um objectivo importante a atingir (Stoop et al., 1996; Hare et al., 1999; Jiang e Zhang,

2002; Bruce et al., 2002).

Durante o ciclo de vida de uma planta ocorrem frequentemente períodos de défice

hídrico nos solos e/ou na atmosfera, mesmo fora de regiões áridas/semi-áridas, como foi

documentado nas florestas decíduas temperadas (Burghardt e Riederer, 2003) ou nas florestas

tropicais (Asner et al., 2004).

Na natureza, as plantas podem estar sujeitas a dois tipos de stresse hídrico de acordo

com a sua duração, podendo ser de longo prazo (de dias a semanas ou meses) ou curto prazo

(de horas a dias) (Chaves et al., 2003). As respostas das plantas à escassez de água são

complexas, envolvendo alterações adaptativas e/ou efeitos deletérios. Em condições naturais,

estas respostas podem ser sinergistica ou antagonisticamente modificadas por sobreposição de

outros stresses, como é o caso do stresse salino (Xiong et al., 2002).

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

7

As plantas terrestres também podem estar sujeitas à desidratação durante a exposição a

temperaturas baixas (Hare et al., 1999), uma vez que a água pode não estar disponível na

forma líquida para ser absorvida pelas raízes e, também, devido à diminuição da absorção

radicular, nestas condições, mesmo quando está disponível.

Algumas das diferenças entre espécies, no que respeita ao crescimento e

sobrevivência, podem ser atribuídas a diferentes capacidades para a aquisição de água,

transporte e acumulação, e não a diferenças drásticas do metabolismo num determinado

estado hídrico. No entanto, a regulação do metabolismo fotossintético também está

dependente de factores como as limitações da difusão de CO2 na folha, repartição na alocação

de carbono para órgãos não-fotossintéticos e moléculas de defesa, ou mudanças na

bioquímica da folha, que podem ser afectados pelo stresse hídrico (Chaves et al., 2002).

Em condições de défice hídrico, também ocorre o aumento da produção de radicais

livres de oxigénio nas plantas, e a acumulação de solutos compatíveis poderá ter algum efeito

protector contra danos oxidativos nas proteínas, interagindo com os grupos que as constituem

(Iturbe-Ormaetxe et al., 1998).

As respostas iniciais ao stresse hídrico permitem a sobrevivência imediata. No entanto,

para que a planta seja capaz de suportar o stresse imposto é necessária uma aclimatação, a

qual produz novas capacidades metabólicas e/ou estruturais mediadas pela alteração da

expressão génica (Sharp et al., 2004).

As respostas fisiológicas ao stresse ambiental têm que ser activadas antes de

ocorrerem danos significativos nos tecidos afectados (Hare et al., 1999). Contudo, é a

resposta integrada ao nível da planta inteira, incluindo a assimilação de carbono e a alocação

de fotoassimilados para diferentes partes da planta e a capacidade reprodutora, que vai

determinar a sobrevivência e persistência em condições de stresse ambiental (Chaves e

Oliveira, 2004).

Para providenciar uma base sólida às estratégias de melhoramento da produção vegetal

é necessário uma melhor caracterização dos receptores moleculares envolvidos na percepção

do stresse e dos eventos moleculares que especificam a expressão da tolerância ao stresse

(Hare et al., 1999).

Os grandes avanços na área da genómica permitiram um enorme progresso na

caracterização de genes individuais e das suas respostas específicas ao stresse, de modo a

determinar a cascata de eventos que estarão associados a vias de sinais inter- e intracelulares

do défice hídrico, como é o caso do ácido abcísico (ABA) (Griffiths e Parry, 2002). Contudo,

como a maioria dos esforços são dirigidos para a transformação genética das plantas (Casas et

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

8

al., 1993), as abordagens fisiológicas tradicionais são negligenciadas. Até agora, foram

desenvolvidas poucas variedades com maior tolerância ao stresse ambiental. Contudo, no

mesmo período de tempo, o conhecimento das respostas fisiológicas aumentou

substancialmente (Heuer, 2003).

2222.4.4.4.4.2.2.2.2. Respostas . Respostas . Respostas . Respostas EstomáticasEstomáticasEstomáticasEstomáticas ao Stresse H ao Stresse H ao Stresse H ao Stresse Hídricoídricoídricoídrico

Os estomas ocupam um papel central nas trocas gasosas, funcionando como o controlo

a curto prazo da perda de água por transpiração e da assimilação do CO2 pelas plantas (Jones,

1998).

Foram identificadas duas respostas gerais (Tipo I e Tipo II) da fotossíntese ao stresse

hídrico, que se distinguem pelo conteúdo relativo de água foliar abaixo do qual surgem os

efeitos não-estomáticos (metabólicos) (Lawlor, 2002). Contudo, durante a imposição gradual

de défices hídricos moderados (normalmente até –1,8 MPa durante um período de 15 dias ou

mais), as respostas baseiam-se quase exclusivamente na limitação da condutividade

estomática (gs) (Cornic e Fresneau, 2002; Yordanov et al., 2003).

Quando os défices hídricos se desenvolvem, um dos primeiros acontecimentos a tomar

lugar nas plantas é o fecho estomático, em resposta a um declínio da turgescência da folha

e/ou do seu potencial hídrico (Yordanov et al., 2003), ou ainda em resposta ao aumento da

concentração de ABA no fluxo transpiratório (Sharp e LeNoble, 2002; Chaves et al., 2003).

Este encerramento permite evitar a desidratação da planta e fenómenos de cavitação, os quais

poderiam comprometer a sobrevivência das plantas. A diminuição do CO2 intracelular, após o

fecho estomático, e a consequente baixa eficiência do uso da luz pode induzir, a longo prazo,

uma regulação da maquinaria fotossintética, no sentido de se adequar ao carbono disponível

(Chaves et al., 2002).

À medida que a seca progride, nas plantas cultivadas no campo, o fecho estomático

ocorre por períodos cada vez mais longos, durante o dia, tendo início a meio da manhã

(Tallman, 2004). Esta diminuição da condutância estomática tem como efeito simultâneo a

redução da assimilação de carbono e das perdas de água no período de maior défice de

pressão de vapor entre a folha e a atmosfera, e leva a uma optimização da assimilação de

carbono, em relação à disponibilidade de água (Jones, 1998).

Foi encontrada claramente uma dependência do ciclo diurno no que respeita à resposta

estomática, tendo em conta a humidade do ar e ao estado hídrico da folha numa dada hora

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

9

(Tallman, 2004), sugerindo que algumas das alterações diurnas na função estomática podem

resultar de processos metabólicos com um ritmo circadiano.

2.42.42.42.4....3333. . . . Metabolismo do Carbono e Metabolismo do Carbono e Metabolismo do Carbono e Metabolismo do Carbono e Efeitos do Stresse Hídrico na Efeitos do Stresse Hídrico na Efeitos do Stresse Hídrico na Efeitos do Stresse Hídrico na

FFFFotossínteseotossínteseotossínteseotossíntese

As plantas terrestres apresentam uma enorme diversidade de formas e estratégias

adaptativas aos desafios impostos pelo meio ambiente. Também ao nível dos processos

fotossintéticos demonstram esta variabilidade. As principais vias fotossintéticas denominam-

se C3 e C4, devido ao facto de se ter observado que o primeiro produto estável da fixação de

CO2 era uma molécula com três e quatro átomos de carbono, respectivamente (Ehleringer e

Cerling, 2002). Existe uma terceira via fotossintética denominada CAM (de crassulacean

acid metabolism) em que há uma fixação do carbono durante o período nocturno, altura em

que os estomas estão abertos, ao contrário do que acontece com as outras duas vias

fotossintéticas (Lüttge, 2004).

A fotossíntese C3 é um processo com várias etapas nas quais o CO2 atmosférico é

fixado em moléculas orgânicas estáveis, ocorrendo praticamente em todas as células do

mesófilo das folhas. No primeiro passo, a ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase

(RuBisCO) cataliza a reacção de carboxilação de uma molécula de ribulose-1,5-bisfosfato

(RuBP) com uma molécula de CO2 para formar duas moléculas de fosfoglicerato. Contudo, a

RuBisCO também apresenta afinidade para o O2, iniciando uma via metabólica – conhecida

por fotorrespiração – levando à perda de carbono e energia (Taiz e Zeiger, 2002; Ehleringer e

Cerling, 2002).

A fotossíntese C4 representa uma modificação bioquímica da fotossíntese C3, de modo

a reduzir a actividade oxigenásica da RuBisCO, aumentando a concentração de CO2 junto

desta enzima. Nas plantas C4, a fotossíntese C3 encontra-se restrita às células da bainha dos

feixes vasculares (Fig. 2.1). É nas células do mesófilo nas quais se encontra a enzima

fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC), a qual fixa o HCO3- (a partir do CO2 numa reacção

levada a cabo pela anidrase carbónica) e PEP em oxaloacetato, um ácido C4 que se difunde

para as células da bainha do feixe vascular, onde é descarboxilado (Ehleringer e Cerling,

2002).

A descarboxilação deste composto e a sua introdução na via C3 normal é realizado de

três formas, consoante o tipo de planta C4: através da enzima málica dependente de NADP

(EM-NADP) (como é o caso do milho) (Fig. 2.1); através da enzima málica dependente de

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

10

NAD (EM-NAD) (como é o caso de Flaveria trinervia); e através da enzima

fosfoenolpiruvato carboxicinase (PEPCK) (como é o caso de Panicum maximum) (Edwards et

al., 2001; Walker et al., 2002). No entanto, esta divisão tem sido vista como uma

simplificação do que realmente acontece, dado que o milho também possui uma actividade

descarboxilativa considerável pela enzima PEPCK (Wingler et al., 1999) e na espécie

Panicum maxicum a descarboxilação também é realizada pela enzima EM-NAD (Walker et

al., 2002).

Independentemente da forma como é descarboxilado o composto C4, a actividade

elevada da PEPC conduz a uma elevada concentração de CO2 junto da RuBisCO, limitando a

actividade fotorrespiratória (Ehleringer e Cerling, 2002).

Fig. 2.1 – Esquema da via fotossintética nas plantas C4, do subtipo EM-NADP, como é o caso do

milho (adaptado de Taiz e Zeiger, 2002).

As plantas C4, como o milho, têm sido documentadas como melhor adaptadas a

condições de défice hídrico devido a uma resistência estomática mais elevada, apresentando,

uma melhor eficiência do uso de água e a capacidade de manter a actividade fotossintética em

condições de baixo potencial hídrico (Bruce et al., 2002). O milho é capaz de tolerar um nível

mais elevado de stresse e manter o crescimento das suas raízes e partes aéreas a níveis de

stresse que são inibitórios para plantas C3, como o trigo (Triticum aestivum) (Siddique et al.,

1999; Nayyar, 2003).

Quando o stresse hídrico é imposto lentamente, como acontece normalmente em

condições naturais, pode ocorrer uma redução na capacidade bioquímica de assimilação e

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

11

utilização de carbono, juntamente com restrições na difusão gasosa (Chaves et al., 2002).

Diferenças na resposta da fotossíntese à concentração interna de CO2 (Ci) indicam que a

necessidade bioquímica de CO2 é regulada em função da diminuição da disponibilidade de

CO2, associada ao fecho dos estomas induzido pela seca (Tallman, 2004). Existem dados

experimentais que demonstram que a diminuição das taxas de assimilação de CO2

encontradas em folhas sujeitas a stresse hídrico não pode ser revertida simplesmente

aumentando o fornecimento externo de CO2, indicando que o stresse hídrico também deve

afectar o metabolismo do mesófilo (Lawlor, 2002; Parry et al., 2002; Tang et al., 2002;

Cornic e Fresneau, 2002). Esta resposta do mesófilo torna-se progressivamente mais

importante com o aumento da deficiência em água (Parry et al., 2002).

Numa experiência de campo com videiras, a assimilação de CO2 foi significativamente

limitada devido ao fecho dos estomas, à medida que a seca se instalava durante o período de

Verão, mas também houve uma redução na actividade de diversas enzimas do ciclo de Calvin

(Maroco et al., 2002).

Foi demonstrado que os efeitos do défice hídrico na capacidade fotossintética do

tremoceiro dependiam da temperatura da folha e da luz incidente (Chaves et al., 1992 in

Chaves et al., 2002). Foram obtidos dados semelhantes em diversas solanáceas, mostrando

que a fotossíntese era significativamente menos inibida por temperaturas acima dos 38-40ºC

em plantas desidratadas comparadas com plantas bem regadas (Havaux, 1992).

Numa experiência com duas espécies de Quercus não se encontraram diferenças

significativas nas taxas de assimilação de carbono quando estas se comparavam entre plantas

em situação de humidade suficiente no solo e plantas sujeitas a um stresse hídrico moderado

no início de Julho. Contudo, no fim do Verão quente e seco (Setembro), as trocas gasosas, a

meio do dia, na azinheira (Quercus ilex L.) eram menos reduzidas que as observadas no

sobreiro (Quercus suber L.) (Faria et al., 1998 in Chaves et al., 2002). Isto sugere um efeito

menos severo do stresse hídrico na primeira relativamente ao último. De facto, foram

observados valores significativamente mais elevados de potencial hídrico nas folhas no fim do

Verão de 1999 na azinheira (-1,52 MPa) quando comparado com os -2,38 MPa medidos no

sobreiro. Uma das hipóteses é a de que as raízes da azinheira eram capazes de retirar água de

camadas de solo mais profundas, permitindo a esta espécie manter o influxo de água e taxas

de assimilação de carbono mais elevadas nas folhas, por um período de tempo mais longo, do

que as do sobreiro (Chaves et al., 2002).

No final da época seca (Setembro), foi observada uma diminuição da fotossíntese na

azinheira e no sobreiro, comparativamente com o início do Verão (Julho). Durante o período

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mais quente do dia, ocorreu uma diminuição da fotossíntese, associada a uma diminuição do

rendimento quântico do fotossistema II. Neste período do dia, a assimilação de carbono estava

limitada pela diminuição da condutância estomática, podendo aquela ser vista como um

importante mecanismo protector contra a foto-oxidação e, portanto, contra a seca nestas

árvores. Esta regulação da fotossíntese resulta de uma dissipação térmica do excesso de

energia de excitação nos cloroplastos, como foi mostrado pelo aumento do amortecimento

não-fotoquímico (NPQ) em Setembro quando comparado com Julho (Chaves et al., 2002).

Noutras espécies, sabe-se que a seca rigorosa diminui a quantidade da proteína

RuBisCO (Vu et al., 1987). A quantidade de RuBisCO nas folhas é controlada pela sua taxa

de síntese e degradação. Mesmo sob stresse hídrico, a holoenzima da RuBisCO é

relativamente estável, com um tempo de semi-vida de vários dias (Webber et al., 1994 in

Parry et al., 2002). Contudo, o stresse hídrico no tomate (Bartholomew et al., 1991), em

Arabidopsis (Williams et al., 1994 in Parry et al., 2002) e no arroz (Vu et al., 1999 in Parry et

al., 2002) leva a uma rápida diminuição na abundância de transcritos da subunidade menor da

RuBisCO (rbcS), o que pode indicar uma diminuição na sua síntese (Marques da Silva e

Arrabaça, 2004b).

Em alguns estudos, o potencial fotossintético (Apot), medido em condições saturantes

de CO2, não é afectado por uma pequena diminuição do teor hídrico relativo (THR) mas

torna-se progressivamente mais inibido, e menos estimulado por elevadas concentrações de

CO2, abaixo de um determinado valor de THR (resposta Tipo I). Noutros estudos, Apot e a

estimulação da taxa fotossintética por elevadas concentrações de CO2 diminui

progressivamente à medida que THR diminui (resposta Tipo II) (Lawlor, 2002).

Diversos estudos sugeriram que a diminuição da capacidade fotossintética resulta da

insuficiente regeneração de ribulose-1,5-bisfosfato (RuBP) (Giménez et al., 1992). Se isto é

provocado ou não pela diminuição da síntese de ATP na fase fotoquímica continua a ser

discutido (Gunasekera e Berkowitz, 1993; Tezara et al., 1999; Lawlor, 2002).

Embora a actividade da RuBisCO possa não ser a principal limitação do metabolismo

cloroplastidial, os efeitos do stresse hídrico na quantidade e actividade da RuBisCO não

podem ser ignorados. No estudo de Tezara et al. (1999), a disponibilidade de ATP diminuiu,

tendo sido identificada como um factor chave na tolerância ao stresse hídrico. No entanto, as

alterações nos níveis de ATP foram inferiores às verificadas para a actividade da RuBisCO,

em potenciais hídricos baixos, quando a assimilação de CO2 estava muito reduzida.

A actividade da RuBisCO é regulada para ajustar à capacidade da folha em regenerar

RuBP, sendo modulada in vivo quer pela reacção com CO2 e Mg2+ para carbamilar o resíduo

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2. Introdução Geral

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de lisina no local catalítico, quer pela ligação de inibidores no local catalítico (Parry et al.,

2002). A ligação dos inibidores à RuBisCO carbamilada previne a catálise, enquanto que a

ligação do substrato RuBP na enzima não-carbamilada previne a carbamilação do resíduo de

lisina que é essencial para a actividade. A libertação de tais compostos tão fortemente ligados

necessita da participação da RuBisCO activase e da hidrólise de ATP (Zhang e Portis, 1999).

Enquanto que a medição da actividade da RuBisCO imediatamente após a extracção

(actividade inicial) reflecte a actividade in vivo, a carbamilação potencial (actividade total)

pode ser determinada incubando os extractos com elevadas concentrações de CO2 e Mg2+

antes do ensaio. Contudo, a carboxilação máxima potencial (actividade máxima) apenas é

revelada se forem dados passos para, em primeiro lugar, remover quaisquer inibidores que

estejam ligados aos locais activos (Parry et al., 2002). A maioria dos inibidores pode ser

removido in vitro através de altas concentrações de sulfato (Parry et al., 1997).

No tabaco (Nicotiana tabacum L.), a seca diminuiu a actividade inicial e total da

RuBisCO. A diminuição da actividade aparenta ser o resultado de uma diminuição do Kcat

aparente e não de uma alteração do estado de activação. Também têm sido observadas

diminuições semelhantes na Kcat da RuBisCO em resposta ao stresse hídrico de longa duração

no trevo (Medrano et al., 1997 in Parry et al., 2002).

Foi demonstrado que a ligação do inibidor CA1P à RuBisCO protege a enzima da

degradação proteolítica (Khan et al., 1999). A RuBisCO que se encontra activa na

carboxilação da RuBP é relativamente resistente à degradação por proteases; por outro lado, a

RuBisCO não-carbamilada com locais activos disponíveis é muito susceptível à proteólise. As

interacções com inibidores podem apresentar vantagens in vivo, de modo a prevenir a

degradação por proteases da RuBisCO não activa.

Como já foi mencionado, a libertação dos inibidores de ligação forte necessita da

participação da RuBisCO activase e da hidrólise de ATP (Zhang e Portis, 1999). A remoção

dos inibidores pela RuBisCO activase pode ser impedida porque, como já foi sugerido por

alguns trabalhos, as concentrações de ATP são reduzidas por acção da seca (Lawlor, 2002).

Além disso, a RuBisCO activase é susceptível a temperaturas elevadas (Crafts-Brandner e

Salvucci, 2000) que podem estar associadas ao stresse hídrico.

No trigo, a diminuição do THR não conduziu ao aumento dos inibidores de ligação

forte. Este resultado contradiz estimativas indirectas da percentagem de locais catalíticos

bloqueados por inibidores (calculados a partir das actividades máxima e total), o qual sugeria

que um número elevado de locais deveriam estar bloqueados por inibidores. Esta discrepância

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pode ser explicada por outros factores, dado que o trigo não contém grandes quantidades de

CA1P (Servaites et al., 1986).

Existem dois mecanismos a ser considerados em relação à diminuição da actividade da

RuBisCO. Primeiro, a RuBisCO reverte a um estado de baixa actividade in vitro através de

uma mudança conformacional (Schmidt et al., 1984). No entanto, a hipótese deste mecanismo

ter um papel regulador in vivo tem recebido pouca atenção. A segunda hipótese é a inibição da

RuBisCO por ligação da RuBP aos locais não-carbamilados (Parry et al., 2002).

Em resumo, em condições de campo, quando o stresse hídrico moderado se

desenvolve lentamente, a diminuição do CO2 intracelular após o fecho estomático

aparentemente induz, a longo prazo, a regulação da maquinaria fotossintética, nomeadamente

da RuBisCO, de modo a ajustar ao fluxo de carbono disponível (Chaves et al., 2002).

2.52.52.52.5.... Estratégias de Sobrevivência à S Estratégias de Sobrevivência à S Estratégias de Sobrevivência à S Estratégias de Sobrevivência à Secaecaecaeca

2.52.52.52.5....1. 1. 1. 1. Aspectos GeraisAspectos GeraisAspectos GeraisAspectos Gerais

A adaptação das plantas à seca tem sido classificada em três estratégias: escapar, evitar

e tolerar (Chaves et al., 2003). No entanto, estas estratégias não são mutuamente exclusivas e,

na prática, as plantas combinam uma variedade de tipos de resposta (Ludlow, 1989 in Chaves

et al., 2003).

As plantas que escapam à seca exibem um elevado grau de plasticidade no seu

desenvolvimento, sendo capazes de completar o seu ciclo de vida antes da ocorrência do

défice hídrico. Estas estratégias têm como base o sucesso reprodutivo antes do stresse se

agravar, sendo de particular importância nas plantas de locais áridos, em que há combinação

de ciclos de vida curtos com elevadas taxas de crescimento e de trocas gasosas, maximizando

o aproveitamento dos recursos hídricos, florescendo e produzindo sementes antes que as

reservas de água se esgotem (Chaves et al., 2002, 2003). Outro mecanismo para um sucesso

reprodutivo consiste em mobilizar parte dos recursos para o desenvolvimento de frutos,

mecanismo associado à capacidade da planta em armazenar reservas em alguns órgãos (caules

e raízes) e mobilizá-los para a produção de frutos, resposta bem documentada em algumas

plantas cultivadas, como os cereais (Gebbing e Schnyder, 1999; Bruce et al., 2002) e alguns

legumes (Chaves et al., 2002). Esta capacidade aumenta em plantas sujeitas à seca (Rodrigues

et al., 1995).

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As plantas também podem superar as condições de seca evitando a desidratação dos

tecidos, enquanto mantém o potencial hídrico nos tecidos o mais elevado possível, ou

tolerando um potencial hídrico baixo no tecido. A desidratação é evitada em plantas anuais ou

perenes e está associada com uma variedade de características adaptativas. Estas envolvem

diminuição das perdas de água e maximização da tomada de água. As perdas de água podem

ser minimizadas pelo fecho dos estomas, por redução da superfície de contacto com a

atmosfera através do enrolamento das folhas (Price et al., 2002), através de uma camada

densa de tricomas aumentando a reflexão (Werker, 2000), através de ângulos fechados das

folhas, ou diminuindo a área da copa através da redução do crescimento e da queda das folhas

mais velhas. A tomada de água é maximizada ajustando o padrão de alocação de carbono,

nomeadamente aumentando o investimento na formação de raízes (Jackson, 2002). Foram

obtidos aumentos significativos na produção de espécies agrícolas, cruzando-as com plantas

de regiões semi-áridas, resultando num melhoramento da profundidade de enraizamento

(Blum, 1984 in Chaves et al., 2003).

A dormência parcial das plantas como sobrevivência à estação seca é outra estratégia

encontrada. A tolerância extrema à desidratação encontra-se nas denominadas plantas da

ressurreição, bem como em alguns fetos, plantas não-vasculares (musgos), algas e líquenes.

As folhas das plantas da ressurreição podem equilibrar com o ar perto de 0-2% (v/v) de

humidade relativa e ainda conseguirem recuperar totalmente a sua actividade fisiológica após

re-hidratação (Chaves et al., 2003).

2.52.52.52.5....2. Modificações Anatómicas, Morfológicas e Metabólicas na 2. Modificações Anatómicas, Morfológicas e Metabólicas na 2. Modificações Anatómicas, Morfológicas e Metabólicas na 2. Modificações Anatómicas, Morfológicas e Metabólicas na

RRRResposesposesposesposta ao Stresse Hta ao Stresse Hta ao Stresse Hta ao Stresse Hídricoídricoídricoídrico

Para além da diminuição dos recursos hídricos, a seca do solo também induz uma

diminuição de nutrientes, em particular o azoto (mas também o cálcio), com fortes efeitos

interactivos no crescimento e funcionamento da planta (Chaves et al., 2003). Esta é uma área

de investigação de grande importância, necessitando de métodos inovadores que permitem

distinguir os efeitos causados pelo défice hídrico dos efeitos causados pela deficiente nutrição

mineral, ambos causados pela seca.

Os ajustamentos da planta aos baixos recursos dos ambientes áridos incluem alteração

da estrutura foliar, aumento da proporção de assimilados mobilizados para as raízes (Poorter e

Nagel, 2000), reduzidas taxas de crescimento e baixas taxas de turnover dos órgãos (Enquist e

Niklas, 2002).

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Enquanto que órgãos com curtos períodos de vida podem ser eliminados em resposta

ao stresse, órgãos com longos períodos de vida têm que optimizar o seu ganho em recursos.

Este é o caso da mudança de demografia foliar observado na espécie desértica perenial

Cryptantha flava, cujo período de vida foliar duplicou em condições de seca (Casper et al.,

2001). Esta resposta resulta em taxas de turnover foliar reduzidas e assim elevada eficiência

do uso de nutrientes. Isto também significa que as plantas podem compensar parcialmente

taxas de ganho de carbono mais reduzidas investindo menos na construção de novas folhas.

As folhas com maior longevidade necessitam sobreviver a períodos em que as

condições são mais hostis. Para tal, necessitam de diversas protecções que variam desde

características anatómicas/morfológicas, como a esclerofilia para resistir a climas extremos e

à herbivoria (Lucas et al., 2000; Burghardt e Riederer, 2003), uma densa camada de tricomas

como na oliveira (Olea europaea L.) para aumentar a reflectância da luz e manter a humidade

(Werker, 2000), ou ângulos foliares fechados (Lizana et al., 2006), até mecanismos

bioquímicos que permitem a dissipação do excesso de energia radiante (Young et al., 1997).

As folhas esclerófilas resistem a condições climáticas extremas e à herbivoria (Lucas

et al., 2000; Burghardt e Riederer, 2003), e são normalmente pequenas e grossas, possuindo

uma reduzida área foliar específica (SLA) e baixa concentração de azoto por unidade de

massa foliar. Uma diminuição na SLA também pode ocorrer nas plantas herbáceas como

resposta à seca, resultando num aumento no investimento de tecidos estruturais, o que permite

uma maior resistência a condições ambientais desfavoráveis (Chaves et al., 2003). Outras

protecções incluem mecanismos bioquímicos de dissipação de energia, como no caso do ciclo

das xantofilas (Young et al., 1997).

Folhas pequenas estão bem adaptadas à elevada luminosidade e à elevada temperatura

que existem na maioria das regiões áridas, porque o seu tamanho permite uma maior

dissipação do calor e um controlo eficaz das perdas de água através do fecho dos estomas

(Jarvis e McNaughton, 1986 in Chaves et al., 2003).

A senescência, que leva a uma diminuição da reserva de açúcares na planta, é um

factor importante na interrupção da formação do fruto, em condições de stresse hídrico.

Assim, os fenótipos com senescência retardada podem ser importantes em culturas onde o

rendimento seja limitado pelos recursos e a acumulação e utilização das reservas dos caules

seja insuficiente para suportar o crescimento do fruto em condições de seca. Contudo, nos

cereais, observa-se uma interacção interessante entre a disponibilidade hídrica e a

disponibilidade de azoto. Em condições de disponibilidade de água não-limitante, azoto

abundante atrasou a senescência mas reduziu o rendimento da produção de grão, enquanto

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que em condições controladas ou suaves de seca no solo, elevada disponibilidade de azoto

aumentou a utilização dos hidratos de carbono armazenados e o rendimento da produção de

grão (Yang et al., 2000). As hormonas vegetais e açúcares também estão envolvidos na

regulação da senescência da parte aérea. Outros estudos revelaram que elevadas

concentrações de açúcares solúveis reprimem a expressão de genes associados à fotossíntese,

num processo em que as hexocinases estão envolvidas (Smeekens e Rook, 1997). Um efeito

importante da sobre-expressão de hexocinases é uma senescência acelerada (Dai et al., 1999).

Para além disso, a queda das folhas mais velhas contribui para a diminuição do gasto

de água, podendo ser visto como um programa de reciclagem no interior da planta, permitindo

a remobilização dos nutrientes armazenados nas folhas mais velhas para os caules ou folhas

mais jovens. Durante a indução da senescência pela seca, algumas proteases específicas da

seca são activadas, as quais não ocorrem no processo normal de envelhecimento, como é o

caso de algumas formas de proteases de cisteína (Solomon et al., 1999). Também existem

diferenças entre as espécies tolerantes e as susceptíveis nomeadamente no grau de

estimulação da actividade endoproteolítica (protease aspártica), sendo superior nas espécies

susceptíveis comparativamente com as tolerantes (Cruz de Carvalho et al., 2001 in Chaves et

al., 2003).

As folhas mais jovens que sobrevivem à seca apresentam, por vezes, taxas

fotossintéticas superiores (Ludlow, 1991) e maior conteúdo de RuBisCO por unidade de área

foliar (David et al., 1998 in Chaves et al., 2003) do que folhas de idade semelhante em

plantas bem regadas, no que pode ser chamado de suspensão do envelhecimento foliar. As

folhas sujeitas a stresse hídrico normalmente atingem a maturidade mais cedo, tornando-se

rapidamente numa fonte de carbono, ao contrário do que acontece nas folhas de plantas bem

regadas (Schurr et al., 2000).

A capacidade da planta captar água de um solo seco através do desenvolvimento de

outras características morfológicas, como raízes mais profundas e de uma maior exploração

do solo, ou através de um ajustamento osmótico são estratégias capazes de estabilizar e

aumentar o fluxo de assimilados encaminhados para as sementes em desenvolvimento (Bruce

et al., 2002).

Algumas das alterações metabólicas que ocorrem como resultado da seca são, elas

próprias, uma consequência da resistência do aparelho fotossintético à desidratação (Cornic,

2000).

Enquanto as árvores e os arbustos desenvolveram estratégias de tolerância e de evitar

o stresse, as plantas herbáceas e as anuais dependem maioritariamente do crescimento rápido

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para escapar aos “stresses de Verão”, bem como das respostas rápidas da maquinaria

fotossintética e do metabolismo do carbono aos sinais iniciais do stresse, incluindo

armazenamento de reservas no caule ou nas raízes (Chaves et al., 2002).

A actividade da invertase aumentou sob stresse moderado e diminuiu drasticamente

com a imposição de um défice hídrico severo. A resposta particular da invertase pode estar

relacionada com o papel central desempenhado por esta enzima na modelação das respostas

da planta aos stresses biótico e abiótico (Roitsch et al., 2003).

O tremoceiro (Lupinus albus L.) sujeito a stresse hídrico mantém a sua produção de

sementes devido à sua capacidade de acumular temporariamente assimilados nas partes aéreas

que mais tarde são encaminhadas para as vagens, durante o estádio de formação das sementes

(Chaves et al., 2002). Essa capacidade do tremoceiro, confirma os dados anteriores de

Withers e Forde (1979 in Chaves et al., 2002) demonstrando que o stresse hídrico estimula a

capacidade de depósito das sementes e vagens.

No caso da azinheira e do sobreiro, a regulação da fotossíntese foi associada com o

aumento da actividade do ciclo das xantofilas e com a diminuição simultânea na concentração

de clorofila da folha, as quais foram observadas durante o período de Verão. Em videiras

sujeitas a precipitação natural após um período prolongado de seca, observou-se uma

diminuição do conteúdo em xantofilas e da eficiência dos centros de reacção abertos do PSII,

resultantes da diminuição da quantidade de proteínas e clorofila (Maroco et al., 2002).

O tremoceiro também é capaz de remover o excesso de energia luminosa através da

dissipação térmica, associada com um aumento da concentração de xantofilas – zeaxantina e

anteraxantina – à custa de violaxantina, como foi observado a meio do dia, especialmente em

plantas sujeitas a stresse hídrico (Chaves et al., 2002).

As temperaturas às quais a planta foi sujeita durante o crescimento também

influenciam a quantidade total de xantofilas relativamente à de clorofilas presentes, ocorrendo

os valores mais elevados em plantas cultivadas num regime de temperaturas mais baixas

(15ºC dia/10ºC noite) comparativamente com o que sucede em plantas cultivadas a

temperaturas mais elevadas (25ºC dia/20ºC noite). A presença de uma maior quantidade de

xantofilas nas plantas no regime de temperaturas mais baixas pode servir como um

mecanismo de protecção das folhas, comparativamente com as plantas cultivadas a

temperaturas mais elevadas, onde a concentração de clorofila é quase o dobro (Chaves et al.,

2002).

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

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Apesar da enorme quantidade de informação acumulada, a compreensão das alterações

metabólicas e da forma como as diferentes vias comunicam entre si necessita de um maior

aprofundamento.

2.52.52.52.5....3. Solutos Compatíveis e Ajustamento 3. Solutos Compatíveis e Ajustamento 3. Solutos Compatíveis e Ajustamento 3. Solutos Compatíveis e Ajustamento OsmóticoOsmóticoOsmóticoOsmótico

O ajustamento osmótico faz parte dos mecanismos que evitam a seca mantendo a

turgescência, através do aumento e manutenção da quantidade de solutos compatíveis

intracelulares no citosol e vacúolo. Tem sido demonstrado que este mecanismo é de particular

importância entre todos os mecanismos adaptativos ao stresse hídrico (Bohnert et al., 1995;

Bohnert e Shen, 1999; Heuer, 2003; Nayyar, 2003; Marques da Silva e Arrabaça, 2004a).

Estudos realizados indicam que ajustamento osmótico mais elevado pode ser um dos

factores decisivos na tolerância ao stresse, oferecendo vantagens, no caso do milho. No caso

do trigo, planta que possui um ajustamento osmótico mais baixo, o desempenho é inferior em

condições de défice hídrico (Nayyar, 2003).

A importância da acumulação de solutos compatíveis já tinha sido reconhecida há

muito tempo (Jefferies et al., 1979).

O tipo de osmólitos e a capacidade de os acumular durante o stresse pode variar entre

diferentes tipos de plantas (Nayyar, 2003; Larher et al., 2003) e especificar diferentes

mecanismos adaptativos.

Muitos dos solutos compatíveis são osmorreguladores, isto é, metabolitos cuja alta

concentração celular reduz significativamente o potencial osmótico, e, portanto, são

considerados responsáveis pelo ajustamento osmótico. Também podem ter outras funções,

nomeadamente na protecção de enzimas e na estrutura das membranas e na eliminação de

ROS, designando-se neste caso de osmoprotectores (Bohnert e Shen, 1999).

As características dos bons osmoprotectores incluem ser hidrofílicos, não-tóxicos e

normalmente sem carga. Estas propriedades são semelhantes aos compostos usados como

crioprotectores para a preservação de células procariotas durante o congelamento (Cleland et

al., 2004). Existe um largo número de osmoprotectores orgânicos, incluindo o manitol, a

trealose, a prolina e a glicina betaína (Stoop et al., 1996; Cleland et al., 2004).

A maioria dos organismos aumentam a concentração celular de solutos compatíveis,

quando estão em perigo de desidratar, quer por efeito de seca quer pelo aumento da pressão

osmótica externa que acompanha, por exemplo, o aumento da salinidade dos solos (Delauney

e Verma, 1993). Os compostos que se acumulam são compatíveis com o metabolismo celular

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

20

normal em elevadas concentrações (Brown e Simpson, 1972 in Bohnert e Shen, 1999). A

adição de solutos compatíveis aumentou a estabilidade térmica de enzimas, e evitou a

dissociação do complexo gerador de oxigénio do PSII (Papageorgiou e Murata, 1995).

Um dos aspectos importantes no estudo dos solutos compatíveis é compreender a

mecânica da sua acção enquanto integrados numa resposta de toda a planta ao stresse, que

inclui a manutenção da homeostase dos iões e das relações hídricas, distribuição

carbono/azoto, alocação das reservas, ou armazenamento (e possivelmente difusão) de poder

redutor (Bohnert et al., 1995). O potássio, se disponível, pode funcionar como soluto

compatível em muitos organismos unicelulares (Bohnert e Shen, 1999). Se existir uma

concentração suficiente de potássio no solo, esta pode levar a uma exclusão do sódio mais

eficiente nas plantas superiores (Niu et al., 1995). Também aminoácidos e derivados de

aminoácidos, açúcares, polióis acíclicos e cíclicos, frutanos, e compostos quaternários de

azoto e enxofre agem frequentemente como solutos compatíveis (Delauney e Verma, 1993;

Vijn e Smeekens, 1999; Bohnert e Shen, 1999).

Foram propostos dois modelos para explicar os efeitos protectores ou estabilizadores

dos solutos compatíveis na estrutura e função das proteínas. O primeiro é denominado

“modelo de exclusão preferencial” (Arakawa e Timasheff, 1985), segundo o qual os solutos

compatíveis são largamente excluídos da película de hidratação das proteínas, que estabiliza a

estrutura da proteína ou promove as interacções proteína-proteína. Neste modelo, os solutos

compatíveis não disturbariam a água de hidratação das proteínas, mas iriam interagir com a

água presente no citosol. O segundo modelo, denominado “modelo da interacção

preferencial”, dá mais relevância às interacções entre os solutos compatíveis e as proteínas

(Schobert, 1977 in Bohnert e Shen, 1999). A película de hidratação das proteínas é crucial

para a sua estabilidade estrutural. Durante o défice hídrico, os solutos compatíveis podem

interagir directamente com os domínios hidrofílicos das proteínas e prevenir a sua

destabilização, ou podem substituir as moléculas de água na proximidade dessas regiões.

