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Resumo

i

Resumo

O fluoreto é ubiquitário na natureza e possui um papel importante no combate

à cárie dentária. Devido às suas propriedades anticariogénicas tem sido adicionado à água de abastecimento público, a produtos dentários (dentífricos e elixires), géneros alimentícios, suplementos, entre outros.

No entanto, a exposição a todas estas fontes de fluoretos tem aumentado o número de casos de toxicidade por fluoreto, de onde se destacam a fluorose

dentária e esquelética.

O consumo de bebidas processadas, como os refrigerantes, tem vindo a aumentar substancialmente pela população infantil e, principalmente neste grupo etário, esta pode ser uma das principais vias de exposição aos fluoretos.

Com o objectivo de estudar a ocorrência de fluoretos em refrigerantes, sumos,

néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões, optimizou-se e validou-se um método potenciométrico com eléctrodo combinado selectivo a ião fluoreto, o qual foi posteriormente utilizado na análise das amostras. Em

simultâneo procedeu-se à análise de ácido ascórbico, do pH e do potencial redox nestas matrizes alimentares.

O método potenciométrico para a análise de fluoreto foi validado através da aplicação de diversos testes estatísticos que permitiram definir o intervalo de

linearidade, a gama de trabalho, os limiares analíticos, a precisão, a exactidão e o efeito de matriz.

Para avaliar o consumo destes produtos foi aplicado um inquérito de frequência de consumo alimentar em crianças com idades entre os 6 e os 10

anos.

O método espectrofotométrico para a determinação de ácido ascórbico é linear

entre 0,1 – 1,6 mg/100 g produto, preciso (DPR<10%) e exacto (erro<10%), apresentando um LOQ de 0,1 mg/100g de produto.

A concentração média de ácido ascórbico é mais elevada em néctares (1,25 ± 0,45 mg/100 g) e mais baixa em chás (0,22 ± 0,19 mg/100g). As bebidas

designadas vulgarmente como bebidas infantis e os produtos à base de citrinos apresentam teores mais elevados de ácido ascórbico.

Os métodos potenciométricos utilizados na determinação do pH e do potencial redox são precisos e exactos, apresentando valores de erro percentual na

análise de controlos e valores de desvio padrão relativo na análise de duplicados inferiores a 10%.

Todas as matrizes analisadas são ligeiramente ácidas e pouco oxidantes.

O método potenciométrico para a determinação de fluoretos é linear na gama de concentrações entre 0,06 e 10 mg/L. O limite de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) foram calculados com base na curva de calibração e em

estudos de repetibilidade. Com base na curva de calibração, o LOD e LOQ são de 0,15 mg/L e 0,50 mg/L, respectivamente, e com base em ensaios de

repetibilidade são de 0,02 mg/L e 0,06 mg/L, respectivamente.

Resumo

ii

O método potenciométrico para a análise de fluoreto é preciso e exacto com desvios padrão relativo inferiores a 10% recuperações entre 83 e 114 % e um

erro percentual inferior a 5%.

O método validado permitiu avaliar o teor de fluoreto em 183 amostras,

incluindo 106 refrigerantes, 23 sumos, 37 néctares, 6 bebidas de sumo, 5 concentrados, 3 chás e 3 infusões.

A concentração média de fluoretos é mais elevada em refrigerantes à base de extratos seguida das bebidas de sumo e dos sumos, apresentando valores

médios de fluoretos de 0,86 ± 0,35 mg/L, 0,40 ± 0,24 mg/L e 0,37 ± 0,11 mg/L, respectivamente.

A concentração de fluoretos mais baixa foi observada em amostras de infusões, com valor médio de 0,12 ± 0,01 mg/L, seguida dos chás e dos

refrigerantes gaseificados com concentração média de fluoretos de 0,16 ± 0,12 mg/L e 0,18 ± 0,07 mg/L, respectivamente.

Os néctares, os concentrados e os refrigerantes à base de sumo possuem teores de fluoretos em gamas de concentração muito próximas, apresentando

valores médios de 0,33 ± 0,16 mg/L, 0,29 ± 0,12 mg/L e 0,25 ± 0,14 mg/L, respectivamente.

As concentrações de fluoretos determinadas nas amostras encontram-se abaixo do valor de dose diária tóxica (DDT=3,5 mg/L), o que indica que os

refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões, por si só, não são susceptíveis de induzir toxicidade por fluoreto na população.

A análise dos inquéritos permitiu verificar que as crianças inquiridas consomem preferencialmente refrigerantes, principalmente refrigerantes à

base de extracto, e néctares. As bebidas de sumo integram o tipo de bebida menos consumido pelas crianças na faixa etária estudada.

A ingestão diária média de fluoretos a partir do consumo de bebidas é 0,011 mg/kg de peso corporal, verificando-se que algumas crianças excedem a DDR

de fluoretos (0,05 mg/kg de peso corporal), principalmente devido ao consumo de refrigerantes. A DDI de fluoretos aumenta consideravelmente

quando contabilizada também a deglutição de pasta dentífrica (0,024 mg/kg de peso corporal).

Os resultados analíticos, os dados dos inquéritos e o modelo de regressão binária explicam o risco de toxicidade do fluoreto através da dieta pelo

consumo de refrigerantes à base de extracto.

A área de residência e a escolaridade dos pais discriminam o consumo de

bebidas nas crianças, bem como a ingestão diária de fluoretos por esta fonte alimentar.

Palavras-chave: fluoretos, fluorose, método potenciométrico, validação analítica.

Abstract

iii

Abstract

Fluoride is ubiquitous in nature and has an important role against dental

caries. Due to its anticariogenic properties have been added to public water

supplies, dental products (toothpaste and mouthwash), food supplements,

among others.

However, exposure to all these sources of fluoride has increased the number

of cases of fluoride toxicity, mainly the dental and skeletal fluorosis.

The consumption of processed beverages such as soft drinks, has increased

substantially by the child population, especially in this age group and this may

be one of the main routs of exposure to fluoride.

In order to study the presence of fluorides in soft drinks, juices, nectars, fruit

juice beverages, concentrates and tea infusions it was optimized and validated

a potentiometric method with fluoride combination ion selective electrode,

which was subsequently used for sample analysis. Ascorbic acid, pH and redox

potential were also determined in these food matrices.

The potentiometric method was validated through the application of several

statistical methods, which allow defining the linearity, working range,

analytical limits, repeatability, precison, accuracy and matriz effect.

