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Revista Baianade Saúde Pública

v.34, n.4, p.835-844out./dez. 2010

ARtiGO ORiGinAL

AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE DIFERENTES MARCAS DE ÁGUA MINERAL

Larissa Rafaele dos Santos Castroa Joelza Silva Carvalhoa

Vera Lúcia Costa Valeb

Resumo

As bactérias do grupo coliformes são indicadoras de contaminação fecal, sendo empregadas como parâmetro para caracterização da qualidade das águas em geral, bem como monitoramento daquelas destinadas ao consumo humano. O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade bacteriológica de água mineral. Foram analisadas sete diferentes marcas comercializadas no município de Alagoinhas (BA), no período de junho de 2008 a junho de 2009, pelo método de tubos múltiplos, para a determinação do número mais provável (nMp/100 mL) de coliformes totais e termotolerantes, contagem padrão e coloração de Gram, para análise das características morfotintoriais das bactérias mesofílicas. As análises foram realizadas no Laboratório de Biologia Experimental da Universidade do Estado da Bahia (UnEB), Campus ii, Alagoinhas. nos resultados obtidos, três amostras apresentaram contaminação por coliformes totais e, dentre estas, duas revelaram contaminação por coliformes termotolerantes. na contagem de colônias, três amostras deram resultados insatisfatórios com mais de 500 UFC/mL. Verificou-se a presença de bactérias Gram positivas e Gram negativas, cocos e bacilos. Estes resultados mostram que 57,1% das amostras encontram-se em desacordo com um ou mais padrões e são contraindicadas para consumo humano.

palavras-chave: Água mineral. Coliformes totais. Coliformes termotolerantes. infecção.

MiCROBiOLOGiCAL EVALUAtiOn OF diFFEREnt BRAndS OF MinERAL WAtER

Abstract the coliform group bacteria are indicators of fecal contamination, being used

as a parameter for monitoring the quality of water in general, as those intended for human consumption. the objective of this study is to assess the bacteriological quality of mineral

a Biólogas, Universidade do Estado da Bahia (UNEB), Departamento de Ciências Exatas e da Terra, Campus II, Alagoinhas.b Professora, Universidade do Estado da Bahia (UNEB), Departamento de Ciências Exatas e da Terra, Campus II,

Alagoinhas. Endereço para correspondência: Universidade do Estado da Bahia, Departamento de Ciências Exatas e da Terra,

Campus II, Laboratório de Biologia Experimental, Alagoinhas, Rodovia Salvador, Bahia, BR10, km 3, Alagoinhas, Bahia. CEP: 48000-000. [email protected]

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water. Seven different brands market in the municipality of Alagoinhas (BA), from june, 2008 to june, 2009 were analyzed using the multiple-tube method for determining the most probable number (nMp/100mL) of total coliforms and thermotolerant coliforms, standard score for mesophilic bacteria and Gram stain to analyze the morphology and staining characteristics characteristics of mesophilic bacteria. the tests were performed at the Laboratory of Experimental Biology, University of Bahia (UnEB), Campus ii, Alagoinhas. three samples showed total coliforms, and two of them were contaminated by coliforms thermotolerant. the colony count showed that three samples were found unsatisfactory with more than 500 CFU/mL. it was observed the presence of Gram-positive and Gram-negative, cocci and bacilli. these results show that 57.1% of the samples are in disagreement with one or more patterns, indicating poor quality or at least dubious quality for human consumption. Key words: Mineral Water. total coliforms. thermotolerant coliforms. infection.