Embora os dois modelos possam parecer contraditórios, a verdadeira função dos solutos

compatíveis poderá ser explicada por ambos os modelos. As estruturas dos diferentes solutos

compatíveis poderiam suportar interacções hidrofóbicas, interacções de van-der-Waals, e

interacções de cargas, mas é necessário mais dados para comprovar estas hipóteses (Bohnert e

Shen, 1999).

Os solutos compatíveis também podem funcionar na remoção de ROS. As plantas e os

animais produzem radicais de oxigénio em resposta a uma variedade de stresses, entre os

quais os derivados de ataques patogénicos. Dados experimentais demonstraram que agentes

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

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patogénicos fúngicos são protegidos pela síntese e excreção de manitol, provando-se que este

é capaz de remover ROS (Halliwell et al., 1988 in Bohnert e Shen, 1999).

Através de experiências que comparavam as capacidades de remoção de radicais por

diferentes solutos compatíveis, verificou-se que o manitol, o sorbitol, o glicerol, a prolina, o

ononitol e o pinitol eram capazes de o fazer, embora a diferentes concentrações in vitro,

enquanto que à glicina betaína não lhe foi atribuída esta função. A eficiência relativa destes

compostos para eliminar radicais parece dependente das suas constantes de reacção com

radicais hidroxilo (Bohnert e Shen, 1999).

Utilizando condições diferentes, como iluminação com luz forte, tratamento com metil

viologénio, geração de H2O2, e infiltração de DMSO, foi demonstrado que as plantas

contendo manitol nos seus cloroplastos apresentavam uma capacidade superior de manter

elevadas taxas de fixação de carbono e um menor branqueamento clorofilino (Shen et al.,

1997b). Experiências posteriores demonstraram que o manitol eliminava especificamente os

radicais hidroxilo mas não eliminava peróxido de hidrogénio ou radical de oxigénio (Shen et

al., 1997a)

Demonstrou-se que algumas enzimas do ciclo de Calvin eram predominantemente

afectadas por radicais hidroxilo. A fosforibulocinase (PRK), e provavelmente outras enzimas-

SH do ciclo de Calvin, demonstraram sensibilidade aos radicais hidroxilo, e a actividade da

PRK foi protegida pela presença de manitol (Shen et al., 1997a).

Assim, a síntese e transporte de solutos compatíveis permitem a protecção contra os

efeitos directos (por hidratação) e indirectos (por eliminação de radicais livres) do stresse

hídrico (Griffiths e Parry, 2002).

As vias que levam à sua síntese estão ligadas a vias do metabolismo geral com

elevadas taxas de fluxo. Exemplos disso são a via biossintética do manitol (Stoop et al.,

1996), a via biossintética da prolina (Delauney e Verma, 1993), a síntese de glicina betaína

(Hanson et al., 1985), e a via que conduz à formação de inositol metilado, D-pinitol (Ishitani

et al., 1996).

O manitol é um açúcar-álcool com grupos hidroxilo composto por seis carbonos, que

se encontra distribuído por todo o reino vegetal. Investigações têm demonstrado que as

espécies capazes de o metabolizar têm vantagens na tolerância ao stresse, nomeadamente um

aumento da tolerância ao stresse hídrico e salino (funcionando como um soluto compatível) e

também no papel que desempenha na resposta aos ataques de agentes patogénicos. Desta

forma, o manitol desempenha, aparentemente, um papel importante quer nas respostas ao

stresse biótico, quer nas respostas ao stresse abiótico.

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

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Os açúcares osmoprotectores são a forma reduzida de açúcares da classe das aldoses e

cetoses. Devido à estrutura dos grupos hidroxilo reproduzir a estrutura da água, pensa-se que

estes compostos mantenham uma esfera de hidratação artificial em redor das macromoléculas

(Schobert, 1977 in Bohnert e Shen, 1999).

Alguns solutos, não respondem ao stresse por acumulação a níveis elevados mas são

protectores mesmo a baixas concentrações (Holmström et al., 1996 in Bohnert e Shen, 1999),

podendo estar envolvidos em mecanismos não-osmóticos, como por exemplo eliminação de

ROS. É exemplo disto a trealose.

A prolina e os compostos quaternários de amónio (QCA) (por exemplo, a glicina

betaína, colina, prolina betaína) são osmólitos chave que contribuem para o ajustamento

osmótico em muitas espécies cultivadas e acumulam-se sob condições de stresse ambiental

(Hare et al., 1999; Heuer, 2003; Nayyar, 2003; Larher et al., 2003). A prolina tem sido

implicada no alívio da acidose citoplasmática, na manutenção da relação NADP+/NADPH em

valores compatíveis com o metabolismo, como antioxidante compatível com proteínas, para

além do seu papel importante no desenvolvimento da planta em condições sem stresse (Hare

et al., 1999; Raymond e Smirnoff, 2002).

Foi demonstrado, no milho, que a prolina desidrogenase (PDH), a primeira enzima na

via oxidativa da prolina, é regulada durante o stresse hídrico mas não é afectada por

tratamentos com ABA, sugerindo uma regulação mediada pela seca e independente do ABA

(Dallmier e Stewart, 1992). Uma rápida indução da actividade da PDH, durante a recuperação

do stresse, é consistente com a importância da acumulação da prolina durante o stresse como

uma reserva de carbono, azoto e energia rapidamente mobilizável (Hare et al., 1999).

Foi sugerido que as alterações induzidas pelo stresse na síntese e degradação da

prolina podem afectar a expressão dos genes da planta, para além da visão mais clássica do

seu papel no ajustamento osmótico e nos efeitos metabólicos da sua acumulação (Hare et al.,

1999; Raymond e Smirnoff, 2002).

Estes dados sugerem que a PDH pode ser incluída nos alvos a seleccionar na

resistência à seca nas culturas pretendidas (Bruce et al., 2002).

Verificou-se que a aplicação exógena de prolina estimula o crescimento das células e

das plantas e melhora o metabolismo, em condições de stresse (Heuer, 2003). Contudo,

também foram descritos efeitos negativos (Manetas et al., 1986; Rodriguez e Heyser, 1988,

Lin e Kao, 2001). A aplicação exógena de prolina (100 mM) diminui a síntese de prolina em

células de milho em suspensão (Xin e Li, 1993). Tem sido demonstrada uma relação entre a

síntese de prolina e a tolerância à seca e ao stresse salino em plantas de tabaco que expressam

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

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a enzima da via sintética da prolina, ∆1-pirrolina-5-carboxilato sintetase (P5CS) (Kishor et

al., 1995).

A glicina betaína é um osmoprotector muito comum que é utilizado por muitas

bactérias, bem como algumas Archaea halofíticas (Galinski e Trüper, 1994). Também é um

osmoprotector comum nos animais, nas plantas e outros eucariotas (Rhodes e Hanson, 1993

in Cleland et al., 2004). A glicina betaína é um crioprotector simples e útil que funciona para

uma vasta gama de organismos procariotas sob diferentes regimes de criopreservação

(Cleland et al., 2004).

Os QCA, como a glicina betaína, em baixas concentrações, podem melhorar a

tolerância ao stresse salino e ao frio, possivelmente por protecção dos complexos proteicos

fotossintéticos (Holmström et al., 2000), reduzindo a peroxidação lipídica das membranas,

estabilizando as enzimas e as membranas durante as condições de stresse (Bohnert e Shen,

1999; Sakamoto e Murata, 2000).

A aplicação exógena de glicina betaína aliviou os efeitos dos stresses hídrico, salino e

térmico (Harinasut et al., 1996, Agboma et al., 1997, Rajashekar et al., 1999 in Heuer, 2003).

Tal como na prolina, também existem dados sobre a resposta negativa à aplicação exógena de

glicina betaína (Kishitani et al., 2000 in Heuer, 2003).

Estudos realizados com aplicação de cálcio (Ca2+), revelaram que o milho apresentava

uma acumulação de prolina significativamente mais elevada enquanto que o trigo mostrou

relativamente uma maior acumulação de QAC’s (Nayyar, 2003).

As partes aéreas do milho sujeitas a stresse possuíam um maior Ψw, ajustamento

osmótico, taxa de elongação e menor perda de electrólitos, do que as de trigo. O Ca2+ elevou a

acumulação de osmólitos em ambas as plantas mas o ajustamento osmótico foi menos

sensível a ele. Na presença de Ca2+, o trigo mostrou significativamente maior acumulação de

osmólitos, maior Ψw, e maior taxa de elongação do que no milho. Os inibidores de Ca2+

reverteram parcialmente os efeitos do cálcio, indicando o seu envolvimento no controlo da

acumulação de solutos (Nayyar, 2003).

Tem sido atribuído ao Ca2+ o papel de mensageiro secundário e transdutor de sinal de

vários estímulos de stresse (Sanders et al., 1999). Também tem sido demonstrado o seu

envolvimento na ligação da percepção do stresse com as várias respostas celulares adaptativas

(Torrecilla et al., 2000). O Ca2+ tem sido implicado na protecção contra o stresse por

estabilização das membranas e reduzindo os danos oxidativos (Larkindale e Knight, 2002).

Tem sido sugerido que o aumento no Ca2+ citosólico induzido pelo stresse funciona como

gestor da osmorregulação, uma vez que um aumento no Ca2+ citosólico actua como regulador

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

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da síntese de prolina. A indução do transcrito para a enzima P5CS, em Arabidopsis, foi

inibida por bloqueadores de canais de Ca2+ (Knight et al., 1997).

Resumindo, a sobre-produção de prolina e QAC’s devido à aplicação de Ca2+ pode

aumentar a protecção contra o stresse como já foi defendido em estudos anteriores (Hare et

al., 1999; Raymond e Smirnoff, 2002).

Num futuro próximo, poderá recorrer-se à transformação genética para direccionar

diferentes solutos compatíveis para diferentes locais subcelulares para protecção da

ultraestrutura dos organitos e das enzimas, e para diferentes órgãos, levando a um aumento na

tolerância da planta ao stresse (Bohnert e Shen, 1999).

2.62.62.62.6.... Técni Técni Técni Técniccccas de Melhoramento e Selecção paraas de Melhoramento e Selecção paraas de Melhoramento e Selecção paraas de Melhoramento e Selecção para Tolerância ao Tolerância ao Tolerância ao Tolerância ao

Stresse HStresse HStresse HStresse Hídricoídricoídricoídrico

Ao longo dos anos, os produtores de milho têm apostado na criação de híbridos com

maior potencial de rendimento na produção de grão, melhor estabilidade deste rendimento e

melhor qualidade de grão para os consumidores (Bruce et al., 2002). A compreensão da

natureza destas características, especialmente em ambientes predispostos ao stresse, permitirá

melhorar o processo de melhoramento das plantas.

Cerca de metade do melhoramento do rendimento de produção das últimas décadas foi

devida à mecanização da agricultura, melhor gestão dos terrenos agrícolas e aumento das

densidades de cultivo. Os melhoramentos genéticos contribuíram para a outra metade do

aumento de produção (Duvick, 2001).

Para o milho, o período compreendido entre a polinização e o início do

desenvolvimento do grão é o mais sensível ao stresse hídrico, quando comparado com os

estádios antes da floração e no final do desenvolvimento do grão. Como resultado da selecção

para melhores desempenhos em ambientes com recursos hídricos limitados, o germoplasma

tropical demonstrou um número final reduzido de espiguetas e uma formação de sedas

precoce e vigorosa. Nas características secundárias, incluem-se o aspecto sempre verde, e

reduções na esterilidade, biomassa radicular e enrolamento foliar (Bruce et al., 2002).

Os processos de selecção baseiam-se no elevado rendimento de produção de grão,

janela de reprodução alargada e um baixo nível de senescência foliar em condições de stresse

crítico ou stresse intermédio, e rendimento de produção adequado, pequenas bandeiras e

folhas verticais em condições ideais de irrigação (Bruce et al., 2002).

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

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O rendimento da produção de grão é uma característica complexa e está dependente de

muitos factores incluindo crescimento vigoroso, fornecimento adequado de água e nutrientes,

melhor captação e conversão da luz solar em energia química, e superioridade genética

(Russel, 1991 in Bruce et al., 2002).

Com os híbridos mais recentes obtêm-se maiores rendimentos de produção

comparativamente com linhas mais antigas. Os aumentos resultam de um melhor desempenho

em densidades de cultivo mais elevadas. Impondo densidades de plantas mais elevadas

geram-se sintomas de resposta ao stresse no milho e reduz-se o rendimento de produção por

planta (Modarres et al., 1998; Tollenaar e Wu, 1999; Andrade et al., 1999). Contudo, esta

redução é compensada pelo aumento do número de plantas por unidade de área, o qual

aumenta o rendimento geral de produção.

É provável que linhas seleccionadas para um melhor desempenho em elevadas

densidades de cultivo apresentem uma maior tolerância a condições de stresse hídrico e vice-

versa, especialmente se os processos que afectam o desenvolvimento da maçaroca quando a

fotossíntese diminui são afectados por ambos os stresses (Bruce et al., 2002).

Elevadas densidades de cultivo criam, obviamente, maior competição para os recursos

disponíveis, como captação de radiação solar e aquisição de água e nutrientes pelos sistemas

radiculares de plantas sujeitas a essa compactação (Scheiner et al., 2000 in Bruce et al.,

2002). O aumento da densidade de cultivo leva a uma menor quantidade de água disponível

por planta e a um acelerar na ocorrência dos sintomas de stresse hídrico à medida que a seca

progride (Tollenaar e Wu, 1999).

Geralmente utiliza-se apenas o rendimento de produção como um parâmetro de

selecção. Contudo, será necessário uma melhor compreensão dos componentes que para ele

contribuem.

O rendimento em termos de produção de grão é a principal característica na selecção.

A utilização de uma característica secundária permite um aumento de 20% de êxito na

selecção para o rendimento de variedades de milho, em condições de baixa concentração de

azoto, em comparação com uma selecção baseada apenas no rendimento da produção de grão

(Bänziger et al., 1997; Araus et al., 2002). Uma característica secundária apropriada é (1)

geneticamente associada com o rendimento da produção de grão sob seca; (2) altamente

hereditária; (3) de medição estável e fiável; (4) não-associada a perdas de rendimento sob

condições ideais de crescimento (Edmeades et al., 2001 in Bruce et al., 2002).

As características secundárias chave, sob seca, são esterilidade reduzida e reduzida

senescência foliar, e, com menor importância, epinastia ou enrolamento da folha em

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

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condições de seca (Edmeades et al., 1999; Chapman e Edmeades, 1999). A inclusão de outras

características, como alterações nos sistemas radiculares, importa apenas incluir quando

forem testadas no campo e cumprirem estes parâmetros.

No milho, demonstrou-se a importância de alguns atributos das raízes que contribuem

para rendimentos mais elevados em ambientes propensos a stresse hídrico, tendo sido

identificado o QTL correspondente (Tuberosa et al., 2002).

O desvio da biomassa radicular das zonas superiores do solo para as regiões mais

profundas poderia melhorar as probabilidades de encontrar novas fontes de água, revelando-se

desejável desde que ocorresse como resposta à seca dos solos (Bruce et al., 2002).

O aumento aparente da tolerância ao stresse, no germoplasma de milho de clima

temperado (Tollenaar e Wu, 1999), tem sido atribuído a um número de factores: (1) a

ocorrência de calor e seca em estufas sem irrigação disponível; (2) a utilização de elevadas

densidades de plantas durante o desenvolvimento de linhas híbridas; (3) testes em larga escala

de vastas áreas que incluem a utilização de estufas de Inverno; e (4) a utilização de

progenitores com rendimentos altos estáveis para formar a próxima colheita de cruzamentos

parentais.

A eficiência na identificação de genótipos com tolerância a stresse abiótico melhorada

necessita de um controlo cuidadoso do stresse hídrico imposto às variações genéticas dos

fenótipos, como por exemplo a fecundidade. Estes progressos devem-se a uma selecção

cuidadosa dos locais de teste. Assim, os ambientes teste necessitam ser estabelecidos onde a

probabilidade de stresse hídrico seja elevada, onde a duração e intensidade do stresse possam

ser modelados por irrigação, e onde haja semelhanças com a área de adaptação do

germoplasma analisado (Bruce et al., 2002).

Existem três elementos importantes da caracterização da seca, relevantes para que haja

uma correcta selecção da tolerância: timing, duração e intensidade do stresse. Os períodos de

stresse encontrados nas áreas de produção a nível mundial são transitórios, imprevisíveis e

medidos sem precisão, levando a diversas dificuldades no melhoramento para a tolerância à

seca (Bruce et al., 2002).

Existem três parâmetros de desempenho centrais para o desenvolvimento de híbridos

melhor adaptados ao stresse: (1) a produtividade média numa gama variada de ambientes; (2)

a estabilidade no rendimento; (3) a performance relativa entre os híbridos experimentais e as

variedades comerciais chave cultivadas nos mesmos ensaios (Bruce et al., 2002).

No milho, é importante considerar o número e tamanho das maçarocas geradas por

planta, uma vez que estes parâmetros são determinados em diferentes estádios do ciclo de

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2. Introdução Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

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vida da cultura (Andrade et al., 1999; Edmeades et al., 1999). Desta forma, os factores que

afectam o desenvolvimento da maçaroca são alvos de investigação, com o intuito de obter

novo germoplasma, com maior capacidade de resposta ao stresse hídrico (Bruce et al., 2002).

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3. Metodologia Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

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3. Metodologia Geral3. Metodologia Geral3. Metodologia Geral3. Metodologia Geral

O trabalho experimental foi dividido em duas fases. Na fase I, mediram-se as trocas

gasosas e a emissão de fluorescência modulada da clorofila a de seis variedades portuguesas

de milho, sujeitas a stresse rápido e a stresse lento, com o intuito de seleccionar a variedade

mais sensível e a mais tolerante ao stresse hídrico. Na fase II, realizaram-se experiências que

permitiram aprofundar o conhecimento do comportamento estomático, do metabolismo do

carbono, do aparelho fotoquímico e da acumulação de solutos compatíveis, nas duas

variedades seleccionadas e nos dois tipos de indução do stresse hídrico.

Neste capítulo são apresentados os métodos que foram utilizados ao longo de todo o

trabalho experimental e que são comuns às duas fases.

3.13.13.13.1.... Material Vegetal Material Vegetal Material Vegetal Material Vegetal

As sementes de milho (Zea mays L., das variedades AD3R, PB64, PB260, PB269,

PB304, PB369) provenientes do Banco Português de Germoplasma Vegetal (BPGV, Braga)

foram desinfectadas em lixívia comercial a 10%, durante 5 minutos, e colocadas em água

corrente durante 24 horas. Após este período foram colocadas 3 a 4 sementes em caixas de

Petri previamente esterilizadas, contendo papel de filtro embebido em água destilada, durante

uma semana, às escuras, numa câmara de crescimento climatizada à temperatura de

25ºC/18ºC (dia/noite).

As sementes germinadas foram colocadas em vasos (500 mL) com terra, contendo um

composto fertilizante na superfície do solo (10 N : 1 P : 1 K) (Neorgan, Shacham Givatada

Ltd., Israel), de modo a obter 0,3 Kg de composto.m-2. Os vasos foram colocados numa

câmara de crescimento climatizada, com condições controladas de fotoperíodo (16 horas),

temperatura (25ºC dia/18ºC noite), de densidade de fluxo fotónico fotossintético (PPFD)

(entre 400 e 500 µmol fotões.m-2.s-1) e de humidade relativa (aproximadamente 40%). As

plantas foram regadas sempre que necessário.

As plantas foram utilizadas nas experiências 45 dias após o início da germinação,

tendo as amostragens sido realizadas na porção média da última folha totalmente expandida

(correspondente à 7ª folha).

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3. Metodologia Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

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3.23.23.23.2.... Indução do Stresse Indução do Stresse Indução do Stresse Indução do Stresse Hídrico Hídrico Hídrico Hídrico

Neste trabalho foram utilizados duas formas de indução do stresse. A indução lenta

(denominada neste trabalho de stresse lento) efectuou-se por supressão da rega durante uma

semana, após a qual se procedeu à irrigação das plantas, também durante uma semana, para

avaliação da recuperação do stresse hídrico. A indução rápida do stresse hídrico (denominada

neste trabalho de stresse rápido) foi obtida por excisão das folhas e sua exposição à atmosfera

do laboratório.

Com o stresse lento procuram-se criar condições semelhantes às que as plantas

encontram no ambiente natural ou agrícola, durante o período de Verão, em que os recursos

hídricos são mais escassos (Marques da Silva e Arrabaça, 2004a).

As experiências de stresse rápido procuraram simular o meio-dia, período do dia em

que a diferença de pressão de vapor entre a folha e a atmosfera é máxima (Marques da Silva e

Arrabaça, 2004a).

3.33.33.33.3.... Relações Hídricas Relações Hídricas Relações Hídricas Relações Hídricas

3.3.3.3.3333.1.1.1.1. Determinaç. Determinaç. Determinaç. Determinação do Teor Hídrico Relativoão do Teor Hídrico Relativoão do Teor Hídrico Relativoão do Teor Hídrico Relativo da Folha da Folha da Folha da Folha

O estado hídrico das folhas foi avaliado através do teor hídrico relativo (THR), que

permite determinar a quantidade de água num determinado tecido em relação à quantidade

máxima que esse tecido pode conter. Este parâmetro foi calculado segundo a equação

seguinte (Catsky, 1960):

em que Pf é o peso do material fresco, Pt é o peso do material túrgido e Ps é o peso do

material seco. O peso fresco das amostras nas experiências de stresse lento foi determinado

por excisão de uma pequena porção da folha e pesagem imediata numa balança de precisão

(BP 210D, Sartorius, Germany). As amostras foram depois colocadas em caixas de Petri com

água desmineralizada durante aproximadamente 24 horas, até atingirem o ponto máximo de

hidratação. As amostras foram pesadas, tendo-se tido o cuidado de, previamente, retirar o

excesso de água por ligeira pressão em papel absorvente. Deste modo, obteve-se o peso

túrgido. Por fim, colocaram-se as amostras numa estufa a 80ºC (TV30, W. Memmert,

Pf – Ps THR (%) =

Pt – Ps × 100 (Eq. 1)

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3. Metodologia Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

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Schwabach, Germany), durante pelo menos 48 horas, obtendo desta forma o peso seco das

amostras.

Nas experiências de stresse rápido o procedimento foi semelhante, tendo, contudo,

sido utilizados os próprios segmentos da folha analisada para determinação do THR. Os

fragmentos foram pesados ao longo da experiência para ulteriormente se determinar os

correspondentes THR ao longo da experiência.

Foi determinada, sempre que necessário, a área das amostras com um medidor de

áreas (CI-202 Portable Leaf Area Meter, CID, Inc., Camas, Washington, USA).

3.3.2. Determinação do Teor Hídrico do Solo3.3.2. Determinação do Teor Hídrico do Solo3.3.2. Determinação do Teor Hídrico do Solo3.3.2. Determinação do Teor Hídrico do Solo

O teor hídrico do solo (THS) foi calculado como a percentagem de massa de água em

relação à massa do solo (Costa, 1985). O solo foi sendo pesado ao longo de vários dias e a

quantidade de água medida com um higrómetro comercial (Ubbink, modelo 2125050,

Holanda), correlacionando a escala do aparelho com o THS para uma mais prática inferência

sobre o estado hídrico do solo ao longo das experiências. Para se obter a percentagem de água

no solo, procedeu-se à sua pesagem após um período de 72 horas numa estufa a 104ºC. O

THS máximo corresponde à sua capacidade de campo, em que o solo se encontra saturado,

após eliminação do excesso de água.

3.3.3.3.4444. Medição das Trocas Gasosas. Medição das Trocas Gasosas. Medição das Trocas Gasosas. Medição das Trocas Gasosas por por por por Análise de Gases por Análise de Gases por Análise de Gases por Análise de Gases por

Radiação IRadiação IRadiação IRadiação Infranfranfranfra----VVVVermelha (IRGA)ermelha (IRGA)ermelha (IRGA)ermelha (IRGA)

A fotossíntese é um dos processos fisiológicos mais estudado nas plantas, sendo

necessário técnicas que permitam quantificar as trocas gasosas que ocorrem nos tecidos

vegetais. A importância de tais métodos no estudo das alterações fisiológicas em plantas

sujeitas a stresses ambientais é notória, permitindo uma avaliação do estado em que se

encontra a planta.

O desenvolvimento recente ao nível da electrónica permitiu a criação de sistemas

altamente complexos e sofisticados que fazem medições muito precisas. Simultaneamente,

desenvolveram-se as técnicas de processamento digital que permitem, com rapidez e precisão,

adquirir dados de uma forma fácil.

Os critérios para decidir qual é o método mais adequado para uma determinada

experiência incluem o gás a ser medido (O2 ou CO2), o meio em que as medidas vão ser

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3. Metodologia Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

32

realizadas (aquoso ou gasoso), o nível de actividade metabólica da amostra e a resolução do

aparelho, a gama de concentrações do gás a que a amostra vai ser sujeita (capacidade do

analisador), se as respostas são ou não rápidas (tempo de resposta do aparelho), a necessidade

de medições contínuas ou pontuais (sistemas abertos ou fechados), e se a amostra pode ou não

ser sujeita a um método de análise destrutivo (Hunt, 2003).

Os resultados deveriam ser avaliados utilizando uma combinação das tecnologias

disponíveis, combinando a fluorescência com as técnicas de trocas gasosas, preferencialmente

em associação com medidas grosseiras de O2 feitas utilizando um espectrómetro de massa

(Haupt-Herting e Fock, 2002).

O analisador de gases por radiação infra-vermelha (IRGA, do inglês Infra Red Gas

Analyser) consiste num sistema que permite realizar medições das trocas gasosas num sistema

aberto. Esta técnica segue o princípio de medição de gases por infra-vermelhos não-

dispersivos (NDIR, em inglês), o qual permite medições de moléculas heteroatómicas (como

o CO2), através da absorção da radiação infra-vermelha em bandas específicas do espectro das

moléculas de gás. Desta forma, quanto maior a concentração de CO2, maior a quantidade de

radiação infravermelha absorvida pelas moléculas, logo menor a quantidade de radiação que

chega ao detector de Luft. A principal banda de absorção do CO2 é nos 4,25 µm com picos

secundários nos 2,66 µm, nos 2,77 µm e nos 14,99 µm (Hill e Powell, 1968 in Hunt, 2003).

Na calibração deve ser determinado o zero e também a quantidade de CO2 presente na

atmosfera. Actualmente, assume-se o valor de 370 ppm de CO2, como o valor atmosférico

(Hunt, 2003).

É necessário ter em conta a temperatura e a pressão a que se realiza a experiência

porque afectam a quantidade molar de CO2 por unidade de volume de ar (mol.m-3). O vapor

de água também poderá interferir com a medição, um vez que possui um pico nos 2,7 µm,

perto de um dos picos do CO2. Deve ser utilizado perclorato de magnésio para retirar a água,

mas não gel de sílica uma vez que este interfere com a quantidade de CO2 presente (Hunt,

2003).

Para uma medição correcta, é preciso ter em conta a taxa de fluxo que atravessa a

câmara, dado que as taxas de troca gasosa de CO2 dependem dela. Isto pode ser facilmente

obtido através da utilização de fluxómetros que permitam a medição e regulação do fluxo.

As taxas fotossintéticas são normalmente expressas em termos de µmoles de CO2 por

unidade de tempo e por um outro parâmetro da amostra (normalmente biomassa ou área).

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3. Metodologia Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

33

Esta técnica da medição da troca gasosa do CO2 é utilizada em quase todos os estudos

fotossintéticos, uma vez que as alterações deste gás são proporcionalmente superiores ao do

O2 e assim mais fáceis de medir com precisão.

Neste trabalho foram utilizados dois modelos de IRGA (LCPro+ e LCA-2, ADC – The

Analytical Development Co., Ltd., Hoddesdon, England) no stresse lento da fase I, tendo sido

utilizado apenas o modelo LCPro+, nas restantes experiências.

As taxas das trocas gasosas e das condutâncias estomáticas foram calculadas

automaticamente no modelo LCPro+, e recorrendo às equações de von Caemmerer e Farquhar

(1981) e Long e Hallgren (1985, 1993) para o modelo LCA-2, de acordo com o descrito em

Marques da Silva (1999), e a eficiência do uso de água (WUE) foi calculada pela razão entre a

taxa fotossintética e a taxa transpiratória.

3.3.3.3.5555. Medição da Fluorescência . Medição da Fluorescência . Medição da Fluorescência . Medição da Fluorescência Modulada Modulada Modulada Modulada da Cda Cda Cda Clorofilalorofilalorofilalorofila aaaa

A fluorescência da clorofila a tornou-se numa das técnicas mais úteis nas áreas de

investigação da Fisiologia Vegetal e Ecofisiologia. Actualmente, muita da investigação em

fotossíntese, sobretudo em condições de stresse, inclui dados da fluorescência (Fracheboud et

al., 1999; Hymus et al., 1999; Maxwell e Johnson, 2000).

A energia luminosa absorvida pelas moléculas de clorofila in vivo pode ter três

destinos possíveis: pode ser utilizada para conduzir a fotossíntese (processo fotoquímico);

pode ser dissipada sob a forma de calor (processos não-fotoquímicos); ou pode ser reemitido

como luz (fosforescência ou fluorescência da clorofila). Existe competição entre estes três

processos (Maxwell e Johnson, 2000).

Através da medição da fluorescência da clorofila a, podem recolher-se informações

acerca da eficiência dos processos fotoquímicos e não-fotoquímicos. Actualmente, muitos

sistemas de medição utilizam luz de excitação modulada, permitindo ler apenas a

fluorescência resultante da excitação pela luz utilizada, podendo as medições ocorrer na

presença de luz ambiente. Estes aparelhos denominam-se por fluorómetros PAM (Pulse

Amplitude Modulated).

Embora a quantidade total de fluorescência da clorofila a seja muito pequena em

condições in vivo, representando apenas 3 ou 4% do total de luz absorvida (Björkman e

Demmig-Adams, 1995), a sua medição é muito simples. O pico de emissão de fluorescência

na zona do vermelho longínquo possui um comprimento de onda maior que o da luz

absorvida. Assim, o rendimento pode ser determinado expondo a folha a uma radiação

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3. Metodologia Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

34

fotossinteticamente activa de comprimento de onda definido e medindo a quantidade de luz

(fluorescência) emitida. Estas medições são apenas relativas, e qualquer análise necessita de

uma forma de normalização (Maxwell e Johnson, 2000).

Kautsky e os seus colaboradores descobriram que após a transferência de material

fotossintético do escuro para a luz, havia um aumento no rendimento da fluorescência da

clorofila a durante o período de cerca de 1 segundo. Este aumento tem sido descrito como

uma consequência da redução de aceitadores de electrões na via fotossintética, a jusante do

PSII, nomeadamente a plastoquinona, em particular a QA. Quando o PSII recebe luz e QA

recebe um electrão, não pode aceitar outro até ser passado para o transportador de electrões

posterior (QB). Durante este período de tempo, diz-se que o centro de reacção está fechado.

Em qualquer altura, a presença de uma proporção de centros de reacção fechados leva a uma

redução global da eficiência fotoquímica e ao correspondente aumento no rendimento da

fluorescência (Maxwell e Johnson, 2000; Hunt, 2003).

Em plantas adaptadas às escuras (todos os centros de reacção abertos) pode medir-se a

fluorescência basal (Fo) do sistema fazendo incidir na amostra uma luz de medição de PPFD e

frequência suficientemente baixa para não produzir actos fotoquímicos ou processos não

fotoquímicos. Se esta amostra for sujeita a um pulso saturante de luz actínica (entre 5000 e

10000 µmol fotões.m-2.s-1) durante 0,8 segundos, os centros de reacção ficam

momentaneamente fechados e, uma vez que os processos de dissipação de energia são

competitivos, tem-se um rendimento máximo da fluorescência (Fm). A expressão (Fm-Fo)/Fm,

normalmente referida como Fv/Fm, representa a eficiência máxima da conversão de energia

pelos centros de reacção abertos dos PSII. Este valor é altamente conservado, sendo cerca de

0,8 em plantas não sujeitas a stresse (Maxwell e Johnson, 2000; Hunt, 2003) e indica que é

necessária a energia de 9-10 fotões absorvidos para a produção de uma molécula de O2 na

fotossíntese (Walker e Osmond, 1986 in Hunt, 2003). Uma redução neste valor indica que o

PSII foi danificado devido a factores ambientais ou à aplicação de inibidores (Maxwell e

Johnson, 2000).

Normalmente, demora alguns minutos até a fluorescência atingir um estado de

equilíbrio (F’), quando o sistema é iluminado por luz actínica. Se a amostra for então sujeita a

um novo pulso de luz saturante, o rendimento da fluorescência aumenta até um valor máximo

(Fm’) inferior ao valor máximo (Fm) obtido durante o período em que a amostra esteve no

escuro. A expressão (Fm’-F’)/Fm’ representa o rendimento quântico efectivo do fotossistema II

(ΦPSII) (Genty et al., 1989). As medições da fluorescência permitem também a medição da

taxa de transporte de electrões (ETR) dada pela expressão ETR = ΦPSII × PPFD × 0,5 × 0,84,

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3. Metodologia Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

35

em que o factor 0,5 corresponde à fracção de fotões que chega ao PSII (relativamente ao PSI)

e o factor 0,84 corresponde à fracção de luz incidente que é absorvida pela folha.

Durante o primeiro segundo de iluminação, há um aumento do rendimento da

fluorescência da clorofila a. Contudo, a partir daí o nível de fluorescência volta a diminuir até

um valor constante. Este fenómeno denomina-se amortecimento da fluorescência e pode ser

explicado por dois processos. O primeiro refere-se ao aumento na taxa de transporte de

electrões no PSII, devido, sobretudo, à activação induzida pela luz de enzimas envolvidas no

metabolismo do carbono e à abertura dos estomas. Este amortecimento é denominado

amortecimento fotoquímico, do qual se pode calcular o coeficiente de amortecimento

fotoquímico (qP) que é dado pela expressão (Fm’–F’)/(Fm’–Fo’) onde Fo’ corresponde à

fluorescência basal mínima obtida quando a luz actínica é desligada. Simultaneamente, existe

um aumento na eficiência da conversão de energia em calor. Este processo é denominado

amortecimento não-fotoquímico, calculando-se o coeficiente de amortecimento não-

fotoquímico (qN) que é dado pela expressão (Fm–Fm’)/(Fm–Fo’) (Müller et al., 2001). Por sua

vez, o amortecimento não-fotoquímico pode ser dividido em três componentes (Quick e Stitt,

1989): qE, que corresponde ao amortecimento de alta energia, resultante da energização dos

tilacóides devido ao aumento do gradiente de pH transmembranar; qT, que corresponde ao

amortecimento de transição do estado energético I para o estado energético II e que resulta da

fosforilação das proteínas dos complexos antena do PSII (LHCII); e qI, que corresponde ao

amortecimento fotoinibitório. De entre os três, qE é o maior componente de qN (Quick e Stitt,

1989). Numa planta típica, alterações nestes dois processos, qP e qN, estarão completas em

cerca de 15-20 minutos e um estado estacionário é atingido, embora o tempo necessário para

alcançar este estado possa variar significativamente entre espécies de plantas (Maxwell e

Johnson, 2000; Hunt, 2003).

Este é um método bastante vantajoso para avaliar o estado de uma planta uma vez que

é uma técnica não-invasiva, não havendo necessidade de destruir a amostra durante as

medições.

Neste trabalho foram utilizados dois fluorómetros PAM, um modelo mais simplificado

na fase I (PAM 210, Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany) e um modelo mais complexo

na fase II (PAM 101 Chlorophyll Fluorometer, Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany). Os

detalhes da sua utilização são descritos na metodologia dessas fases.

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3. Metodologia Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

36

3.6. Medição da Libertação de O3.6. Medição da Libertação de O3.6. Medição da Libertação de O3.6. Medição da Libertação de O2222

O eléctrodo de oxigénio de fase gasosa consiste num aparelho com um cátodo de

platina e um ânodo de prata ligados por um electrólito contendo KCl. Este conjunto está

separado da amostra por uma membrana permeável ao oxigénio. Aplica-se uma voltagem de

cerca de 0,7 V de modo a que o O2 seja reduzido a H2O2 (sendo depois reduzido a iões

hidroxilo) no cátodo de platina. Os quatro electrões necessários para a ocorrência desta

redução são fornecidos pela oxidação do ânodo de prata, formando-se cloreto de prata. O

fluxo entre o ânodo e o cátodo é directamente proporcional à concentração de O2 que se forma

nos cloroplastos da amostra (Hunt, 2003).

A câmara é fechada de modo a que o O2 se acumule na amostra durante a fotossíntese.

Esta técnica também pode ser utilizada para estudar a respiração, na qual se observa, neste

caso, uma depleção de O2.

A inclinação da curva fornece uma medida da taxa de troca gasosa para o O2, a partir

da qual se pode calcular a taxa fotossintética através da área da amostra. A calibração do

instrumento é realizada acertando o zero através da utilização de N2 e um valor máximo

saturando a câmara com O2.

Outro factor a ter em atenção é a temperatura a que se conduz a experiência, uma vez

que a solubilidade do O2 e a permeabilidade da membrana variam com este factor. Também é

importante ter especial cuidado com a membrana do eléctrodo uma vez que é muito sensível e

poderá comprometer as medições se estiver em mau estado (Hunt, 2003).

Pode-se medir as trocas de O2 num disco foliar que é selado na câmara. O eléctrodo

situa-se na parte inferior do disco, enquanto se fornece luz actínica na parte superior. Nas

paredes da janela da câmara circula água de modo a controlar a temperatura. Uma vez que o

volume da câmara é muito pequeno, fornece-se CO2 à câmara através de uma solução de

bicarbonato de potássio.

É necessário determinar o volume da câmara, injectando um volume de ar com uma

seringa. A alteração do sinal do eléctrodo de O2 pode ser utilizado para calcular o volume da

câmara, uma vez que depende na quantidade de O2 na seringa e na pressão do O2 (valores

conhecidos) (Hunt, 2003).