To evaluate the consumption of these products was applied a food questionary

frequency of food intake in children aged 6 to 10 years.

The spectrophotometric method for the determination of ascorbic acid is linear

from 0.1 to 1.6 mg/100 g product, precise (RSD <10%) and accurate (error

<10%), with a LOQ of 0.1 mg / 100g of product.

The concentration of ascorbic acid is higher in nectars (1.25 ± 0.45 mg/100 g)

and lower in teas (0.22 ± 0.19 mg/100g). The beverages commonly

designated as beverage products infant and citrus based beverages have

higher levels of ascorbic acid.

The pH and oxidation-reduction potential (ORP) methods are precise and

accurate, with relative errors for control solutions and relative standard

deviation for duplicate analysis lower than 10%.

The potentiometric method is linear from 0.06 to 10 mg/L. The limit of

detection (LOD) and quantification (LOQ) were calculated based on the

calibration curve and repeatability studies. Based on the calibration curve, the

LOD and LOQ are 0.15 mg/L and 0.50 mg/L, respectively, and on repeatability

tests are 0.02 mg/L and 0.06 mg/L, respectively.

Abstract

iv

The potentiometric method for the analysis of fluoride is precise and accurate

with a relative standard deviation lower than 10% (repeatability), recoveries

between 83 and 114% and relative errors lower than 5% (control solutions).

The occurrence studies were made in 183 samples, including 106 soft drinks,

23 juices, 37 nectars, 6 juice drinks, 5 concentrates, 3 teas and 3 infusions.

The fluoride concentration is higher in the extracts based soft drinks, juice

drinks and juice, with fluoride values of 0.86 0.35 mg/L, 0.40 0.24 mg/L

and 0.37 0.11 mg/L, respectively.

The lowest concentration of fluoride was observed in infusions samples (0.12

0.01 mg/L), followed by tea and soft drinks with fluoride concentration of 0.16

0.12 mg/L and 0.18 0,07 mg/L, respectively.

The nectars, concentrates and juice-based drinks have higher and similar

fluoride values, 0.33 0.16 mg/L, 0.29 0.12 mg/L and 0.25 0.14 mg/L,

respectively.

The concentrations of fluoride in these samples are below the acceptable daily

intake (ADI= 3.5 mg/l), indicating that individually, are not able to induce

fluoride toxicity in the population.

The analysis of questionnaires has shown that children mainly consume soft

drinks (especially extracts based soft drinks) and nectars.

The juice beverages have a lowest consumption by studied group.

The average daily intake of fluorides from the beverage consumption is 0.011

mg/kg body weight, verifying that some children have a consumption higher

than recommended daily intake (RDI) (0.05 mg/kg body weight), especially

due to the use of soft drinks. RDI fluoride also increases considerably when

calculated swallowing of toothpaste (0.024 mg/kg body weight).

The analytical results, the questionnaires data and binary model regression

explain the risk of toxicity of fluoride through diet by consumption of extract

based soft drinks.

The residential area and parents' education discriminate against the

consumption of beverages on children, as well as the daily intake of fluoride

by this food source.

Key-words: Fluoride, fluorosis, potenciometric method, validation method.

Agradecimentos

v

Agradecimentos

A concretização deste trabalho só foi possível graças à colaboração de um

conjunto de pessoas, que de forma directa ou indirecta intervieram na sua definição, preparação e realização.

Começo por agradecer às minhas duas orientadoras, Profª. Doutora Cristina Almeida e Profª. Doutora Maria Eduardo Figueira que, com enorme dedicação, disponibilidade, inesgotável paciência, simpatia e boa disposição cooperaram

com afinco para a elaboração desta tese de mestrado. Demonstraram um enorme apoio, não só durante a fase de planeamento do trabalho

experimental e aplicação dos inquéritos de frequência alimentar, como também na elaboração da tese. Agradeço também a objectividade na

transmissão de conhecimentos, todas as críticas construtivas e sugestões que permitiram enriquecer o trabalho e o apoio demonstrado no tratamento e organização dos resultados, bem como na sua correccão. O seu auxílio e

orientação foram fundamentais para a conclusão desta tese.

Gostaria de agradecer ao Prof. Doutor Afonso Cavaco que, embora não

estando directamente envolvido no âmbito deste trabalho, prestou um apoio incondicional no tratamento estatístico dos resultados dos questionários de

frequência alimentar e uma ajuda preciosa na utilização do programa estatístico SPSS. Agradeço a disponibilidade, a paciência incansável e toda a simpatia demonstradas e que tornaram a análise estatística mais entusiasta.

Refiro-me de forma especial e reconhecida aos Órgãos de Gestão e respetivos

Docentes dos Estabelecimentos de Ensino Básico, público e privado, nomeadamente à Escola Básica de Alcanena, ao Colégio João de Deus, à Escola Básica Fernando Pessoa e à Escola Lar da Criança, que de forma

entusiasta e voluntária, aceitaram participar no estudo, permitindo a realização deste trabalho. A todos eles agradeço a disponibilidade e simpatia

demonstradas.

Quero agradecer à Dra. Lucília Vales que, com toda a dedicação e

disponibilidade, prestou um apoiou extraordinário na fase final do trabalho experimental, nomeadamente na análise das amostras.

Á Inês Martins e à Isabel Barroso agradeço a perseverança e disponibilidade na lavagem e arrumo de material, entre análise de amostras de sumos,

refrigerantes, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões. Às duas agradeço ainda a boa disposição, simpatia e as palavras de incentivo à

conclusão do trabalho experimental.

Agradeço à minha colega Graça Costa que acompanhou e colaborou de forma

extremamente empenhada na organização e codificação das amostras e na realização do trabalho laboratorial, principalmente na análise de amostras. A

ela agradeço a companhia e a boa disposição durante a análise de tantas bebidas.

Agradecimentos

vi

À Profª Doutora Matilde Castro, coordenadora do mestrado em Controlo de Qualidade e Toxicologia dos Alimentos, agradeço a organização de mais uma

edição do referido mestrado. Agradeço de forma muito sincera aos meus patrões e amigos, Paula Silva e

Michael Lopes, todo o apoio, perseverança e amizade demonstrados ao longo da realização deste trabalho. Gostaria também de agradecer à Graciete Gomes

a simpatia e o apoio prestados. Aos três agradeço ainda a disponibilidade, incentivo e compreensão por todos os dias que me ausentei do meu local de trabalho e que permitiram alcançar os meus objectivos e terminar o presente

trabalho.