EVALUACiÓn MiCROBiOLÓGiCA dE LAS diFEREntES MARCAS dE AGUA MinERAL

Resumen Las bacterias del grupo coliformes son indicadores de la contaminación fecal y

se utilizan como parámetro para la caracterización de la calidad de las aguas en general, así como el monitoreo de aquellas destinadas al consumo humano. El objetivo de este estudio fue evaluar la calidad bacteriológica del agua mineral. Se analizaron siete marcas diferentes comercializadas en la ciudad de Alagoinhas (BA),en el perío de junio de 2008 a junio de 2009, por el método de tubos múltiplos para la determinación del número más probable (nMp/100ml) de coliformes totales y termotolerantes, recuento estándar y la coloración de Gram. para analizar las características de las bacterias mesófilas morphotinctorial los análisis se realizaron en el Laboratorio de Biología Experimental de la Universidad de Bahía (UnEB), Campus ii, de la ciudad de Alagoinhas. En los resultados, tres muestras presentaron contaminación por coliformes totales, y dentro de estos, dos mostraron contaminación por coliformes termotolerantes. En el recuento de colonias, tres muestras presentaron resultados satisfactorios con más de 500 UFC/ml. Se verificó la presencia de Gram-positivos y Gram-negativos cocos y bacilos. Estos resultados muestran que el 57,1% de las muestras están en desacuerdo con una o más normas y están contraindicados para el consumo humano.

palabras-clave: Agua mineral. Coliformes. Coliformes termotolerantes. infección.

INTRODUÇÃO

A água é fundamental para a vida. todo o funcionamento do organismo humano

depende de sua presença, pois, além de distribuir os nutrientes pelos diferentes órgãos, ajuda


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a regular a temperatura do corpo, eliminar as toxinas através da urina e da transpiração e

estimular o trânsito intestinal. Sendo assim, quando há pouca água no corpo, o organismo sofre

prejuízos.1

A água mineral é um tipo de água subterrânea que, ao chegar à superfície, já

passou por todo um processo de transformação na própria natureza. É formada quando as águas

das chuvas penetram no solo e atravessam diversas camadas até chegar às impermeáveis, onde

estacionam. nesse trajeto por baixo do solo, a água passa por várias rochas cheias de substâncias

minerais, como carbonato e sulfato de cálcio, que se diluem na água enriquecendo-a. Quando

a água acumulada no subterrâneo sofre pressão de um novo volume d’água, ela sobe para a

superfície e surge em locais específicos chamados nascentes.2

Ao analisar a água mineral segundo as suas propriedades nutricionais, percebe-se

que é um produto rico em cálcio, que auxilia no fortalecimento dos ossos, além de possuir

grande concentração de magnésio, favorecendo a contração muscular. no caso das que contém

potássio, têm a propriedade de tonificar o sistema nervoso e aquelas com sódio facilitam o

equilíbrio de água no organismo.3

Água mineral natural, conforme a Resolução de diretoria Colegiada (RdC) n° 274,

de setembro de 2005, do Ministério da Saúde, é aquela obtida diretamente de fontes naturais

ou por extração de águas subterrâneas, caracterizada pelo conteúdo definido e constante de

determinados sais minerais, oligoelementos e outros constituintes, considerando as flutuações

naturais.4 Segundo essa mesma Resolução, as etapas às quais a água mineral natural deve

ser submetida, desde a captação até o armazenamento, não podem produzir, desenvolver

e/ou agregar substâncias físicas, químicas ou biológicas que coloquem em risco a saúde do

consumidor e/ou alterem a composição original do produto.

A preocupação com a qualidade da água de rede pública e, principalmente, a

busca do bem-estar proporcionado pelos sais minerais naturais provocou, nos últimos anos,

uma contínua demanda por água mineral em todos os países.2 O Brasil coloca-se atualmente

como o sexto maior mercado mundial de água mineral, com produção de aproximadamente

3,5 bilhões de litros em 2000. O consumo per capita, que era de 13,2 litros em 1997, saltou

para 24,9 litros em 2001, registrando um aumento de 88,63%.5

A receita de uma saúde passa, obrigatoriamente, pelo consumo de uma água

límpida, cristalina, saudável e sem impurezas. desse modo, é preciso ter muito cuidado na

escolha da água para consumo, pois, quando contaminada, transmite uma série de doenças,

gastroenterites, hepatite, parasitose, entre outras, que podem provocar diarreia, vômito, náusea

e até levar à morte.6


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A água é um excelente meio para o crescimento microbiano, por isso deve ser

colocada no mercado com sua qualidade garantida, em conformidade com os padrões rigorosos

do Ministério da Saúde.7

São adotados como microrganismos indicadores da contaminação da água mineral

os mesmos que contaminam as águas dos rios e lençóis freáticos, destacando-se os coliformes

totais, coliformes termotolerantes e/ou Escherichia coli, Pseudômonas aeruginosa, enterococos,

clostridios sulfitos redutores a 46 0C e a contagem de bactérias mesofilicas. Estes microrganismos

são empregados para avaliar a qualidade do produto final e a higiene do processamento.8