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3. Metodologia Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

37

3.7. Medição de Actividades Enzimáticas3.7. Medição de Actividades Enzimáticas3.7. Medição de Actividades Enzimáticas3.7. Medição de Actividades Enzimáticas

Num estudo envolvendo enzimas é necessário que a sua actividade seja preservada.

Desta forma é necessário haver uma paragem rápida da actividade metabólica, para evitar que

enzimas proteolíticas actuem sobre a enzima cuja actividade se pretende determinar (Marques

da Silva e Arrabaça, 2004b). Uma das formas de assegurar que tal acontece é congelar a

amostra em azoto líquido.

Também o processo de extracção das enzimas é um dos passos cruciais para a

avaliação da sua actividade, uma vez que é necessário manter as condições fundamentais de

funcionamento, de modo a minimizar perda de actividade. No entanto, a extracção de enzimas

solúveis, como é o caso da RuBisCO (EC 4.1.1.39), da PEPC (EC 4.1.1.31) e da EM-NADP

(EC 1.1.1.82), envolve sempre a ruptura da parede celular, normalmente através de

esmagamento manual em almofariz. No caso da RuBisCO de plantas C4, o problema agrava-

se uma vez que está localizada nas células da bainha do feixe vascular, as quais apresentam

uma parede celular mais espessa (Edwards e Walker, 1983 in Marques da Silva, 1999).

Assim, é necessário que o meio de extracção possua condições que permitam manter a

conformação estrutural das enzimas. Factores como o pH, temperatura, presença de agentes

quelantes, como o EDTA, e concentração salina necessitam ser controlados no meio de

extracção.

Neste trabalho experimental, as enzimas RuBisCO, PEPC e EM-NADP foram isoladas

a partir de um extracto comum. A actividade da RuBisCO foi determinada por incorporação

de carbono radioactivo (14C), procedendo-se à sua medição num contador de cintilações,

permitindo calcular o carbono fixado num determinado período de tempo. Por outro lado, as

actividades da PEPC e da EM-NADP foram determinadas por espectrofotometria (ver 5.2.6).

3.3.3.3.8888. Análise E. Análise E. Análise E. Análise Estatísticastatísticastatísticastatística

O tratamento estatístico dos resultados foi realizado recorrendo a análise e comparação

de modelos de regressão e análise de variâncias (ANOVA), recorrendo ao software GraphPad

Prism 4.0 (GraphPad Software Inc., USA).

Para cada par de variáveis, foram efectuadas uma regressão linear e uma regressão

quadrática, escolhendo o mais indicado através da realização de um teste F, admitindo sempre

um α de 0,05. Nas curvas de resposta da taxa fotossintética líquida à PPFD foi utilizada a

equação de Platt et al. (1980).

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3. Metodologia Geral

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

38

As curvas ajustadas foram apresentadas nos gráficos, com a respectiva equação, o

coeficiente de determinação e o nível de significância (p). Nos casos de ajuste da função

quadrática, é indicado o nível de significância em relação à função linear.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

39

4. Fase I 4. Fase I 4. Fase I 4. Fase I –––– Análise Análise Análise Análise Preliminar Preliminar Preliminar Preliminar ddddeeee Seis VariedadesSeis VariedadesSeis VariedadesSeis Variedades

Portuguesas Portuguesas Portuguesas Portuguesas de Milhode Milhode Milhode Milho

4.1. Introdução4.1. Introdução4.1. Introdução4.1. Introdução

Nesta fase procedeu-se à análise de seis variedades portuguesas de milho (AD3R,

PB64, PB260, PB269, PB304, PB369) provenientes do Banco Português de Germoplasma

Vegetal (BPGV, Braga).

De modo a seleccionar a variedade mais tolerante e a mais susceptível ao stresse

hídrico, foram efectuadas medições de trocas gasosas e de fluorescência modulada da

clorofila a, nos dois sistemas de indução de stresse hídrico propostos.

4.2. Metodologia4.2. Metodologia4.2. Metodologia4.2. Metodologia

4.2.1. Material Vegetal4.2.1. Material Vegetal4.2.1. Material Vegetal4.2.1. Material Vegetal

Foram utilizadas as variedades de milho AD3R, PB64, PB260, PB269, PB304 e

PB369. As plantas foram obtidas segundo o descrito em 3.1..

4.2.2. 4.2.2. 4.2.2. 4.2.2. Relações HídricasRelações HídricasRelações HídricasRelações Hídricas

O THR e o THS foram determinados segundo o descrito em 3.3.1. e 3.3.2..

4.4.4.4.2.2.2.2.3333. Medição das Trocas Gasosas. Medição das Trocas Gasosas. Medição das Trocas Gasosas. Medição das Trocas Gasosas

Através da análise de gases no IRGA foi possível determinar vários parâmetros que

permitem caracterizar as trocas gasosas, como a taxa fotossintética (A), taxa transpiratória

(E), condutância estomática (gs) e a pressão parcial de CO2 no espaço intercelular (Ci), nas

folhas das seis variedades portuguesas de milho.

As medições nesta fase foram efectuadas em dois modelos de IRGA (LCPro+ e LCA-

2), ambos do mesmo fabricante (ADC – The Analytical Development Co., Ltd., Hoddesdon,

England). Inicialmente seria apenas utilizado o modelo LCPro+, mas devido a avaria deste

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

40

iniciou-se ulteriormente a utilização do modelo LCA-2. Deste modo, nas experiências de

stresse lento foram utilizados os dois modelos, enquanto que nas experiências de stresse

rápido foi apenas utilizado o modelo LCPro+.

Embora o modelo LCPro+ possua registo automático e controlo dos parâmetros

integrados, o modo de funcionamento dos dois IRGA é semelhante, à excepção de alguns

detalhes: no modelo LCPro+, a fonte luminosa era um LED que se colocava no topo da

câmara, enquanto que, no modelo LCA-2, a fonte de luz era a de um projector de slides

(Sawyer’s 302 Automatic, Belgium); a humidade e a temperatura no interior da câmara eram

controladas no modelo LCPro+, algo que não acontecia com o modelo LCA-2, embora fosse

possível a sua monitorização.

Os ensaios foram efectuados sob condições atmosféricas de CO2 (actualmente situa-se

próximo de 370 ppm). Para determinar a PPFD adequada a utilizar nesta fase, foi efectuado

um ensaio preliminar em várias plantas com o modelo LCPro+. A taxa fotossintética máxima,

sem fotoinibição visível na fotossíntese aparente, foi obtida com 870 µmol fotões.m-2.s-1 (ver

4.3.2.). Também foi determinado o período mínimo de iluminação das folhas para se atingir a

fotossíntese máxima, sendo este de 20 minutos. Contudo, foi utilizado nas experiências um

período de 30 minutos de iluminação para garantir a activação das enzimas do metabolismo

do carbono. Quando foi utilizado o modelo LCPro+, foi também seleccionada uma humidade

de 10 mbar e uma temperatura de 21ºC (correspondia a cerca de 25ºC ao nível da folha).

Nas experiências de stresse lento, foram utilizadas folhas não destacadas, procedendo-

se à sua medição de 2 em 2 dias, ao longo de duas semanas. Apenas era destacada uma

pequena porção dessa folha para determinação do THR (segundo o descrito em 3.3.1.).

Nas experiências de stresse rápido, a primeira medição era efectuada na folha ainda

intacta, tendo sido realizadas ao longo de um dia. As medições posteriores foram efectuadas

na mesma área da folha mas já destacada da planta (fragmento com cerca de 8 cm de

comprimento), de modo a obter tecidos com diferentes níveis hídricos. No final da

experiência, o fragmento foi tratado segundo o descrito em 3.3.1..

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

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4.4.4.4.2.42.42.42.4. Medição da Fluorescência Modu. Medição da Fluorescência Modu. Medição da Fluorescência Modu. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofilalada da Clorofilalada da Clorofilalada da Clorofila aaaa

As medições da fluorescência modulada da clorofila a foram efectuadas utilizando o

fluorómetro PAM 210 (Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany) ligado a um computador

possuindo o software de registo de dados DA-TEACH v1.11 (Heinz Walz GmbH, Effeltrich,

Germany).

O método utilizado foi idêntico nas experiências de stresse lento e de stresse rápido,

tendo sido utilizada a mesma folha analisada no IRGA.

Para medir a variação da área complementar (normalizada) à fase rápida da curva de

Kautsky, adaptou-se a folha ao escuro durante 10 minutos. Utilizou-se o Triggered Mode do

software mencionado, com as seguintes definições: o pulso de luz saturante com nível 10

(correspondendo à PPFD máxima obtida neste fluorómetro de 3500 µmol fotões.m-2.s-1,

considerando-se os pulsos de luz saturante suficientemente fortes para ocorrer o fecho dos

centros de reacção), luz de medição com nível 10, e os parâmetros de gain e damp

seleccionados para 1. Dado que o fabricante do PAM não indica os valores absolutos das

intensidades da luz de medição foi assumido que a luz de medição utilizada é suficientemente

fraca para manter os centros de reacção abertos.

Para determinar os vários parâmetros de fluorescência, utilizou-se o Saturated Pulse

Mode do software mencionado. Novamente, colocou-se a folha na escuridão, durante 5

minutos. Após este período de tempo, foi fornecido um pulso de luz saturante, de modo a

determinar o rendimento quântico máximo do PSII (Fv/Fm).

Para determinar o rendimento quântico efectivo do PSII (ΦPSII), a taxa de transporte

electrónico (ETR) e os coeficientes de amortecimento fotoquímico (qP) e não-fotoquímico

(qN) no software foi fornecida à folha uma luz actínica (nível 9, que corresponde a uma PPFD

de 840 µmol fotões.m-2.s-1, próxima à utilizada no IRGA), durante 30 minutos, período após o

qual se deu um pulso de luz saturante.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

42

4.3. Resultados4.3. Resultados4.3. Resultados4.3. Resultados e Discussão e Discussão e Discussão e Discussão

Os ensaios realizados durante a primeira fase do trabalho permitiram a selecção de

duas variedades de milho distintas na sua resposta ao stresse hídrico, sendo uma tolerante e a

outra susceptível.

4.3.1. Relações Hídricas4.3.1. Relações Hídricas4.3.1. Relações Hídricas4.3.1. Relações Hídricas

De modo a monitorizar a quantidade de água disponível no solo, foi utilizado um

higrómetro comercial (Ubbink, modelo 2125050, Holanda), ao longo das experiências de

stresse lento, tendo sido feita uma calibração da escala do aparelho (estabelecida entre 1 e 10)

com o teor hídrico do solo (THS) (Fig. 4.1).

Fig. 4.1 – Relação entre o teor hídrico do solo (THS) e a escala do higrómetro comercial, nas

experiências de stresse lento.

Através da análise do gráfico verifica-se que, quando se procedia à irrigação do solo, o

solo apresentava um THS próximo de 30% (valor 10 da escala do higrómetro), diminuindo

para cerca de 15% no final do período de stresse (valor 1 da escala do higrómetro).

A partir desta calibração e assumindo o THS de 30% como o máximo da capacidade

de retenção de água no solo, em que o solo está saturado e o higrómetro comercial

apresentava o valor 10, foi possível observar a diminuição da capacidade de campo relativa do

solo ao longo das experiências de stresse lento (Fig. 4.2), permitindo deste modo monitorizar

os recursos hídricos disponíveis às plantas das diversas variedades.

Após uma semana sem irrigação, o solo apresentava uma capacidade de campo

relativa de 50%. Contudo, a velocidade com que a mesma era atingida não foi semelhante nas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1010

20

30

Escala do Higrómetro

TH

S (

%)

y = 13,96 + 0,3642x + 0,1065x2 (r2 = 0,94 ; p < 0,05)

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

43

diferentes variedades devido essencialmente às diferentes taxas transpiratórias. A variedade

PB260 foi a que apresentou uma maior taxa de redução da capacidade de campo relativa ao

fim de 2 a 4 dias, enquanto a variedade PB64 foi a que apresentou a menor taxa de redução.

Fig. 4.2 – Variação da capacidade de campo relativa do solo em função do tempo do ensaio, nas

experiências de stresse lento.

Consequentemente, as folhas de plantas de diferentes variedades também não se

encontravam no mesmo estado hídrico em cada momento. A variedade PB260 foi a que

apresentou a maior redução de THR ao fim de 4 e 6 dias (40%), enquanto que nas restantes

AD3R

0 2 4 6 8 10 1240

60

80

100

Tempo (dias)

Cap

acid

ad

e d

e c

am

po

rela

tiva (

%)

PB64

0 2 4 6 8 10 1240

60

80

100

Tempo (dias)

Cap

acid

ad

e d

e c

am

po

rela

tiva (

%)

PB260

0 2 4 6 8 10 1240

60

80

100

Tempo (dias)

Cap

acid

ad

e d

e c

am

po

rela

tiva (

%)

PB269

0 2 4 6 8 10 1240

60

80

100

Tempo (dias)

Cap

acid

ad

e d

e c

am

po

rela

tiva (

%)

PB304

0 2 4 6 8 10 1240

60

80

100

Tempo (dias)

Cap

acid

ad

e d

e c

am

po

rela

tiva (

%)

PB369

0 2 4 6 8 10 1240

60

80

100

Tempo (dias)

Cap

acid

ad

e d

e c

am

po

rela

tiva (

%)

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

44

variedades uma diminuição significativa só se verificou ao fim de 6 dias, atingindo 60%,

embora a variedade PB269 já apresentasse uma ligeira redução no dia 4 (Fig. 4.3).

Fig. 4.3 – Variação do teor hídrico relativo (THR) das folhas em função do tempo do ensaio, nas

experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas de diferentes plantas.

Após irrigação, os THR das variedades AD3R, PB64 e PB304 recuperaram para

valores próximos dos iniciais. Contudo, ao contrário das outras, a variedade AD3R apresentou

valores de 90% para 95%. As variedades PB260 e PB269 não passaram dos 80% e a

variedade PB369 não conseguiu recuperar para além dos 70%, demonstrando, as primeiras,

uma dificuldade moderada e, a última, uma dificuldade grande em recuperar os valores de

AD3R

0 2 4 6 8 10 120

20

40

60

80

100

Tempo (dias)

TH

R (

%)

PB64

0 2 4 6 8 10 120

20

40

60

80

100

Tempo (dias)

TH

R (

%)

PB260

0 2 4 6 8 10 120

20

40

60

80

100

Tempo (dias)

TH

R (

%)

PB269

0 2 4 6 8 10 120

20

40

60

80

100

Tempo (dias)

TH

R (

%)

PB304

0 2 4 6 8 10 120

20

40

60

80

100

Tempo (dias)

TH

R (

%)

PB369

0 2 4 6 8 10 120

20

40

60

80

100

Tempo (dias)

TH

R (

%)

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

45

THR. Comparativamente com outros trabalhos, verifica-se que factores que influenciam a

imposição do stresse hídrico e a recuperação após irrigação incluem o tipo de solo, dimensões

do recipiente que contém a planta e a própria espécie vegetal analisada (Beardsell e Cohen,

1975; Collinson et al., 1997; Abraham et al., 2004), dificultando a comparação entre

diferentes estudos de stresse hídrico.

Fig. 4.4 – Variação do teor hídrico relativo (THR) das folhas em função do tempo do ensaio, nas

experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

AD3R

0 100 200 30030

40

50

60

70

80

90

100

Tempo (minutos)

TH

R (

%)

y = 91,18 – 0,1858x (r2 = 0,96 ; p < 0,01)

PB64

0 100 200 30030

40

50

60

70

80

90

100

Tempo (minutos)

TH

R (

%)

y = 96,03 – 0,1259x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

PB260

0 100 200 30030

40

50

60

70

80

90

100

Tempo (minutos)

TH

R (

%)

y = 94,18 – 0,1528x (r2 = 0,98 ; p < 0,01)

PB269

0 100 200 30030

40

50

60

70

80

90

100

Tempo (minutos)

TH

R (

%)

y = 95,55 – 0,1783x (r2 = 0,98 ; p < 0,01)

PB304

0 100 200 30030

40

50

60

70

80

90

100

Tempo (minutos)

TH

R (

%)

y = 93,33 – 0,2106x (r2 = 0,97 ; p < 0,01)

PB369

0 100 200 30030

40

50

60

70

80

90

100

Tempo (minutos)

TH

R (

%)

y = 96,49 – 0,1922x (r2 = 0,98 ; p < 0,01)

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

46

Actualmente, existem abordagens experimentais em que se faz variar a duração e

intensidade da seca imposta a curto (5 dias) e longo prazo (2-3 semanas), uma vez que

parecem ter resultados significativamente diferentes (Griffiths e Parry, 2002; Marques da

Silva e Arrabaça, 2004a).

Nas experiências de stresse rápido, as diferentes variedades de milho também

apresentaram diferentes THR das folhas ao longo do ensaio para os mesmos intervalos de

tempo e para valores de humidade relativa semelhantes (Fig. 4.4).

No final destas experiências, as folhas da variedade PB64 possuíam um THR médio

de 60%, enquanto que as variedades PB260 e PB269 apresentavam um THR de 50% e as

restantes apresentavam THR de 40%. No entanto, realizando uma ANOVA do último ponto

registado em cada variedade, a diferença, em relação à variedade PB64, apenas foi

significativa nas variedades AD3R, PB304 e PB369, indicando uma maior perda de água,

nestas variedades, em stresse rápido.

O THR das folhas de todas as variedades diminuiu ao longo da imposição do stresse

hídrico nas experiências de stresse lento, embora com taxas diferentes. As variedades PB260

e PB269 atingiram valores mais baixos de THR foliar, tendo, no entanto, recuperado de forma

significativa após o início da irrigação, mas não atingindo os valores iniciais (Fig. 4.3). Tal

facto poderá estar relacionado com danos celulares ou perda de regulação estomática (Giles et

al., 1974; Franks e Farquhar, 2001) ou alterações estruturais que conduzam a um aumento do

tempo de recuperação dos níveis hídricos iniciais, devido a alterações do módulo elástico da

parede celular (Marshall e Dumbroff, 1999). Por outro lado, a variedade PB369 demonstrou

uma taxa mais lenta de recuperação do THR das folhas, relativamente às outras variedades.

Kim et al. (2004) obtiveram valores de THR semelhantes no milho mas num período de

stresse de cerca de 12 dias. Uma vez que o aspecto das folhas no final do ensaio era

semelhante ao observado neste trabalho, em que as folhas se encontravam enroladas segundo

o sulco central, Ivandic et al. (2000) sugerem que as diferenças poderão estar essencialmente

ligadas à diferença de capacidade de campo dos solos utilizados. Outro aspecto muito

importante nos estudos de stresse hídrico e recuperação é a velocidade de imposição stresse

hídrico e a duração do mesmo, os quais podem implicar diferentes respostas em variedades da

mesma espécie (Kim et al., 2004).

O solo utilizado revelou ser adequado a experiências de stresse lento, permitindo a

obtenção de stresse moderado e intenso, no período de uma semana. Após irrigação, o solo

voltou à sua capacidade máxima de retenção de água, permitindo o estudo do comportamento

nas variedades portuguesas de milho. Embora muitos investigadores tenham procedido ao

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

47

estudo dos efeitos do stresse hídrico sobre as plantas (Raymond e Smirnoff, 2002; Nayyar,

2003; Çakir, 2004; Marques da Silva e Arrabaça, 2004a, 2004b), o estudo da recuperação dos

diversos parâmetros fisiológicos, após irrigação do solo, tem sido, em parte, negligenciado,

não permitindo uma clarificação do seu efeito nesses parâmetros (Miyashita et al., 2005).

Nas experiências de stresse rápido, as variedades PB64, PB260 e PB269 apresentaram

as menores taxas de diminuição do THR ao longo do tempo, revelando um maior controlo

estomático comparativamente às variedades AD3R, PB304 e PB369. Uma vez que se

pretendia simular as condições do período de dia em que as plantas estão sujeitas a uma maior

intensidade luminosa, e em que existe um maior défice hídrico (Marques da Silva e Arrabaça,

2004a), as variedades PB64, PB260 e PB269 parecem conseguir manter o seu THR durante

um maior período de tempo, neste momento do dia.

Devido à variação do THR das folhas ao longo do tempo não ser igual para todas as

variedades, optou-se por apresentar os parâmetros analisados nos ensaios de trocas gasosas e

nos ensaios de fluorescência modulada da clorofila a em função do THR e não em função do

tempo.

4.3.2. Trocas Gasosas4.3.2. Trocas Gasosas4.3.2. Trocas Gasosas4.3.2. Trocas Gasosas

A realização de um ensaio preliminar nas variedades PB260 e PB369 permitiu

averiguar qual a melhor PPFD a utilizar durante os ensaios (Fig. 4.5), em que a taxa

fotossintética fosse máxima e os efeitos da fotoinibição na fotossíntese aparente não fossem

visíveis.

Fig. 4.5 – Variação da taxa fotossintética líquida (A) em função da densidade de fluxo fotónico

fotossintético (PPFD). Os pontos foram obtidos de 4 folhas de diferentes plantas das variedades

PB260 e PB369.

0 500 1000 1500 20000

5

10

15

PPFD (µµµµmol fotões.m-2

.s-1

)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

y = 20,34 * ((1 – exp (– 0,03805x / 20,34)) * exp (– 0,005627x / 20,34)

(r2 = 0,98 ; p < 0,01)

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

48

Chegou-se desta forma ao valor 870 µmol.m-2.s-1, quer por estar no intervalo com as

características pretendidas, quer por facilidade de programação no IRGA LCPro+ (ver 4.2.3.).

Este valor foi utilizado para as restantes variedades de milho, admitindo-se que apresentam

uma resposta semelhante a estas duas variedades, uma vez que estiveram sujeitas às mesmas

condições de crescimento. Nas variedades utilizadas no ensaio preliminar, pode observar-se

que, para PPFD superiores a 1000 µmol.m-2.s-1, a taxa fotossintética líquida apresenta uma

tendência para diminuir, tornando-se visível o fenómeno da fotoinibição (Ying et al., 2002).

Também as variações, dadas pelos desvios padrão para os diferentes pontos de PPFD, são

relativamente pequenas, o que proporciona alguma segurança sobre o comportamento das

restantes variedades.

4.3.2.4.3.2.4.3.2.4.3.2.1. Stresse Lento1. Stresse Lento1. Stresse Lento1. Stresse Lento

Na Fig. 4.6 está representada a variação da taxa fotossintética líquida (A) em função

do THR, nas diferentes variedades de milho, durante as experiências de stresse lento. É

importante referir que, neste trabalho, todos os parâmetros medidos em função do THR

apresentam pontos que são simultaneamente os últimos do período de stresse hídrico e os

primeiros para o início do período de recuperação, ocorrendo sobreposição dos mesmos.

Verifica-se que os valores máximos de A nas diferentes variedades variam entre os 15

e os 30 µmol CO2.m-2.s-1. Estes valores estão de acordo com os observados para o milho e

outras plantas C4 por outros autores em condições de crescimento idênticas (Maroco et al.,

1998; Marques da Silva, 1999). Os valores de THR a que A se anula também são diferentes

consoante as variedades, rondando os 60 a 65% nas variedades AD3R, PB64, PB304 e

PB369. Distinguem-se as variedades PB260 e PB269, em que A decresce suavemente num

gradiente até se anular a THR baixos, de 40 e 50% respectivamente, valores próximos dos

observados por Lal e Edwards (1996) para o milho. No entanto, durante a recuperação,

embora estas duas variedades recuperem a função fotossintética quase totalmente, não

recuperam o THR inicial (caixas a tracejado na Fig. 4.6). As variedades AD3R, PB64, PB304

e PB369 destacam-se por manifestarem um comportamento diferente. Possuem alguma

variação de A até THR de 70-80%, momento em que há uma quebra dessa função,

delimitando assim duas regiões de A em função do THR atingido (caixas fechadas na Fig.

4.6). Durante a recuperação, manifestam um comportamento idêntico mas no sentido inverso.

Contudo, estas quatro variedades recuperam o seu THR para valores iniciais mas, no geral,

não atingem a A inicial. A variedade PB369 destaca-se, ainda, por ser a única que apresenta

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

49

valores negativos de A, ou seja, em que a respiração é superior à taxa fotossintética, e que, de

um modo geral, apresentou maiores dificuldades em recuperar.

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 100

0

10

20

30

THR (%)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 100

0

10

20

30

THR (%)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 100

0

10

20

30

THR (%)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆; - -): y = – 5,731 + 0,1902x (r2 = 0,81 ; p < 0,01)

Recuperação (�)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 100

0

10

20

30

THR (%)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆; - -): y = 15,13 – 0,6625x + 0,007447x2

(r2 = 0,91 ; p < 0,01)

Recuperação (�; –): y = 16,04 – 0,7276x + 0,008393x2

(r2 = 0,86 ; p < 0,05)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 100

0

10

20

30

THR (%)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

40 50 60 70 80 90 100

0

10

20

30

THR (%)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

Fig. 4.6 – Variação da taxa fotossintética líquida (A) em função do teor hídrico relativo (THR),

nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas de diferentes plantas.

Resumindo, as variedades PB260 e PB269 vão ajustando a sua A à medida que o THR

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

50

diminui, conseguem ir até THR mais baixos e após irrigação recuperam significativamente a

A inicial. No entanto, PB260 apresenta valores inferiores de A na hidratação máxima. Por

outro lado, as variedades AD3R, PB64, PB304 e PB369 sofrem um anulamento abrupto da

sua A num valor limite de THR, com um comportamento ao qual se pode chamar “tudo-ou-

nada”, e, embora recuperem o seu THR inicial, apresentam valores inferiores aos de A inicial,

após irrigação.

Fig. 4.7 – Variação da condutância estomática (gs) em função do teor hídrico relativo (THR), nas

experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas de diferentes plantas.

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

THR (%)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

THR (%)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

THR (%)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

Stresse (∆; - -): y = – 0,08262 + 0,002449x (r2 = 0,81 ; p < 0,01)

Recuperação (�; –): y = – 0,07998 + 0,002487x

(r2 = 0,76 ; p < 0,01)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

THR (%)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

Stresse (∆; - -): y = 0,2576 – 0,009618x + 9,24e-5x2

(r2 = 0,81 ; p < 0,05)

Recuperação (�; –): y = 0,1093 – 0,00447x + 5,204e-5x2

(r2 = 0,83 ; p < 0,05)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

THR (%)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

THR (%)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

51

Na Fig. 4.7 está representada a condutâmcia estomática (gs) em função do THR. Nas

folhas perto da hidratação total, as variedades AD3R, PB64, PB260 e PB304 apresentam gs

máximas entre os 0,10 e os 0,20 mol.m-2.s-1, valores de acordo com os observados no milho

(Maroco et al., 1999; Bruce et al., 2002; Goodger et al., 2005), destacando-se a variedade

PB269 com valores mais elevados (entre os 0,20 e os 0,30 mol.m-2.s-1) e a variedade PB369

com valores mais baixos a rondar os 0,10 mol.m-2.s-1. O momento em que se dá o fecho total

dos estomas também diverge nas variedades, ocorrendo na PB260 a THR perto dos 40% e,

por oposição, na PB64 ocorre logo aos 70%. A variedade PB260 parece ser também a mais

versátil, adaptando a sua gs de uma forma mais ou menos linear com a diminuição do THR.

Na variedade PB269 também ocorre alguma adaptação com a diminuição do THR, mas nas

restantes ocorre o já referido mecanismo de “tudo-ou-nada”: a maior parte das observações

numa janela estreita de THR elevados e amostras finais com valores muito baixos (quase

nulos) para níveis de THR inferiores.

Após irrigação, a gs das variedades AD3R, PB304 e PB369 recuperou para valores

próximos dos iniciais. No caso de AD3R é de notar que A não havia recuperado para os

valores iniciais embora gs sim. No caso da variedade PB64, embora THR tenha recuperado, os

valores de gs são inferiores aos iniciais. Na variedade PB260, existe a recuperação de gs mas

THR nunca recupera totalmente. Na variedade PB269, gs não recupera tal como acontece com

o THR. No caso da variedade PB369, uma vez que a A apresenta valores negativos para THR

em que gs ainda não se encontra perto dos valores nulos, poderá existir um efeito negativo do

stresse hídrico sobre o metabolismo fotossintético do carbono, nomeadamente o efeito do

stresse oxidativo na maquinaria fotossintética (Shen et al., 1997a; Kingston-Smith e Foyer,

2000; Chaves e Oliveira, 2004). Esta variedade possui um controlo estomático mais apertado,

em oposição à variedade PB269. PB369 necessitará de gs mais baixas de modo reduzir as

perdas de água, enquanto, na variedade PB269, o controlo possui uma regulação com uma

maior janela de acção, apresentando maiores perdas de água mas mantendo A até THR mais

baixos. Estes dados são cruciais na medida que fornecem informações importantes sobre

diferentes graus de tolerância destas variedades ao stresse hídrico.

A taxa transpiratória (E) acompanha a redução de A devido à diminuição da gs perto

da hidratação máxima (Fig. 4.8). A variedade PB269 apresenta um valor de 3 mmol H2O.m-

2.s-1, semelhante ao encontrado na espécie herbácea Poa pratensis, a qual apresenta uma

resistência moderada ao stresse hídrico (DaCosta et al., 2004), e a variedade PB369 o valor de

1,5 mmol H2O.m-2.s-1, este mais próximo do encontrado por Tang e Boyer (2002) para o

milho (1,6 mmol H2O.m-2.s-1). Contudo, a variedade AD3R apresenta uma E praticamente

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

52

nula a THR de 70%, enquanto que o mesmo acontece apenas para THR inferiores a 40% na

variedade PB260.

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

THR (%)

E (

mm

ol

H2O

.m-2

.s-1

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

THR (%)

E (

mm

ol

H2O

.m-2

.s-1

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

THR (%)

E (

mm

ol

H2O

.m-2

.s-1

)

Stresse (∆; - -): y = – 0,5858 + 0,02183x (r2 = 0,92 ; p < 0,01)

Recuperação (�; –): y = – 1,209 + 0,03828x (r2 = 0,82 ; p < 0,01)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

THR (%)

E (

mm

ol

H2O

.m-2

.s-1

)

Stresse (∆; - -): y = 2,707 – 0,0981x + 0,0009918x2

(r2 = 0,82 ; p < 0,05)

Recuperação (�; –): y = – 1,434 – 0,05697x + 0,0007075x2

(r2 = 0,81 ; p < 0,05)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

THR (%)

E (

mm

ol

H2O

.m-2

.s-1

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

THR (%)

E (

mm

ol

H2O

.m-2

.s-1

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

Fig. 4.8 – Variação da taxa transpiratória (E) em função do teor hídrico relativo (THR), nas

experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas de diferentes plantas.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

53

Após irrigação, todas as variedades recuperaram a sua E para valores próximos dos

observados inicialmente, à excepção da variedade PB64, que apenas recuperou parcialmente,

e da variedade PB269, o que está de acordo com os valores de gs registados.

Nas variedades AD3R e PB64 verifica-se um ligeiro aumento do Ci mas apenas nas

amostras finais (THR baixos) (Fig. 4.6).

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 1000

100

200

300

400

500

THR (%)

Ci (p

pm

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 1000

100

200

300

400

500

THR (%)

Ci (p

pm

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 1000

100

200

300

400

500

THR (%)

Ci (p

pm

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000

100

200

300

400

500

THR (%)

Ci (p

pm

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 1000

100

200

300

400

500

THR (%)

Ci (p

pm

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000

100

200

300

400

500

THR (%)

Ci (p

pm

)

Stresse (∆; - -): y = 522,7 – 3,937x (r2 = 0,76 ; p < 0,01)

Recuperação (�)

Fig. 4.9 – Variação da concentração interna de CO2 (Ci) em função do teor hídrico relativo (THR),

nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas de diferentes plantas.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

54

As variedades PB260, PB269 e PB304 não apresentam variações significativas de Ci

com a diminuição do THR, embora a dispersão dos pontos aumente um pouco. Destaca-se a

variedade PB369 com um aumento de Ci significativo durante o período de stresse. Verifica-

se, no entanto, uma manutenção de Ci para THR até 90%. O facto de ocorrer um aumento de

Ci para THR inferiores a 90%, poderá estar relacionado com a modificação física da folha

(distorção das células do mesófilo) (Giles et al., 1974; Lal e Edwards, 1996), ou com a

existência de barreiras internas como o pH, dificultando a difusão do CO2 nesta variedade de

milho (Marshall e Dumbroff; 1999; Marques da Silva, 1999), ou ainda com um aumento da

respiração (Lawlor e Cornic, 2002).

Nas variedades em que Ci variou, os valores regressaram aos iniciais, após irrigação,

retomando as variedades a assimilação fotossintética do carbono. No entanto, a variedade

PB369 apresentou valores de Ci bastante elevados durante a recuperação, o que, comparando

com a Fig. 4.6, revela a dificuldade que esta variedade apresentou em retomar a sua função

fotossintética.

Em relação à eficiência do uso da água (WUE), verifica-se uma maior susceptibilidade

ao stresse nas variedades AD3R e PB369, nas quais WUE se anula a THR de 50% (Fig. 4.10).

Embora AD3R possua a maior WUE das seis variedades, após irrigação recuperou para

valores inferiores aos iniciais. Por outro lado, durante a recuperação da variedade PB369, os

valores de WUE continuavam praticamente nulos a THR de cerca de 80%, embora para THR

superiores tenha recuperado para valores iniciais. A WUE da variedade PB64 não sofreu

variações significativas durante o período de stresse, verificando-se, num entanto, um ligeiro

aumento após o período de recuperação. De notar também que a variedade PB260, embora

não tenha sofrido variação de WUE até THR de 40%, não recuperou a sua WUE inicial, no

final do período de recuperação. A variedade PB304 também diminuiu a sua WUE para

metade da inicial a um THR de 40%, recuperando parcialmente após irrigação. A WUE da

variedade PB269 sofreu uma redução com a diminuição do THR mas após irrigação

recuperou para valores ligeiramente superiores aos iniciais (à excepção de dois pontos)

mesmo com THR na ordem dos 80-90%. Esta variedade parece ser a que possui um melhor

equilíbrio entre a capacidade fotossintética e a disponibilidade de água no solo. A maior ou

menor taxa de redução da WUE poderá estar relacionada com a velocidade a que o stresse

hídrico se desenvolve (Richardson e McCree, 1985), reflectindo uma das características de

tolerância à seca, como a adaptação deste parâmetro à água disponível.

Marques da Silva (1999) registou em Setaria sphacelata (planta C4) um THR de cerca

de 75% para a anulação de WUE. No entanto, nestas variedades de milho os valores de THR

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

55

registados em que tal sucedia eram inferiores. Tal facto poderá estar relacionado com o

fenómeno de enrolamento das folhas, que permite uma melhor WUE, uma vez que diminui as

perdas de água por transpiração e permite continuar a assimilação de CO2 (Richards et al.,

2002). Este fenómeno foi observado em todas as variedades analisadas. As diferenças entre

cada variedade poderão estar relacionadas com outros factores, nomeadamente nas diferenças

entre os módulos elásticos da parede celular que afectam a difusão do CO2, uma vez que a

rigidez da parede permite ou impede a passagem dos gases (Marshall e Dumbroff, 1999).

Fig. 4.10 – Variação da eficiência do uso da água (WUE) em função do teor hídrico relativo

(THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas de diferentes

plantas.

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 1000

10

20

THR (%)

WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 1000

10

20

THR (%)

WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 1000

10

20

THR (%)

WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000

10

20

THR (%)

WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 1000

10

20

THR (%)

WU

E

( µµ µµm

ol C

O2 /

mm

ol H

2O

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000

10

20

THR (%)

WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

56

Observou-se uma relação linear entre A e gs (Kim e Lieth, 2003) em todas as

variedades, à excepção do ocorrido durante o período de stresse na variedade PB269 (Fig.

4.11).

Fig. 4.11 – Relação entre a taxa fotossintética líquida (A) e a condutância estomática (gs), nas

experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas de diferentes plantas.

AD3R

0.0 0.1 0.2 0.3 0.40

10

20

30

gs (mol.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆; - -): y = – 0,5661 + 141,6x (r2 = 0,91 ; p < 0,01)

Recuperação (�; –): y = – 0,6958 + 93,45x (r2 = 0,91 ; p < 0,01)

PB64

0.0 0.1 0.2 0.3 0.40

10

20

30

gs (mol.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆; - -): y = 1,295 + 75,44x (r2 = 0,65 ; p < 0,01)

Recuperação (�; –): y = – 0,8057 + 139,9x (r2 = 0,66 ; p < 0,01)

PB260

0.0 0.1 0.2 0.3 0.40

10

20

30

gs (mol.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆; - -): y = 1,8 + 58,84x (r2 = 0,50 ; p < 0,01)

Recuperação (�; –): y = 1,935 + 40,97x (r2 = 0,49 ; p < 0,01)

PB269

0.0 0.1 0.2 0.3 0.40

10

20

30

gs (mol.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆; - -): y = 0,6314 + 132x – 176,7x2 (r2 = 0,90 ; p < 0,05)

Recuperação (�; –): y = – 1,084 + 150,1x (r2 = 0,91 ; p < 0,01)

PB304

0.0 0.1 0.2 0.3 0.40

10

20

30

gs (mol.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆; - -): y = – 0,1462 + 111,2x (r2 = 0,91 ; p < 0,01)

Recuperação (�; –): y = – 1,244 + 119,8x (r2 = 0,83 ; p < 0,01)

PB369

0.0 0.1 0.2 0.3 0.40

10

20

30

gs (mol.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆; - -): y = – 0,7673 + 139,4x (r2 = 0,90 ; p < 0,01)

Recuperação (�; –): y = – 2,22 + 127,4x (r2 = 0,96 ; p < 0,01)

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

57

Verificou-se que estes dados estão de acordo com os da WUE (Fig. 4.10). AD3R

possui a maior A para uma gs menor, mas durante o período de recuperação ocorre uma

diminuição desta relação, apresentado a recta um declive mais reduzido. Algo semelhante

acontece na variedade PB260. Por outro lado, a variedade PB64 possui uma relação superior

após a irrigação, apresentando uma A maior para uma gs mais baixa, comparativamente ao

período de stresse. Também em PB269 se observa uma A igual aos valores iniciais mas com

uma gs menor, o que justifica uma WUE superior durante a recuperação. Nesta variedade,

observa-se uma tendência para um estado de equilíbrio de A com o aumento de gs o que

revela alguma limitação não-estomática. Nas variedades PB304 e PB369 não houve

diferenças significativas entre o período de stresse e o período de recuperação, embora na

variedade PB304 não se tenham observado valores de A superiores a 15 µmol CO2.m-2.s-1,

durante a recuperação.