Ao Duarte Duarte agradeço de forma especial a energia e o positivismo que, nas horas mais difíceis, me deram força e ânimo para a conclusão desta tese, com afinco e determinação. Agradeço ainda todo o apoio prestado na

informatização dos resultados dos questionários e a enorme paciência e compreensão pelos fins-de-semana, datas festivas, dias e noites que passei

em frente ao computador.

Quero agradecer à minha amiga Verónica Paiva o apoio incondicional na

compilação da informação recolhida nos questionários de frequência alimentar, a paciência demonstrada nas tantas horas que me ouviu falar de bebidas

consumidas por crianças, inquéritos e fluoretos e pelo exemplo de determinação que me inspirou e incentivou a alcançar as minhas metas.

Fundamental tem sido o grande apoio e dedicação da minha mãe no meu percurso académico. O maior e mais sentido agradecimento vai para ela, pelo exemplo de determinação e coragem que me inspira e faz sonhar e acreditar

que poderei ir mais além. Agradeço ainda a compreensão e paciência pelos longos dias em que me dediquei, quase exclusivamente, à escrita deste

trabalho.

Aos restantes familiares e amigos que, embora não tenham contribuído

directamente para a realização deste trabalho, agradeço as palavras amigas de incentivo e coragem para ultrapassar os momentos mais difíceis.

Índice

vii

Índice

Resumo ....................................................................................................................... i

Abstract ......................................................................................................................iii

Agradecimentos........................................................................................................ v

Índice ........................................................................................................................vii

Índice de tabelas .................................................................................................... xiii

Índice de figuras .................................................................................................... xvi

Símbolos e abreviaturas ....................................................................................... xix

Introdução ................................................................................................................. 1

Capítulo I – Fluoretos .............................................................................................. 7

1. Generalidades ....................................................................................... 7

2. Metabolismo do flúor .............................................................................. 8

3. Mecanismo de acção do flúor ..................................................................11

4. Via de exposição aos fluoretos pela dieta .................................................13

5. Toxicidade dos fluoretos ........................................................................17

5.1 Fluorose dentária ..................................................................................18

5.2 Fluorose esquelética ..............................................................................20

5.3 Outros efeitos tóxicos ............................................................................21

5.3.1 Citotoxicidade ...............................................................................21

5.3.2 Toxicidade no tracto gastrointestinal ................................................22

5.3.3 Nefrotoxicidade e hepatotoxicidade ..................................................22

5.3.4 Teratogenecidade ..........................................................................23

5.3.5 Neurotoxicidade ............................................................................23

5.3.6 Indução do stresse oxidativo ..........................................................23

5.3.7 Toxicidade do sistema reprodutor ....................................................24

5.3.8 Aumento da toxicidade de metais ....................................................24

5.3.9 Desregulação endócrina .................................................................25

6. Avaliação do risco .................................................................................25

6.1 Relação risco vs benefício ......................................................................27

Capítulo II – Aspectos legais ................................................................................29

Capítulo III – Avaliação do consumo alimentar ................................................31

1. Métodos de avaliação do consumo alimentar ............................................31

1.1 Diário alimentar ....................................................................................32

1.2 Recordatório alimentar de 24h ...............................................................33

1.3 História alimentar .................................................................................33

Índice

viii

1.4 Questionário de frequência alimentar ...................................................... 34

Capítulo IV - Metodologia analítica ..................................................................... 39

1. Generalidades ...................................................................................... 39

2. Métodos de análise de fluoretos em alimentos .......................................... 39

2.1 Métodos colorimétricos .......................................................................... 40

2.2 Métodos potenciométricos ..................................................................... 41

3. Análise do pH, do potencial redox e do ácido ascórbico .............................. 43

4. Validação de métodos analíticos ............................................................. 45

4.1 Selectividade/Especificidade ................................................................... 47

4.2 Linearidade .......................................................................................... 47

4.3 Gama de trabalho ................................................................................. 48

4.4 Limiares analíticos ................................................................................ 48

4.4.1 Limite de detecção (LOD) ............................................................... 48

4.4.2 Limite de quantificação (LOQ) ......................................................... 49

4.5 Sensibilidade ........................................................................................ 50

4.6 Precisão .............................................................................................. 50

4.6.1 Repetibilidade ............................................................................... 51

4.6.2 Precisão intermédia ....................................................................... 52

4.6.3 Reprodutibilidade .......................................................................... 53

4.7 Exactidão ............................................................................................ 54

4.8 Descrição de métodos analíticos ............................................................. 55

5. Questionário de frequência alimentar ...................................................... 56

5.1 Selecção dos géneros alimentícios .......................................................... 56

5.2 Elaboração de um questionário de frequência alimentar............................. 56

5.2.1 Elaboração de uma lista dos géneros alimentícios .............................. 57

5.2.2 Definição de porções e da frequência de consumo ............................. 58

5.2.3 Aplicação do questionário de frequência alimentar ............................. 58

5.3 Análise estatística dos dados .................................................................. 59

Capítulo V – Parte experimental .......................................................................... 61