A realização das análises microbiológicas em amostras de águas minerais é

fundamental no âmbito da saúde coletiva, visto que é um produto de grande consumo pela

população cujas características higiênico-sanitárias adequadas estão relacionadas à saúde dos

consumidores. Entretanto, mesmo com a crescente preocupação com a qualidade da água

para consumo humano, são poucos os trabalhos disponíveis no Brasil, principalmente na Bahia,

sobre a qualidade microbiológica das águas minerais.

Este trabalho tem por objetivo avaliar a qualidade microbiológica, quanto à

presença de coliformes totais e termotolerantes e a presença ou ausência de bactérias mesofílicas

em diferentes marcas de água mineral.

METODOLOGIA

As amostras foram compostas por sete marcas das quais se obtiveram duas

amostras de dois lotes diferentes de água mineral comercializada em embalagens de 500 mL a

20 L, que foram compradas no período de junho de 2008 a junho de 2009 em distribuidoras e

supermercados em uma cidade de médio porte do interior da Bahia, em embalagens originais,

lacradas e sem qualquer possibilidade de contaminação externa. para cada amostra foram

realizadas três repetições das análises microbiológicas.

As análises foram realizadas no Laboratório de Biologia Experimental da

Universidade do Estado da Bahia (UnEB), Campus ii em Alagoinhas (BA) e foram realizadas

pelo método de tubos múltiplos, por determinação do número mais provável (nMp/100

mL) de bactérias do grupo coliformes totais e termotolerantes. Esta técnica foi utilizada em

série de cinco tubos de ensaio contendo meio de cultura e tubos de durham invertidos. para

a determinação de coliformes totais e termotolerantes das amostras foram utilizadas duas

etapas:

a) teste presuntivo, que consistiu na inoculação de volumes de 10.0; 1.0 e 0.1 mL

de cada amostra da água a ser analisada em triplicata, em tubos de ensaio contendo tubos


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de durham e meio de cultura (caldo lactosado – Lactose Broth – Himedia), os quais foram

incubados a uma temperatura de 37 oC por 24/48 h.

b) teste Confirmativo, que consistiu na inoculação de uma alíquota de todos os tubos

positivos, com bolhas, no teste presuntivo em meio de cultura (Verde Brilhante Bile – Himedia),

para detecção de bactérias do grupo coliformes totais, os quais foram incubados durante 24/48 h

a uma temperatura de 37 oC e em meio seletivos para Escherichia coli (caldo E.C. – Himedia). Estes

foram incubados em banho-maria durante 24 h a 45 oC com agitação e temperatura constante. A

produção de gás foi considerada prova confirmativa positiva nos dois testes.

para a contagem de bactérias mesofilicas, utilizou-se a técnica de contagem

padrão em placa. Foi adicionado 1 mL de cada amostra de água, em triplicata, em placas de

petri esterilizadas. Foi adicionado cerca de 20 mL de Agar plate Count para contagem padrão

em placa, o qual foi homogeneizado (movimentos circulares em “8”). deixou-se solidificar o

ágar e as placas foram incubadas em posição invertida a 35 oC / 24/48 h. Foram consideradas

significativas as contagens que apresentarem >500 colônias. Com o resultado da contagem

de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) foi realizada a técnica de Gram, para análise das

características morfotintoriais das bactérias.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

de acordo com os resultados obtidos pela técnica de tubos múltiplos, nas três

análises realizadas, apenas as amostras 2, 4 e 5 apresentaram contaminação por coliformes

totais e as 2 e 4 por coliformes termotolerantes (Quadro 1).