Estes dados estão, em parte, de acordo com os valores de Ci observados (Fig. 4.9). Se

A varia paralelamente a gs, então Ci permanece constante. Tal facto verifica-se em todas as

variedades, ocorrendo pouca variação desse parâmetro, à excepção do que acontece em

PB369, em que Ci aumenta, mas possivelmente devido a mecanismos que já foram discutidos

anteriormente.

Observa-se que A se anula quando os estomas não estão completamente fechados, o

que poderá indicar algumas limitações a nível do mesófilo. A nível ecofisiológico WUE

poderá ser importante para determinar a tolerância das variedades ao stresse hídrico, dado que

indica a capacidade de compromisso entre a perda de água e a assimilação de CO2, à medida

que ocorre o fecho estomático. Desta forma, as variedades AD3R, PB260 e PB269 são

aquelas que conseguem manter algum nível de A com gs muito reduzidas, mesmo com a

intensificação do stresse hídrico, enquanto que nas restantes variedades, principalmente na

PB304 e PB369, A anula-se quando os estomas ainda estão abertos.

Em todas as variedades, Ci encontra-se entre os 130 e os 230 ppm perto da hidratação

total, verificando-se uma relativa manutenção deste parâmetro com a variação de A (Fig.

4.12). Quando A se anula, Ci sofre um aumento para perto dos 300-350 ppm, valores

semelhantes aos encontrados noutras C4 (Marques da Silva, 1999). Em PB369, observam-se

valores superiores de Ci (cerca de 500 ppm) após a anulação da A, que poderão resultar, como

já foi referido, da distorção das células do mesófilo e entrada de CO2 através da cutícula,

associados a um módulo elástico mais elevado que impede a difusão de CO2 até aos locais de

carboxilação (Giles et al., 1974; Lal e Edwards, 1996; Marshall e Dumbroff, 1999), e ainda a

um aumento da respiração (Lawlor e Cornic, 2002).

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

58

AD3R

0 100 200 300 400 5000

10

20

30

Ci (ppm)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB64

0 100 200 300 400 5000

10

20

30

Ci (ppm)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB260

0 100 200 300 400 5000

10

20

30

Ci (ppm)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB269

0 100 200 300 400 5000

10

20

30

Ci (ppm)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB304

0 100 200 300 400 5000

10

20

30

Ci (ppm)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

100 200 300 400 5000

10

20

30

Ci (ppm)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

Fig. 4.12 – Relação entre a taxa fotossintética líquida (A) e a concentração interna de CO2 (Ci),

nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 a 5 folhas de diferentes plantas.

Na recuperação, os valores de Ci retomaram os iniciais para todas as variedades,

indicando uma retoma da assimilação fotossintética do carbono, embora as variedades AD3R

e PB304 apresentassem uma recuperação mais lenta dos valores iniciais.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

59

Em suma, nos ensaios de stresse lento, observou-se nas seis variedades, com o

decréscimo do THR, uma diminuição geral dos parâmetros estudados (A, E, gs, WUE),

característica deste tipo de stresse (Turner, 1974; Lawlor e Cornic, 2002), com o decréscimo

do THR nas seis variedades. No entanto, Ci permaneceu relativamente constante num

determinado intervalo de THR, sofrendo um aumento à medida que se intensificava o stresse

hídrico. O facto dos valores de Ci se manterem com a diminuição do THR (Stuhlfauth et al.,

1988) e/ou aumentarem à medida que o THR atinge valores mais baixos (Marques da Silva,

1999) poderá dever-se à existência de barreiras internas à difusão de CO2 que dificultem o seu

acesso aos locais de carboxilação (Lawlor e Cornic, 2002), continuando, no entanto, a ocorrer

alguma difusão cuticular após o fecho estomático (Meyer e Genty, 1998; Tezara et al., 2003),

e um aumento da respiração (Lawlor e Cornic, 2002).

Uma vez que existem diferenças entre gs e A relativamente ao THR a que se anulam,

as condicionantes de A poderão estar relacionadas com factores não-estomáticos,

nomeadamente uma alteração do metabolismo. gs e E anulam-se a um THR inferior ao

verificado para A, indicando que existem trocas gasosas mas a fixação de CO2 é inferior à

taxa respiratória (Lawlor e Cornic, 2002).

4.3.2.4.3.2.4.3.2.4.3.2.2. Stresse Rápido2. Stresse Rápido2. Stresse Rápido2. Stresse Rápido

Os valores de A nas experiências de stresse rápido são mais baixos em todas as

variedades quando comparados com os valores das experiências de stresse lento (Fig. 4.6).

Tal facto poderá estar relacionado com um curto período em que as plantas estiveram sujeitas

a temperaturas mais elevadas devido a avaria da câmara de crescimento. Alterando desta

forma as condições de crescimento, as plantas procederam a um ligeiro fecho dos estomas

(valores inferiores aos do stresse lento observados na Fig. 4.14), e, como tal, partindo de A

mais baixas também poderão ter-se anulado a THR mais altos. Com esta reserva, procedeu-se

à análise dos dados obtidos.

Nas experiências de stresse rápido verificou-se que A aparente se anulava a THR entre

60 e 70% nas diferentes variedades, à excepção de PB64 em que isso sucedeu a THR de cerca

de 85% (ver caixas da Fig. 4.13). Observa-se que, neste caso, a fotossíntese diminuiu mais

rapidamente que nas experiências de stresse lento (Fig. 4.6), sobretudo devido a um rápido

fecho dos estomas nestas condições (Fig. 4.14).

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

60

AD3R

50 60 70 80 90 100

-5

0

5

10

15

20

THR (%)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

y = 4,684 – 0,305x+ 0,003702x2 (r2 = 0,97 ; p < 0,05)

PB64

50 60 70 80 90 100

-5

0

5

10

15

20

THR (%)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

PB260

50 60 70 80 90 100

-5

0

5

10

15

20

THR (%)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

y = – 17,2 + 0,2763x (r2 = 0,84 ; p < 0,01)

PB269

50 60 70 80 90 100

-5

0

5

10

15

20

THR (%)A

(µµ µµ

mo

l C

O2.m

-2.s

-1)

y = 2,923 – 0,2474x+ 0,003161x2 (r2 = 0,97 ; p < 0,05)

PB304

50 60 70 80 90 100

-5

0

5

10

15

20

THR (%)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

y = 12,86 – 0,6169x+ 0,006596x2 (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

PB369

50 60 70 80 90 100

-5

0

5

10

15

20

THR (%)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

y = – 15,38 + 0,2578x (r2 = 0,70 ; p < 0,01)

Fig. 4.13 – Variação da taxa fotossintética líquida (A) em função do teor hídrico relativo (THR),

nas experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

Relativamente à gs, e também como acontece em relação a A (Fig. 4.13), a mesma

anula-se a THR de cerca de 60-70% para todas as variedades, à excepção de PB64, que

diminui abruptamente até um THR na ordem dos 85% e depois mantém-se sem se anular (Fig.

4.14). Observa-se um rápido fecho dos estomas com a diminuição do THR, a partir do qual os

valores permanecem praticamente nulos, o que evita a perda de água através das folhas, nos

períodos de maior défice hídrico (Raschke, 1970).

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

61

AD3R

40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

THR (%)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

y = 0,1487 – 0,005555x+ 5,4142e-5x2 (r2 = 0,88 ; p < 0,05)

PB64

40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

THR (%)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

y = 0,975 – 0,02559x+ 0,0001691x2 (r2 = 0,69 ; p < 0,05)

PB260

40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

THR (%)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

y = 0,2519 – 0,009277x + 8,3765e-5x2 (r2 = 0,88 ; p < 0,05)

PB269

40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

THR (%)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

y = 0,165 – 0,005727x + 5,084e-5x2 (r2 = 0,94 ; p < 0,05)

PB304

40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

THR (%)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

y = 0,1702 – 0,006466x + 6,1748e-5x2 (r2 = 0,99 ; p < 0,05)

PB369

40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

THR (%)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

y = 0,1132 – 0,003909x + 3,5903e-5x2 (r2 = 0,72 ; p < 0,05)

Fig. 4.14 – Variação da condutância estomática (gs) em função do teor hídrico relativo (THR), nas

experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

Pode observar-se na Fig. 4.15, a diminuição de E com a diminuição do stresse hídrico,

muito semelhante a gs. De salientar as relativamente elevadas E da variedade PB64 mantidas a

baixos THR devido ao não anulamento da gs.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

62

AD3R

40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

THR (%)

E (

mm

ol.

m-2

.s-1

)

y = 2,023 – 0,07554x + 0,0007849x2 (r2 = 0,96 ; p < 0,05)

PB64

40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

THR (%)

E (

mm

ol.

m-2

.s-1

)

y = 14,23 – 0,3733x + 0,002504x2 (r2 = 0,70 ; p < 0,05)

PB260

40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

THR (%)

E (

mm

ol.

m-2

.s-1

)

y = 2,716 – 0,1089x + 0,001091x2 (r2 = 0,91 ; p < 0,05)

PB269

40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

THR (%)

E (

mm

ol.

m-2

.s-1

)

y = 2,688 – 0,09357x + 0,0008661x2 (r2 = 0,96 ; p < 0,05)

PB304

40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

THR (%)

E (

mm

ol

m-2

s-1

)

y = 2,456 – 0,09103x + 0,0009155x2 (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

PB369

40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

THR (%)

E (

mm

ol

m-2

s-1

)

y = 0,7149 – 0,03273x + 0,0004125x2 (r2 = 0,75 ; p < 0,05)

Fig. 4.15 – Variação da taxa transpiratória (E) em função do teor hídrico relativo (THR), nas

experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

Na Fig. 4.16 está representada a variação de Ci em função do THR, onde se observa

que até valores de THR próximos de 70-80%, Ci pouco varia (valores assinalados com caixas

nos gráficos). Este facto poderá estar relacionado com o facto de A e gs covariarem até este

valor de THR. Abaixo desse valor, à medida que o THR diminui observa-se um aumento de

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

63

Ci, relacionado com os dados já referidos anteriormente (ver Fig. 4.9) Apenas na variedade

PB64, tal facto não se observa, em parte por não se terem obtido THR mais reduzidos, mas

também poderá resultar do facto de gs não se anular e o CO2 respirado ser libertado para o

exterior, não ocorrendo acumulação deste.

AD3R

40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

THR (%)

Ci (p

pm

)

y = 2639 – 55,16x + 0,3079x2 (r2 = 0,82 ; p < 0,05)

PB64

40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

THR (%)

Ci (p

pm

)

y = 762,8 – 5,731x (r2 = 0,74 ; p < 0,01)

PB260

40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

THR (%)

Ci (p

pm

)

y = 3553 – 75,86x + 0,4261x2 (r2 = 0,67 ; p < 0,05)

PB269

40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

THR (%)

Ci (p

pm

)

y = 3531 – 76,96x + 0,4351x2 (r2 = 0,93 ; p < 0,01)

PB304

40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

THR (%)

Ci (p

pm

)

y = 3082 – 67,03x + 0,3751x2 (r2 = 0,84 ; p < 0,05)

PB369

40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

THR (%)

Ci (p

pm

)

y = 3305 – 69,44x + 0,9091x2 (r2 = 0,91 ; p < 0,05)

Fig. 4.16 – Variação da concentração interna de CO2 (Ci) em função do teor hídrico relativo

(THR), nas experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes

plantas.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

64

Relativamente à WUE, verificou-se sempre uma anulação da mesma para THR de

cerca de 70-75%, à excepção da variedade PB64 em que tal sucedeu a THR de 80% (Fig.

4.17). Esta variedade parece ter alguma sensibilidade ao stresse hídrico por indução rápida.

Todas as variedades apresentaram uma WUE de 5-6 µmol CO2 / mmol H2O perto da

hidratação total, semelhante às registadas por Kang e Zhang (2004) no milho, à excepção das

variedades PB304 e PB369 que possuem uma WUE ligeiramente mais elevada (8 µmol CO2 /

mmol H2O).

AD3R

50 60 70 80 90 100

-15

-10

-5

0

5

10

THR (%)WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

PB64

50 60 70 80 90 100

-15

-10

-5

0

5

10

THR (%)WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

PB260

50 60 70 80 90 100

-15

-10

-5

0

5

10

THR (%)WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

PB269

50 60 70 80 90 100

-15

-10

-5

0

5

10

THR (%)WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

PB304

50 60 70 80 90 100

-15

-10

-5

0

5

10

THR (%)WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

PB369

50 60 70 80 90 100

-15

-10

-5

0

5

10

THR (%)WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

Fig. 4.17 – Variação da eficiência do uso da água (WUE) em função do teor hídrico relativo

(THR), nas experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes

plantas.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

65

Os valores negativos de WUE observados no gráfico resultam de existirem valores

negativos de A, provavelmente resultantes de respiração celular a stresse hídrico mais elevado

(THR foliar perto de 50%), associados a uma reduzida mas presente transpiração (Fig. 4.15).

AD3R

0.1 0.2

-5

0

5

10

15

20

gs (mol.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

y = – 2,554 + 179,8x – 595,8x2 (r2 = 0,98 ; p < 0,05)

PB64

0.1 0.2

-5

0

5

10

15

20

gs (mol.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

y = – 1,889 + 118,7x (r2 = 0,98 ; p < 0,01)

PB260

0.1 0.2

-5

0

5

10

15

20

gs (mol.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

y = – 0,5647 + 149,8x – 512,8x2 (r2 = 0,95 ; p < 0,05)

PB269

0.1 0.2

-5

0

5

10

15

20

gs (mol.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

y = – 1,645 + 180,2x – 659,8x2 (r2 = 0,99 ; p < 0,05)

PB304

0.1 0.2

-5

0

5

10

15

20

gs (mol.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

y = – 1,383 + 132,3x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

PB369

0.1 0.2

-5

0

5

10

15

20

gs (mol.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

y = – 1,617 + 159x (r2 = 0,96 ; p < 0,01)

Fig. 4.18 – Relação entre a taxa fotossintética líquida (A) e a condutância estomática (gs), nas

experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

Comparando A com gs verifica-se que as variedades AD3R, PB260 e PB269

apresentam uma relação polinomial de segundo grau, enquanto que as variedades PB64,

PB304 e PB369 apresentam uma relação linear (Fig. 4.18). As primeiras conseguem manter

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

66

níveis de A mais ou menos constantes até uma determinada gs, o que indica uma maior

tolerância ao stresse hídrico, enquanto que as últimas diminuem a sua A consoante a gs,

perdendo em parte produtividade e demonstrando uma maior sensibilidade ao stresse hídrico.

De notar também que, tal como no stresse lento, as funções aplicadas não cruzam a

origem, ou seja, quando A se anula, os estomas não estão totalmente fechados, podendo

indicar algumas limitações a nível do mesófilo ou não-estomáticas (ver Fig. 4.11) (Lawlor,

2002), embora possa resultar da uma A real tão baixa que é “mascarada” pelo CO2 respirado.

AD3R

250 500 750 1000

-5

0

5

10

15

20

Ci (ppm)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

PB64

250 500 750 1000

-5

0

5

10

15

20

Ci (ppm)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

PB260

250 500 750 1000

-5

0

5

10

15

20

Ci (ppm)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

PB269

250 500 750 1000

-5

0

5

10

15

20

Ci (ppm)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

PB304

250 500 750 1000

-5

0

5

10

15

20

Ci (ppm)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

PB369

250 500 750 1000

-5

0

5

10

15

20

Ci (ppm)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

Fig. 4.19 – Relação entre a taxa fotossintética líquida (A) e a concentração interna de CO2 (Ci),

nas experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

67

Na Fig. 4.19 verifica-se que, quando A varia, os valores de Ci se mantém constantes

num determinado intervalo (cerca de 130-230 ppm), tal como sucedia no stresse lento (Fig.

4.12). No entanto, quando A se anula, os valores de Ci aumentam para valores que chegam a

ser o triplo dos verificados em condições de hidratação total ou stresse moderado,

provavelmente devido a um aumento da respiração (Lawlor e Cornic, 2002).

A análise dos parâmetros das trocas gasosas nos ensaios de stresse rápido permitem

observar uma rápida resposta das variedades portuguesas de milho ao período do dia

correspondente a um maior défice hídrico e défice de pressão de vapor (Marques da Silva e

Arrabaça, 2004b). Uma resposta mais rápida a uma diminuição brusca do THR foliar é

fundamental para que as perdas de água sejam minimizadas e as plantas mantenham o seu

estado hídrico constante. Para tal é necessário uma optimização da regulação estomática por

parte das plantas de modo a que também as limitações não-estomáticas sejam minimizadas

com a perda de água (Raschke, 1970). Especificamente, na variedade PB64, gs e E não se

anulam e, portanto, pode desidratar mais facilmente a meio do dia. Por outro lado, nas

variedades PB260 e PB269, gs diminui num determinado intervalo sem ocorrer diminuição de

A e, desta forma, da produtividade.

Esta resposta rápida verificou-se em todas as variedades de milho. Os parâmetros

analisados (A, E, gs, WUE) anularam-se de uma forma mais rápida do que nos ensaios de

stresse lento. No caso do Ci, houve uma manutenção dos valores até um determinado THR

seguido de um aumento, tal como aconteceu no stresse lento.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

68

4.3.3. Flu4.3.3. Flu4.3.3. Flu4.3.3. Fluorescência Moduorescência Moduorescência Moduorescência Modulada da Clorofilalada da Clorofilalada da Clorofilalada da Clorofila aaaa

4.3.34.3.34.3.34.3.3.1.1.1.1. . . . Stresse LentoStresse LentoStresse LentoStresse Lento

Na Fig. 4.20 está representada a variação da área complementar (normalizada pela

fluorescência basal) à fase rápida da curva de Kautsky, em função do THR, que nos permite

inferir sobre a dimensão do pool de quinonas (Lazár, 1999).

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

1250

THR (%)

(mV

*ms)/

(F0*1

000)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

1250

THR (%)

(mV

*ms)/

(F0*1

000)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

1250

THR (%)

(mV

*ms)/

(F0*1

000)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

1250

THR (%)

(mV

*ms)/

(F0*1

000)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

1250

THR (%)

(mV

*ms)/

(F0*1

000)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

1250

THR (%)

(mV

*ms)/

(F0*1

000)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

Fig. 4.20 – Variação da área complementar (normalizada) à fase rápida da curva de Kautsky em

função do teor hídrico relativo (THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos

de 4 ou 5 folhas de diferentes plantas.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

69

Verifica-se que, à medida que o THR diminui, o pool de quinonas também diminui.

Pode observar-se que nas variedades AD3R, PB64 e PB304 a variação é maior, enquanto que

nas variedades PB260, PB269 e PB369 essa variação é menor. Na variedade PB260, só em

stresse intenso (THR entre 30 e 50%) é que a diminuição é visível.

Após a irrigação, a variedade AD3R demonstrou maior dificuldade na recuperação do

parâmetro, enquanto nas restantes variedades recuperou para valores próximos dos iniciais.

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 1000.2

0.4

0.6

0.8

THR (%)

Fv/F

m

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 1000.2

0.4

0.6

0.8

THR (%)

Fv/F

m

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 1000.2

0.4

0.6

0.8

THR (%)

Fv/F

m

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000.2

0.4

0.6

0.8

THR (%)

Fv/F

m

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 1000.2

0.4

0.6

0.8

THR (%)

Fv/F

m

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000.2

0.4

0.6

0.8

THR (%)

Fv/F

m

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

Fig. 4.21 – Variação do rendimento quântico máximo do PSII (Fv/Fm) em função do teor hídrico

relativo (THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas de

diferentes plantas.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

70

Relativamente ao Fv/Fm, verifica-se um valor perto de 0,8 unidades relativas perto da

hidratação total, descrito para a maioria das espécies vegetais em condições de ausência de

stresse (Fracheboud et al., 1999; Nogués e Baker, 2000; Maxwell e Johnson, 2000) (Fig.

4.21).

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

THR (%)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

THR (%)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

THR (%)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

THR (%)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

THR (%)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

THR (%)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

Fig. 4.22 – Variação do rendimento quântico efectivo do PSII (ΦPSII) em função do teor hídrico

relativo (THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas de

diferentes plantas.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

71

Até a um THR de 80% (stresse baixo), este parâmetro mantém-se constante entre as

0,7 e 0,8 unidades relativas. Com a diminuição do THR (agravamento do stresse), há um

decréscimo deste parâmetro até às 0,6 unidades relativas. As variedades AD3R e PB304

foram as únicas que apresentaram valores inferiores a este. No caso de AD3R, apresentou

valores inferiores a este no intervalo de THR de 50-70% (stresse moderado), e no caso de

PB304 apresentou um único ponto inferior a este para um THR de cerca de 40% (stresse

intenso). Tal facto indica um efeito negativo nos centros de reacção do PSII, provavelmente

devido a degradação dos componentes (van Wijk et al., 1994; Mattos et al., 1999; Maxwell e

Johnson, 2000). De qualquer modo, este parece ser um parâmetro bastante robusto e pouco

sensível a estes níveis de stresse testados.

Após a iluminação das folhas, o ΦPSII apresentou, perto da hidratação total, um valor

próximo de 0,35 nas variedades AD3R, PB260, PB304 e PB369 e próximo de 0,25 nas

variedades PB64 e PB269, decrescendo à medida que o THR diminuía (Fig. 4.22). As

variedades AD3R, PB64, PB304 e PB369 são aquelas em que este decréscimo foi mais

acentuado, mesmo em stresse moderado (THR entre 50% e 80%). PB64 foi a variedade que

apresentou um valor de ΦPSII superior ao inicialmente observado, após irrigação. Por outro

lado, em PB260 e PB269 o decréscimo não foi tão marcado durante o stresse moderado, e só

PB260 apresentou variações significativas em stresse intenso (THR inferior a 50%). Este

parâmetro é assim um bom indicador do estado geral da fotossíntese quando comparado com

a evolução de A (ver Fig. 4.6).

O parâmetro qP indica-nos que, perto da hidratação total, existe um maior

amortecimento fotoquímico nas variedades AD3R, PB260, PB304 e PB369 (perto de 0,7) e

menor nas variedades PB64 e PB269 (perto de 0,6) (Fig. 4.23). À medida que o THR diminui,

qP também diminui fornecendo uma indicação da energia utilizada para as reacções

fotoquímicas (Maxwell e Johnson, 2000). Esta diminuição, também observada por Tezara et

al. (2003) em Lycium nodosum e por Ögren (1990) em Salix sp., é mais visível nas variedades

AD3R e PB304, enquanto que nas restantes variedades a variação é muito menor. Apenas na

variedade PB260 ocorre uma diminuição mais acentuada para THR inferiores a 50% (stresse

intenso), e nas variedades PB269 e PB369 o parâmetro praticamente não varia nos intervalos

de THR considerados na Fig. 4.23. Na maioria das variedades analisadas, estes dados indicam

que não há alterações na dissipação da energia fotoquímica, indicando uma integridade da

cadeia transportadora de electrões até THR de cerca de 50%, sendo apenas afectada para

stresse hídrico intenso. Após irrigação, o parâmetro recuperou para valores perto dos iniciais

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

72

em todas as variedades, chegando em alguns casos a apresentar valores superiores (variedades

PB64 e PB260).

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 1000.4

0.6

0.8

1.0

THR (%)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 1000.4

0.6

0.8

1.0

THR (%)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 1000.4

0.6

0.8

1.0

THR (%)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000.4

0.6

0.8

1.0

THR (%)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 1000.4

0.6

0.8

1.0

THR (%)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000.4

0.6

0.8

1.0

THR (%)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

Fig. 4.23 – Variação do coeficiente de amortecimento fotoquímico (qP) em função do teor hídrico

relativo (THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas de

diferentes plantas.

O parâmetro qN possuía, perto da hidratação total, um valor entre 0,75 e 0,8 para todas

as variedades (Fig. 4.24). Em todas as variedades este parâmetro sofreu uma evolução

semelhante à do parâmetro qP mas em sentido oposto, ou seja, naquelas variedades em que

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

73

ocorreu variação (AD3R e PB304), esta ocorre no sentido de aumentar ligeiramente o seu

valor, tal como em Lycium nodosum (Tezara et al., 2003). Assim, também a variedade PB260

só demonstra um ligeiro aumento do parâmetro para THR superiores a 50% e as variedades

PB269 e PB369 praticamente não sofrem alterações.

Fig. 4.24 – Variação do coeficiente de amortecimento não-fotoquímico (qN) em função do teor

hídrico relativo (THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas

de diferentes plantas.

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 1000.6

0.7

0.8

0.9

1.0

THR (%)

qN

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 1000.6

0.7

0.8

0.9

1.0

THR (%)

qN

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 1000.6

0.7

0.8

0.9

1.0

THR (%)

qN

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000.6

0.7

0.8

0.9

1.0

THR (%)

qN

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 1000.6

0.7

0.8

0.9

1.0

THR (%)

qN

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000.6

0.7

0.8

0.9

1.0

THR (%)

qN

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

74

Estes dados são coerentes com os anteriores na medida em que quando a cadeia de

electrões é afectada pelo stresse hídrico, o excesso de energia é dissipada por processos não-

fotoquímicos, de modo a proteger a integridade da folha (Horton et al., 1994). Após irrigação

o parâmetro regressou aos valores iniciais em todas as variedades.

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 1000

30

60

90

120

150

THR (%)

ET

R (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 1000

30

60

90

120

150

THR (%)

ET

R (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 1000

30

60

90

120

150

THR (%)

ET

R (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000

30

60

90

120

150

THR (%)

ET

R (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 1000

30

60

90

120

150

THR (%)

ET

R (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000

30

60

90

120

150

THR (%)

ET

R (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

Fig. 4.25 – Variação da taxa de transporte electrónico (ETR) em função do teor hídrico relativo

(THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 4 ou 5 folhas de diferentes

plantas.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

75

Na ETR verifica-se uma diminuição acentuada nas variedades AD3R e PB304 e nas

restantes variedades uma diminuição menos acentuada, implicando uma redução do transporte

de electrões com a diminuição do THR, que poderá resultar de uma diminuição do

metabolismo fotossintético do carbono (Fig.4.25) (Maxwell e Johnson, 2000).

Apenas na variedade PB260 se verifica uma diminuição mais acentuada para stresse

hídrico intenso (THR inferior a 50%). Na variedade PB269 a variação é muito pequena,

apresentando valores superiores de ETR após irrigação. Estes dados estão de acordo com os

dados de A obtidos nos ensaios de trocas gasosas (Fig. 4.6). No entanto, na variedade PB369

observam-se valores elevados de ETR, mesmo durante a imposição do stresse e que parecem

contradizer os valores de A observados. Tal facto poderá estar relacionado com um aumento

do transporte de electrões cíclico em torno do PSII devido à reduzida actividade do ciclo de

Calvin, aliviando o excesso de energia em redor do PSII, já observado em girassol (Laisk et

al., 2006).

Após irrigação, o parâmetro recuperou para valores perto dos iniciais, tendo as

variedades PB64 e PB269 apresentado valores superiores aos observados inicialmente.

4.3.3.2. Stresse Rápido4.3.3.2. Stresse Rápido4.3.3.2. Stresse Rápido4.3.3.2. Stresse Rápido

Em todas as variedades, observou-se um decréscimo da área (normalizada)

complementar à fase rápida da curva de Kautsky, sendo maior na variedade PB369 e menor

na variedade PB269 (Fig. 4.26), em semelhança ao já observado nos ensaios de stresse lento

(Fig. 4.20).

No parâmetro Fv/Fm constatou-se pouca variação do parâmetro, embora demonstrasse

uma ligeira descida em todas as variedades à medida que se aproximavam do THR de 40%

(Fig. 4.27). Nas variedades AD3R, PB260 e PB269 a diminuição foi bastante reduzida, sendo

AD3R e PB269 aquelas que apresentavam variação mais pequena. Comparativamente ao

stresse lento (Fig. 4.21), notam-se algumas variações principalmente na variedade AD3R.

Esta apresentava um decréscimo acentuado no stresse lento que não se observa no stresse

rápido, o que indicará que a velocidade de imposição do stresse desempenha um papel

importante na evolução deste parâmetro associado com uma diminuição da eficiência

fotoquímica (Lizana et al., 2006).

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

76

AD3R

40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

THR (%)

(mV

*ms)/

(F0*1

000)

y = 312,5 + 4,044x (r2 = 0,50 ; p < 0,05)

PB64

40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

THR (%)

(mV

*ms)/

(F0*1

000)

y = – 116,7 + 6,987x (r2 = 0,43 ; p < 0,05)

PB260

40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

THR (%)

(mV

*ms)/

(F0*1

000)

y = 135,6 + 4,947x (r2 = 0,64 ; p < 0,01)

PB269

40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

THR (%)

(mV

*ms)/

(F0*1

000)

y = 237,9 + 3,552x (r2 = 0,75 ; p < 0,01)

PB304

40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

THR (%)

(mV

*ms)/

(F0*1

000)

y = 106,3 + 6,379x (r2 = 0,81 p < 0,01)

PB369

40 50 60 70 80 90 1000

250

500

750

1000

THR (%)

(mV

*ms)/

(F0*1

000)

y = – 25,97 + 8,349x (r2 = 0,85 ; p < 0,01)

Fig. 4.26 – Variação da área complementar (normalizada pela fluorescência basal) à fase rápida

da curva de Kautsky, em função do teor hídrico relativo (THR), nas experiências de stresse rápido.

Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

77

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 1000.4

0.5

0.6

0.7

0.8

THR (%)

Fv/F

m

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = 0,5901 + 0,001441x (r2 = 0,64 ; p = 0,01)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 1000.4

0.5

0.6

0.7

0.8

THR (%)

Fv/F

m

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = 0,4142 + 0,002773x (r2 = 0,53 ; p < 0,05)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 1000.4

0.5

0.6

0.7

0.8

THR (%)

Fv/F

m

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = 0,5446 + 0,001746x (r2 = 0,61 ; p < 0,05)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000.4

0.5

0.6

0.7

0.8

THR (%)

Fv/F

m

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = 0,5578 + 0,001419x (r2 = 0,76 ; p < 0,01)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 1000.4

0.5

0.6

0.7

0.8

THR (%)

Fv/F

m

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = 0,479 + 0,002638x (r2 = 0,73 ; p < 0,01)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000.4

0.5

0.6

0.7

0.8

THR (%)

Fv/F

m

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = 0,5382 + 0,002111x (r2 = 0,71 ; p < 0,01)

Fig. 4.27 – Variação do rendimento quântico máximo do PSII (Fv/Fm) em função do teor hídrico

relativo (THR), nas experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de

diferentes plantas.

Após a iluminação das folhas, o ΦPSII apresentou um valor entre 0,3 e 0,4 perto da

hidratação total, decrescendo à medida que o THR diminui (Fig. 4.28). Todas as variedades

apresentam um valor nulo de ΦPSII a THR de cerca de 40%, à excepção da variedade PB64,

em que tal acontece a THR de cerca de 60%, e da variedade PB260 que a 40% ainda

apresenta um ΦPSII de 0,1 unidades relativas. O fecho progressivo dos centros de reacção do

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

78

PSII explica a diminuição de A de forma semelhante (Fig. 4.13), já observado em cultivares

de trigo (Loggini et al., 1999).

Fig. 4.28 – Variação do rendimento quântico efectivo do PSII (ΦPSII) em função do teor hídrico

relativo (THR), nas experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de

diferentes plantas.

Relativamente a qP, as variedades apresentam um valor de cerca de 0,7 a 0,8 unidades

relativas perto da hidratação total, à excepção da variedade PB269 que apresenta um valor

mais baixo (0,6 unidades relativas) (Fig. 4.29). Comparativamente ao stresse lento, existe um

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

THR (%)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = – 0,008431 – 0,001983x + 5,778e-5x2 (r2 = 0,97 ; p < 0,05)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

THR (%)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = – 0,3505 + 0,006734x (r2 = 0,78 ; p < 0,01)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

THR (%)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = 0,1772 – 0,004758x + 6,393e-5x2 (r2 = 0,86 ; p < 0,05)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

THR (%)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = – 0,1428 + 0,003977x (r2 = 0,94 ; p < 0,01)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

THR (%)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = 0,05687 – 0,002733x + 5,92e-5x2 (r2 = 0,98 ; p < 0,05)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

THR (%)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = – 0,2539 + 0,006313x (r2 = 0,87 ; p < 0,01)

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

79

decréscimo mais acentuado deste parâmetro ao longo da imposição do stresse, apresentando

um declive mais marcado na variedade PB64 e um declive mais suave nas variedades PB260

e PB269. Estes dados indicam que o fluxo electrónico é rapidamente desviado dos processos

fotoquímicos da fotossíntese para mecanismos de dissipação de energia não-fotoquímicos

(Ögren, 1990; Tezara et al., 2003).

Fig. 4.29 – Variação do coeficiente de amortecimento fotoquímico (qP) em função do teor hídrico

relativo (THR), nas experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de

diferentes plantas.

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

THR (%)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = – 0,4104 + 0,01177x (r2 = 0,95 ; p < 0,01)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

THR (%)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = – 0,6247 + 0,01392x (r2 = 0,74 ; p < 0,01)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

THR (%)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = – 0,01262 + 0,007054x (r2 = 0,82 ; p < 0,01)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

THR (%)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = – 0,1592 + 0,007981x (r2 = 0,92 ; p < 0,01)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

THR (%)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = – 0,07762 + 0,008503x (r2 = 0,80 ; p < 0,01)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

THR (%)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = – 0,3384 + 0,01122x (r2 = 0,84 ; p < 0,01)

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

80

O parâmetro qN (Fig. 4.30) demonstrou um aumento maior do que aquele verificado

no stresse lento. No final do período de stresse rápido, todas as variedades apresentavam um

qN de 0,9 unidades relativas. A variedade PB64 foi aquela em que apresentou um maior

declive (em módulo), apresentando o referido valor de qN num THR mais elevado que as

restantes variedades (cerca de 60%). Por outro lado, as variedades PB260 e PB269 foram

aquelas que apresentaram o menor declive (em módulo), de um modo semelhante ao que

sucedeu no stresse lento (Fig. 4.24).

Fig. 4.30 – Variação do coeficiente de amortecimento não-fotoquímico (qN) em função do teor

hídrico relativo (THR), nas experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de

diferentes plantas.

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 1000.6

0.7

0.8

0.9

1.0

THR (%)

qN

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = 1,059 – 0,003503x (r2 = 0,92 ; p < 0,01)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 1000.6

0.7

0.8

0.9

1.0

THR (%)q

N(u

nid

ad

es r

ela

tivas)

y = 1,184 – 0,005371x (r2 = 0,67 ; p < 0,01)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 1000.6

0.7

0.8

0.9

1.0

THR (%)

qN

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = 0,933 – 0,002277x (r2 = 0,51 ; p < 0,05)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000.6

0.7

0.8

0.9

1.0

THR (%)

qN

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = 0,9666 – 0,002105x (r2 = 0,90 ; p < 0,01)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 1000.6

0.7

0.8

0.9

1.0

THR (%)

qN

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = 1,006 – 0,003030x (r2 = 0,96 ; p < 0,01)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000.6

0.7

0.8

0.9

1.0

THR (%)

qN

(un

idad

es r

ela

tivas)

y = 1,041 – 0,003429x (r2 = 0,82 ; p < 0,01)

Page 99: Ricardo Filipe Duarte da Cruz InduçãoIndução e Recuperação ...repositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/1822/6200/1/Indu%C3%A7%C3%A3o... · Este trabalho teve como objectivo geral,

4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

81

Em todas as variedades, ETR diminui de forma mais acentuada que nos ensaios de

stresse lento. Mais uma vez, PB64 apresentou a variação mais acentuada, em oposição ao que

acontece às variedades PB260 e PB269 (Fig. 4.31). Estes dados indicam um cessar do

transporte da cadeia de electrões que poderá resultar de danos ao nível dos aceitadores de

electrões, ou ao nível do metabolismo fotossintético do carbono (Chaves e Oliveira, 2004).

Fig. 4.31 – Variação da taxa de transporte electrónico (ETR) em função do teor hídrico relativo

(THR), nas experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes

plantas.

AD3R

30 40 50 60 70 80 90 1000

30

60

90

120

150

THR (%)

ET

R (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

y = – 2,886 – 0,7005x + 0,02038x2 (r2 = 0,97 ; p < 0,05)

PB64

30 40 50 60 70 80 90 1000

30

60

90

120

150

THR (%)

ET

R (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

y = – 123,8 + 2,378x (r2 = 0,78 ; p < 0,01)

PB260

30 40 50 60 70 80 90 1000

30

60

90

120

150

THR (%)

ET

R (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

y = 61,64 – 1,652x + 0,02236x2 (r2 = 0,86 ; p < 0,05)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000

30

60

90

120

150

THR (%)

ET

R (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

y = – 50,24 + 1,403x (r2 = 0,94 ; p < 0,01)

PB304

30 40 50 60 70 80 90 1000

30

60

90

120

150

THR (%)

ET

R (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

y = 19,96 – 0,9623x + 0,02088x2 (r2 = 0,98 ; p < 0,05)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000

30

60

90

120

150

THR (%)

ET

R (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

y = – 89,68 + 2,229x (r2 = 0,87 ; p < 0,01)

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

82

Em resumo, nos ensaios de fluorescência modulada da clorofila a verificou-se uma

diminuição de vários parâmetros (ΦPSII, qP, ETR), aumento de uns (qN) e manutenção de

outros (Fv/Fm), alterações já referidas por outros autores (Mattos et al., 1999; Marques da

Silva, 1999; Maxwell e Johnson, 2000; Tezara et al., 2003).