1. Equipamento e material......................................................................... 61

1.1 Equipamento ........................................................................................ 61

1.2 Material ............................................................................................... 61

2. Reagentes ........................................................................................... 62

2.1 Análise de fluoretos .............................................................................. 62

2.1.1 Reagentes gerais .......................................................................... 62

2.1.2 Padrões ....................................................................................... 62

Índice

ix

2.1.3 Controlos .....................................................................................62

2.2 Análise de ácido ascórbico .....................................................................62

2.2.1 Reagentes gerais ...........................................................................62

2.3 Determinação do pH .............................................................................63

2.3.1 Padrões de calibração ....................................................................63

2.3.2 Controlos .....................................................................................63

2.4 Determinação do potencial redox ............................................................63

2.4.1 Padrões de calibração ....................................................................63

2.4.2 Controlos .....................................................................................63

3. Soluções ..............................................................................................63

3.1 Análise de fluoretos ...............................................................................63

3.1.1 Soluções gerais .............................................................................63

3.1.2 Soluções de calibração ...................................................................64

3.1.3 Soluções padrão de controlo ...........................................................64

3.1.4 Soluções de controlo instrumental ...................................................65


3.2.1 Soluções gerais .............................................................................65

3.2.2 Soluções de calibração ...................................................................66

3.2.3 Soluções padrão de controlo ...........................................................66

4. Implementação e validação dos métodos de ensaio ...................................67

4.1 Análise de fluoretos ...............................................................................67

4.1.1 Técnica ........................................................................................67

4.1.2 Controlo instrumental ....................................................................68

4.1.3 Estudo da linearidade.....................................................................68

4.1.4 Gama de trabalho ..........................................................................69

4.1.5 Limiares analíticos (LOD e LOQ) ......................................................69

4.1.6 Precisão .......................................................................................70

4.1.6.1 Repetibilidade ...............................................................................70

4.1.6.2 Precisão intermédia .......................................................................70

4.1.7 Exactidão .....................................................................................70

4.1.8 Limite de determinação do método (LD) ...........................................70

4.1.9 Efeito do pH ..................................................................................71

4.1.10 Análise das amostras .....................................................................72


4.2.1 Verificação da pureza do xileno .......................................................73

4.2.2 Aferição da solução corante ............................................................73

4.2.3 Estudo da linearidade.....................................................................73

4.2.4 Gama de trabalho ..........................................................................74

Índice

x

4.2.5 Limiares analíticos (LOD e LOQ) ...................................................... 74

4.2.6 Análise das amostras ..................................................................... 74

4.2.6.1 Preparação da amostra .................................................................. 74

4.2.6.2 Calibração do método analítico ....................................................... 75

4.2.6.3 Análise do ácido ascórbico .............................................................. 75

4.3 Determinação do pH ............................................................................. 76

4.4 Determinação do potencial redox ............................................................ 76

5. Selecção das amostras .......................................................................... 77

Capítulo VI – Resultados e discussão ................................................................. 79

1. Análise de fluoretos .............................................................................. 79

1.1 Controlo instrumental ........................................................................... 79

1.2 Estudo da linearidade ............................................................................ 80

1.3 Gama de trabalho ................................................................................. 83

1.4 Limiares analíticos (LOD e LOQ) ............................................................. 83

1.5 Precisão .............................................................................................. 83

1.6 Exactidão ............................................................................................ 84

1.7 Limite de determinação do método (LD) .................................................. 86

1.7.1 Efeito do pH ................................................................................. 87

1.8 Controlo de qualidade interno (CQI) ........................................................ 88

1.9 Análise de amostras .............................................................................. 91

2. Análise de ácido ascórbico ..................................................................... 93

2.1 Estudo da linearidade ............................................................................ 93

2.2 Gama de trabalho ................................................................................. 95

2.3 Limiares analíticos (LOD e LOQ) ............................................................. 95

2.4 Precisão .............................................................................................. 96

2.5 Exactidão ............................................................................................ 96

2.6 Controlo de qualidade interno (CQI) ........................................................ 98

2.7 Análise de amostras ............................................................................ 100

3. Determinação do pH ........................................................................... 101

3.1 Controlo de qualidade interno (CQI) ...................................................... 101


4. Determinação do potencial redox .......................................................... 104

4.1 Controlo de qualidade interno (CQI) ...................................................... 104


5. Questionários de frequência alimentar ................................................... 106

5.1 Caracterização da amostra ................................................................... 107

5.1.1 Distribuição das crianças por idade e género................................... 107

Índice

xi

5.1.2 Distribuição das crianças por peso e altura ..................................... 108

5.1.3 Distribuição das crianças por escola e ano de escolaridade ............... 108

5.1.4 Distribuição das crianças por região ............................................... 110

5.1.5 Distribuição das crianças por nível de escolaridade dos pais .............. 111

5.2 Resultados dos questionários de frequência alimentar ............................. 112

5.2.1 Estimativa da ingestão diária de fluoretos ....................................... 112

5.2.2 Regressão binária para avaliar o risco de toxicidade por fluoretos ...... 115

5.2.3 Relações entre o consumo e variáveis de interesse .......................... 119

5.2.3.1 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e o género e idade .......... 119

5.2.3.2 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e a região ...................... 121

5.2.3.3 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e a escolaridade dos pais . 122

5.2.3.4 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e o tipo de escola ............ 122

6. Relação entre os dados analíticos e a avaliação de consumo alimentar ..... 123

Capítulo VII - Conclusões .................................................................................... 125

Bibliografia e referências bibliográficas ........................................................... 131

Anexos ..................................................................................................................... 143

Anexo 1 – Características das amostras analisadas............................................... 144

Anexo 2 – Definições de tipos de bebidas .............................................................. 167

Anexo 3 – Método dos mínimos quadrados ............................................................ 169

Anexo 4 – Teste dos valores normalizados ............................................................ 173

Anexo 5 – Análise de resíduos ................................................................................ 174

Anexo 6 – Teste de Mandel..................................................................................... 175

Anexo 7 – Teste de homogeneidade de variâncias ................................................ 177

Anexo 8 – Convite às escolas ................................................................................. 179

Anexo 9 – Questionário de frequência alimentar ................................................... 181