Amostras Coliformes totais Coliformes termotolerantes

Bactérias mesofílicas/UFC/ml

01 negativo negativo 60 Colônias

02positivo

2 nMp/100 mLpositivo

2 nMp/100 mL> 1000 Colônias

03 negativo negativo 57 Colônias

04positivo

4 nMp/100mL positivo

4 nMp/100 mL> 1000 Colônias

05positivo

2 nMp/100 mLnegativo 219 Colônias

06* negativo negativo 1 Colônia

07* negativo negativo > 1000 Colôniasnota: * Amostras de água mineral envasadas em embalagens de 20 L.

Quadro 1. Análise bacteriológica de amostras de água mineral envasadas em embalagens individuais de 500 mL e 20 L, comercializadas na cidade de Alagoinhas (BA)


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A detecção de coliformes totais na ausência de coliformes termotolerantes pode

significar que a fonte de água mineral está sendo contaminada com águas superficiais.8 pesquisas

realizadas em várias cidades brasileiras não encontraram contaminação por coliformes totais e

coliformes termotolerantes/E. coli nas amostras de água minerais analisadas.9-13 Como mostram

os resultados das amostras 2, 4 e 5, outros autores encontraram amostras de águas minerais

contaminadas por coliformes totais, mas não detectaram coliformes termotolerantes/E. coli

em nenhuma delas.14-17 Entretanto, amostras procedentes dos estados do Rio de Janeiro e

Minas Gerais apresentaram resultados positivos para esses dois microrganismos indicadores de

contaminação.8,18

Ressalta-se que resultado negativo de coliformes termotolerantes não significa

ausência de contaminação fecal, porque esse resultado pode ser influenciado pelo número

e tamanho da amostra e sensibilidade da metodologia.18 A presença de coliformes nas águas

engarrafadas evidencia que houve uma contaminação de origem externa, visto que essas

bactérias não fazem parte da composição do produto,19,20 e pode ter ocorrido na fonte, no

envase, no transporte, no armazenamento ou outros,16,19 demonstrando certa vulnerabilidade

do sistema industrial frente às contaminações, o que não é desejável.15

todas as amostras analisadas estavam dentro do prazo de validade estipulado

pelo fabricante, não tendo sido averiguada nenhuma correlação entre este e uma possível

contaminação.

A presença de coliformes a 35 oC não significa necessariamente contaminação

fecal, mas é um poderoso indicador das condições higiênicas do processo.8 A presença de

coliformes totais em água e alimentos, em alguns casos, pode não ser indicativa de contaminação

fecal porque participam deste grupo bactérias cuja origem direta não é exclusivamente entérica.

Esse fato decorre da capacidade de colonização ambiental destes microrganismos, em especial

no solo.21 Sendo assim, a presença de coliformes totais nestes materiais pode também estar

relacionada a práticas inadequadas de sanitização e processamento desses produtos, ou mesmo

sua recontaminação após estes procedimentos.22 Em pesquisa realizada sobre a qualidade

microbiológica de 32 amostras de água mineral em São Luís (MA), detectou-se coliformes a

45 oC e E.coli em somente uma amostra.9 Em estudo realizado em Brasília (dF),21 apenas uma

amostra na contra prova foi positiva para coliformes totais.

Além dos microrganismos de importância médica para a saúde pública, deve

ser dada atenção especial para microrganismos que podem deteriorar a água por alterar o

sabor e/ou coloração e aos indicadores das condições higiênicas, pois estes microrganismos

podem contaminar, seja na fonte, seja no processamento por diversas vias. As bactérias aeróbias


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mesófilas são aquelas que se multiplicam em aerobiose a temperaturas entre 20 e 40 oC. neste

grupo existem bactérias patogênicas e não patogênicas. Elevadas quantidades de mesófilos

indicam que a água não é apropriada para consumo humano.8

Embora não seja determinado um padrão para bactérias mesofílicas na legislação

em vigor para águas minerais, nesta pesquisa as amostras também foram submetidas a essas

análises para avaliar suas condições higiênico-sanitárias que, muito provavelmente, poderão

refletir as condições da matéria-prima, do ambiente e do pessoal envolvido na produção.