Comparando os ensaios de stresse lento e de stresse rápido, verifica-se que os

parâmetros diminuem de forma mais marcante no stresse rápido. Tal facto, revela a rapidez da

resposta da planta, resultante da sensibilidade e/ou dano dos seus constituintes ao aumento do

stresse hídrico. A aclimatação da planta, durante o stresse lento, permite o estabelecimento de

formas de tolerância ao stresse hídrico, quer por reorientações nas vias de vários metabolitos,

quer pela expressão de chaperonas (Rizhsky et al., 2002; Sharp et al., 2004), o qual não é

possível no stresse rápido.

Também a área complemetar (normalizada) à fase rápida da curva de Kautsky, que

permite inferir sobre a dimensão do pool de quinonas (Lazár, 1999), sofreu um decréscimo

em ambos os tipos de stresse (Mattos et al., 1999). Desta forma, observa-se uma

sobrerredução das quinonas com a diminuição do THR que vai diminuir o transporte de

electrões (Chaves e Oliveira, 2004).

Além disso, observou-se um aumento de qN em quase todas as variedades, o que, em

conjunto com a diminuição dos outros parâmetros, permite inferir sobre a possibilidade de

existir dano em algum passo do metabolismo fotossintético do carbono, uma vez que o fluxo

de electrões foi desviado, quase na sua totalidade, para mecanismos de dissipação de energia

não-fotoquímicos.

No caso da variedade PB269, verificou-se que qN não sofreu alterações ao longo do

stresse lento, ao contrário do que se observou nos ensaios de stresse rápido. Esta variedade

poderá possuir outros mecanismos que lhe permitam proteger os fotossistemas de danos

provocados pela radiação luminosa, que não envolvam alterações de qN.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

83

4.4.4.4.4444. . . . ConclusõesConclusõesConclusõesConclusões

4.4.14.4.14.4.14.4.1. . . . Conclusões das Trocas GasosasConclusões das Trocas GasosasConclusões das Trocas GasosasConclusões das Trocas Gasosas

Relativamente às variedades analisadas, destacam-se as variedades AD3R, PB260 e

PB269 como aquelas que apresentam características de uma maior tolerância ao stresse

hídrico e a variedade PB369 como a que possui maiores dificuldades neste tipo de stresse.

A variedade AD3R apresenta uma WUE elevada, com A elevada perto da hidratação

total. No entanto, após a irrigação, embora tenha recuperado o THR, não conseguiu recuperar

A para os valores iniciais, antes de se ter iniciado o período de stresse.

A variedade PB260 apresenta um bom desempenho durante a imposição do stresse

lento moderado e intenso, tolerando THR baixos. No entanto, após irrigação, apresenta

dificuldades em recuperar, quer os valores de THR quer os valores de A, gs e E.

A variedade PB269 apresenta uma elevada WUE, A e gs durante o stresse lento e em

condições de ausência de stresse, demonstrando uma elevada produtividade, que se traduziu

em plantas de elevado porte. Após irrigação, apresenta uma boa recuperação dos parâmetros,

mesmo com THR inferiores aos registados na ausência de stresse.

Por outro lado, a variedade PB369 apresenta um mau desempenho durante a

imposição do stresse hídrico, com baixos valores de A e gs, e, após a irrigação, demonstra

uma má recuperação dos parâmetros avaliados.

4.4.4.4.4.24.24.24.2. . . . Conclusões da Fluorescência Modulada da Clorofila Conclusões da Fluorescência Modulada da Clorofila Conclusões da Fluorescência Modulada da Clorofila Conclusões da Fluorescência Modulada da Clorofila aaaa

A forma como as plantas responderam ao stresse rápido foi diferente da forma como

responderam ao stresse lento. Na primeira situação, a planta reage rapidamente e de forma

brusca às novas condições que lhe são impostas. Todas as variedades parecem reagir de uma

forma semelhante. Na segunda situação, a planta sofrendo um processo de adaptação,

passando por uma fase de aclimatação, variando os parâmetros de forma quase sempre mais

suave. Notam-se também maiores diferenças entre as variedades.

No primeiro caso é necessário uma reacção rápida e que é certamente resultante de

mecanismos constitutivos ou mesmo de danos, enquanto que, no segundo caso, a reacção ao

stresse lento vai resultar mais de mecanismos induzidos e de um efeito cumulativo.

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4. Fase I – Análise Preliminar de Seis Variedades Portuguesas de Milho

Stresse Hídrico e Recuperação do Stresse em Variedades Portuguesas de Milho

84

4.4.4.4.4.4.4.4.3.3.3.3. Conclusõe Conclusõe Conclusõe Conclusõessss da Fase I da Fase I da Fase I da Fase I

A avaliação de todos os parâmetros analisados permitiu a escolha das variedades que

mais se destacaram pelas suas respostas contrastantes ao stresse hídrico.

Por um lado, as variedades PB260 e PB269 mostraram ser as que melhor toleravam o

stresse hídrico, adaptando as trocas gasosas com a diminuição do THR e apresentando uma

redução progressiva dos parâmetros, nomeadamente a taxa fotossintética líquida e a

condutividade estomática, semelhante ao grupo de resposta ao stresse de tipo I (Lawlor e

Cornic, 2002). No entanto, uma vez que PB260 não recuperou no parâmetro da WUE optou-

se pela variedade PB269 como a mais tolerante ao stresse hídrico.

Por outro lado, a variedade PB369, demonstrou, desde cedo, ser a mais susceptível ao

stresse hídrico nas experiências de stresse lento, apresentando sintomas de dano a THR mais

elevados do que as restantes variedades. O comportamento desta variedade enquadra-se no

modelo referido neste trabalho como “tudo-ou-nada”, que consiste na manutenção dos

parâmetros até um valor crítico de THR, a partir do qual ocorria uma diminuição drástica

desses mesmos parâmetros, passando de um patamar de valores para outro, semelhante ao

grupo de resposta ao stresse de tipo II (Lawlor e Cornic, 2002). Também durante o período de

recuperação apresentou maiores dificuldades em regressar aos valores iniciais dos parâmetros

analisados. Por estas razões, foi seleccionada como a variedade mais susceptível ao stresse

hídrico.

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5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

85

5. Fase II 5. Fase II 5. Fase II 5. Fase II –––– Estudo Estudo Estudo Estudo ComparaComparaComparaComparativo Aprofundadtivo Aprofundadtivo Aprofundadtivo Aprofundado do do do dasasasas Duas Duas Duas Duas

Variedades Variedades Variedades Variedades Mais e Menos Susceptíveis Mais e Menos Susceptíveis Mais e Menos Susceptíveis Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídricoao Stresse Hídricoao Stresse Hídricoao Stresse Hídrico

5.1. Introdução5.1. Introdução5.1. Introdução5.1. Introdução

Nesta fase, pretendeu-se aprofundar o conhecimento das duas variedades

seleccionadas na fase I, PB269 e PB369.

Procedeu-se a uma série de experiências em que as trocas gasosas foram medidas

simultaneamente com a fluorescência modulada da clorofila a, nomeadamente as respostas a

diferentes intensidades luminosas e a diferentes concentrações de CO2 das duas variedades ao

longo do stresse hídrico. Foi ainda avaliada a libertação de O2 ao longo do stresse. As

actividades experimentais envolvendo estes factores foram apenas realizadas em condições de

stresse lento. Este tipo de ensaios tem uma duração demasiado longa para permitir a sua

utilização nos ensaios de stresse rápido, que levariam a uma perda de água demasiado rápida

para ser possível retirar qualquer tipo de conclusão.

Foram também avaliadas as actividades enzimáticas de enzimas chaves do

metabolismo do carbono e a quantificação de solutos compatíveis, como a prolina. Estes

parâmetros foram analisados nos dois tipos de stresse, de modo a avaliar possíveis diferenças.

5.2. Metodologia5.2. Metodologia5.2. Metodologia5.2. Metodologia

5.2.1. Material Vegetal5.2.1. Material Vegetal5.2.1. Material Vegetal5.2.1. Material Vegetal

Foram utilizadas as variedades de milho PB269 e PB369. As plantas foram obtidas

segundo o descrito em 3.1..

5.2.2. Relações Hídricas5.2.2. Relações Hídricas5.2.2. Relações Hídricas5.2.2. Relações Hídricas

5.2.2.1. Determinação do Teor Hídrico Relativo5.2.2.1. Determinação do Teor Hídrico Relativo5.2.2.1. Determinação do Teor Hídrico Relativo5.2.2.1. Determinação do Teor Hídrico Relativo da Folha da Folha da Folha da Folha

O THR foi determinado segundo o descrito em 3.3.1..

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5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

86

5.2.2.2. Determinação do Potencial Hídrico das Folhas5.2.2.2. Determinação do Potencial Hídrico das Folhas5.2.2.2. Determinação do Potencial Hídrico das Folhas5.2.2.2. Determinação do Potencial Hídrico das Folhas

O potencial hídrico das folhas foi determinado psicrometricamente, ao longo da

experiência de stresse lento, através do psicrómetro HR-33T (Wescor, Logan, USA),

equipado com câmaras C-52 (Wescor, Logan, USA) e ligado a um registador LKB REC101

(Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden).

Retirou-se da região analisada pelo IRGA e pelo fluorómetro, um disco de folha com 5

mm de diâmetro, tendo sido colocado no interior da câmara do psicrómetro, onde permaneceu

durante 30 minutos (tempo de equilíbrio). Durante este período de tempo, o potencial hídrico

da amostra vai entrar em equilíbrio com o da atmosfera da câmara, assumindo-se que a água

perdida pela amostra não é suficiente para afectar o potencial hídrico da folha (Marques da

Silva, 1999).

Nesta experiência foram utilizadas as mesmas plantas da experiência de determinação

das curvas A/PPFD (descritas em 5.2.3.1.).

5.2.2.3. 5.2.2.3. 5.2.2.3. 5.2.2.3. Estabelecimento de Estabelecimento de Estabelecimento de Estabelecimento de Curvas Pressão/VolumeCurvas Pressão/VolumeCurvas Pressão/VolumeCurvas Pressão/Volume

As curvas pressão/volume permitiram averiguar as relações hídricas em folhas das

variedades portuguesas PB269 e PB369 de milho não sujeitas a stresse hídrico, tendo sido

utilizado para tal o psicrómetro HR-33T (Wescor, Logan, USA), equipado com câmaras C-52

(Wescor, Logan, USA) e ligado a um registador LKB REC101 (Pharmacia LKB

Biotechnology AB, Uppsala, Sweden).

Cortaram-se folhas totalmente expandidas, dividindo-se em cinco fragmentos, cada

um pesado numa balança de precisão. Os fragmentos foram hidratados até à saturação,

flutuando-os em água destilada durante 12 horas, à temperatura ambiente e sob condições de

luminosidade reduzida.

Retirou-se de um dos fragmentos um disco com 5 mm de diâmetro (com a ajuda de um

furador) e colocou-se na câmara do psicrómetro, durante 30 minutos (tempo de equilíbrio). Os

restantes fragmentos foram colocados em contacto com a atmosfera do laboratório, em

processo de desidratação. De um dos fragmentos não se retiraram discos, tendo sido utilizado

como controlo para cálculo do THR (ver 3.3.1.), sendo pesado antes e após cada medição do

psicrómetro, assumindo-se como idêntico aos restantes fragmentos. Os parâmetros hídricos

foram calculados segundo Matos (1990).

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

87

5.2.3. Medição das Trocas Gasosas5.2.3. Medição das Trocas Gasosas5.2.3. Medição das Trocas Gasosas5.2.3. Medição das Trocas Gasosas

5.2.3.1. Curvas A/PPFD5.2.3.1. Curvas A/PPFD5.2.3.1. Curvas A/PPFD5.2.3.1. Curvas A/PPFD

Para observar a resposta das duas variedades a diferentes PPFD ao longo do stresse

lento, utilizou-se o IRGA de modelo LCPro+ (ADC – The Analytical Development Co., Ltd.,

Hoddesdon, England), em conjunto com o fluorómetro PAM 101 (Heinz Walz GmbH,

Effeltrich, Germany) (ver 5.2.4.).

Os ensaios com o IRGA LCPro+ foram realizados em condições semelhantes às

descritas anteriormente (ver 4.2.3.), à excepção da PPFD, fornecida por uma fonte de luz

externa KL1500 LCD (Schott AG, Mainz, Germany). As plantas foram ensaiadas a sete PPFD

diferentes (65, 100, 140, 200, 430, 720 e 1320 µmol fotões.m-2.s-1), sendo a primeira aplicada

por um período de 15 minutos e as seguintes por períodos de 9 minutos.

As plantas foram ensaiadas a cada 3 dias durante duas semanas, correspondendo ao

início, meio e fim do stresse, e ao meio e fim da recuperação.

Durante este ensaio foram recolhidas amostras das folhas analisadas para posterior

análise das actividades enzimáticas e solutos compatíveis, tendo sido congeladas em azoto

líquido e armazenadas numa arca congeladora a –70ºC (DLT-13V-85V12, Harris

Manufacturing, Co., Asheville, USA).

5.5.5.5.2.3.2. Curvas A/CO2.3.2. Curvas A/CO2.3.2. Curvas A/CO2.3.2. Curvas A/CO2222aaaa

Para observar a resposta das duas variedades a diferentes concentrações de CO2 ao

longo do stresse lento, utilizou-se o IRGA de modelo LCPro+ (ADC – The Analytical

Development Co., Ltd., Hoddesdon, England), em conjunto com o fluorómetro PAM 101

(Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany) (ver 5.2.4.).

Os ensaios com o IRGA LCPro+ foram realizados em condições semelhantes às

descritas anteriormente (ver 4.2.3.), à excepção da fonte de luz externa (KL1500 LCD, Schott

AG, Mainz, Germany) e das diferentes concentrações de CO2, controladas pelo próprio

IRGA. As plantas foram ensaiadas a seis concentrações de CO2 diferentes (100, 200, 370,

700, 1000 e 1400 ppm), iniciando-se nos 370 ppm, por um período de 15 minutos, e as

seguintes por períodos de 9 minutos. Inicialmente, a concentração ia aumentando até aos 1400

ppm, com posterior diminuição até aos 100 ppm.

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88

As plantas foram ensaiadas a cada 3 dias durante duas semanas, correspondendo ao

início, meio e fim do stresse, e ao meio e fim da recuperação.

Durante este ensaio, foram recolhidos fragmentos de material vegetal para

determinação da libertação de O2 (ver 5.2.3.3.).

As limitações estomáticas (Ls) e não-estomáticas (Lns) foram determinadas utilizando a

equação Ls = 100 × (A0 – A) / A0, em que A0 é a taxa fotossintética medida a Ci de 370 ppm e

A é a taxa fotossintética medida a CO2a de 370 ppm, e a equação Lns = 100 × (AC – AS) / AC,

em que AC é a taxa fotossintética de folhas controlo para Ci de 800 ppm e AS é a taxa

fotossintética de folhas sujeitas a stresse hídrico para Ci de 800 ppm (Jones, 1985; Geber e

Dawson, 1997; Tezara et al., 2003).

5.2.3.3. Determinação da Libertação de O5.2.3.3. Determinação da Libertação de O5.2.3.3. Determinação da Libertação de O5.2.3.3. Determinação da Libertação de O2222

A libertação de O2 foi efectuada sob condições saturantes de CO2 (aproximadamente

7%) recorrendo a um eléctrodo de fase gasosa (LD2, Hansatech Instruments Ltd., Norfolk,

UK) à temperatura controlada de 25ºC e sob uma PPFD de 850 µmol fotões.m-2.s-1 fornecida

por uma fonte luminosa (LS2, Hansatech Instruments Ltd., Norfolk, UK). Foram recolhidas

porções da folha analisada, ao longo do período de stresse lento, de modo a preencher a

câmara do eléctrodo. O peso fresco foi determinado numa balança de precisão (BP 210D,

Sartorius, Goettingen, Germany) e a área num medidor de áreas (CI-202 Portable Leaf Area

Meter, CID, Inc., Camas, Washington, USA). Nesta experiência foram utilizadas as mesmas

plantas do ensaio da determinação das curvas A/CO2a (descritas em 5.2.3.2.).

5.2.4. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofila5.2.4. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofila5.2.4. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofila5.2.4. Medição da Fluorescência Modulada da Clorofila aaaa

A medição da fluorescência modulada da clorofila a foi efectuada recorrendo ao

fluorómetro PAM 101 (Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany).

A medição da razão Fv/Fm foi determinada aplicando um pulso de luz saturante

(KL2500 LCD, Schott AG, Mainz, Germany), após as folhas estarem 10 minutos na

escuridão.

No ensaio das curvas A/PPFD, após a última PPFD, a luz era desligada e iniciava-se

uma série de pulsos saturantes no escuro. Durante 4 minutos aplicou-se os pulsos com

intervalos de tempo de 40 segundos, durante os 10 minutos seguintes com intervalos de 100

segundos e durante os últimos 5 minutos com intervalos de 200 segundos. O amortecimento

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de alta energia (qE), o amortecimento da transição de estado (qT) e o amortecimento

fotoinibitório (qI) foram calculados segundo Quick e Stitt (1989).

5.5.5.5.2.5. Determinação de Clorofilas e Carotenóides2.5. Determinação de Clorofilas e Carotenóides2.5. Determinação de Clorofilas e Carotenóides2.5. Determinação de Clorofilas e Carotenóides

Na determinação de clorofilas e carotenóides foram utilizados os fragmentos de folha

provenientes dos ensaios de determinação da libertação de O2 (ver 5.2.3.3.).

Os fragmentos de folha foram colocados em tubos de ensaio contendo 10 ml de

metanol absoluto, durante 72 horas, período necessário à extracção dos pigmentos das folhas.

As amostras foram lidas nos comprimentos de onda 470 nm, 652 nm e 665 nm num

espectrofotómetro UV500 UV-Visible Spectro (Unicam, Waltham, USA), contra um branco

de metanol absoluto.

Para a determinação da quantidade de clorofilas (Ca, Cb, Ca+b) e carotenóides (Cx+c)

foram utilizadas as seguintes equações (Lichtenthaler, 1987):

Ca = 16,72 × A665 – 9,16 × A652

Cb = 34,09 × A652 – 15,28 × A665

Ca+b = 1,44 × A665 + 24,93 × A652

Cx+c = (1000 × A470 – 1,63 × Ca – 104,96 × Cb) / 221

5.2.6. Determinação de Actividades Enzimáticas5.2.6. Determinação de Actividades Enzimáticas5.2.6. Determinação de Actividades Enzimáticas5.2.6. Determinação de Actividades Enzimáticas

Nesta fase do trabalho experimental foram avaliadas as actividades de três enzimas

fundamentais no metabolismo fotossintético do carbono das duas variedades de milho: as

duas enzimas carboxilativas fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC) e a ribulose-1,5-bisfosfato

carboxilase/oxigenase (RuBisCO) e uma descarboxilativa, a enzima málica dependente de

NADP (EM-NADP).

Para além do ensaio de stresse lento, foi também realizado um ensaio de stresse rápido

(ver 3.2.), durante o qual foram recolhidas amostras das folhas analisadas para posterior

análise das actividades enzimáticas.

Todas as amostras foram congeladas em azoto líquido e armazenadas numa arca

congeladora a –70ºC (DLT-13V-85V12, Harris Manufacturing, Co., Asheville, USA).

As actividades enzimáticas foram determinadas à temperatura de 25ºC ± 1ºC, devido

ao facto de ter sido esta a temperatura de crescimento das plantas.

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90

5.2.6.1. Extracção5.2.6.1. Extracção5.2.6.1. Extracção5.2.6.1. Extracção

As enzimas estudadas foram extraídas do material vegetal num extracto comum. O

material vegetal foi recolhido durante a experiência de stresse lento para determinação das

curvas A/PPFD e durante as experiências de stresse rápido da fase II.

O meio de extracção foi adaptado de Edwards et al. (1988), sendo composto por

HEPES-KOH 50 mM pH 7,3, DTT 10 mM, EDTA 1 mM, PVP25 5% (m/v), Polyclar AT 1%

(m/v), PEG4000 6% (m/v), Triton X-100 0,5 % (v/v) e cocktail de inibidores de proteases 1%

(v/v) (Sigma). Foi utilizado uma proporção de 20 ml de meio de extracção para cada 1 g de

material vegetal para as amostras com THR superior a 70% e uma proporção de 30 ml de

meio de extracção para cada 1 g de material vegetal para as amostras com THR inferior a

70%. As folhas foram esmagadas muito rapidamente num almofariz gelado com metade do

meio de extracção a adicionar e uma pequena porção de areia de quartzo. Adicionou-se a

outra metade do meio de extracção e transferiu-se o extracto para tubos Eppendorf gelados.

Centrifugou-se durante 5 minutos a uma temperatura de 4ºC à velocidade de 13.500 g na

centrífuga Sigma 2-16K (Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Germany).

Recuperou-se o sobrenadante e conservou-se em gelo até à determinação das actividades

enzimáticas.

5.2.6.2. 5.2.6.2. 5.2.6.2. 5.2.6.2. RibuloseRibuloseRibuloseRibulose----1,51,51,51,5----Bisfosfato Carboxilase/Oxigenase (Bisfosfato Carboxilase/Oxigenase (Bisfosfato Carboxilase/Oxigenase (Bisfosfato Carboxilase/Oxigenase (RuBisCORuBisCORuBisCORuBisCO))))

Na RuBisCO, foram determinadas as actividades inicial e total através da incorporação

de carbono radioactivo (14C), segundo Perchorowicz et al. (1982). O meio para realizar o

ensaio enzimático era composto por HEPES-KOH 50 mM pH 8,0 contendo MgCl2 30 mM e

NaH14CO3 10 mM. Na determinação da actividade inicial, colocaram-se 500 µl de meio de

ensaio juntamente com 50 µl de RuBP 6m M. Adicionaram-se 50 µl de extracto e após 1

minuto a reacção foi parada com 100 µl de HCl 2N. Para a determinação da actividade total,

colocaram-se 500 µl de meio de ensaio com 50 µl de extracto. Após 3 minutos de activação,

adicionaram-se 50 µl de RuBP 6 mM. A reacção foi parada de modo idêntico, ao fim de 1

minuto. As amostras foram transferidas para uma estufa a 80ºC. Após a evaporação de todo o

meio, o resíduo foi dissolvido em 1 ml de água ultra-pura. Adicionaram-se 8 ml de líquido de

cintilação (Ready Safe, Beckman, USA) aos frascos, tendo sido lidos num espectrómetro de

cintilação LS 7800 (Beckman Instruments Inc., Fullerton, USA).

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5.2.6.3. 5.2.6.3. 5.2.6.3. 5.2.6.3. Fosfoenolpiruvato Carboxilase (PEPC)Fosfoenolpiruvato Carboxilase (PEPC)Fosfoenolpiruvato Carboxilase (PEPC)Fosfoenolpiruvato Carboxilase (PEPC)

Na enzima PEPC foi determinada a actividade em condições fisiológicas e a

actividade máxima, adaptada a partir da metodologia de Donkin e Martin (1980).

A actividade em condições fisiológicas foi determinada num meio composto por

HEPES-KOH 50 mM pH 7,2, MgCl2 10 mM, NaHCO3 10 mM, PEP 2,5 mM e 12 unidades

de malato desidrogenase (MDH), utilizando-se 20 µl de extracto. A reacção foi iniciada com

20 µl de NADH 10 mM. A actividade foi determinada a um comprimento de onda de 340 nm

no espectrofotómetro UV500 UV-Visible Spectro (Unicam, Waltham, USA), com agitação.

A actividade máxima foi determinada de modo semelhante, utilizando um meio

composto por HEPES-HOH 50 mM pH 8,0 e PEP 10 mM, mantendo-se as restantes

condições.

5.2.6.4. 5.2.6.4. 5.2.6.4. 5.2.6.4. Enzima Málica DEnzima Málica DEnzima Málica DEnzima Málica Dependente de NADP (EMependente de NADP (EMependente de NADP (EMependente de NADP (EM----NADP)NADP)NADP)NADP)

Na EM-NADP apenas foi determinada a actividade máxima, segundo o descrito em

Simon (1987).

A actividade máxima foi determinada num meio composto por HEPES-KOH 50 mM

pH 8,0, MgCl2 30 mM, DTT 2,5 mM e L-malato 10 mM, utilizando-se 50 µl de extracto. A

reacção foi iniciada com 20 µl de NADP+ 25 mM. A actividade foi determinada a um

comprimento de onda de 340 nm no espectrofotómetro UV500 UV-Visible Spectro (Unicam,

Waltham, USA), com agitação.

5.2.7. Quantificação de Proteína Solúvel5.2.7. Quantificação de Proteína Solúvel5.2.7. Quantificação de Proteína Solúvel5.2.7. Quantificação de Proteína Solúvel

A quantificação da proteína solúvel foi determinada pelo método de Bradford (1976),

utilizando placas de ELISA, tendo sido lidas no espectrofotómetro MPRA4 Microplate reader

(DuPont, Newton, USA). A recta de calibração foi efectuada utilizando BSA. Esta

quantificação permitiu expressar as actividades enzimáticas por unidade de proteína solúvel.

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92

5.2.8. Qua5.2.8. Qua5.2.8. Qua5.2.8. Quantificação de Solutos Compatíveisntificação de Solutos Compatíveisntificação de Solutos Compatíveisntificação de Solutos Compatíveis

A quantificação de solutos compatíveis, em particular a prolina (Živković et al., 2005),

foi efectuada nas amostras recolhidas nos ensaios de stresse lento para determinação das

curvas A/PPFD e num ensaio independente de stresse lento. Foi também realizado um ensaio

de stresse rápido (ver 3.2.), durante o qual foram recolhidas amostras para posterior análise.

As amostras foram congeladas em azoto líquido e armazenadas a –70ºC numa arca

congeladora (DLT-13V-85V12, Harris Manufacturing, Co., Asheville, USA).

5.2.8.1. Extracção5.2.8.1. Extracção5.2.8.1. Extracção5.2.8.1. Extracção

As amostras recolhidas durante os ensaios foram maceradas num almofariz arrefecido

em azoto líquido. Adicionou-se 5 ml de etanol 85% (v/v) e verteu-se o extracto para um

gobelé, onde permaneceu durante 30 minutos. Filtrou-se o extracto e recolheu-se num tubo de

ensaio.

5.2.8.2. Quantificação de Aminoácidos Livres e Prolina5.2.8.2. Quantificação de Aminoácidos Livres e Prolina5.2.8.2. Quantificação de Aminoácidos Livres e Prolina5.2.8.2. Quantificação de Aminoácidos Livres e Prolina

Antes do início dos ensaios de quantificação de aminoácidos livres e de prolina, foram

realizadas várias curvas de calibração utilizando soluções de L-leucina (Fluka, Sigma-

Aldrich, Germany) e L-prolina (Fluka, Sigma-Aldrich, Japan) em etanol 85% (v/v), com

concentrações entre 0 e 200 µg.ml-1.

Para a quantificação dos aminoácidos livres e de prolina nas amostras adicionou-se em

tubos Eppendorf 200 µl de extracto, 500 µl de tampão citrato 0,2 M (pH 5,0) contendo

SnCl2.H2O 0,75 mM e 500 µl de solução 4% ninidrina (Fluka, Sigma-Aldrich, Chec

Republic) em etilenoglicol. Foram realizadas três réplicas para cada amostra. Agitaram-se os

tubos no vórtex e colocaram-se num banho de água a ferver durante 20 minutos, tendo o

cuidado de fechar apenas parcialmente as tampas (de modo, a não aumentar demasiado a

pressão dos tubos). Arrefeceram-se os tubos em gelo e diluíram-se as amostras em 5 ml de

água-propanol 1:1 (v/v). Após 15 minutos, leu-se a absorvância das amostras no comprimento

de onda 570 nm para os aminoácidos livres e 440 nm para a prolina, num espectrofotómetro

UV-Visible 1-E Cary (Cary System, Varian Inc., Palo Alto, USA) utilizando o sistema Cary

System (Software Issue v3.01, Instrument Software Issue v4.00, Varian Inc., Palo Alto, USA).

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5.3. Resultados e Discussão5.3. Resultados e Discussão5.3. Resultados e Discussão5.3. Resultados e Discussão

5.3.1. Relações Hídricas5.3.1. Relações Hídricas5.3.1. Relações Hídricas5.3.1. Relações Hídricas

O potencial hídrico (Ψw) das folhas foi seguido ao longo da experiência de stresse

lento (Fig. 5.1). A variedade PB269 apresentou valores de cerca de −0,7 MPa perto da

hidratação total, e a variedade PB369 valores de cerca −1,5 MPa. Nesta última, o valor

reduzido de Ψw perto da hidratação total estará relacionado com as propriedades da parede

celular, nomeadamente paredes mais rígidas (maior módulo de elasticidade) com menor

capacidade de manter água ligada nas folhas (Marshall e Dumbroff, 1999).

Na variedade PB269, observa-se uma diminuição mais suave do Ψw até −2 MPa (para

THR de cerca de 55%), à medida que o THR diminui, do que na variedade PB369. Nesta

última, há uma manutenção do Ψw em torno dos −2 MPa até THR de cerca de 70%, ocorrendo

depois uma diminuição brusca deste parâmetro. As plantas da variedade PB269 apresentam

valores de cerca de −5 MPa no final do período de stresse, correspondente a THR de 35%. A

variedade PB369 atingiu valores de Ψw de −6,5 MPa a THR muito baixos (cerca de 20%).

Estas plantas não sobreviveram e a recuperação foi realizada nas restantes plantas que

apresentavam THR de cerca de 30% no final do período de stresse.

Fig. 5.1 – Variação do potencial hídrico das folhas (Ψw) em função do teor hídrico relativo (THR),

ao longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de diferentes

plantas.

PB269

20406080100

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

THR (%)

ΨΨ ΨΨw

(MP

a)

Stresse (∆; - -): y = – 9,851 + 0,1808x – 0,0009349x2

(r2 = 0,89 ; p < 0,05)

Recuperação (�)

PB369

20406080100

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

THR (%)

ΨΨ ΨΨw

(MP

a)

Stresse (∆; - -): y = – 8,954 + 0,1293x – 0,0005534x2

(r2 = 0,97 ; p < 0,05)

Recuperação (�; –): y = – 10,33 + 0,197x – 0,001066x2

(r2 = 0,95 ; p < 0,05)

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O período de recuperação do stresse foi efectuado com a câmara climatizada a cerca de

38ºC(1), o que se traduziu em THR mais baixos e que não excederam os 75-80%, o que, no

caso da variedade PB269 se traduziu numa incapacidade de recuperar o Ψw para valores

próximos dos inicias, apresentando um Ψw de −2 MPa para um THR de 75%.

Na Fig. 5.2 está representada a variação do Ψw em função do THR, para folhas

destacadas de plantas bem irrigadas (ver 5.2.2.3).

Fig. 5.2 – Variação do potencial hídrico das folhas (Ψw) em função do teor hídrico relativo (THR),

para folhas destacadas de plantas bem irrigadas. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes

plantas.

Perto da hidratação total, as duas variedades apresentam valores de Ψw de

aproximadamente – 0,8 MPa. No caso da variedade PB369, este valor é superior ao observado

no ensaio de stresse lento, dado que as folhas estiveram, durante a noite, a flutuar em água

destilada e em condições de baixa luminosidade, garantindo um maior Ψw perto da hidratação

total. A variedade PB269 não apresentou quaisquer diferenças significativas em relação ao

método anterior.

A partir deste ponto, verifica-se, em ambas as variedades, uma diminuição do Ψw com

o THR, embora a variedade PB269 consiga manter o seu Ψw em cerca de – 2,5 MPa para um

THR de 45%, enquanto que na variedade PB369, e para o mesmo THR, o Ψw diminui até

cerca de – 4 MPa.

A partir da Fig. 5.2, construíram-se as curvas pressão-volume da Fig. 5.3.

PB269

405060708090100

-4

-3

-2

-1

0

THR (%)

ΨΨ ΨΨw

(MP

a)

y = – 3,633 + 0,02748x (r2 = 0,59 ; p < 0,01)

PB369

405060708090100

-4

-3

-2

-1

0

THR (%)

ΨΨ ΨΨw

(MP

a)

y = – 5,951 + 0,05354x (r2 = 0,77 ; p < 0,01)

(1) Resultado de uma avaria da câmara climatizada.

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95

Fig. 5.3 – Curvas pressão-volume de folhas destacadas de plantas bem irrigadas, construídas a

partir da Fig. 5.2.

A partir da Fig. 5.3 foi possível obter os valores de diversos parâmetros hídricos

apresentados na Tabela 5.1.

Tabela 5.1 – Parâmetros hídricos de folhas destacadas de plantas bem irrigadas, nas duas

variedades portuguesas de milho.

Embora não tenha sido possível, por insuficiência de material vegetal disponível,

realizar curvas independentes, inviabilizando, portanto, uma validação estatística, a criação de

uma curva única com os dados das folhas utilizadas permite fazer uma avaliação dos

parâmetros hídricos nas duas variedades portuguesas de milho. A variedade PB369 atinge a

perda de turgescência a THR superiores (79%) quando comparada com a variedade PB269

(72%). O valor de THR para a perda de turgescência observado na variedade PB369 é

próximo do observado para o feto Ceratopteris richardii (81%), uma planta característica de

locais húmidos (Augé et al., 1989). Por outro lado, a variedade PB269 apresenta um valor

próximo do observado para a gramínea Seratia sphacelata (68%) (Marques da Silva, 1999),

indicada como apresentando um bom comportamento em stresse hídrico moderado. Deste

modo, a variedade PB269 apresenta, na turgescência máxima, um potencial osmótico

ligeiramente mais elevado que na variedade PB369, o mesmo acontecendo no ponto de perda

PB269

4050607080901000.0

0.5

1.0

1.5

THR (%)

1/ ΨΨ ΨΨ

w

(-M

Pa)

y = 1,491 – 0,04241x + 0,0004196x2 (r2 = 0,74 ; p < 0,05)

PB369

4050607080901000.0

0.5

1.0

1.5

THR (%)

1/ ΨΨ ΨΨ

w

(-M

Pa)

y = 1,423 – 0,04319x + 0,0004190x2 (r2 = 0,81 ; p < 0,05)

Parâmetro hídrico PB269 PB369

Potencial osmótico à turgescência máxima (Ψπo) (MPa) - 0,91 - 1,11

Potencial osmótico no ponto de perda de turgescência (Ψπtlp) (MPa) - 1,67 - 2,00

Teor hídrico relativo no ponto de perda de turgescência (THRtlp) (%) 72 79

Módulo de elasticidade à turgescência máxima (εo) (MPa) 0,76 0,89

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

96

de turgescência, o que poderá indicar uma melhor adaptação da variedade PB269, em caso de

ocorrência de stresse hídrico, uma vez que possui uma maior capacidade “tampão” do seu

sistema.

Por outro lado, verifica-se um valor de módulo de elasticidade inferior na variedade

PB269 (0,76 MPa), indicando uma parede mais elástica. Estes dados indicam que a variedade

PB269 apresenta uma melhor capacidade de manter a turgescência das suas células, facto

observado em espécies de locais mais secos (Lamberts et al., 1998).

Estes dados estão de acordo com os valores observados de fotossíntese durante os

ensaios. De facto, uma vez que PB269 mantém a turgescência a THR mais reduzidos, apesar

de um maior potencial osmótico e uma maior elasticidade da parede, o metabolismo

fotossintético do carbono poderá manter-se num nível superior ao de PB369, uma vez que a

ultraestrutura das células da folha e a das próprias enzimas sofrerão menor alteração para

THR mais reduzidos.

5.3.2. Trocas Gasosas5.3.2. Trocas Gasosas5.3.2. Trocas Gasosas5.3.2. Trocas Gasosas

Nestes ensaios procedeu-se à avaliação do efeito do stresse hídrico nas trocas gasosas

em diferentes condições de PPFD e CO2 ambiente.

5.3.2.15.3.2.15.3.2.15.3.2.1.... Curvas A/PPFD Curvas A/PPFD Curvas A/PPFD Curvas A/PPFD

Na Fig. 5.4 está representada a variação da taxa fotossintética líquida (A) em função

da PPFD, para diferentes THR.

Os valores baixos de A em condições controlo de hidratação não limitante,

comparativamente aos observados por Maroco et al. (1999), poderão estar relacionados com

as condições de crescimento, uma vez que o milho é uma planta que está adaptada a elevada

radiação, apresentando normalmente valores superiores de A. No entanto, as câmaras

climatizadas não permitiram a obtenção de valores de PPFD superiores a 500 µmol fotões.m-

2.s-1, condições semelhantes às utilizadas por Fracheboud et al. (1999), onde o milho

apresenta valores de A idênticos. Também Maroco et al. (1998) obteve taxas fotossintéticas

de cerca de 15 µmol CO2.m-2.s-1, em plantas de Amaranthus edulis (planta C4) crescidas em

PPFD de 600 µmol fotões.m-2.s-1, tal como observado na gramínea Setaria sphacelata

(Marques da Silva, 1999).

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

97

Fig. 5.4 – Variação da taxa fotossintética líquida (A) em função da densidade de fluxo fotónico

fotossintético (PPFD), ao longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5

folhas de diferentes plantas.

Perto da hidratação total, ambas as variedades apresentam um perfil semelhante da

variação da A com a PPFD. Verifica-se uma certa diminuição na taxa fotossintética líquida a

partir de PPFD de cerca de 1000 µmol fotões.m-2.s-1, valor em que se atinge a A máxima. Este

valor também é inferior ao registado por outros autores no milho (Maroco et al., 1999;

Leakey et al., 2006), e provavelmente deve-se, como já foi referido, às relativamente baixas

condições de PPFD (para plantas C4) permitidas pela câmara climatizada, durante o

crescimento das plantas.