Índice de tabelas

xiii

Índice de tabelas

Tabela 1 Dose Diária Recomendada (DDR) para uma eficaz proteção da

cárie dentária e Dose Diária Tóxica (DDT) com risco de fluorose

26

Tabela 2 Aspectos comparativos entre os métodos de avaliação do

consumo alimentar

37

Tabela 3 Interferências mais comuns referentes ao método

potenciométrico para o doseamento de fluoretos

43

Tabela 4 Caracterização do tipo de bebidas incluídas no questionário de

frequência alimentar

57

Tabela 5 Distribuição dos participantes por escola e distrito 59

Tabela 6 Critérios de aceitação para a definição do intervalo de linearidade 69

Tabela 7 Parâmetros da primeira curva de calibração dos fluoretos para a

avaliação da linearidade do método potenciométrico

81

Tabela 8 Limiares analíticos do método potenciométrico com base nos

parâmetros da curva de calibração e em condições de

repetibilidade

83

Tabela 9 Repetibilidade e precisão intermédia do método potenciométrico 84

Tabela 10 Estudos de recuperação dos fluoretos em várias matrizes

alimentares em condições de repetibilidade

84

Tabela 11 Limite de determinação do método potenciométrico para a

análise de fluoretos em refrigerantes, sumos, néctares, bebidas

de sumo, concentrados, chás e infusões

86

Tabela 12 Parâmetros do controlo de qualidade interno relativo à análise de

fluoretos pelo método potenciométrico

90

Tabela 13 Concentração de fluoretos em refrigerantes, sumos, néctares,

bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões comercializados

em Portugal continental

91

Tabela 14 Avaliação da linearidade do método espetrofotométrico para a

análise de ácido ascórbico

94

Tabela 15 Limares analíticos do método espetrofotométrico com base na

curva de calibração e em condições de repetibilidade

95

Tabela 16 Repetibilidade e precisão intermédia do método

espetrofotométrico do 2,6-diclorofenolindofenol para a análise do

ácido ascórbico

96

Tabela 17 Parâmetros do controlo de qualidade interno relativo à análise de

ácido ascórbico pelo método espetrofotométrico do 2,6-

99

Índice de tabelas

xiv

diclorofenolindofenol

Tabela 18 Teor médio de ácido ascórbico em refrigerantes, sumos,

néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões

comercializados em Portugal continental

100

Tabela 19 Valores médios do pH de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas

de sumo, concentrados, chás e infusões comercializados em

Portugal continental

103

Tabela 20 Potencial redox médio de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas

de sumo, concentrados, chás e infusões comercializados em

Portugal continental

106

Tabela 21 Ingestão diária de fluoreto (mg/kg de peso corporal) dos

inquiridos pelo consumo de bebidas e deglutição de pasta

dentífrica

113

Tabela 22 Ingestão diária de fluoreto (mg/kg peso corporal) pelo consumo

de bebidas e deglutição de pasta dentífrica

114

Tabela 23 Estatísticas de validação do modelo de regressão logística 115

Tabela 24 Teste de Hosmer e Lemeshow 116

Tabela 25 Classificação do modelo final de regressão binária logística 116

Tabela 26 Coeficientes (B) e razão de chance (Exp(B)) da regressão binária

para avaliação do risco de toxicidade por fluoretos

117

Tabela 27 Valores médios da dose diária ingerida de fluoreto por género 119

Tabela 28 Valores médios de ingestão diária de fluoretos, por região 120

Tabela 29 Características das amostras de refrigerantes 144

Tabela 30 Características das amostras de refrigerantes (continuação) 145










Índice de tabelas

xv





Tabela 44 Características das amostras de sumo 159

Tabela 45 Características das amostras de sumo (continuação) 160

Tabela 46 Características das amostras de néctares 161

Tabela 47 Características das amostras de néctares (continuação) 162

Tabela 48 Características das amostras de néctares (continuação) 163

Tabela 49 Características das amostras de bebidas de sumo 164

Tabela 50 Características das amostras de concentrados 165

Tabela 51 Características das amostras de chá 165

Tabela 52 Características das amostras de infusões 166

Índice de figuras

xvi

Índice de figuras

Figura 1 Metabolismo do flúor (absorção, distribuição e excreção do flúor

pelo organismo) em sobreposição com uma curva de

concentração de flúor no plasma

11

Figura 2 Lesões no esmalte dentário induzidas pela exposição crónica (A) e

aguda (B) ao fluoreto. E: esmalte e D: dentina

19

Figura 3 Opacidade e pigmentação do esmalte em formas severas de

fluorose dentária

19

Figura 4 Radiografia do antebraço com calcificação do periósteo

(membrana de revestimento ósseo) (A) e deformações ósseas de

Genuvalgum numa criança com fluorose esquelética (B)

21

Figura 5 Natureza cíclica da estratégia a ser seguida na validação de um

método analítico

45

Figura 6 Sequência do trabalho experimental para o controlo instrumental,

optimização, validação e análise potenciométrica de fluoretos em

refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados,

chás e infusões

67

Figura 7 Sequência do trabalho experimental para a optimização, validação

e análise de ácido ascórbico por espetrofotometria de absorção

molecular em refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo,

concentrados, chás e infusões

72

Figura 8 Diferença dos potenciais do elétrodo (LS – Limite Superior e LI –

Limite Inferior)

80

Figura 9 Testes estatísticos para o estudo da linearidade. (a) Curva de

calibração e bandas de incerteza (superior e inferior), (b) análise

de resíduos, (c) valores normalizados e (d) teste de Mandel

82

Figura 10 Erro relativo da análise de soluções controlo de fluoretos de 0,06

mg/L (n=10)

85

Figura 11 Erro relativo da análise de soluções controlo de fluoretos de 10

mg/L (n=10)

86

Figura 12 Efeito do pH nas recuperações de amostras ácidas 87

Figura 13 Análise de soluções controlo de ácido ascórbico, n=10 97

Figura 14 Erro relativo da análise de padrões de controlo de pH=6,00,1

(n=15)

102

Figura 15 Erro relativo da análise de padrões de controlo de pH=6,8±0,1

(n= 15)

102

Índice de figuras

xvii

Figura 16 Análise dos padrões de controlo de potencial redox, n=15 104

Figura 17 Número de participantes distribuídos por idade e género, n=217 107

Figura 18 Descrição dos participantes por altura e peso em função da idade 108

Figura 19 Distribuição dos participantes por escola e ano de escolaridade 109

Figura 20 Número de participantes por região 110

Figura 21 Nível de escolaridade dos pais e/ou encarregados de educação

dos participantes

111

Figura 22 Distribuição do consumo por tipo de bebida 113

Símbolos e abreviaturas

xix


a Ordenada na origem (equação da recta, y = a + bx)

ADP Adenosina-Difosfato

ALP Fosfatase Alcalina

ALT Alanina Transaminase

AMP Adenosina-Monofosfato

AOAC “Association of Official Analytical Chemists”, Associação Oficial de

Químicos Analíticos

AST Aspartato Transaminase

ATP Adenosina-Trifosfato

b Declive da recta (equação da recta y = a + bx)

CA Concentração de analito na amostra

CAT Catalase

CCA Comissão do Codex Alimentarius

CCAH Comissão Científica da Alimentação Humana

CDTA “1,2-cyclohexylenedi nitrilo-tetraacetic acid”, ácido1,2-ciclo-

hexilenodiaminotetraacético

CE Comissão Europeia

CP Concentração de analito no padrão

CR Concentração de analito no recuperado

CV Coeficiente de variação (o mesmo que desvio padrão relativo)