Quanto à contagem padrão feita em meio pCA, para verificação do controle

higiênico na industrialização da água, 4 marcas analisadas apresentaram valores satisfatórios

(Quadro 1). Quando lâminas de todas as marcas foram coradas pela metodologia do Gram,

observou-se que as bactérias presentes eram Gram-positivas e Gram-negativas com formato de

cocos e bacilos, sendo a grande maioria estreptobacilos; as gram-negativas estavam em maiores

quantidades e presentes em todas as amostras. Considerando-se a legislação para água potável,

que fixa um valor máximo de 500 unidades formadoras de colônias por mL (UFC/mL) de água,

proveniente de sistemas de abastecimento público, limite adotado como padrão para a presente

pesquisa, uma vez que a legislação para água mineral não traz nenhum índice reprovatório para

o número de bactérias mesofílicas em placas, três amostras foram reprovadas. A presença de

microrganismos mesófilos em grande número em alimentos pode ser indicativa de deficiência na

qualidade higiênica da matéria-prima devido à aplicação de processo tecnológico inadequado,

manipulação higiênica incorreta ou manutenção em condições impróprias.23 Entretanto, os

microrganismos mesofílicos encontrados em águas envasadas podem fazer parte da microbiota

inicial, antes de sua captação (microbiota autóctone).24

Como as águas minerais engarrafadas são consumidas sem qualquer tratamento,

altas contagens de heterotróficos com possível presença de patógenos, especialmente formas

resistentes a múltiplos antibióticos, podem representar sério risco para a saúde de indivíduos

imunocomprometidos.25 A maioria das bactérias mesofilicas, geralmente, não é patogênica.

Entretanto alguns membros desse grupo, incluindo Legionella spp., Myicobacterium spp.,

Pseudomonas spp. e Aeromonas spp., podem ser patógenos oportunistas.26 Além disso, alguns

mesofílicos podem exercer influência inibidora sobre alguns organismos, podendo impedir a

detecção de coliformes, por produção de fatores de inibição ou por um desenvolvimento mais

intenso desses organismos, sobrepujando uma menor população de coliformes.27

nossos resultados mostram isenção de coliformes totais e termotolerantes

em quatro amostras analisadas; três apresentaram coliformes totais e, dentre estas, duas

apresentaram coliformes termotolerantes. na avaliação de bactérias mesofílicas em três


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amostras há uma grande quantidade microrganismos mesofílicos (>1000 UFC/mL), enquanto

quatro amostras apresentam números inferiores ao determinado na Resolução de 2005 do

Ministério da Saúde.4 Esta resolução determina a ausência de coliformes e a 500 UFC para

bactérias mesofílicas. dessa forma, os resultados deste estudo mostram que 42,8% das amostras

analisadas encontram-se impróprias para o consumo humano. Se for considerada a medida

de UFC para bactérias mesofílicas, este percentual sobe para 57,1%, pois uma das amostras

(amostra 7) apresentou >1000 UFC/mL resultado negativo para coliformes.

É importante salientar que em todas as amostras analisadas houve turvação no

caldo lactose. A turvação pode ser um indicativo da presença de Staphylococcus aureus. Os

Staphylococcus aureus são bactérias Gram-positivas, mesofílicas, aeróbias facultativas, que

provocam intoxicação pela ingestão de alimento contaminado. A presença de Staphylococcus

aureus é uma indicação de perigo potencial à saúde pública, devido à enterotoxina estafilocócica,

bem como à sanificação questionável, principalmente na manipulação da água.28

Os resultados microbiológicos de duas amostras permitiram constatar-se a presença

de coliformes totais e coliformes termotolerantes. Em uma amostra encontrou-se apenas a

presença de coliformes totais. Estas três amostras (42,8%) são consideradas impróprias para o

consumo humano de acordo com a RdC nº 275, de 22 de setembro de 2005. Entretanto, na

contagem padrão para bactérias mesofílicas, uma das amostras que se mostrou negativa para

coliformes totais e coliformes termotolerantes apresentou contagem de colônias acima do limite

aceito para água potável. desta forma, concluiu-se que 57,1% das amostras não têm padrão de

qualidade para o consumo humano.

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Recebido em 29.12.2009 e aprovado em 25.10.2010.


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