No entanto, com a diminuição do THR começam a surgir diferenças. Com um THR de

cerca de 70%, PB269 sofreu apenas uma redução de cerca de 50% da A líquida, enquanto que

na variedade PB369, em THR de cerca de 80%, a A praticamente se anulou. Tal facto poderá

PB269 Stresse

250 500 750 1000 1250 1500

-5

0

5

10

15

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

THR = 97,8±1,0 (�;–): y = 8464 * ((1 – exp (– 0,024x / 8464)) *

exp (– 8,606x / 8464) (r2 = 0,94 ; p < 0,05)

THR = 68,8±14,9 (�;- -): y = 927,7 * ((1 – exp (– 0,006057x /

927,7)) * exp (– 0,4687x / 927,7) (r2 = 0,76 ; p < 0,05)

THR = 37,0±3,2 (∆)

PB369 Stresse

250 500 750 1000 1250 1500

-5

0

5

10

15

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

THR = 94,6±2,0 (�;–): y = 17245 * ((1 – exp (– 0,02035x /

17245)) * exp (– 16,53x / 17245) (r2 = 0,94 ; p < 0,05)

THR = 83,5±11,4 (�)

THR = 26,7±11,2 (∆)

PB269 Recuperação

250 500 750 1000 1250 1500

-5

0

5

10

15

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

THR = 76,8±3,2 (�;–): y = 577,9 * ((1 – exp (– 0,005362x / 577,9))

* exp (– 0,5673x / 577,9) (r2 = 0,80 ; p < 0,05)

THR = 76,1±5,7 (�;- -): y = 391,6 * ((1 – exp (– 0,002228x /

391,6)) * exp (– 0,1935x / 391,6) (r2 = 0,62 ; p < 0,05)

THR = 37,0±3,2 (∆)

PB369 Recuperação

250 500 750 1000 1250 1500

-5

0

5

10

15

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

A (

µµ µµm

ol

CO

2.m

-2.s

-1)

THR = 73,9±1,4 (�;–): y = 633,9 * ((1 – exp (– 0,006780x / 633,9))

* exp (– 0,4205x / 633,9) (r2 = 0,77 ; p < 0,05)

THR = 74,0±16,0 (�;- -): y = 465,1 * ((1 – exp (– 0,003429x /

465,1)) * exp (– 0,2533x / 465,1) (r2 = 0,70 ; p < 0,05)

THR = 26,7±11,2 (∆)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

98

estar relacionado com problemas a diversos níveis, como no fecho estomático, na diminuição

da eficiência do transporte de electrões ou nas enzimas do metabolismo do carbono (Flexas e

Medrano, 2002).

A utilização do modelo de Platt et al. (1980) (y = Ps × (1 – e (-αx/Ps)) × e (-βx/Ps)), permite

adaptar uma curva de saturação luminosa que apresenta fotoinibição. Através deste modelo é

possível determinar o parâmetro Ps (que representa o valor de fotossíntese potencial máximo

caso não houvesse fotoinibição [β = 0]), o parâmetro α (eficiência fotossintética, que

caracteriza as reacções fotoquímicas da fotossíntese e se mede a baixas PPFD), e o parâmetro

β (que caracteriza o processo de fotoinibição). Para determinar a capacidade fotossintética

(Amáx) utilizou-se a equação Amáx = Ps × (α/(α+β) × (β/(α+β)β/α). Apresentam-se na Tabela

5.2 os parâmetros estimados pela aplicação deste modelo na Fig. 5.4.

Tabela 5.2 – Parâmetros da equação de Platt et al. (1980), resultantes da aplicação do modelo à

Fig. 5.4, nas duas variedades portuguesas de milho.

PB269 PB369 Stresse Stresse

THR (%) THR (%)

Parâmetros 97,8 ± 1,0 68,8 ± 14,9 37,0 ± 3,2 94,6 ± 2,1 83,5 ± 11,4 26,7 ± 11,2

Amáx (µmol CO2.m

-2.s-1) 8,88 ± 2,12 4,38 ± 1,11 - 7,18 ± 2,85 - -

αααα ((((µmol CO2 / µmol fotões)

0,024 ± 0,006 0,006 ± 0,000 - 0,019 ± 0,011 - -

ββββ ((((µmol CO2 / µmol fotões)

8,606 ± 2,202 0,469 ± 0,282 - 16,53 ± 1,34 - -

Recuperação Recuperação

THR (%) THR (%)

Parâmetros 37,0 ± 3,2 76,1 ± 5,7 76,8 ± 3,2 26,7 ± 11,2 74,0 ± 16,0 73,9 ± 1,4

Amáx (µmol CO2.m

-2.s-1) - 1,65 ± 0,71 2,00 ± 0,99 - 2,30 ± 0,14 3,73 ± 0,87

αααα ((((µmol CO2 / µmol fotões)

- 0,002 ± 0,002 0,005 ± 0,004 - 0,003 ± 0,001 0,007 ± 0,003

ββββ ((((µmol CO2 / µmol fotões)

- 0,194 ± 0,594 0,567 ± 0,001 - 0,253 ± 0,245 0,421 ± 0,325

Observam-se valores de Amáx de cerca de 8,9 µmol CO2.m-2.s-1, para PB269, e de cerca

de 7,2 µmol CO2.m-2.s-1, para PB369, perto da hidratação total. Perto do THR de 70%, a

variedade PB269 ainda apresenta uma Amáx de cerca de 4,4 µmol CO2.m-2.s-1, enquanto a

variedade PB369, embora não tenha sido possível aplicar o modelo de Platt et al. (1980) no

ponto de THR de cerca de 85%, não apresenta uma Amáx superior a 2 µmol CO2.m-2.s-1,

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

99

estimado por análise directa dos pontos obtidos. Relativamente ao valor de β, observa-se que

ocorre uma maior fotoinibição na variedade PB369, quando comparada com a variedade

PB269, perto da hidratação total. Com o stresse hídrico, aparentemente o efeito da

fotoinibição diminui na variedade PB269, mas tal deve-se ao facto de ocorrerem outros danos

e/ou alterações metabólicas que provocam uma diminuição de Amáx. Relativamente aos

valores de α, não são estatisticamente diferentes entre as duas variedades, quer durante o

stresse quer durante a recuperação, embora em PB269, ao longo do stresse, se observe uma

diminuição deste parâmetro, que se mantém inalterado durante a recuperação. Na variedade

PB369, também existe uma redução de α, na recuperação, relativamente ao valor inicial.

Estes dados indicam uma perda da eficiência fotossintética com a imposição do stresse

hídrico.

No caso da variedade PB369, na segunda medição (THR de cerca de 85%) durante o

processo de indução do stresse e também nas últimas medições do período de stresse das duas

variedades, o modelo de Platt et al. (1980) não pôde ser aplicado, por não ser estatisticamente

significativo.

Após a irrigação, devido à alteração das condições de crescimento decorrente da

avaria da câmara de crescimento, ambas as variedades apresentaram um baixo nível de

recuperação da A, verificando-se um aumento progressivo da fotoinibição nas duas

variedades.

Na Fig. 5.5 está representada a variação da condutância estomática (gs) com a PPFD,

para diferentes THR.

Na hidratação total, ambas as variedades apresentam um perfil semelhante,

aumentando gs de 0,03 mol.m-2.s-1, em PPFD mais baixos, até cerca de 0,1 mol.m-2.s-1, para

PPFD de 750 µmol fotões.m-2.s-1, a partir do qual se mantém relativamente constante na

variedade PB369, mas continuando a aumentar até 0,13 mol.m-2.s-1, na variedade PB269.

À medida que o THR diminui, verifica-se uma diminuição de gs para valores de 50-

60% dos iniciais. PB369, com THR de cerca de 85%, apresenta valores semelhantes aos de

PB269 com THR de 70%. Desta forma, a diminuição de A verificada para PB369 na Fig. 5.4

não será (principalmente) consequência de limitações estomáticas, as quais estão descritas

como as principais responsáveis pela diminuição de A para stresse hídrico baixo a moderado

(Flexas e Medrano, 2002), uma vez que para o mesmo valor de THR, as duas variedades

apresentam valores semelhantes de gs, mas valores diferentes de A, o que implica uma

alteração ou da componente fotoquímica ou das enzimas do metabolismo fotossintético do

carbono.

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

100

Para valores de THR de 25-35% (stresse intenso), os estomas estão praticamente

fechados, apresentando as duas variedades uma gs praticamente nula.

Fig. 5.5 – Variação da condutância estomática (gs) em função da densidade de fluxo fotónico

fotossintético (PPFD), ao longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de

diferentes plantas.

Após a irrigação, ambas as variedades vão apresentando valores progressivamente

superiores aos observados no final do período de stresse, e quando atingem THR de cerca de

75%, a variedade PB269 apresenta valores ligeiramente inferiores aos iniciais e a variedade

PB369 apresenta valores superiores aos iniciais, antes do início do stresse hídrico. Tal facto

PB269 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.1

0.2

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

THR = 97,8±1,0 (�;–): y = 0,02784 + 0,0001863x – 8,3951-8x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 68,8±14,9 (�;- -): y = 0,008359 + 0,000119x – 5,6e-8x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 37,0±3,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,01291 + 0,00001405x

(r2 = 0,94 ; p < 0,01)

PB369 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.1

0.2

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

THR = 94,6±2,0 (�;–): y = 0,00526 + 2,4681e-5x + 1,7723e-8x2

(r2 = 0,96 ; p < 0,01)

THR = 83,5±11,4 (�;- -): y = 0,01576 + 5,4562e-5x – 2,07e-8x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 26,7±11,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,01574 – 0,00001067x

(r2 = 0,92 ; p < 0,01)

PB269 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.1

0.2

PPFD (µµµµmol fotões.m-2

.s-1

)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

THR = 76,8±3,2 (�;–): y = 0,06259 + 8,3068e-5x – 3,1858e-8x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 76,1±5,7 (�;- -): y = 0,03836 + 7,08e-5x – 2,7426e-8x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 37,0±3,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,01291 + 0,00001405x

(r2 = 0,94 ; p < 0,01)

PB369 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.1

0.2

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

THR = 73,9±1,4 (�;–): y = 0,07203 + 9,0429e-5x – 3,3782e-8x2

(r2 = 0,98 ; p < 0,05)

THR = 74,0±16,0 (�;- -): y = 0,04177 + 7,085e-5x – 2,751e-8x2

(r2 = 0,99 ; p < 0.01)

THR = 26,7±11,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,01574 – 0,00001067x

(r2 = 0,92 ; p < 0,01)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

101

vem reforçar a ideia de limitação não-estomática da fotossíntese visível no período de

recuperação (Fig. 5.4). Verifica-se também que para PPFD mais baixos, durante a

recuperação, as duas variedades apresentam valores de gs superiores aos observados quer na

ausência de stresse, quer durante a imposição do stresse, o que poderá ser produto de um

aumento da sensibilidade à luz, no controlo estomático (Aphalo e Sánchez, 1986).

Na Fig. 5.6 está representada a variação da taxa transpiratória (E) em função da PPFD,

para diferentes THR.

Nas duas variedades observa-se uma baixa E para valores de PPFD reduzidos,

aumentando até cerca de 1,5 mmol.m-2.s-1, em PB269, e 1,3 mmol.m-2.s-1, em PB369, para

PPFD de cerca de 500 µmol fotões.m-2.s-1, a partir do qual E se mantém relativamente

constante para a variedade PB369, mas continua a aumentar para PB269 até 1350 µmol

fotões.m-2.s-1. Esta evolução de E vai acompanhando a evolução de gs (Fig. 5.5).

Perto da hidratação total, verifica-se que, em PB269, a E é sempre superior à de

PB369, para qualquer valor de PPFD. À medida que o THR diminui, também E vai sendo

afectado nas duas variedades, apresentando uma variação relativa semelhante, mas é em

PB369 que ocorre a maior diminuição em valores absolutos, uma vez que, a THR de cerca de

70%, a variedade PB269 apresenta uma E de 1 mmol.m-2.s-1, enquanto que, para um THR de

cerca de 85%, a variedade PB369 apresenta uma E de 0,76 mmol.m-2.s-1.

Para THR de 25-35%, ambas as variedades apresentaram valores de E bastante

reduzidos, na ordem das 0,4-0,5 mmol.m-2.s-1, verificando-se que, no final do período de

stresse, a maior redução, em termos absolutos, acabou por se verificar na variedade PB269.

Durante a recuperação, observou-se em PB269 um regresso quase aos valores iniciais,

embora para PPFD baixas os valores fossem superiores aos registados perto da hidratação

total. Em PB369, após a irrigação no final do período de stresse, os valores de E foram

sempre superiores aos iniciais, situando-se em cerca de 1,5 mmol.m-2.s-1. Tal aumento poderá

estar relacionado com o aumento de gs verificado.

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

102

PB269 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000

1

2

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

E (

mm

ol.

m-2

.s-1

)

THR = 97,8±1,0 (�;–): y = 0,6563 + 0,002164x – 1,0747e-6x2

(r2 = 0,91 ; p < 0,05)

THR = 68,8±14,9 (�;- -): y = 0,2384 + 0,001723x – 8,9623e-7x2

(r2 = 0,96 ; p < 0,01)

THR = 37,0±3,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,2795 + 0,000166x

(r2 = 0,94 ; p < 0,01)

PB369 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000

1

2

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

E (

mm

ol.

m-2

.s-1

)

THR = 94,6±2,0 (�;–): y = 0,4559 + 0,002095x – 1,1367e-6x2

(r2 = 0,86 ; p < 0,05)

THR = 83,5±11,4 (�;- -): y = 0,3369 + 0,000775x – 3,453e-7x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 26,7±11,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,3248 – 0,0001199x

(r2 = 0,85 ; p < 0,01)

PB269 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000

1

2

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

E (

mm

ol.

m-2

.s-1

)

THR = 76,8±3,2 (�;–): y = 1,151 + 0,0006509x – 3,3446e-7x2

(r2 = 0,76 ; p < 0,05)

THR = 76,1±5,7 (�;- -): y = 0,0393 + 0,0001844x + 1,3241e-7x2

(r2 = 0,91 ; p < 0,05)

THR = 37,0±3,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,2795 + 0,000166x

(r2 = 0,94 ; p < 0,01)

PB369 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000

1

2

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

E (

mm

ol.

m-2

.s-1

)

THR = 73,9±1,4 (�;–): y = 1,346 + 0,0007121x – 3,5882e-7x2

(r2 = 0,79 ; p < 0,05)

THR = 74,0±16,0 (�;- -): y = 0,8313 + 0,000713x – 3,453e-7x2

(r2 = 0,95 ; p < 0,05)

THR = 26,7±11,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,3248 – 0,0001199x

(r2 = 0,85 ; p < 0,01)

Fig. 5.6 – Variação da taxa transpiratória (E) em função da densidade de fluxo fotónico

fotossintético (PPFD), ao longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5

folhas de diferentes plantas.

Na Fig. 5.7 está representada a variação da concentração interna de CO2 (Ci) em

função da PPFD, para diferentes THR.

Perto da hidratação total, verifica-se que para PPFD baixas, Ci é superior à observada

para PPFD mais elevadas, variando desde os 350 ppm até aos 200 ppm nas duas variedades.

O mesmo sucede durante o período de stresse mas os valores de Ci são sempre superiores aos

observados antes da sua imposição. Perto da hidratação total, as plantas apresentam valores

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

103

mais elevados de Ci, em PPFD baixas, uma vez que as enzimas do metabolismo fotossintético

não estão activas, principalmente a RuBisCO activase, responsável pela activação da

RuBisCO, e que é activada pela luz (Furbank et al., 1996).

Fig. 5.7 – Variação da concentração interna de CO2 (Ci) em função da densidade de fluxo fotónico

fotossintético (PPFD), ao longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5

folhas de diferentes plantas.

Para THR da ordem dos 25-35%, as folhas apresentam um aumento de Ci situado entre

os 500-600 ppm. Este aumento de Ci poderá estar relacionado com a alteração da morfologia

das células do mesófilo (Giles et al., 1974), provocando uma distorção que dificulta a difusão

do CO2 inorgânico até aos locais em que é fixado pela PEPC (Marques da Silva e Arrabaça,

2004b) que, conjuntamente com um aumento da respiração (Lawlor e Cornic, 2002)

PB269 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000

100

200

300

400

500

600

700

800

900

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

Ci (p

pm

)

THR = 97,8±1,0 (�)

THR = 68,8±14,9 (�)

THR = 37,0±3,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 630 – 0,1607x (r2 = 0,88 ; p < 0,01)

PB369 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000

100

200

300

400

500

600

700

800

900

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

Ci (p

pm

)

THR = 94,6±2,0 (�)

THR = 83,5±11,4 (�;- -): y = 490,1 – 0,3665x – 0,0001857x2

(r2 = 0,96 ; p < 0,01)

THR = 26,7±11,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 615,8 – 0,09492x (r2 = 0,79 ; p < 0,01)

PB269 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000

100

200

300

400

500

600

700

800

900

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

Ci (p

pm

)

THR = 76,8±3,2 (�)

THR = 76,1±5,7 (�;- -): y = 398,8 – 0,1918x + 0,8339x2

(r2 = 0,83 ; p < 0,05)

THR = 37,0±3,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 630 – 0,1607x (r2 = 0,88 ; p < 0,01)

PB369 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000

100

200

300

400

500

600

700

800

900

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

Ci (p

pm

)

THR = 73,9±1,4 (�)

THR = 74,0±16,0 (�)

THR = 26,7±11,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 615,8 – 0,09492x (r2 = 0,79 ; p < 0,01)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

104

permitiria um aumento de CO2 junto da enzima, e manter alguma taxa fotossintética, como já

foi observado em folhas de tomate, durante stresse hídrico (Haupt-Herting et al., 2001).

Durante a recuperação, ambas as variedades apresentaram valores de Ci entre os 300-

400 ppm, sendo menores que os registados no final do período de stresse, embora superiores

aos registados inicialmente, perto da hidratação total. Observa-se sempre uma diminuição de

Ci com o aumento de PPFD, que reflecte alguma actividade da maquinaria enzimática

fotossintética.

Na Fig. 5.8 está representada a variação da eficiência do uso da água (WUE) em

função da PPFD, para diferentes THR.

Fig. 5.8 – Variação da eficiência do uso da água (WUE) em função da densidade de fluxo fotónico

fotossintético (PPFD), ao longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5

folhas de diferentes plantas.

PB269 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000

1

2

3

4

5

6

7

PPFD (µµµµmol fotões.m-2

.s-1

)

WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

THR = 97,8±1,0 (�;–): y = 0,8502 + 0,01171x – 6,6337e-6x2

(r2 = 0,85 ; p < 0,05)

THR = 68,8±14,9 (�;- -): y = 0,4463 + 0,007749x – 3,9046e-6x2

(r2 = 0,92 ; p < 0,05)

PB369 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000

1

2

3

4

5

6

7

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

THR = 94,6±2,0 (�;–): y = 0,8502 + 0,01171x – 6,6337e-6x2

(r2 = 0,85 ; p < 0,05)

THR = 83,5±11,4 (�;- -): y = – 2,399 + 0,006999x – 3,0880e-6x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

PB269 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000

1

2

3

4

5

6

7

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

THR = 76,8±3,2 (�;–): y = 0,1429 + 0,002956x – 1,5741e-6x2

(r2 = 0,78 ; p < 0,05)

THR = 76,1±5,7 (�;- -): y = – 0,07077 + 0,003030x – 1,5799e-6x2

(r2 = 0,92 ; p < 0,05)

PB369 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000

1

2

3

4

5

6

7

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

THR = 73,9±1,4 (�;–): y = – 0,1150 + 0,004914x – 2,4606e-6x2

(r2 = 0,86 ; p < 0,05)

THR = 74,0±16,0 (�;- -): y = 0,2034 + 0,002898x – 1,3803e-6x2

(r2 = 0,82 ; p < 0,05)

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105

Perto da hidratação total, ambas as variedades apresentaram variação da WUE, sendo

esta menor para PPFD mais baixas e aumentando até cerca de 6 µmol CO2 / mmol H2O para

PPFD mais elevadas. Em PB269, a WUE foi afectada com a diminuição do THR (cerca de

70%), apresentando valores negativos para PPFD mais baixos mas recuperando para valores

positivos a partir de PPFD de cerca de 200 µmol fotões.m-2.s-1. Na variedade PB369, WUE

foi mais afectada, como seria esperado pela análise dos dados anteriores (Fig. 5.4 e Fig. 5.6).

Para THR na ordem dos 85%, apresenta valores positivos de WUE apenas a partir de PPFD

de 430 µmol fotões.m-2.s-1. Por vezes, são observados aumentos na WUE, com a imposição

do stresse hídrico, dado que gs diminui mais rapidamente que o metabolismo fotossintético do

carbono, ocorrendo uma maior fixação de CO2 por cada mole de água transpirada (Chaves e

Oliveira, 2004). No entanto, não foi o que aqui sucedeu.

Os valores mais baixos de THR (stresse intenso) não estão representados na Fig. 5.8

porque apresentam valores de WUE negativos, devido a A apresentar também valores

negativos (Fig. 5.4).

Durante a recuperação, a WUE recuperou apenas muito parcialmente nas duas

variedades, apresentando valores reduzidos para PPFD baixas e não ultrapassando os 2 µmol

CO2 / mmol H2O para PPFD mais elevados, devido à conjunção de uma redução de A e de

um aumento de E, provocados principalmente devido ao aumento da temperatura e

diminuição da humidade relativa, resultante da avaria da câmara de crescimento.

5.3.2.2. Curvas A/CO5.3.2.2. Curvas A/CO5.3.2.2. Curvas A/CO5.3.2.2. Curvas A/CO2222aaaa

Na Fig. 5.9 está representada a variação de A em função da concentração externa de

CO2 (CO2a), para diferentes THR.

Na variedade PB269, observaram-se inicialmente valores de trocas gasosas inferiores

aos registados posteriormente no ensaio. Contudo, na segunda medição, os valores de THR

ainda se encontravam perto da hidratação total (cerca de 90%), e poderão ser os mais

próximos dos esperados.

Com uma CO2a entre os 100 ppm e os 370 ppm verifica-se um grande aumento de A e,

para valores superiores de CO2a, o aumento de A é menor, como acontece com as plantas C4

que saturam com o aumento de CO2a. Tal como já se havia verificado no ensaio das curvas

A/PPFD, observa-se um menor valor de A para a variedade PB369. Esta apresenta um valor

semelhante de A registado para PB269 mas para THR diferentes (cerca de 70% em PB269 e

cerca de 85% em PB369).

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

106

Fig. 5.9 – Variação da taxa fotossintética líquida (A) em função da concentração externa de CO2

(CO2a), ao longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de

diferentes plantas.

Verifica-se que a variedade PB269 recupera melhor aqui que no ensaio da PPFD

(indicando alguma susceptibilidade à temperatura), embora, tal como na fase I, não consiga

recuperar o THR até aos valores iniciais. Por outro lado, a variedade PB369 não recupera

após irrigação. Dado que o aumento de CO2 não restaura A para Amáx, pode afirmar-se que

existe um predomínio da limitação não-estomática (Kanechi et al., 1996; Pankovic et al.,

1999; Lawlor, 2002).

Associando os dados de A aos valores de Ci, foi possível calcular as limitações

estomáticas e não-estomáticas (Tab. 5.3) (Jones, 1985; Geber e Dawson, 1997; Tezara et al.,

2003).

PB269 Stresse

250 500 750 1000 1250 1500

-5

0

5

10

15

20

CO2a (ppm)

A (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

THR = 94,8±2,1 (�;–): y = 2,211 + 0,002536x (r2 = 0,84 ; p <,0,01)

THR = 89,7±8,4 (�;- -): y = 4,628 + 0,01587x – 6,7091e-6x2

(r2 = 0,96 ; p <,0,05)

THR = 68,5±8,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 2,29 + 0,002004x (r2 = 0,94 ; p <,0,01)

PB369 Stresse

250 500 750 1000 1250 1500

-5

0

5

10

15

20

CO2a (ppm)

A (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

THR = 92,3±3,2 (�;–): y = 2,287 + 0,01191x – 4,2717e-6x2

(r2 = 0,99 ; p <,0,05)

THR = 94,2±0,6 (�;- -): y = 3,071 + 0,01003x – 3,5170e-6x2

(r2 = 0,96 ; p <,0,05)

THR = 85,2±7,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 1,666 + 0,002033x (r2 = 0,92 ; p <,0,01)

PB269 Recuperação

250 500 750 1000 1250 1500

-5

0

5

10

15

20

CO2a (ppm)

A (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

THR = 85,5±3,4 (�;–): y = 3,338 + 0,004317x – 4,4179e-7x2

(r2 = 0,95 ; p <,0,05)

THR = 85,1±4,6 (�;- -): y = 3,775 + 0,008619x – 2,4388e-6x2

(r2 = 0,97 ; p <,0,05)

THR = 68,5±8,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 2,29 + 0,002004x (r2 = 0,94 ; p <,0,01)

PB369 Recuperação

250 500 750 1000 1250 1500

-5

0

5

10

15

20

CO2a (ppm)

A (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

THR = 94,6±2,6 (�;–): y = 0,0399 + 0,00229x (r2 = 0,77 ; p <,0,01)

THR = 92,0±4,8 (�;- -): y = 0,772 + 0,00308x (r2 = 0,89 ; p <,0,01)

THR = 85,2±7,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 1,666 + 0,002033x (r2 = 0,92 ; p <,0,01)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

107

Tab. 5.3 – Limitações não-estomáticas e estomáticas da fotossíntese, a partir das curvas A/Ci.

A variedade PB269 apresentou valores mais baixos de fotossíntese no primeiro dia de

ensaio, mas no terceiro dia apresentou valores próximos dos esperados para a hidratação total,

que se consideraram mais indicados para funcionarem como controlo. Verifica-se que as

limitações não-estomáticas se manifestam de forma mais intensa na variedade PB369, uma

vez que possuem uma limitação não-estomática relativa de cerca de 90% a um THR de 85%,

enquanto que o mesmo valor foi observado na variedade PB269 num THR de cerca de 70%.

A análise da Tab. 5.3 permite constatar que as limitações estomáticas da fotossíntese

têm uma maior importância perto da hidratação total (dia 3). À medida que o stresse hídrico

vai aumentando e o THR diminuindo, as limitações não-estomáticas começam a aumentar, e

as limitações estomáticas deixam de ter a mesma relevância (dia 6) (Marques da Silva, 1999;

Flexas e Medrano, 2002; Tezara et al., 2003). Durante a fase de recuperação também se

registam diferenças, com a variedade PB269 a recuperar de forma mais marcante que PB369,

a qual continua a sofrer uma diminuição de A, mesmo após irrigação. Relativamente às

limitações da fotossíntese, verifica-se que em ambas as variedades as limitações não-

estomáticas são as responsáveis pela baixa ou praticamente inexistente recuperação da

fotossíntese.

Na Fig. 5.10 está representada a variação de gs em função da CO2a, para diferentes

THR.

Verifica-se que para CO2a mais baixos, ambas as variedades apresentam valores de gs

superiores aos registados para CO2a mais elevados, o que é de esperar como resposta dos

estomas ao aumento de CO2, de modo a permitir manter a actividade fotossintética (Lopez et

al., 1987; Maroco et al., 1999). No entanto, na variedade PB269, há uma diminuição de gs de

cerca de 0,2 mol.m-2.s-1 para cerca de 0,05 mol.m-2.s-1, enquanto que em PB369 a mesma

THR (%) Limitação total

(%)

Limitação não-

estomática (%)

Limitação

estomática (%)

Limitação não-

estomática

relativa (%)

Limitação

estomática

relativa (%)

Dia PB269 PB369 PB269 PB369 PB269

(*)

PB369 PB269 PB369 PB269 PB369 PB269 PB369

0 95 92 74 19 66 0 8 19 89 0 11 100

3 90 94 13 18 0 4 13 14 0 22 100 78

6 69 85 74 63 68 57 6 6 92 91 8 9

9 85 92 40 76 26 62 14 14 66 81 34 19

12 86 95 55 94 48 94 7 0 87 100 13 0

(*) Foi considerado o dia 3 como os valores controlo, ou seja, ainda perto da hidratação total.

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

108

diminuição acontece de 0,1 mol.m-2.s-1 para 0,05 mol.m-2.s-1, indicando que esta última

variedade apresenta estomas com uma sensibilidade inferior ao CO2 ambiente. Por outro lado,

a maior sensibilidade estomática da variedade PB269 poderia explicar a razão do ajustamento

da gs e da A com o Ψw e o THR (Fig. 4.6 e 4.7), como foi verificado numa variedade tolerante

de Coffea canephora (Pinheiro et al., 2005).

Fig. 5.10 – Variação da condutância estomática (gs) em função da concentração externa de CO2

(CO2a), ao longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de

diferentes plantas.

À medida que o THR diminui, em PB269, os valores de gs para CO2a baixos vão

PB269 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.1

0.2

0.3

CO2a (ppm)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

THR = 94,8±2,1 (�;–): y = 0,1459 – 0,002485x + 1,2862e-7x2

(r2 = 0,90 ; p < 0,05)

THR = 89,7±8,4 (�;- -): y = 0,2359 – 0,000345x + 1,5397e-7x2

(r2 = 0,96 ; p < 0,05)

THR = 68,5±8,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,09507 – 0,00127x + 5,6102e-8x2

(r2 = 0,96 ; p < 0,05)

PB369 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.1

0.2

0.3

CO2a (ppm)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

THR = 92,.3±3,.2 (�;–): y = 0,1299 – 0,0001555x + 6,6621e-8x2

(r2 = 0,97 ; p < 0,05)

THR = 94,2±0,6 (�;- -): y = 0,1445 – 0,000194x + 8,6688e-8x2

(r2 = 0,97 ; p < 0,05)

THR = 85,2±7,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,06748 – 7,8896e-5x + 3,4431e-8x2

(r2 = 0,96 ; p < 0,05)

PB269 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.1

0.2

0.3

CO2a (ppm)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

THR = 85,5±3,4 (�;–): y = 0,1785 – 0,000259x + 1,1931e-7x2

(r2 = 0,96 ; p < 0,05)

THR = 85,1±4,6 (�;- -): y = 0,1699 – 0,00024x + 1,0271e-7x2

(r2 = 0,96 ; p < 0,05)

THR = 68,5±8,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,09507 – 0,00127x + 5,6102e-8x2

(r2 = 0,96 ; p < 0,05)

PB369 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.1

0.2

0.3

CO2a (ppm)

gs (

mo

l.m

-2.s

-1)

THR = 94,6±2,6 (�;–): y = 0,08945 – 5,7028e-5x + 2,6638e-8x2

(r2 = 0,93 ; p < 0,05)

THR = 92,0±4,8 (�;- -): y = 0,07465 – 7,749e-5x + 3,4997e-8x2

(r2 = 0,95 ; p < 0,05)

THR = 85,2±7,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,06748 – 7,8896e-5x + 3,4431e-8x2

(r2 = 0,96 ; p < 0,05)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

109

diminuindo, embora para CO2a mais elevados se mantenham constantes. Em PB369, não

existem alterações significativas. Comparando com a Fig. 5.9, verifica-se que para valores

idênticos de gs, a A em PB369 apresenta uma maior redução.

Durante a recuperação, PB269 recupera parcialmente os valores iniciais de gs, não

ocorrendo a recuperação total provavelmente devido a não recuperar facilmente o THR, facto

já observado na fase I. Por outro lado, na variedade PB369 há uma certa tendência para

manter os valores semelhantes aos observados no final do período de stresse.

Fig. 5.11 – Variação da taxa transpiratória (E) em função da concentração externa de CO2 (CO2a),

ao longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de diferentes

plantas.

PB269 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000

1

2

3

CO2a (ppm)

E (

mm

ol.

m-2

.s-1

)

THR = 94,8±2,1 (�;–): y = 1,929 – 0,002897x + 1,4784e-6x2

(r2 = 0,93 ; p < 0,05)

THR = 89,7±8,4 (�;- -): y = 2,513 – 0,002885x + 1,1967e-6x2

(r2 = 0,98 ; p < 0,05)

THR = 68,5±8,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 1,318 – 0,001463x + 6,1415e-7x2

(r2 = 0,97 ; p < 0,05)

PB369 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000

1

2

3

CO2a (ppm)E

(m

mo

l.m

-2.s

-1)

THR = 92,3±3,2 (�;–): y = 1,81 – 0,0018x + 7,3107e-7x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,05)

THR = 94,2±0,6 (�;- -): y = 1,903 – 0,00212x + 9,0264e-7x2

(r2 = 0,98 ; p < 0,05)

THR = 85,2±7,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 1,134 – 0,001193x + 5,0385e-7x2

(r2 = 0,97 ; p < 0,05)

PB269 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000

1

2

3

CO2a (ppm)

E (

mm

ol.

m-2

.s-1

)

THR = 85,5±3,4 (�;–): y = 2,269 – 0,00241x + 1,0674e-6x2

(r2 = 0,98 ; p < 0,05)

THR = 85,1±4,6 (�;- -): y = 2,426 – 0,002936x + 1,2902e-6x2

(r2 = 0,98 ; p < 0,05)

THR = 68,5±8,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 1,318 – 0,001463x + 6,1415e-7x2

(r2 = 0,96 ; p < 0,05)

PB369 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000

1

2

3

CO2a (ppm)

E (

mm

ol.

m-2

.s-1

)

THR = 94,6±2,6 (�;–): y = 1,393 – 0,0008393x + 3,9304e-7x2

(r2 = 0,95 ; p < 0,05)

THR = 92,0±4,8 (�;- -): y = 1,337 – 0,001268x + 5,5299e-7x2

(r2 = 0,96 ; p < 0,05)

THR = 85,2±7,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 1,134 – 0,001193x + 5,0385e-7x2

(r2 = 0,97 ; p < 0,05)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

110

Na Fig. 5.11 está representada a variação de E em função da CO2a, para diferentes

THR.

Perto da hidratação total, ambas as variedades apresentam valores de E superiores para

CO2a inferiores, diminuindo à medida que CO2a aumenta. À medida que o THR diminui

verifica-se uma diminuição do valor máximo de E. Na recuperação, o padrão observado é

semelhante, acompanhando a evolução de gs (Fig. 5.10).

Na Fig. 5.12 está representada a variação de Ci em função da CO2a, para diferentes

THR.

Fig. 5.12 – Variação da concentração interna de CO2 (Ci) em função da concentração externa de

CO2 (CO2a), ao longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de

diferentes plantas.

Tal como seria esperado, observa-se um aumento linear de Ci com o aumento de CO2a.

Com o aumento de A (Fig. 5.9), Ci apresenta uma ligeira diminuição com o aumento de CO2a,

PB269 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000

250

500

750

1000

1250

CO2a (ppm)

Ci (p

pm

)

THR = 94,8±2,1 (�;–): y = – 24,48 + 0,8156x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 89,7±8,4 (�;- -): y = – 37,08 + 0,6373x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 68,5±8,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = – 15,13 + 0,7686x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

PB369 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000

250

500

750

1000

1250

CO2a (ppm)

Ci (p

pm

)

THR = 92,3±3,2 (�;–): y = – 32 + 0,6621x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 94,2±0,6 (�;- -): y = – 36,44 + 0,6654x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 85,2±7,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = – 17,42 + 0,7444x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

PB269 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000

250

500

750

1000

1250

CO2a (ppm)

Ci (p

pm

)

THR = 85,5±3,4 (�;–): y = – 31,21 + 0,7868x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 85,1±4,6 (�;- -): y = – 21,04 + 0,6306x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 68,5±8,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = – 15,13 + 0,7686x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

PB369 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000

250

500

750

1000

1250

CO2a (ppm)

Ci (p

pm

)

THR = 94,6±2,6 (�;–): y = 16,14 + 0,8884x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 92,0±4,8 (�;- -): y = 4,821 + 0,7799x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 85,2±7,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = – 17,42 + 0,7444x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

111

na hidratação total. Com a diminuição do THR, Ci vai apresentando valores superiores aos

iniciais, com o aumento de CO2a, indicando uma diminuição da capacidade de fixação do

carbono pelo processo fotossintético (Medrano et al., 2002) ou um aumento da respiração

(Lawlor e Cornic, 2002).

Durante a recuperação, PB269 sofre uma evolução para valores perto dos iniciais,

enquanto que em PB369 os valores de Ci continuam a aumentar.

Na Fig. 5.13 está representada a variação de WUE em função da CO2a, para diferentes

THR.

Fig. 5.13 – Variação da eficiência do uso da água (WUE) em função da concentração externa de

CO2 (CO2a), ao longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de

diferentes plantas.

PB269 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000

5

10

15

20

CO2a (ppm)

WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

THR = 94,8±2,1 (�;–): y = 0,957 + 0,005482x (r2 = 0,92 ; p < 0,01)

THR = 89,7±8,4 (�;- -): y = 0,5908 + 0,01752x – 3,9491e-6x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 68,5±8,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,7389 + 0,006567x

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

PB369 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000

5

10

15

20

CO2a (ppm)

WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

THR = 92,3±3,2 (�;–): y = 0,34 + 0,01477x – 2,9241e-6x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,05)

THR = 94,2±0,6 (�;- -): y = 0,6951 + 0,01456x – 2,9014e-6x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,05)

THR = 85,2±7,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,6329 + 0,006695x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

PB269 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000

5

10

15

20

CO2a (ppm)

WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

THR = 85,5±3,4 (�;–): y = 1,291 + 0,00573x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 85,1±4,6 (�;- -): y = 1,081 + 0,009645x

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 68,5±8,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,7389 + 0,006567x

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

PB369 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000

5

10

15

20

CO2a (ppm)

WU

E

( µµ µµm

ol

CO

2 /

mm

ol

H2O

)

THR = 94,6±2,6 (�;–): y = 0,8434 – 0,001895x + 3,2128e-6x2

(r2 = 0,97 ; p < 0,05)

THR = 92,0±4,8 (�;- -): y = – 0,1916 + 0,006058x

(r2 = 0,93 ; p < 0,01)

THR = 85,2±7,5 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,6329 + 0,006695x (r2 = 0,99 ; p < 0,01)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

112

Perto da hidratação total verifica-se um aumento de WUE com o aumento de CO2a em

ambas as variedades. A evolução crescente deste parâmetro é semelhante em todos os THR

registados.