CVm Coeficiente de variação do método

CVr Coeficiente de variação de repetibilidade

CVRL Coeficiente de variação de reprodutibilidade

DDI Dose Diária Ingerida

DDR Dose Diária Recomendada

DDT Dose Diária Tóxica

DD Diferença de duplicados

DFI “Dean Dental Fluorosis Index”, Índice de Fluorose Dentária de

Dean

DP Desvio padrão (igual a S)

DPR Desvio padrão relativo

DPRr Desvio padrão relativo da repetibilidade

DPRRL Desvio padrão relativo da reprodutibilidade


xx

DS2 Diferença de variâncias (estudo de funções lineares)

EFSA “European Food Safety Authority”, Autoridade Europeia para a

Segurança Alimentar

EPA “Environmental Protection Agency”, Agência de Protecção

Ambiental

Er Erro relativo

EUA Estados Unidos da América

F Valor tabelado da distribuição F de Snedecor/Fisher

FD Fluorose Dentária

GDP Guanosina-Difosfato

GPx Glutationo Peroxidase

GSH Glutationo

GTP Guanosina-Trifosfato

HPLC “High Performance Liquid Chromatography”, cromatografia líquida de alta eficiência

IUPAC “International Union of Pure and Applied Chemistry”, União

Internacional de Química Pura e Aplicada

ISO “International Standard Organization”, Organização Internacional

de Normalização

LOAEL “Lowest-Observed-Adverse-Effect-Level”, nível mais baixo de efeitos adversos observáveis

LD “Limit of Determination”, limite de determinação

LOD “Limit of Detection”, limite de detecção

LOQ “Limit of Quantification”, limite de quantificação

MRC Materiais de Referência Certificados

m0 Massa, em miligramas, de ácido ascórbico, equivalente a 1,0 mL

da solução corante

m1 Massa, em gramas, contida na alíquota da amostra utilizada na

redução do corante

n Número de ensaios, número de amostras analisadas ou número

de inquiridos

N Número de pontos experimentais da recta de calibração

N.A. Não Aplicável

NOAEL “No-Observed-Adverse-Effect-Level”, nível de ausência de efeitos adversos ou nível de efeitos adversos não observados

NOEL “No-Observed-Effect-Level”, nível de ausência de efeitos ou nível de efeitos não observados

NP Norma Portuguesa

OMS Organização Mundial de Saúde


xxi

ORP Potencial de oxidação-redução, “oxidation reduction potential”

PVC “Polyvinyl Chloride”, Cloreto de polivinilo

QFA Questionário de Frequência Alimentar

QI Quociente de Inteligência

r Limite de repetibilidade

R Coeficiente de correlação da recta

R2 Coeficiente de determinação da recta

Rec (%) Percentagem de recuperação

RI Limite de precisão intermédia

RL Limite de reprodutibilidade

S Unidade de desvio ou desvio padrão (igual a DP)

SMEWW “Standard Methods for the Examination of Water and

Wastewater”, Métodos Padrão para a Análise de Água potável e Águas residuais

SNC Sistema Nervoso Central

SOD Superóxido Dismutase

SPSS “Statistical Package for Social Sciences”

S2 Variância

Sa Desvio padrão da ordenada na origem(a)

Sb Desvio padrão do declive da recta (b)

Sm Desvio padrão do método

Sr Desvio padrão calculado a partir dos resultados obtidos em

condições de repetibilidade

SRL Desvio padrão calculado a partir dos resultados obtidos em

condições de reprodutibilidade

Desvio padrão residual de uma função não linear

So Desvio padrão correspondente a várias leituras do branco ou da

solução com a concentração mais baixa da gama de trabalho

Sy/x Desvio padrão residual de uma função linear

t Valor da variável de Student

TFI “Thylstrup-Fejerskov Index”, Índice de Fluorose Dentária de Thylstrup-Fejerskov

TISAB “Total Ionic Strength Adjustment Buffer, ”solução tampão e de ajustamento da força iónica,

UE União Europeia

VA Volume de amostra


xxii

Vest Valor de diferença de potencial estimado a uma determinada

concentração

Vexp Valor da diferença de potencial obtida experimentalmente a uma

determinada concentração

VP Volume de padrão

VR Volume de recuperado

VT Valor teste

V1 Volume, em mL, da solução corante adicionado à amostra para

análise

V2 Volume, em mL, da solução corante em excesso, correspondente

à absorvência lida da amostra, determinado na curva de calibração

V100 Diferença de potencial correspondente ao ponto experimental

com melhor correlação

Valores individuais de concentração conhecida na solução padrão

Valor experimental

Valor aceite como verdadeiro (material de referência interno ou

material de referência certificado)

Valores individuais do sinal instrumental

У-GT Gama-Glutamiltranspeptidase

∆L Variação do sinal instrumental

∆C Variação da concentração em relação à variação do sinal instrumental

Média dos valores de x (concentração de analito)

Média dos valores de y (sinal instrumental)

Introdução

1

Introdução

O flúor é um elemento químico abundante na crosta terrestre. No grupo dos halogénios é o elemento mais electronegativo e reactivo. Na natureza, o flúor está presente sob a forma de fluoretos, os quais, podem ser encontrados em

pequenas quantidades, na água, ar, solo, plantas e animais. A concentração de fluoretos na água e no solo depende de vários factores, tais como pH,

sólidos dissolvidos totais, alcalinidade, porosidade e acidez do solo, temperatura e profundidade. A actividade vulcânica e a utilização de muitos dos fertilizantes fosfatados também são responsáveis pelo aumento do teor de

fluoretos a nível ambiental (1-3).

Os fluoretos não são essenciais para o crescimento e desenvolvimento humano, encontrando-se no corpo humano em pequenas concentrações (2,6 mg num adulto), essencialmente nos dentes e ossos (99 %). No entanto, a

ingestão de fluoretos, em doses moderadas (3-4 mg/dia para adultos), é benéfica na prevenção da cárie dentária e na manutenção da estrutura óssea,

principalmente nas crianças. Os fluoretos fortalecem e favorecem a reparação (remineralização) do esmalte e dentina, não só porque reduzem a solubilidade destes compostos em meio ácido, mas também, porque reduzem a capacidade

bacteriana de produzir ácidos. Os fluoretos também têm sido utilizados no tratamento da osteoporose (2, 4, 5).

De acordo com os relatórios da Organização Mundial de Saúde (OMS) as cáries dentárias constituem um importante problema de saúde pública nos países

mais desenvolvidos, onde afectam cerca de 60-90% das crianças em idade escolar e um número representativo da população adulta. Para combater este

problema, e uma vez que os fluoretos são reconhecidos como a medida mais eficaz na prevenção da cárie dentária, a OMS recomenda que este elemento seja adicionado à água, ao leite ou ao sal, de modo a permitir o acesso de

toda a população aos fluoretos, sem no entanto, alterar os seus hábitos alimentares (6).

Em 2005, aproximadamente 317 milhões de pessoas em 39 países beneficiavam de água fluoretada artificialmente. Outros 40 milhões de pessoas

consumiam água naturalmente fluoretada (5).

A fluoretação da água é realizada em países como os Estados Unidos da América, Espanha, Suíça, Canadá, o Reino Unido, Israel, Singapura e Nova

Zelândia (5). Em Portugal a água de abastecimento público não é artificialmente fluoretada (7), uma vez que este ião ocorre naturalmente nas águas (< 1 mg/L) e a legislação nacional (8) apresenta um valor paramétrico

de 1,5 mg/L de fluoretos na água para consumo humano.

No entanto, para além da fluoretação da água (adição de flúor na forma de fluoreto de sódio à água potável), este ião está presente numa vasta gama de produtos, tais como pastas dentífricas (0,1% de flúor na forma de NaF, SnF2 e

Na2PO3F), elixires orais, suplementos, bebidas, alimentos e produtos odontológicos para uso profissional (2, 9, 10).

Introdução

2

A exposição ao flúor a partir destas fontes provocou uma melhoria significativa na saúde oral e na manutenção da estrutura óssea da população (9), embora

tenham de ser tomadas algumas medidas preventivas, de forma a evitar excessos.

Os fluoretos são facilmente absorvidos pelo trato gastrointestinal na ausência de elementos interferentes, tais como o cálcio, iodo e alumínio (11). O fluoreto

pode bioacumular-se no organismo, uma vez que apenas 50% da dose diária ingerida é excretada através dos rins; o restante acumula-se nos ossos, na

hipófise e outros tecidos, podendo tornar-se tóxico (10, 12).

Nos adultos a dose letal é de 0,20-0,35 g de fluoreto por quilograma de peso corporal, sendo que a diferença entre a necessidade de flúor para a

manutenção da saúde oral e óssea e uma dose nociva para o ser humano é muito pequena (2, 10).

As populações particularmente susceptíveis a efeitos adversos do fluoreto são as crianças, diabéticos, doentes renais, indivíduos com osteoporose, grávidas

ou mulheres que estão a amamentar e indivíduos com deficiência de micronutrientes específicos como o cálcio, o magnésio, o iodo e o selénio (13).

Os teores elevados de fluoretos podem desencadear fenómenos de

neurotoxicidade, diminuir as capacidades cognitivas, conduzir a distúrbios comportamentais em crianças, promover alterações da função do sistema

nervoso central, reduzir a mielina das fibras nervosas, aumentar a apoptose neuronal, alterar os níveis proteicos e de neurotransmissores e modificar a actividade de algumas enzimas cerebrais (10, 12). Verifica-se ainda o

aumento da concentração de cálcio (Ca2+) intracelular nos eritrócitos, nos osteoblastos e nos túbulos proximais. Deste modo, o aumento da

concentração de cálcio pode ser considerado um indicador da toxicidade dos fluoretos manifestada pela indução de apoptose e/ou necrose celular (1).

Desde o início da fluoretação da água que tem havido numerosas alegações de lesões decorrentes da ingestão de água fluoretada, como, reacções alérgicas,

cancro, defeitos congénitos e doenças genéticas (5). A água fluoretada está associada principalmente ao aumento da prevalência de fluorose dentária ou

esquelética e tem sido considerada como a responsável pelo aumento de 40% dos casos, os restantes 60% são atribuídos às restantes fontes de fluoretos (9). Não é possível controlar a quantidade de água que cada pessoa vai

consumir e, portanto, pode estar a fomentar-se ingestões desajustadas de fluoretos. A fluorose dentária é um distúrbio de formação dentária provocada

pela ingestão prolongada de fluoretos durante o desenvolvimento dentário, tendo como consequência, uma opacidade do esmalte (2, 9, 12).

A fluorose dentária pode ser moderada ou severa caracterizando-se por

alterações estéticas com aparecimento de pigmentação branca no esmalte dentário no primeiro caso e pigmentos castanhos no segundo, com perda de esmalte (14). O período crítico para o desenvolvimento de fluorose dentária é

dos 4 meses aos 4 anos de idade (15) e, como tal, a severidade da fluorose depende da dose, idade e a frequência da ingestão de fluoretos (16).

A ingestão de elevadas concentrações de fluoreto (concentrações superiores a 3,5 mg/L) também pode desencadear a fluorose esquelética com alterações

esqueléticas, articulares, nefrológicas e neurológicas (2, 9, 14). Nas crianças

Introdução

3

até aos 4 anos de idade, as primeiras manifestações clínicas de toxicidade por fluoreto surgem para concentrações superiores a 0,7 mg/L.

As crianças podem ser as principais lesadas com ingestões de quantidades excessivas de fluoretos através da ingestão em simultâneo da água para

consumo humano, de alguns alimentos, das pastas dentífricas (que acabam por engolir em grande quantidade) e ainda pela suplementação que lhes é

feita nas escolas. Além do mais, as crianças constituem um grupo populacional vulnerável, em virtude da maior ingestão de alimentos face ao seu peso corporal.

Nas últimas décadas ocorreram mudanças significativas nos hábitos alimentares das crianças, aumentando o consumo de bebidas processadas

industrialmente, como os sumos e refrigerantes, que podem conter teores elevados de fluoretos, devido à presença deste elemento nos frutos, nos

vegetais e na água (9, 17).

Em geral, uma alimentação equilibrada, com o fornecimento adequado de alimentos, é suficiente para suprir as necessidades de minerais. Deste modo,

os odontologistas e os médicos dentistas devem ser cautelosos na prescrição de suplementos de flúor na dieta de crianças que consomem quantidades substanciais de sumos, néctares e refrigerantes (9, 17).

Devido ao aumento do consumo de sumos e refrigerantes, a avaliação da

exposição total de fluoretos deve incluir a quantidade consumida das diferentes bebidas e o seu conteúdo em fluoretos (15).