À medida que o THR decresce, os valores de WUE para valores de CO2a superiores

vão sendo menores. Durante a recuperação, com o consequente aumento de THR, PB269

apresenta uma recuperação de WUE, enquanto em PB369 continua a sofrer uma diminuição.

Os dados de trocas gasosas, no seu conjunto, permitem verificar uma maior tolerância

ao stresse hídrico na variedade PB269, relativamente a PB369, como já havia sido verificado

na fase I deste trabalho. O padrão de “tudo-ou-nada”, na diminuição geral dos parâmetros

(exceptuando Ci), parece verificar-se novamente para a variedade PB369, enquanto em PB269

vai ocorrendo uma diminuição gradual dos mesmos.

5.3.2.3. Libertação de O5.3.2.3. Libertação de O5.3.2.3. Libertação de O5.3.2.3. Libertação de O2222

No que respeita à libertação de O2, PB369 apresenta uma diminuição da taxa, em

condições de stresse, mais acentuada que a da variedade PB269 (Fig. 5.14), embora isso se

possa dever ao facto de, na primeira variedade, se terem obtido poucas medições a THR

baixos. Os dados estão de acordo com os obtidos nas curvas de A/CO2a (Fig. 5.9).

Fig. 5.14 – Variação da libertação de O2 em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo das

experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de diferentes plantas.

Pela análise da recta da variedade PB269, observou-se uma anulação da libertação de

O2 a THR de 42%. Em PB369, não foi possível obter valores mais baixos de THR mas a 70%

já apresenta um ponto com forte redução de libertação de O2. Também se observa que, mais

uma vez, PB369 recupera o THR para valores próximos da hidratação total, após irrigação,

PB269

60 70 80 90 1000

5

10

15

20

25

THR (%)

Lib

ert

ação

de O

2

( µµ µµm

ol

O2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆; - -): y = – 12,95 + 0,3044x (r2 = 0,55 ; p < 0,01)

Recuperação (�; –): y = – 7,564 + 0,2185x (r2 = 0,56 ; p < 0,01)

PB369

60 70 80 90 1000

5

10

15

20

25

THR (%)

Lib

ert

ação

de O

2

( µµ µµm

ol

O2.m

-2.s

-1)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

113

embora PB269 não (caixas da Fig. 5.14). No entanto, há uma retoma significativa da taxa de

libertação de O2 nesta última, no período de recuperação. Em PB369, durante a recuperação, o

complexo de formação de O2 não parece ter sido muito afectado, até THR de 85%.

Através da normalização dos valores obtidos na libertação de O2 (Fig. 5.14) e dos

dados obtidos nos ensaios da curva de A/CO2a, procedeu-se à construção da Fig. 5.15,

admitindo os valores iniciais obtidos na ausência de stresse (exceptuando os de PB269, em

que os valores utilizados foram os do segundo dia de medições, mas no qual as plantas ainda

se encontravam perto da hidratação total [ver Fig. 5.9]), como o máximo de actividade

fotossintética. Este gráfico permite observar a diferença entre a limitação não-estomática (a

CO2 saturante) e a limitação estomática (a CO2 atmosférico) (Ghannoum et al., 2003;

Marques da Silva e Arrabaça, 2004a).

Fig. 5.15 – Normalização da variação da taxa fotossintética em condições atmosféricas normais de

CO2 (370 ppm) (- -) e medida sob 7% de CO2 (libertação de O2) (–) em função do teor hídrico

relativo (THR). Os parâmetros exprimem-se em % do valor máximo.

A partir da Fig. 5.15, foi possível determinar as limitações estomáticas e não-

estomáticas da fotossíntese, apresentadas na Tab. 5.4.

Tab. 5.4 – Limitações não-estomáticas e estomáticas da fotossíntese.

PB269

60 70 80 90 1000

25

50

75

100

THR (%)

Tro

cas g

aso

sas (

%)

PB369

60 70 80 90 1000

25

50

75

100

THR (%)

Tro

cas g

aso

sas (

%)

Limitação total

(%)

Limitação não-

estomática (%)

Limitação

estomática (%)

Limitação relativa

não-estomática (%)

Limitação relativa

estomática (%) THR

(%) PB269 PB369 PB269 PB369 PB269 PB369 PB269 PB369 PB269 PB369

100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

95 13 14 9 12 4 2 69 86 31 14

90 26 28 17 24 8 4 65 86 35 14

85 38 42 26 35 12 6 68 83 32 17

70 77 83 52 70 25 13 68 84 32 16

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

114

Verifica-se que na variedade PB269 as limitações não-estomáticas apresentam um

valor relativo inferior ao registado em PB369, com a diminuição do THR. No entanto, as

limitações estomáticas apresentam uma maior componente relativa na variedade PB269,

relativamente a PB369. Porém, as limitações não-estomáticas apresentam um valor relativo

superior ao observado para as limitações estomáticas, em ambas as variedades, para stresse

baixo a moderado. Tal facto, poderá estar relacionado com a concentração de CO2 utilizada

(7%) não ser saturante ou inibir a fotossíntese destas plantas C4, o que poderá provocar uma

sobrevalorização da componente do mesófilo (Marques da Silva, 1999). No entanto, novos

estudos têm revelado que a componente não-estomática pode ser uma componente mais

importante do que aquela que tem sido descrita em stresse moderado, principalmente devido à

diminuição da síntese de ATP, observada para o girassol (Tezara et al., 1999; Medrano et al.,

2002).

Este facto permite verificar que, embora em CO2 ambientais as duas variedades não

apresentem diferenças significativas de A (Fig. 5.9), na variedade PB269 estas limitações

estão relacionadas mais directamente com o fecho estomático (Fig. 5.10) do que com

modificações do metabolismo fotossintético do carbono (Flexas e Medrano, 2002). Em

PB369, as limitações de A estarão mais directamente ligadas a alterações do ciclo do

metabolismo do carbono com a variação do THR, observações concordantes com os valores

da Tab. 5.3.

5.3.3. Fluorescência Modu5.3.3. Fluorescência Modu5.3.3. Fluorescência Modu5.3.3. Fluorescência Modulada dalada dalada dalada da Clorofila Clorofila Clorofila Clorofila aaaa

Os dados da fluorescência da clorofila a fornecem informações importantes sobre a

competência fotossintética das espécies vegetais.

A razão entre a fluorescência variável máxima (Fv) e a fluorescência máxima (Fm)

indica a eficiência da conversão de energia pelos centros de reacção do PSII abertos, na

ausência de fenómenos de amortecimento não-fotoquímico. Na Fig. 5.16 observa-se a

variação deste parâmetro com o THR, nas duas variedades seleccionadas.

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

115

Fig. 5.16 – Variação do rendimento quântico máximo do PSII (Fv/Fm) em função do teor hídrico

relativo (THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de

diferentes plantas.

Pode observar-se que o valor se encontra próximo das 0,7 unidades relativas na

hidratação máxima em ambas as variedades, valor inferior ao de 0,8 encontrado por outros

autores (Maxwell e Johnson, 2000; Marques da Silva e Arrabaça, 2004b) e ao encontrado na

primeira fase deste trabalho (Fig. 4.21). Tal facto, poderá reflectir algumas diferenças

observadas nesta fase, nomeadamente na diminuição de A, em relação à primeira fase do

trabalho. Provavelmente, essas diferenças estarão relacionadas com um maior crescimento das

plantas que poderá ter ocorrido, em relação à fase I, atingindo a maturidade mais cedo que a

inicialmente determinada.

No entanto, podem verificar-se diferenças nas duas variedades. Na variedade PB269,

não se verificam variações significativas deste parâmetro em THR entre os 50 e os 100%,

sofrendo uma queda abrupta para 0,4-0,5 unidades relativas para um THR de cerca de 35%

(caixas da Fig. 5.16), também observado por Marques da Silva (1999) em Setaria sphacelata.

Na variedade PB369, o parâmetro analisado diminui continuamente até atingir um valor de

0,2-0,3 unidades relativas para um THR de cerca de 25%. Tal facto é um dado importante

para distinguir as duas variedades, no que respeita à susceptibilidade do PSII ao stresse

hídrico.

Durante a recuperação, embora realizada em condições de temperatura mais elevadas

(38ºC) que durante o período de stresse, ambas as variedades regressaram aos valores iniciais.

Na Fig. 5.17 observa-se a variação do rendimento quântico efectivo do PSII (ΦPSII) em

função da PPFD.

PB269

25 50 75 1000.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

THR (%)

Fv/F

m

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

25 50 75 1000.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

THR (%)

Fv/F

m

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆; - -): y = 0,06583 + 0,01108x – 4,8227e-5x2

(r2 = 0,96 ; p < 0,05)

Recuperação (�; –): y = – 0,0276 + 0,0163x – 9,203e-5x2

(r2 = 0,95 ; p < 0,05)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

116

Fig. 5.17 – Variação do rendimento quântico efectivo do PSII (ΦPSII) em função da densidade de

fluxo fotónico fotossintético (PPFD), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos

de 5 folhas de diferentes plantas.

Assim perto da hidratação total e no início do stresse, ambas as variedades apresentam

valores perto das 0,65 unidades relativas, para PPFD mais reduzidas, valor observado também

noutras espécies como Cucumis sativus, Ternstroemia gymnantheria e Acacia auriculiformis

(Tsuyama et al., 2003). Este valor diminui com o aumento da PPFD, o que indica o fecho

progressivo dos centros de reacção do PSII, com o aumento da PPFD e também a existência

de processos de fotoinibição da fotossíntese.

Com a diminuição do THR, a proporção de centros de reacção do PSII abertos vai

diminuindo, para as mesmas PPFD, em ambas as variedades. Esta diminuição é, contudo,

PB269 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

THR = 93,9±2,9 (�;–): y = 0,7104 – 0,001137x + 4,6742e-7x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 68,8±14,9 (�;- -): y = 0,4813 – 0,0007776x + 3,1195e-7x2

(r2 = 0,95 ; p < 0,01)

THR = 37,0±3,2 (∆)

PB369 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

THR = 95,6±1,5 (�;–): y = 0,727 – 0,00114x + 4,4544e-7x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 83,5±11,4 (�;- -): y = 0,4332 – 0,00085x + 3,985e-7x2

(r2 = 0,96 ; p < 0,05)

THR = 26,7±11,2 (∆)

PB269 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

THR = 76,8±3,2 (�;–): y = 0,4794 – 0,001082x + 5,4715e-7x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 76,1±5,7 (�;- -): y = 0,5653 – 0,001119x + 5,2405e-7x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 37,0±3,2 (∆)

PB369 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

PPFD (µµµµmol fotões.m-2

.s-1

)

ΦΦ ΦΦP

SII

(un

idad

es r

ela

tivas)

THR = 73,9±1,4 (�;–): y = 0,4997 – 0,0005759x – 1,4409e-7x2

(r2 = 0,90 ; p < 0,01)

THR = 74,0±16,0 (�;- -): y = 0,426 – 0,000692x – 2,7933e-7x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 26,7±11,2 (∆)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

117

mais marcante em PB369, onde, para qualquer dos níveis de stresse considerados, ΦPSII

diminui mais acentuadamente e se anula para PPFD mais baixas. Estes dados indicam uma

progressiva perda de capacidade fotossintética com a diminuição do THR, possivelmente por

dano dos centros de reacção do PSII (Matsubara e Chow, 2004) e associada a efeitos

negativos nas enzimas do metabolismo fotossintético (Parry et al., 2002), com PB369 a

revelar, mais uma vez, uma maior susceptibilidade.

Durante a recuperação, as variedades demonstraram um progressivo regresso a valores

perto dos iniciais. Contudo, o perfil inicial não foi atingido provavelmente porque os valores

de THR não foram recuperados.

Na Fig. 5.18 está representada a variação do amortecimento fotoquímico (qP) em

função da PPFD, em diferentes THR.

Verifica-se também uma diferença de comportamentos nas duas variedades à medida

que o stresse hídrico se intensifica. Perto da hidratação total, até PPFD de cerca de 500 µmol

fotões.m-2.s-1, qP praticamente não sofre variações (ver caixas da Fig. 5.18). Em PB369,

ocorre uma diminuição de qP com o aumento da PPFD a THR de 85%. No entanto, em

PB269, para THR de cerca de 70%, qP apresenta valores semelhantes aos das plantas perto da

hidratação total, indicando que a cadeia fotoquímica apresenta um maior grau de tolerância ao

stresse do que a variedade PB369.

Com a intensificação do stresse hídrico, ambas as variedades apresentam um

anulamento de qP, embora para valores de PPFD diferentes. Este anulamento deve-se ao facto

de a planta sofrer danos nos centros de reacção do PSII (Matsubara e Chow, 2004) e também

porque, à medida que o stresse hídrico progride, as actividades enzimáticas vão sendo

afectadas negativamente, factores que contribuem para a diminuição de qP (Medrano et al.,

2002; Parry et al., 2002).

Na recuperação (efectuada a 38ºC), o parâmetro qP recupera totalmente nas duas

variedades, embora o THR seja mais reduzido que o observado inicialmente, que poderá

resultar de alguma aclimatação das plantas (Sharp et al., 2004).

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

118

Fig. 5.18 – Variação do coeficiente de amortecimento fotoquímico (qP) em função da densidade

de fluxo fotónico fotossintético (PPFD), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram

obtidos de 5 folhas de diferentes plantas.

Na Fig. 5.19 está representada a variação do amortecimento não-fotoquímico (qN) em

função de PPFD, para diferentes THR.

Verifica-se que para valores de THR perto da hidratação total, qN, que traduz a

fracção de energia dissipada não-fotoquimicamente, se encontra perto da capacidade máxima

para PPFD de 1300 µmol fotões.m-2.s-1, valor que não é considerado saturante para plantas C4

(Marques da Silva, 1999; Maroco et al., 1999). Tal facto poderá dever-se às condições em que

as plantas foram cultivadas (PPFD de aproximadamente 500 µmol fotões.m-2.s-1).

PB269 Stresse

250 500 750 1000 1250 15000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

THR = 93,9±2,9 (�)

THR = 68,8±14,9 (�)

THR = 37,0±3,2 (∆)

PB369 Stresse

250 500 750 1000 1250 15000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

THR = 95,6±1,5 (�)

THR = 83,5±11,4 (�)

THR = 26,7±11,2 (∆)

PB269 Recuperação

250 500 750 1000 1250 15000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

THR = 76,8±3,2 (�)

THR = 76,1±5,7 (�)

THR = 37,0±3,2 (∆)

PB369 Recuperação

250 500 750 1000 1250 15000.00

0.25

0.50

0.75

1.00

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

qP

(un

idad

es r

ela

tivas)

THR = 73,9±1,4 (�)

THR = 74,0±16,0 (�)

THR = 26,7±11,2 (∆)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

119

Fig. 5.19 – Variação do coeficiente de amortecimento não-fotoquímico (qN) em função da

densidade de fluxo fotónico fotossintético (PPFD), nas experiências de stresse lento. Os pontos

foram obtidos de 5 folhas de diferentes plantas.

À medida que o stresse hídrico aumenta, as variedades vão perdendo a capacidade de

dissipação da energia fotoquimicamente, mesmo para valores reduzidos de PPFD,

aumentando a dissipação não-fotoquímica. No entanto, a diferença entre as duas variedades é

notória. Para valores de THR de cerca de 85%, em PB369, a evolução de qN com PPFD já se

destaca relativamente à observada em PB269, para valores de THR de 70%. Para os valores

de THR considerados, PB369 já apresenta um valor de qN superior ao observado em PB269,

implicando um desvio da energia captada para processos de dissipação não-fotoquímica,

PB269 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000.00

0.25

0.50

0.75

1.00

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

qN

(un

idad

es r

ela

tivas)

THR = 93,9±2,9 (�;–): y = 0,09664 + 0,001756x – 8,2417e-7x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 68,8±14,9 (�;- -): y = 0,5419 + 0,0008629x – 3,941e-7x2

(r2 = 0,92 ; p < 0,05)

THR = 37,0±3,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,6748 + 0,0009621x – 5,5758e-7x2

(r2 = 0,59 ; p < 0,05)

PB369 Stresse

0 250 500 750 1000 1250 15000.00

0.25

0.50

0.75

1.00

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

qN

(un

idad

es r

ela

tivas)

THR = 95,6±1,5 (�;–): y = 0,03413 + 0,001866x – 8,6279e-7x2

(r2 = 0,98 ; p < 0,01)

THR = 83,5±11,4 (�;- -): y = 0,586 + 0,0009194x – 4,6538e-7x2

(r2 = 0,90 ; p < 0,05)

THR = 26,7±11,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,7066 + 0,0008811x – 5,1853e-7x2

(r2 = 0,53 ; p < 0,05)

PB269 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000.00

0.25

0.50

0.75

1.00

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

qN

(un

idad

es r

ela

tivas)

THR = 76,8±3,2 (�;–): y = 0,564 + 0,001019x – 5,2704e-7x2

(r2 = 0,97 ; p < 0,01)

THR = 76,1±5,7 (�;- -): y = 0,4476 + 0,001202x – 5,9714e-7x2

(r2 = 0,99 ; p < 0,01)

THR = 37,0±3,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,6748 + 0,0009621x – 5,5758e-7x2

(r2 = 0,59 ; p < 0,05)

PB369 Recuperação

0 250 500 750 1000 1250 15000.00

0.25

0.50

0.75

1.00

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

qN

(un

idad

es r

ela

tivas)

THR = 73,9±1,4 (�;–): y = 0,6037 + 0,0003279x

(r2 = 0,74 ; p < 0,05)

THR = 74,0±16,0 (�;- -): y = 0,603 + 0,0007018 – 3,0625e-7x2

(r2 = 0,96 ; p < 0,05)

THR = 26,7±11,2 (∆;⋅⋅⋅⋅): y = 0,7066 + 0,0008811x – 5,1853e-7x2

(r2 = 0,53 ; p < 0,05)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

120

relacionados com um efeito negativo na maquinaria enzimática fotossintética (dissipação

fotoquímica) (Tezara et al., 2003), verificado na Fig. 5.18. Desta forma, a mesma evolução de

qN é observada nas duas variedades em THR diferentes, surgindo, mais uma vez, a variedade

PB269 como a mais tolerante ao stresse hídrico, dado que os seus processos fotossintéticos se

mantém activos a THR mais baixos, comparativamente com a variedade PB369.

Ao aprofundar o estudo de qN através da caracterização dos seus componentes (qE, qT

e qI), é possível observar as diferenças de comportamento nas duas variedades.

Na Fig. 5.20 está representada a variação do coeficiente de amortecimento de alta

energia (qE) em função do THR.

Fig. 5.20 – Variação do coeficiente de amortecimento de alta energia (qE) em função do teor

hídrico relativo (THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de

diferentes plantas.

Podem verificar-se comportamentos distintos nas duas variedades. Em PB269, existe

uma manutenção de qE entre 0,5 para 0,6 unidades relativas, para THR até cerca de 50% (ver

caixa na Fig. 5.20), embora para THR mais baixos aumente até valores de 0,7 unidades

relativas. qE é considerado o mecanismo de dissipação de energia não-fotoquímica mais

importante, reflectindo um processo de dissipação de energia desencadeado pelo aumento da

concentração de protões no lúmen dos tilacóides, na presença de luz. Esta manutenção de qE,

revela que a variedade PB269 não necessita activar este mecanismo até valores moderados de

stresse hídrico, mantendo uma actividade fotossintética razoável (ver Fig. 5.4), activando-os

apenas em stresse hídrico intenso. Este facto poderá implicar um mecanismo de adaptação

para stresse hídrico moderado da variedade PB269.

PB269

0 25 50 75 1000.4

0.5

0.6

0.7

0.8

THR (%)

qE

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

0 25 50 75 1000.4

0.5

0.6

0.7

0.8

THR (%)

qE

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆; - -): y = 0,7394 – 0,002877x (r2 = 0,76 ; p < 0,01)

Recuperação (�; –): y = 0,7402 – 0,003023x (r2 = 0,76 ; p < 0,01)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

121

Na variedade PB369, qE apresenta um valor de 0,5 unidades relativas perto da

hidratação total e sofre um progressivo aumento até 0,7 unidades relativas, para THR de cerca

de 20%. Este aumento do qE poderá dever-se ao facto de haver uma diminuição da actividade

do ciclo de Calvin, ocorrendo uma baixa regeneração de ADP, com consequente aumento da

concentração protónica no lúmen dos tilacóides, verificando-se uma energização dos mesmos

(Marques da Silva, 1999; Tezara et al., 1999). Embora as condições de recuperação tenham

sido alteradas, qE recupera para os valores iniciais em ambas as variedades.

Na Fig. 5.21 está representada a variação do coeficiente de amortecimento de transição

de estado (qT) com o THR.

Fig. 5.21 – Variação do coeficiente de amortecimento de transição de estado (qT) em função do

teor hídrico relativo (THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas

de diferentes plantas.

qT está relacionado com a transição do estado energético I para o estado energético II,

que resulta da fosforilação de polipéptidos do LHCII, permitindo-lhe o movimento lateral das

zonas ricas em PSII dos grana para as zonas ricas em PSI do estroma, aumentando a

eficiência da fotossíntese através de uma redistribuição de energia entre os dois fotossistemas

(Quick e Stitt, 1989).

Em ambas as variedades há um aumento de qT com a intensificação do stresse hídrico,

embora ligeiramente maior na variedade PB369. Além disso, em PB269, qT parece não variar

significativamente até THR perto de 50%. Esta variação parece indicar que o stresse hídrico

tem um maior impacto na fosforilação do LHCII, no caso da variedade PB369. No entanto, na

recuperação notam-se diferenças entre as duas variedades, uma vez que em PB269, qT

PB269

0 25 50 75 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

THR (%)

qT

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

0 25 50 75 1000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

THR (%)

qT

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆; - -): y = 0,3145 – 0,00289x (r2 = 0,91 ; p < 0,01)

Recuperação (�; –): y = 0,3879 – 0,00755x + 5,274e-5x2

(r2 = 0,94 ; p < 0,01)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

122

permaneceu constante no valor de 0,2 unidades relativas, enquanto que PB369 recuperou

ligeiramente.

Na Fig. 5.22 está representada a variação do coeficiente de amortecimento

fotoinibitório (qI) em função do THR.

O parâmetro qI está relacionado com o mecanismo de dissipação não-fotoquímica

pelos próprios centros de reacção do PSII, quando existe uma sobre-redução do pool de

quinonas, ocorrendo fotoinibição (Quick e Stitt, 1989).

Na variedade PB269 há um ligeiro aumento de 0,2 para 0,4 unidades relativas quando

foi atingido um THR de 30%, valor claramente inferior ao obtido na variedade PB369, de 0,6

unidades relativas para THR semelhantes. Um aumento de qI pode estar relacionado com a

degradação da proteína D1 do centro de reacção (tipo lesivo) mas também poderá estar

relacionado com um mecanismo adaptativo, uma vez que esse aumento pode preceder a

degradação dessa proteína (Pieters et al., 2003).

Na recuperação, PB269 manteve-se nas 0,4 unidades relativas, enquanto que em

PB369 houve uma diminuição de 0,8 para 0,4 unidades relativas.

Fig. 5.22 – Variação do coeficiente de amortecimento fotoinibitório (qI) em função do teor hídrico

relativo (THR), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de

diferentes plantas.

Globalmente, a análise dos componentes de qN mostra que qE tem um peso maior na

variedade PB269, enquanto qI e qT têm mais relevo na variedade PB369, durante a imposição

do stresse. Isto parece sugerir que a variedade PB269 induz mecanismos mais rápidos (qE) de

PB269

0 25 50 75 1000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

THR (%)

qI

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆; - -): y = 0,5118 – 0,002972x (r2 = 0,66 ; p < 0,01)

Recuperação (�)

PB369

0 25 50 75 1000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

THR (%)

qI

(un

idad

es r

ela

tivas)

Stresse (∆; - -): y = 1,067 – 0,01818x + 9,4599e-5x2

(r2 = 0,98 ; p < 0,05)

Recuperação (�; –): y = 1,123 – 0,0221x + 0,0001524x2

(r2 = 0,92 ; p < 0,01)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

123

ajustamento a situações de variação da disponibilidade hídrica e possui uma menor proporção

de danos no PSII (qI).

Na Fig. 5.23 está representada a variação da taxa de transporte electrónico (ETR) em

função de PPFD, para diferentes THR, apresentando um perfil semelhante ao observado na

variação de A com PPFD (Fig. 5.4).

Fig. 5.23 – Variação da taxa de transporte electrónico (ETR) em função da densidade de fluxo

fotónico fotossintético (PPFD), nas experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5

folhas de diferentes plantas.

Observa-se na Tabela 5.5, os parâmetros retirados da aplicação do modelo de Platt et

al. (1980) na Fig. 5.23.

PB269 Stresse

0 250 500 7500

20

40

60

80

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

ET

R (

µµ µµm

ol

m-2

s-1

)

THR = 93,9±2,9 (�;–): y = 241144 * ((1 – exp (– 0,3215x /

241144)) * exp (– 558,3x / 241144) (r2 = 0,98 ; p < 0,01)

THR = 68,8±14,9 (�;- -): y = 180433 * ((1 – exp (– 0,2428x /

180433)) * exp (– 483,1x / 180433) (r2 = 0,87 ; p < 0,01)

THR = 37,0±3,2 (∆)

PB369 Stresse

0 250 500 7500

20

40

60

80

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

ET

R (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

THR = 95,6±1,5 (�;–): y = 221588 * ((1 – exp (– 0,3611x /

221588)) * exp (– 592,4x / 221588) (r2 = 0,92 ; p < 0,01)

THR = 83,5±11,4 (�;- -): y = 85740 – 8.478 * ((1 – exp (– 0,1917x

/ 85740)) * exp (– 267,1x / 85740) (r2 = 0,92 ; p < 0,01)

THR = 26,7±11,2 (∆)

PB269 Recuperação

0 250 500 7500

20

40

60

80

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

ET

R (

µµ µµm

ol.

m-2

.s-1

)

THR = 76,8±3,2 (�;–): y = 121101 * ((1 – exp (– 0,2841x /

121101)) * exp (– 617,8x / 121101) (r2 = 0,90 ; p < 0,05)

THR = 76,1±5,7 (�;- -): y = 178010 * ((1 – exp (– 0,2946x /

178010)) * exp (– 713,5e7x / 178010) (r2 = 0,92 ; p < 0,01)

THR = 37,0±3,2 (∆)

PB369 Recuperação

0 250 500 7500

20

40

60

80

PPFD (µµµµmol fotões.m-2.s-1)

ET

R (

µµ µµm

ol

m-2

s-1

)

THR = 73,9±1,4 (�;–): y = 162754 * ((1 – exp (– 0,2847x /

162754)) * exp (– 387,9x / 162754) (r2 = 0,83 ; p < 0,05)

THR = 74,0±16,0 (�;- -): y =170994 * ((1 – exp (– 0,2212x /

170994)) * exp (– 459,6x / 170994) (r2 = 0,89 ; p < 0,01)

THR = 26,7±11,2 (∆)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

124

Tabela 5.5 – Parâmetros da equação de Platt et al. (1980), resultantes da aplicação do modelo à

Fig. 5.23., nas duas variedades portuguesas de milho.

Pode observar-se uma ETR máxima de cerca de 50 µmol.m-2.s-1, em ambas as

variedades, para uma PPFD entre os 400 e os 500 µmol fotões.m-2.s-1, valores em que as

plantas foram cultivadas na câmara climatizada. Ambas as variedades demonstram uma

diminuição deste parâmetro para PPFD mais elevadas, demonstrando um efeito de

fotoinibição, e um valor de eficiência fotossintética semelhante (valor de α). No que respeita

ao parâmetro β, o modelo não conseguiu estimar este parâmetro com precisão, pelo que não

são apresentados na Tabela 5.5.

À medida que o stresse hídrico aumenta, com a consequente diminuição do THR,

verifica-se uma diminuição de ETR, por possível afectação da cadeia transportadora de

electrões e/ou danos no PSII e também devido a uma diminuição da taxa de actividade do

ciclo de Calvin. A variedade PB269 demonstra uma maior ETR para THR mais baixos,

comparativamente com a variedade PB369, bem como uma eficiência fotossintética superior

(valor de α superior em PB269).

No final do período de stresse, em que ambas as variedades apresentavam um THR

muito reduzido, o ETR era reduzido para PPFD mais baixos e nulos para PPFD mais

elevados. O transporte de electrões a THR muito baixos, quando A é pequeno ou nulo, é

mantido principalmente devido ao funcionamento da fotorrespiração (Lawlor e Cornic, 2002).

PB269 PB369 Stresse Stresse

THR (%) THR (%)

Parâmetros 93,9 ± 2,9 68,8 ± 14,9 37,0 ± 3,2 95,6 ± 1,5 83,5 ± 11,4 26,7 ± 11,2

ETRmáx (mmol.m-2.s-1)

51,07 ± 22,43 33,35 ± 8,32 - 49,67 ±13,40 22,63 ± 8,57 -

αααα ((((µmol CO2 / µmol fotões)

0,322 ± 0,040 0,243 ± 0,089 - 0,361 ± 0,028 0,192 ± 0,013 -

Recuperação Recuperação

THR (%) THR (%)

Parâmetros 37,0 ± 3,2 76,1 ± 5,7 76,8 ± 3,2 26,7 ± 11,2 74,0 ± 16,0 73,9 ± 1,4

ETRmáx (mmol.m-2.s-1) - 27,03 ± 12,43 20,48 ± 6,92 - 30,27 ±12,82 43,93 ± 6,04

αααα ((((µmol CO2 / µmol fotões)

- 0,295 ± 0,067 0,284 ± 0,037 - 0,221 ± 0,040 0,285 ± 0,048

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

125

Durante a recuperação verificou-se que PB269 apresentou algumas dificuldades em

recuperar para os valores iniciais, embora PB369 tenha recuperado quase totalmente o seu

perfil de ETR em resposta a um gradiente de luz.

Na Fig. 5.23, não foram representados os pontos obtidos a PPFD de 1300 µmol

fotões.m-2.s-1, uma vez que eram nulos e não estavam concordantes com as taxas

fotossintéticas registadas durante este ensaio para aquela gama de PPFD, pelo que terá

ocorrido uma interferência entre o fluorómetro e o PPFD elevado que foi utilizado (Maxwell

et al., 1999).

Desta forma, verifica-se que o stresse hídrico afecta grande parte da componente

química e fotoquímica da fotossíntese nas duas variedades, embora PB269 tenha claramente

surgido como a variedade mais tolerante, apresentando uma estratégia de redução progressiva

da fotossíntese com a diminuição do THR, por dissipação de energia não-fotoquímica

desencadeado pelo aumento da concentração de protões no lúmen dos tilacóides na presença

de luz (qE), principalmente em stresse moderado. Por outro lado, a variedade PB369

apresentou sérias dificuldades durante o stresse hídrico, com danos no PSII a THR mais

elevados (redução de Fv/Fm e aumento de qI) do que em PB269.

5.3.5.3.5.3.5.3.4444. . . . Clorofilas Totais e CarotenóidesClorofilas Totais e CarotenóidesClorofilas Totais e CarotenóidesClorofilas Totais e Carotenóides

A quantificação das clorofilas e carotenóides totais foi realizada nas amostras

recolhidas durante o ensaio das curvas A/CO2a, e, desta forma, o período de stresse e a

recuperação na câmara climatizada foram efectuadas em condições idênticas.

Na Fig. 5.24 está representada a variação da clorofila a em função do THR. Observa-

se, em ambas as variedades, um valor de cerca de 3 mg.g-1 peso seco perto da hidratação total.

Na variedade PB269, ocorreu uma diminuição para cerca de 2 mg.g-1 peso seco para um THR

de cerca de 60%, e durante a recuperação permanece entre 1-2 mg.g-1 peso seco. Estes níveis

reduzidos de clorofila a durante a recuperação poderão ser, em parte, responsáveis pela fraca

recuperação desta variedade (ver Fig. 5.9). Por outro lado, na variedade PB369, só se obteve

uma medição abaixo de THR de 80%, não ocorrendo qualquer variação significativa entre o

período de stresse e o de recuperação.

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126

Fig. 5.24 – Variação da clorofila a em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo das

experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de diferentes plantas.

Na Fig. 5.25 está representada a variação da clorofila b em função do THR.

Fig. 5.25 – Variação da clorofila b em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo das

experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de diferentes plantas.

Na variedade PB269, ocorre uma ligeira descida da clorofila b de 0,50 mg.g-1 peso

seco para 0,25 mg.g-1 peso seco, com a diminuição do THR. Após irrigação, permanece em

torno deste último valor. Na variedade PB369, tal como na clorofila a, não se verificam

alterações, dado que só existe um ponto abaixo do THR de 80%.

Na Fig. 5.26 está representada a variação da clorofila total com o THR.

PB269

60 70 80 90 1000

1

2

3

4

5

THR (%)

Clo

rofi

laa

(mg

.g-1

peso

seco

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

60 70 80 90 1000

1

2

3

4

5

THR (%)

Clo

rofi

laa

(mg

.g-1

peso

seco

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB269

60 70 80 90 1000.00

0.25

0.50

0.75

1.00

THR (%)

Clo

rofi

lab

(mg

.g-1

peso

seco

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

60 70 80 90 1000.00

0.25

0.50

0.75

1.00

THR (%)

Clo

rofi

lab

(mg

.g-1

peso

seco

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

127

Fig. 5.26 – Variação da clorofila total em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo das

experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de diferentes plantas.

Embora estes dados não sejam estatisticamente significativos, observa-se uma

variação semelhante à observada para a clorofila a, dado que a clorofila b apresenta valores

muito mais baixos e não apresenta variações significativas.

Durante períodos de stresse hídrico, a diminuição do conteúdo em clorofilas é comum,

tendo sido observada quer em milho (Alberte et al., 1977), quer em trigo (Loggini et al.,

1999). Tal facto deve-se à exposição das clorofilas a agentes de degradação, como ROS, com

a diminuição da quantidade de água presente nas células e do próprio desequilíbrio entre a

fase fotoquímica e a fase química (Loggini et al., 1999).

Dependendo do nível de stresse a que as plantas estão sujeitas, poderá haver maior ou

menor degradação de clorofila. No entanto, a variedade PB269 consegue suportar stresses

hídricos elevados mantendo alguma actividade fotossintética, mas não conseguindo impedir a

degradação da clorofila, o que vai implicar alguns problemas na recuperação.

Por outro lado, na azinheira e no sobreiro, espécies tipicamente mediterrânicas, ocorre

uma diminuição da clorofila, durante o Verão, de forma a regular a fotossíntese em condições

de baixos recursos hídricos e elevada radiação solar (Maroco et al., 2002).

Na Fig. 5.27 está representada a variação dos carotenóides totais com o THR.

PB269

60 70 80 90 1000

1

2

3

4

5

THR (%)

Clo

rofi

la t

ota

l

(mg

.g-1

peso

seco

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

60 70 80 90 1000

1

2

3

4

5

THR (%)

Clo

rofi

la t

ota

l

(mg

.g-1

peso

seco

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

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128

Fig. 5.27 – Variação dos carotenóides totais em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo

das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 5 folhas de diferentes plantas.

A variedade PB269 apresenta um valor de carotenóides totais de cerca de 1,7 mg.g-1

peso seco em folhas totalmente hidratadas, enquanto PB369 apresenta um valor de 1,4 mg.g-1

peso seco. Com a diminuição do THR, em PB269, os carotenóides diminuem até cerca de 1

mg.g-1 peso seco. Em PB369, não se observam quaisquer diferenças significativas até THR de

85%.

Durante o período de recuperação, PB369 não sofre quaisquer alterações

significativas. Por outro lado, em PB269, os carotenóides totais diminuem para cerca de 0,5

mg.g-1 peso seco, durante o período de recuperação. Tal facto pode revelar mecanismos

diferentes de resposta ao stresse hídrico, nomeadamente algumas alterações nas vias

metabólicas dos carotenóides, que podem levar, em parte, à produção de ABA, com

consequente aumento da tolerância ao stresse hídrico (Schwartz et al., 1997; Borel et al.,

2001).

5.3.55.3.55.3.55.3.5. Metabolismo do Carbono. Metabolismo do Carbono. Metabolismo do Carbono. Metabolismo do Carbono

As actividades das principais enzimas do metabolismo fotossintético das duas

variedades de milho seleccionadas foram determinadas a partir de amostras recolhidas durante

o ensaio de determinação das curvas A/PPFD. Durante este ensaio, as câmaras climatizadas

sofreram uma avaria durante o período de recuperação, aumentando a temperatura dos 25ºC

para os 38ºC, pelo que é necessário ter este facto em conta na análise e discussão dos dados

obtidos.

PB269

60 70 80 90 1000

1

2

3

THR (%)

Caro

ten

óid

es t

ota

is

(mg

.g-1

peso

seco

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

60 70 80 90 1000

1

2

3

THR (%)

Caro

ten

óid

es t

ota

is

(mg

.g-1

peso

seco

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

129

5.3.5.1. 5.3.5.1. 5.3.5.1. 5.3.5.1. RRRRibuloseibuloseibuloseibulose----1,51,51,51,5----BBBBisfosfato isfosfato isfosfato isfosfato CCCCarboxilase/arboxilase/arboxilase/arboxilase/OOOOxigenase xigenase xigenase xigenase ((((RuBisCORuBisCORuBisCORuBisCO))))

Na Fig. 5.28 está representada a variação da actividade inicial da RuBisCO em função

do THR, no ensaio de stresse lento.

Fig. 5.28 – Variação da actividade inicial da RuBisCO em função do teor hídrico relativo (THR),

ao longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes

plantas.

Perto da hidratação total, a variedade PB369 apresenta uma actividade inicial da

RuBisCO de 3,2 µmol RuBP.hr-1.mg-1 proteína solúvel, a qual é superior à da variedade

PB269 (2,6 µmol RuBP.hr-1.mg-1 proteína solúvel). Em ambas as variedades há uma

diminuição da actividade inicial da RuBisCO com a diminuição do THR. Para THR de cerca

de 30%, as duas variedades apresentam actividades enzimáticas iniciais da RuBisCO muito

reduzidas que mantêm durante a recuperação. No entanto, no final do stresse, a A apresentava

valores negativos (Fig. 5.4), que recuperou muito pouco durante o período de recuperação. O

facto de A ser negativo, embora exista alguma actividade inicial da RuBisCO para o mesmo

THR poderá estar relacionado com uma reduzida A bruta que corresponderá a uma A efectiva

negativa.

A diminuição da actividade inicial da RuBisCO também poderá estar relacionada com

a inibição ou não-activação dos locais activos da enzima (Parry et al., 2002). Inibidores como

o CA1P ligam-se fortemente aos locais de carbamilação em condições de luz reduzida e à

noite (Holbrook et al., 1994) e a sua remoção é facilitada pela RuBisCO activase (Hammond

et al., 1998), pelo que pode a sua actividade ser afectada à medida que o stresse hídrico

progride.

PB269

25 50 75 1000

1

2

3

4

5

THR (%)

Ac

tiv

idad

e i

nic

ial

da R

uB

isC

O

(µµ µµm

ol R

uB

P.h

r-1.m

g-1

pro

teín

a)

Stresse (∆; - -): y = – 0,8214 + 0,03390x (r2 = 0,71 ; p < 0,01)

Recuperação (�; –)

PB369

25 50 75 1000

1

2

3

4

5

THR (%)

Ac

tiv

ida

de

in

icia

l d

a R

uB

isC

O

(µµ µµm

ol R

uB

P.h

r-1.m

g-1

pro

teín

a)

Stresse (∆)

Recuperação (�; –)

Page 148: Ricardo Filipe Duarte da Cruz InduçãoIndução e Recuperação ...repositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/1822/6200/1/Indu%C3%A7%C3%A3o... · Este trabalho teve como objectivo geral,

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

130

Na Fig. 5.29 está representada a variação da actividade total da RuBisCO em função

do THR, no ensaio de stresse lento.

Fig. 5.29 – Variação da actividade total da RuBisCO em função do teor hídrico relativo (THR), ao

longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

Ambas as variedades apresentam um valor de actividade total da RuBisCO de cerca de

9 µmol RuBP.hr-1.mg-1 proteína solúvel, perto da hidratação total. Tal como na actividade

inicial, também a actividade total diminui de forma semelhante com a diminuição do THR.

Durante a recuperação verifica-se, tal como na actividade inicial, uma tendência para

haver uma diminuição da actividade total, com o aumento do THR (ver caixas Fig. 5.28 e

5.29). É preciso ter em conta as condições de temperatura durante a recuperação que parecem

ter afectado quer a actividade inicial, quer a actividade total da RuBisCO, que poderão

resultar de alterações na conformação estrutural da enzima e, assim, a sua actividade (Parry et

al., 2002). Também poderia dever-se a alterações da concentração das proteínas totais, mas tal

não se observou após a quantificação das mesmas.

Observa-se, em ambas as actividades, um padrão semelhante de diminuição com o

progresso do stresse hídrico. No entanto, a variedade PB269 apresenta uma diminuição

gradual com o THR, enquanto a variedade PB369 apresenta uma diminuição em patamar,

ocorrendo uma diminuição brusca das actividades num determinado THR (cerca de 80%),

como já havia sido verificado durante a fase I deste trabalho.

Comparando com os dados da Fig. 5.4, em que ambas as variedades apresentam

valores negativos da A para THR perto dos 30%, poderá constatar-se que para estes valores

reduzidos de THR, a respiração apresenta uma contribuição relativa mais importante que a da

fotossíntese (Lawlor e Cornic, 2002). No entanto, A recupera parcialmente, embora as

PB269

25 50 75 1000

5

10

15

THR (%)

Ac

tiv

ida

de

to

tal d

a R

uB

isC

O

(µµ µµm

ol

Ru

BP

.hr-1

.mg

-1 p

rote

ína)

Stresse (∆; - -): y = – 2,145 + 0,1083x (r2 = 0,76 ; p < 0,01)

Recuperação (�)

PB369

25 50 75 1000

5

10

15

THR (%)

Acti

vid

ad

e t

ota

l d

a R

uB

isC

O

(µµ µµm

ol R

uB

P.h

r-1.m

g-1

pro

teín

a)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

131

actividades da RuBisCO permaneçam inalteradas, o que poderá em parte estar relacionado

com a recuperação da estrutura das folhas (que se encontravam enroladas, possivelmente com

a estrutura histológica distorcida), que facilita a difusão do CO2 até aos locais de fixação, ou

ainda com a diminuição da respiração, com o aumento da gs (correspondendo a uma

diminuição da limitação estomática) ou com a recuperação dos centros activos do PSII.

Na Fig. 5.30 está representada a activação da RuBisCO em função do THR, no ensaio

de stresse lento.

Perto da hidratação total, pode observar-se que a activação da RuBisCO na variedade

PB369 (cerca de 40%) é ligeiramente superior à da variedade PB269 (cerca de 30%). Embora

em ambas haja uma certa tendência para diminuir com a diminuição do THR, esta não é

estatisticamente significativa, ou seja, as diminuições das actividades da RuBisCO não se

devem a grandes alterações na activação da enzima e, provavelmente, dever-se-á a uma

diminuição de Kcat (Parry et al., 2002).

Fig. 5.30 – Variação da activação da RuBisCO em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo

das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

Na redução de A, a RuBisCO tem certamente um papel importante na medida que

ocorre uma diminuição das suas actividades, a qual poderá ter como origem uma diminuição

da quantidade de RuBisCO presente nas folhas (Gallais e Hirel, 2004), embora tal facto só

pudesse ser comprovado por uma quantificação efectiva da enzima, dado que poderá ser

resultado apenas de uma inibição ou não-activação da enzima (Parry et al., 2002). No entanto,

como tem sido observado ao longo deste trabalho, a RuBisCO não é o único factor a

contribuir para a diminuição de A, como o demonstram os resultados de fluorescência da

clorofila. O conjunto de todos os processos, desde a captação da luz até à fixação do carbono,

formam uma rede complexa de interacções, as quais serão afectadas pelo stresse hídrico em

PB269

25 50 75 1000

20

40

60

THR (%)

Ac

tiv

ão

da

Ru

Bis

CO

(%

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

25 50 75 1000

20

40

60

THR (%)

Ac

tiv

ão

da

Ru

Bis

CO

(%

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

132

diferentes graus, contribuindo de formas diferentes para a redução de A, com a diminuição do

THR.

Na Fig. 5.31 está representada a variação das actividades inicial e total da RuBisCO

em função do THR, no ensaio de stresse rápido.

As actividades observadas perto da hidratação total são inferiores às observadas nas

plantas do stresse lento devido ao facto de terem passado por dois dias de temperaturas

elevadas (38ºC) devido a avaria da câmara climatizada. Este dado é preciso ter em conta na

análise dos dados do stresse rápido.

Em ambas as variedades, não há uma variação estatisticamente significativa das

actividades inicial e total da RuBisCO com a diminuição do THR. Contudo, em PB269

observa-se uma descida da actividade para THR inferiores a 50%.

Fig. 5.31 – Variação das actividades inicial (∆) e total (�) da RuBisCO em função do teor hídrico

relativo (THR), ao longo das experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas

de diferentes plantas.

Também na activação da RuBisCO não há uma variação estatisticamente significativa,

situando-se entre 30% e 40%, ao longo do THR (Fig. 5.32).

Lal e Edwards (1996) encontraram valores superiores de activação para Zea mays

(cerca de 80%). Os valores observados neste trabalho poderão reflectir as condições de

crescimento das plantas, uma vez que o estado de activação da RuBisCO está dependente da

PPFD ambiente (Perchorowicz et al., 1981; Zhang e Portis, 1999).

PB269

25 50 75 1000

1

2

3

4

5

THR (%)

Ac

tiv

idad

e d

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uB

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O

(µµ µµm

ol R

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g-1

pro

teín

a)

Actividade inicial (∆)

Actividade total (�)

PB369

25 50 75 1000

1

2

3

4

5

THR (%)

Ac

tiv

ida

de

da

Ru

Bis

CO

(µµ µµm

ol

Ru

BP

.hr-1

.mg

-1 p

rote

ína)

Actividade inicial (∆)

Actividade total (�)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

133

Fig. 5.32 – Variação da activação da RuBisCO em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo

das experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

Desta forma, em ambas as variedades, verificam-se diferenças nas actividades da

RuBisCO quando sujeitas a diferentes tipos de stresse. No stresse lento, há uma progressiva

diminuição das actividades da RuBisCO com a diminuição do THR, enquanto que no stresse

rápido, a enzima não sofre alteração nas suas actividades. No entanto, verificou-se na fase I

deste trabalho que ocorria uma diminuição da A com a diminuição do THR, no stresse rápido

(Fig. 4.13). Tal facto indica que se deverá a limitações estomáticas da fotossíntese (Fig. 4.14)

ou a outro tipo de limitações não-estomáticas, nomeadamente a elementos da cadeia

transportadora de electrões (Fig. 4.25) ou a alterações das actividades de outras enzimas do

ciclo fotossintético do carbono (Fig.5.35 e Fig. 5.37).

5.3.5.25.3.5.25.3.5.25.3.5.2. . . . Fosfoenolpiruvato Carboxilase (PEPC)Fosfoenolpiruvato Carboxilase (PEPC)Fosfoenolpiruvato Carboxilase (PEPC)Fosfoenolpiruvato Carboxilase (PEPC)

Na Fig. 5.33 está representada a variação da actividade inicial da PEPC em função do

THR.

Perto da hidratação total, a variedade PB269 apresenta uma actividade inicial da PEPC

de cerca de 30 µmol PEP.hr-1.mg-1 proteína solúvel, inferior à observada na variedade PB369

(cerca de 40 µmol PEP.hr-1.mg-1 proteína solúvel). No entanto, verifica-se que, com a

diminuição do THR, a actividade inicial da PEPC vai diminuindo até atingir o valor de 10

µmol PEP.hr-1.mg-1 proteína solúvel para THR na ordem dos 30%. Isto não está de acordo

com o observado para o milho, em que a actividade da PEPC se mantém ou chega a aumentar

em condições de stresse moderado, a qual tem sido relacionada com o aumento da

concentração de prolina, através do aumento dos seus percursores (Jeanneau et al., 2002).

PB269

25 50 75 1000

20

40

60

THR (%)

Ac

tiv

açã

o d

a R

uB

isC

O (

%)

PB369

25 50 75 1000

20

40

60

THR (%)

Ac

tiv

ão

da

Ru

Bis

CO

(%

)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

134

Fig. 5.33 – Variação da actividade inicial da PEPC em função do teor hídrico relativo (THR), ao

longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

Durante a recuperação, tal como já foi verificado nas actividades da RuBisCO, a

actividade inicial da PEPC de ambas as variedades permanece constante no valor observado

no final do período de stresse.

Na Fig. 5.34 está representada a variação da actividade máxima da PEPC em função

do THR.

Fig. 5.34 – Variação da actividade máxima da PEPC em função do teor hídrico relativo (THR), ao

longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

A variedade PB269 apresenta, perto da hidratação total, uma actividade máxima da

PEPC de cerca de 40 µmol PEP.hr-1.mg-1 proteína solúvel. Na variedade PB369, o valor da

actividade total da PEPC é superior (50 µmol PEP.hr-1.mg-1 proteína solúvel). Em ambas as

variedades, há uma diminuição da actividade total com a diminuição do THR, atingindo os 15

PB269

25 50 75 1000

10

20

30

40

50

THR (%)

Ac

tiv

ida

de i

nic

ial d

a P

EP

C

(µµ µµm

ol P

EP

.hr-1

.mg

-1 p

rote

ína)

Stresse (∆; - -): y = 4,161 + 0,2432x (r2 = 0,59 ; p < 0,05)

Recuperação (�)

PB369

25 50 75 1000

10

20

30

40

50

THR (%)

Ac

tiv

ida

de

in

icia

l d

a P

EP

C

(µµ µµm

ol P

EP

.hr-1

.mg

-1 p

rote

ína)

Stresse (∆; - -): y = 0,06901 + 0,4057x (r2 = 0,83 ; p < 0,01)

Recuperação (�)

PB269

25 50 75 1000

10

20

30

40

50

60

70

THR (%)

Ac

tiv

idad

e m

áx

ima

da

PE

PC

(µµ µµm

ol P

EP

.hr-1

.mg

-1 p

rote

ína)

Stresse (∆; - -): y = 2,992 +0,3476x (r2 = 0,89 ; p < 0,01)

Recuperação (�)

PB369

25 50 75 1000

10

20

30

40

50

60

70

THR (%)

Acti

vid

ad

e m

áxim

a d

a P

EP

C

(µµ µµm

ol P

EP

.hr-1

.mg

-1 p

rote

ína)

Stresse (∆; - -): y = 7,812 + 0,4423x (r2 = 0,85 ; p < 0,01)

Recuperação (�)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

135

µmol PEP.hr-1.mg-1 proteína solúvel na variedade PB269 e os 20 µmol PEP.hr-1.mg-1 proteína

solúvel na variedade PB369, para THR de 30%.

No período de recuperação, mais uma vez, a actividade máxima da PEPC permaneceu

inalterada nos valores registados no final do período de stresse.

Nos ensaios de stresse rápido, verificam-se, tal como nas actividades da RuBisCO,

diferenças significativas em relação aos ensaios de stresse lento.

Na Fig. 5.35 está representada a variação das actividades inicial e máxima da PEPC

em função do THR, no ensaio de stresse rápido.

Fig. 5.35 – Variação das actividades inicial (∆) e máxima (�) da PEPC em função do teor hídrico

relativo (THR), ao longo das experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas

de diferentes plantas.

Embora as diferenças observadas entre os valores das actividades da PEPC, entre as

duas variedades, sejam notórias, em nenhuma há alteração com a diminuição do THR. No

entanto, mais uma vez se relembra que as actividades observadas perto da hidratação total são

inferiores às observadas nas plantas do stresse lento devido ao facto de terem passado por dois

dias de temperaturas elevadas (38ºC) devido a avaria da câmara climatizada.

A regulação da enzima PEPC é efectuada essencialmente pela resposta a metabolitos

efectores, como a inibição pelo malato e a activação por açúcares fosfatados (Ting e Osmond,

1973; Doncaster e Leegood, 1987). Os efeitos destes metabolitos são modulados pela

fosforilação da enzima, a qual é reversível, dependente da luz e levada a termo pela enzima

PEPCK. Esta fosforilação leva a uma diminuição da sensibilidade à inibição pelo malato e a

um aumento da sensibilidade à activação pela glucose-6-fosfato (Jao e Chollet, 1992; Bailey

et al., 2000). Por outro lado, a actividade da enzima PEPCK está dependente da quantidade de

PB269

25 50 75 1000

10

20

30

40

50

THR (%)

Ac

tivid

ad

e d

a P

EP

C

(µµ µµm

ol P

EP

.hr-1

.mg

-1 p

rote

ína)

Actividade inicial (∆)

Actividade máxima (�)

PB369

25 50 75 1000

10

20

30

40

50

THR (%)

Ac

tivid

ad

e d

a P

EP

C

(µµ µµm

ol P

EP

.hr-1

.mg

-1 p

rote

ína)

Actividade inicial (∆)

Actividade máxima (�)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

136

ATP presente, a qual diminui durante períodos de stresse hídrico (Tezara et al., 1999).

Também as curvas A/Ci (não representadas, mas muito semelhantes às curvas A/CO2a da Fig.

5.9), através da análise do seu declive inicial (eficiência de carboxilação), indicam algumas

propriedades cinéticas da enzima (Bailey et al., 2000). Desta forma, observa-se uma

diminuição do declive da curva à medida que o stresse hídrico aumenta, reflectindo uma

diminuição da actividade da PEPC. Na variedade PB269, existe alguma recuperação após

irrigação, enquanto que na variedade PB369 a recuperação não existe, continuando o declive

inicial do gráfico a diminuir.

5.3.5.3. 5.3.5.3. 5.3.5.3. 5.3.5.3. Enzima Málica Enzima Málica Enzima Málica Enzima Málica DDDDependente de NADP (EMependente de NADP (EMependente de NADP (EMependente de NADP (EM----NADP)NADP)NADP)NADP)

Na Fig. 5.36 está representada a variação da actividade da enzima málica dependente

de NADP em função do THR, no ensaio de stresse lento.

Fig. 5.36 – Variação da actividade máxima da EM-NADP em função do teor hídrico relativo

(THR), ao longo das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de

diferentes plantas.

Ambas as variedades apresentam valores de actividade desta enzima de cerca de 15

µmol malato.h-1.mg-1 proteína solúvel, na hidratação total. No entanto, na variedade PB269,

há uma clara diminuição da actividade com a redução do THR até 5 µmol malato.hr-1.mg-1

proteína solúvel em THR de cerca de 30%. Em PB369, a variação não é significativa.

Durante a recuperação, PB269 mantém a actividade em 5 µmol malato.hr-1.mg-1

proteína solúvel, enquanto que em PB369 há uma diminuição até atingir o mesmo valor de

PB269

25 50 75 1000

5

10

15

20

THR (%)

Ac

tiv

ida

de d

a E

M-N

AD

P

(µµ µµm

ol

mala

to.h

r-1.m

g-1

pro

teín

a)

Stresse (∆; - -): y = – 3,609 + 0,1982x (r2 = 0,92 ; p < 0,01)

Recuperação (�)

PB369

25 50 75 1000

5

10

15

20

THR (%)

Ac

tiv

ida

de

da

EM

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DP

(µµ µµm

ol

ma

lato

.hr-1

.mg

-1 p

rote

ína)

Stresse (∆)

Recuperação (�; –): y = 16,84 – 0,1537x (r2 = 0,66 ; p < 0,05)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

137

actividade a THR de 75%. No entanto, estes dados não permitem discutir a recuperação,

dadas as circunstâncias em que esta ocorreu.

A variação da actividade no ensaio do stresse lento contrasta claramente com a

variação obtida no ensaio de stresse rápido (Fig. 5.37). No ensaio de stresse rápido, a

actividade não sofre alterações estatisticamente significativas, mantendo-se constante em

ambas as variedades. No entanto, a actividade em PB269, na hidratação total, é cerca de

metade da verificada nos ensaios de stresse lento, o que pode indicar alguma perturbação

nesta variedade durante o crescimento das plantas.

Fig. 5.37 – Variação da actividade máxima da EM-NADP em função do teor hídrico relativo

(THR), ao longo das experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de

diferentes plantas.

Esta manutenção da actividade da enzima málica no milho, em condições de stresse

rápido, já havia sido verificada por outros autores (Saccardy et al., 1996), e a expressão do

gene desta enzima em plantas de tabaco, melhorou consideravelmente a sua tolerância ao

stresse hídrico (Laporte et al., 2002). No entanto, as actividades observadas perto da

hidratação total são inferiores às observadas nas plantas do stresse lento pelas razões já

referidas.

5.3.65.3.65.3.65.3.6. . . . Determinação de Determinação de Determinação de Determinação de Solutos CompatíveisSolutos CompatíveisSolutos CompatíveisSolutos Compatíveis

A quantificação de aminoácidos livres e prolina, para averiguar a possível presença de

solutos compatíveis, foi realizada em três ensaios, dois de stresse lento e um de stresse rápido.

PB269

25 50 75 1000

5

10

15

20

THR (%)

Ac

tiv

ida

de d

a E

M-N

AD

P

(µµ µµm

ol

mala

to.h

r-1.m

g-1

pro

teín

a)

PB369

25 50 75 1000

5

10

15

20

THR (%)

Ac

tiv

ida

de

da

EM

-NA

DP

(µµ µµm

ol

ma

lato

.hr-1

.mg

-1 p

rote

ína)

Page 156: Ricardo Filipe Duarte da Cruz InduçãoIndução e Recuperação ...repositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/1822/6200/1/Indu%C3%A7%C3%A3o... · Este trabalho teve como objectivo geral,

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

138

5.3.6.15.3.6.15.3.6.15.3.6.1. . . . Aminoácidos LivresAminoácidos LivresAminoácidos LivresAminoácidos Livres

A concentração de aminoácidos livres, na variedade PB269, permaneceu relativamente

constante ao longo da experiência de stresse lento (cerca de 3 µg.mg-1 peso seco), ao contrário

da variedade PB369 que, para THR semelhantes (30 %), duplicou a sua concentração (de

cerca de 3-4 µg.mg-1 peso seco para cerca de 8 µg.mg-1 peso seco) (Fig. 5.38), possivelmente

devido a efeitos de senescência, resultante de uma maior actividade endoproteolítica,

característica de espécies susceptíveis ao stresse hídrico (Arad e Richmond, 1976; Buchanan-

Wollaston, 1997). No período de recuperação do stresse, a concentração pareceu indicar uma

leve diminuição em PB269 e uma diminuição marcada em PB369, regressando a valores

próximos dos iniciais. Estes dados sugerem a utilização dos aminoácidos na reparação dos

danos provocados pelo stresse hídrico, na variedade PB369.

Fig. 5.38 – Variação dos aminoácidos livres em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo

das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

Contudo, o período de recuperação foi realizado a uma temperatura diferente da inicial

(38ºC e não os 25ºC programados), devido a uma avaria na câmara climatizada, pelo que

procedeu-se à realização de um ensaio independente (Fig. 5.39).

Neste ensaio, não se atingiram valores de THR tão baixos como no primeiro ensaio

(cerca de 60%). Na variedade PB269, a concentração de aminoácidos livres permaneceu

relativamente constante (cerca de 3 µg.mg-1 peso seco) (ver caixa da Fig. 5.39) mas no

período de recuperação desceu até valores mais baixos (cerca de 1 µg.mg-1 peso seco). Na

variedade PB369, a concentração de aminoácidos livres manteve-se relativamente constante

até THR de 80%, embora tenha sido obtido um ponto com THR inferior (cerca de 65%) com

PB269

0 25 50 75 1000

5

10

15

THR (%)

Am

ino

ácid

os l

ivre

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( µµ µµg

.mg

-1 p

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)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB369

0 25 50 75 1000

5

10

15

THR (%)

Am

ino

ácid

os l

ivre

s

( µµ µµg

.mg

-1 p

eso

seco

)

Stresse (∆; - -): y = 11,07 – 0,07952x (r2 = 0,76 ; p < 0,01)

Recuperação (�; –): y = 11,96 – 0,1102x (r2 = 0,79 ; p < 0,01)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

139

uma concentração de aminoácidos livres de cerca de 4 µg.mg-1 peso seco, e durante o período

de recuperação diminuiu para cerca de 2 µg.mg-1 peso seco (ver caixas da Fig. 5.39). Este

ensaio veio confirmar os dados e reforçar a hipótese colocada no ensaio anterior.

Fig. 5.39 – Variação dos aminoácidos livres em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo

das experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

Procedeu-se também à quantificação dos aminoácidos livres em experiências de

stresse rápido (Fig. 5.40).

Fig. 5.40 – Variação dos aminoácidos livres em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo

das experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

Na variedade PB269, a concentração de aminoácidos livres manteve-se constante ao

longo do stresse rápido, enquanto que em PB369 sofreu um aumento significativo.

O stresse hídrico provoca uma degradação dos componentes celulares, nomeadamente

a nível das membranas celulares (Gigon et al., 2004). No entanto, poderão também estar

PB269

60 70 80 90 1000

1

2

3

4

5

THR (%)

Am

ino

ácid

os l

ivre

s

( µµ µµg

.mg

-1 p

eso

seco

)

Stresse (∆)

Recuperação (�; –): y = 7,603 – 0,06901x (r2 = 0,91 ; p < 0,01)

PB369

60 70 80 90 1000

1

2

3

4

5

THR (%)

Am

ino

ácid

os l

ivre

s

( µµ µµg

.mg

-1 p

eso

seco

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

4

5

6

THR (%)

Am

ino

ácid

os l

ivre

s

( µµ µµg

.mg

-1 p

eso

seco

)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

4

5

6

THR (%)

Am

ino

ácid

os l

ivre

s

( µµ µµg

.mg

-1 p

eso

seco

)

y = 6,363 – 0,0308x (r2 = 0,66 ; p < 0,01)

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

140

relacionadas com a mobilização de proteínas de reserva (Raymond e Smirnoff, 2002). De uma

forma ou de outra, é possível verificar as diferenças entre as duas variedades, em ambas as

experiências de stresse lento e de stresse rápido. A variedade PB269 parece possuir

mecanismos que evitam uma maior degradação dos seus componentes celulares ou manter a

sua actividade sem aumento da mobilização das suas reservas proteicas, em comparação com

PB369.

5.3.6.25.3.6.25.3.6.25.3.6.2. . . . ProlinaProlinaProlinaProlina

Nas duas variedades, a concentração de prolina, durante o período de stresse lento, não

sofreu uma variação significativa (Fig. 5.41). Tal facto poderá estar relacionado com a

diminuição da actividade da enzima PEPC, a qual já foi apontada como responsável pelo

aumento da prolina, conduzindo a um ajustamento osmótico (Jeanneau et al., 2002). Contudo,

durante o período de recuperação, a concentração de prolina diminuiu de forma marcada na

variedade PB269. Em PB369 mostrou alguma tendência para diminuir mas não de forma

significativa.

Fig. 5.41 – Variação da prolina em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo das

experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

As amostras utilizadas nesta experiência também estiveram sujeitas a temperaturas

elevadas durante o período de recuperação (38ºC), pelo que se repetiu o ensaio numa

experiência independente.

Os resultados foram semelhantes, com ambas as variedades a não sofrerem variações

significativas na concentração de prolina ao longo do período de stresse (Fig. 5.42). Em

PB269, a concentração de prolina diminuiu de forma marcada durante o período de

PB269

0 25 50 75 1000

2

4

6

8

10

THR (%)

Pro

lin

a

( µµ µµg

.mg

-1 p

eso

seco

)

Stresse (∆)

Recuperação (�; –): y = 8,639 – 0,06283x (r2 = 0,65 ; p < 0,01)

PB369

0 25 50 75 1000

2

4

6

8

10

THR (%)

Pro

lin

a

( µµ µµg

.mg

-1 p

eso

seco

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

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5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

141

recuperação para cerca de 30% da concentração inicial. Esta diminuição pode ser resultado da

indução da prolina desidrogenase, cuja actividade aumenta durante a recuperação do stresse

hídrico (Hare et al., 1999). A variedade PB369 demonstra uma certa tendência para ocorrer a

diminuição da concentração de prolina durante a recuperação, embora não seja significativa.

Fig. 5.42 – Variação da prolina em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo das

experiências de stresse lento. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

Nas experiências de stresse rápido, também se verificam diferenças nas duas

variedades (Fig. 5.43). Em PB269, ocorreu uma diminuição da concentração de prolina para

cerca de metade da inicial, enquanto que, em PB369, a concentração de prolina se manteve

constante ao longo do stresse.

Fig. 5.43 – Variação da prolina em função do teor hídrico relativo (THR), ao longo das

experiências de stresse rápido. Os pontos foram obtidos de 3 folhas de diferentes plantas.

PB269

60 70 80 90 1000

2

4

6

8

10

THR (%)

Pro

lin

a

( µµ µµg

.mg

-1 p

eso

seco

)

Stresse (∆)

Recuperação (�; –): y = 16,18 – 0,147x (r2 = 0,78 ; p < 0,01)

PB369

60 70 80 90 1000

2

4

6

8

10

THR (%)

Pro

lin

a

( µµ µµg

.mg

-1 p

eso

seco

)

Stresse (∆)

Recuperação (�)

PB269

30 40 50 60 70 80 90 1000

2

4

6

8

10

THR (%)

Pro

lin

a

( µµ µµg

.mg

-1 p

eso

seco

)

y = – 0,2655 + 0,01805x (r2 = 0,73 ; p < 0,05)

PB369

30 40 50 60 70 80 90 1000

2

4

6

8

10

THR (%)

Pro

lin

a

( µµ µµg

.mg

-1 p

eso

seco

)

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5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

142

Os dados parecem indicar que ambas as variedades possuem uma reserva de prolina, a

qual tem sido indicada como sendo um soluto compatível que permite manter actividade

celular a stresses hídricos elevados (Hare et al., 1999; Heuer, 2003; Nayyar, 2003; Larher et

al., 2003) e também com função na remoção de radicais hidroxilo (Bohnert e Shen, 1999), os

quais afectam a actividade das enzimas do ciclo de Calvin (Shen et al., 1997a). Além disso,

mantém a relação NADP+/NADPH em valores compatíveis com o metabolismo e é essencial

no desenvolvimento da planta em condições sem stresse (Hare et al., 1999; Raymond e

Smirnoff, 2002). Estes ensaios parecem indicar que a reserva de prolina é utilizada como

fonte de carbono, azoto e energia rapidamente mobilizável durante o período de recuperação

(Hare et al., 1999), mais facilmente utilizada pela variedade PB269 do que pela variedade

PB369, provavelmente compensando as baixas taxas de recuperação das actividades da

RuBisCO e da PEPC, durante esse período. Tal facto, pode observar-se nas experiências de

stresse rápido em que PB269 rapidamente inicia a mobilização das reservas de prolina, ao

contrário de PB369, cujas reservas não são tão facilmente mobilizáveis.

5.3.7. Conclusões da Fase II5.3.7. Conclusões da Fase II5.3.7. Conclusões da Fase II5.3.7. Conclusões da Fase II

As variedades escolhidas na primeira fase e analisadas mais detalhadamente na

segunda fase apresentam, claramente, diferenças na resposta ao stresse hídrico.

A variedade PB269 apresenta valores mais reduzidos de rigidez da parede celular e de

THR no ponto de perda de turgescência, os quais permitem a manutenção do Ψw compatível

com o metabolismo fotossintético do carbono. A sua diminuição é efectuada de uma forma

progressiva, com um fecho dos estomas controlado, mantendo, desta forma, uma WUE mais

elevada para THR mais baixos.

Por outro lado, a variedade PB369 apresentou sempre limitações estomáticas mais

elevadas e uma menor resposta estomática ao CO2, durante a recuperação. Esta variedade

poderá também sofrer uma maior inibição do funcionamento do PSII com a imposição do

stresse hídrico, que poderá ser consequência da degradação da proteína D1.

Durante o período de stresse, PB269 apresentou alguma degradação da clorofila a, não

recuperando o conteúdo desse pigmento após irrigação, o que poderá ter contribuído para a

dificuldade em regressar aos valores iniciais de taxa fotossintética. No entanto, apresenta um

mecanismo de manutenção dos valores de qN (em especial de qE) até níveis de stresse hídrico

moderados.

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5. Fase II – Estudo Comparativo Aprofundado das Duas Variedades Mais e Menos Susceptíveis ao Stresse Hídrico

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

143

Nas actividades da RuBisCO, observou-se uma diminuição progressiva, na variedade

PB269, durante o stresse lento, em contraste com a diminuição de “tudo-ou-nada” da

variedade PB369, já observada durante a primeira fase deste trabalho. Durante o stresse

rápido, as variedades mantiveram as suas actividades constantes até THR de 50%, mas a

variedade PB269 apresentou uma ligeira descida para valores de THR inferiores a este.

Nas actividades da PEPC, os valores diminuíram durante o stresse lento, mas ficaram

inalteradas durante o stresse rápido, um pouco à semelhança do que acontece com a

actividade da EM-NADP.

Relativamente à prolina, observou-se que ambas as variedades possuem uma reserva

deste aminoácido, que parece ser rapidamente mobilizável, talvez como fonte de energia, pela

variedade PB269, durante o stresse rápido e na recuperação do stresse lento.

Os dados recolhidos permitem afirmar que PB269 é uma variedade de milho que

tolera o stresse hídrico (stress endurer) mas que apresenta algumas dificuldades em recuperar

os parâmetros hídricos. Por outro lado, a variedade PB369 é mais susceptível ao stresse

hídrico, mas as plantas conseguem recuperar um pouco melhor os parâmetros hídricos,

embora o metabolismo fotossintético do carbono fique mais comprometido do que na

variedade PB269.

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Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

144

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6. Conclusões Gerais

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

145

6666. Conclus. Conclus. Conclus. Conclusões Geraisões Geraisões Geraisões Gerais

As variedades de milho analisadas apresentaram diferenças entre si, na forma como

respondem ao stresse hídrico, comprovando que uma das dificuldades dos estudos de stresse

reside na variabilidade inter-varietal das respostas. A esta acrescem, naturalmente, as que são

recorrentemente referidas na bibliografia, nomeadamente o efeito da velocidade de imposição

do stresse, as condições ambientais em que ocorre e a idade e espécie das plantas. As técnicas

de determinação das trocas gasosas e de fluorescência modulada da clorofila a confirmaram a

sua utilidade na identificação de diferenças intra-específicas.

O stresse hídrico afecta fortemente os processos fotossintéticos, o crescimento e a

sobrevivência das espécies vegetais. O conjunto de todos os processos, desde a captação da

luz até à fixação do carbono, formam uma rede complexa de interacções, as quais serão

afectadas pelo stresse hídrico em diferentes graus, contribuindo de formas diferentes para a

redução global da fotossíntese. Nas variedades analisadas, observaram-se variações dos

parâmetros hídricos, das trocas gasosas e dos parâmetros fotoquímicos, corroborando os

resultados de outros ensaios efectuados noutras plantas sujeitas à seca.

Das diferenças entre os dois sistemas de indução de stresse, destacam-se a rapidez com

que os parâmetros se alteram no stresse rápido, enquanto no stresse lento variam mais

suavemente. No entanto, as diferenças entre variedades em stresse rápido eram menos

significativas do que em stresse lento, pelo que foi este último que permitiu a distinção de

duas variedades com respostas qualitativamente diferentes ao stresse hídrico.

A análise mais pormenorizada das variedades seleccionadas, PB269 como a mais

tolerante e PB369 como a mais susceptível ao stresse hídrico, permitiu recolher dados sobre

os diferentes mecanismos subjacentes.

A elasticidade mais elevada da parede celular da variedade PB269 permite-lhe manter

a turgescência até THR mais reduzidos, permitindo a manutenção do Ψw compatível com o

metabolismo fotossintético do carbono, durante mais tempo, sendo uma estratégia importante

na tolerância ao stresse hídrico.

Por outro lado, a variedade PB369 apresenta limitações estomáticas mais elevadas na

ausência de stresse mas, à medida que o stresse lento se vai intensificando, as limitações não-

estomáticas começam a desempenhar um papel importante nas duas variedades. Nas

actividades da RuBisCO, observaram-se diferenças entre as duas variedades: uma diminuição

progressiva, na variedade PB269, durante o stresse lento, semelhante ao observado nas

plantas do grupo de resposta ao stresse do tipo I, em contraste com a diminuição de “tudo-ou-

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6. Conclusões Gerais

Indução e Recuperação do Stresse Hídrico em Variedades Portuguesas de Milho

146

nada” da variedade PB369, que passa de um patamar de valores para outro, semelhante ao

observado nas plantas do grupo de resposta ao stresse do tipo II (Lawlor e Cornic, 2002). No

entanto, no stresse rápido, as variedades mantiveram as suas actividades constantes até THR

de 50%. Nas actividades da PEPC, os valores diminuíram durante o stresse lento, mas ficaram

inalterados durante o stresse rápido, tal como acontece com a actividade da EM-NADP. Desta

forma, durante a indução lenta do stresse hídrico, a diminuição da fotossíntese, em stresse

moderado, deve-se, essencialmente, a limitações estomáticas, enquanto que, a partir de stresse

intenso, tomam lugar as limitações não-estomáticas.

Também durante a imposição do stresse hídrico ocorreram variações nos parâmetros

da fluorescência da clorofila a, de forma mais suave durante o stresse lento e mais marcadas

durante o stresse rápido. Estes dados, conjuntamente com os dados das actividades

enzimáticas, indicam alterações na estrutura fotoquímica e enzimática, durante o stresse lento,

e uma maior incidência na fase fotoquímica, durante o stresse rápido. Tal facto poderá estar

relacionado com mecanismos de protecção induzidos ao longo da imposição do stresse lento,

ao contrário do que acontece no stresse rápido, em que não existe uma janela temporal

suficiente para desencadear esses mecanismos. Destaca-se PB269, com uma manutenção de

qE até THR de cerca de 50%, que poderá traduzir-se num mecanismo de tolerância a níveis de

stresse hídrico moderados, sem activação de processos de amortecimento não-fotoquímicos.

Também se observou, em PB269, alguma degradação da clorofila a, não recuperando

após irrigação, e a existência de uma reserva de prolina rapidamente mobilizável, talvez como

fonte de energia, durante o stresse rápido e na recuperação do stresse lento.

O conjunto de todos estes dados permitem afirmar que PB269 é uma variedade de

milho que tolera o stresse hídrico (stress endurer) mas que apresenta algumas dificuldades em

recuperar. Por outro lado, a variedade PB369 é mais susceptível ao stresse hídrico, mas as

plantas conseguem recuperar um pouco melhor os parâmetros hídricos, embora o

metabolismo fotossintético do carbono fique comprometido.

O rápido desenvolvimento e melhoramento de plantas agrícolas, como o milho, é um

dos objectivos a atingir, recorrendo a técnicas de Fisiologia Vegetal, de modo a compreender

as respostas da planta ao stresse e, ulteriormente, isolarmos os factores responsáveis. Os

conhecimentos adquiridos neste trabalho fornecem dados consistentes com os observados

noutros trabalhos, reforçando ideias que se têm vindo a estabelecer sobre o efeito do stresse

hídrico no processo fotossintético, fornecendo pistas para compreender as respostas das

plantas e as formas de enfrentarem este problema.

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