De forma a avaliar a contribuição dos sumos, néctares e refrigerantes na

ingestão diária de fluoretos pretende-se optimizar e validar um método analítico adequado para o estudo da ocorrência de fluoretos nestas amostras,

que podem ser um dos veículos maioritários de fluoretos, principalmente nas crianças.

O aumento do consumo dos produtos alimentares processados, nomeadamente as bebidas, incentivou a fortificação dos alimentos com

vitamina C. Esta vitamina é geralmente, adicionada aos géneros alimentícios como ácido ascórbico, embora a forma natural e sintética sejam quimicamente

idênticas e não apresentem diferenças na sua atividade biológica ou biodisponibilidade (18).

Assim, a utilização de ácido ascórbico como aditivo alimentar tem por

objectivo aumentar o valor nutricional do produto alimentar, bem como permitir a manutenção do sabor, cor e estabilidade (18, 19). Devido às propriedades antioxidantes que detém, o ácido ascórbico prolonga a validade

do alimento ao qual é adicionado pois contribui para o equlíbrio redox (20, 21), muitas vezes perturbado por alguns compostos como os fluoretos.

No entanto, o ácido ascórbico é facilmente oxidado podendo degradar-se

durante o armazenamento de alimentos e bebidas (22). A baixa estabilidade deste antioxidante, em meio aquoso, exige o controlo do seu teor nos géneros alimentícios (20), razão pela qual representa um bom indicador de qualidade

alimentar (23).

Com a crescente preocupação inerente aos efeitos tóxicos das espécies reactivas de oxigénio e restantes radicais livres, os géneros alimentícios que

Introdução

4

apresentam na sua constituição antioxidantes, naturais ou sintéticos, são cada vez mais solicitados pelos consumidores. Neste sentido, a determinação do

potencial redox é uma forma rápida, precisa e económica de estimar a capacidade antioxidante global dos agentes redutores presentes numa matriz alimentar (24).

O pH da maioria dos refrigerantes e sumos de fruta é inferior a 4 (25) como

consequência da adição de conservantes e aromatizantes como o ácido ascórbico, cítrico, tartárico, málico e fosfórico (26). O impacte dos acidificantes na conservação, sabor e acção antimicrobiana está dependente do pH. A pH

baixo há um aumento do efeito da pasteurização e da preservação dos ácidos fracos, o que impede o crescimento microbiano (25).

Contudo, o consumo frequente de bebidas ácidas favorece a diminuição do pH da saliva, diminuindo a sua capacidade tampão, responsável pela protecção

dos dentes da desmineralização do esmalte, pelo que é importante a monitorização do pH em géneros alimentícios susceptíveis de serem

consumidos por crianças durante o desenvolvimento dentário (26, 27).

O estabelecimento de relações entre a ingestão de alguns nutrientes e o

desenvolvimento de doenças nos seres humanos, suscitou a necessidade de desenvolvimento de metodologias de avaliação do perfil de consumo alimentar da população (28).

O Questionário de Frequência Alimentar (QFA) tornou-se o método mais utilizado em estudos epidemiológicos para avaliação da dieta habitual de grandes grupos populacionais, com aplicação simples, rápida e sem grande

esforço económico. Comparado a outros instrumentos, substitui a medição da ingestão alimentar de um ou vários dias pela informação global da ingestão de

um período amplo de tempo (28, 29). Este tipo de questionário visa assim avaliar a frequência com que os alimentos ou grupos de alimentos são consumidos durante um período de tempo pré-definido, podendo ter vertente

semi-quantitativa se incluir a porção ou quantidade consumida do respectivo alimento (28, 29).

Deste modo, este trabalho tem como objectivos:

Implementar e validar um método potenciométrico, usando um

eléctrodo combinado seletivo ao ião fluoreto, para a determinação de

fluoretos em amostras alimentares;

Dosear os teores de fluoretos em refrigerantes, sumos, néctares,

bebidas de sumo, concentrados de fruta, chás e infusões

comercializados em Portugal Continental que são utilizados na dieta

infantil;

Caracterizar as mesmas amostras em vitamina C, pH e potencial redox;

Elaborar um questionário de frequência alimentar dirigido a consumo de

bebidas, contendo fluoretos, utilizadas na alimentação infantil;

Fazer um estudo prévio da ingestão diária dos produtos alimentares

analisados por crianças dos 6 a 10 anos através das respostas dadas ao

questionário de frequência alimentar;

Introdução

5

Determinar a dose diária ingerida de fluoretos pelas crianças

relacionando os resultados do inquérito com os teores determinados nas

bebidas.

O presente trabalho foi organizado em capítulos, onde se descrevem os fundamentos teóricos, as metodologias, o desenvolvimento experimental, os

resultados e respectiva discussão e as principais conclusões do trabalho desenvolvido.

O capítulo I apresenta de forma resumida, as características, o metabolismo, as vias de exposição, a ocorrência e a toxicidade do fluoreto.

O capítulo II expõe os aspectos legislativos relevantes na pesquisa de fluoretos em géneros alimentícios.

O capítulo III descreve, sumariamente, o tipo de inquéritos que podem ser elaborados e aplicados para estimar o perfil de consumo alimentar de uma população.

O capítulo IV apresenta os fundamentos teóricos dos métodos analíticos para a

análise de fluoretos em géneros alimentícios e os parâmetros de qualidade utilizados na validação de métodos de ensaio. Refere ainda a metodologia utilizada para a implementação de um inquérito de frequência de consumo

alimentar.

No capítulo V é descrita a metodologia seguida ao longo do trabalho experimental, incluindo equipamento, material, reagentes e preparação de soluções. Inclui, também, as metodologias utilizadas na optimização e

validação dos métodos potenciométrico e espectrofotométrico para posterior análise de fluoretos e de ácido ascórbico, respectivamente, em refrigerantes,

sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões. Neste capítulo referem-se, ainda, as metodologias utilizadas na determinação do potencial redox e do pH das amostras em estudo.

O capítulo VI apresenta e discute os resultados obtidos nos ensaios de

validação dos métodos de ensaio e de análise das amostras, assim como, os resultados dos questionários de frequência de consumo alimentar, aplicados a crianças do 1º ciclo de escolaridade, com idades compreendidas entre os 6 e

os 10 anos.

O capítulo VII apresenta as principais conclusões do trabalho realizado.

Capítulo I- Fluoretos

7

Capítulo I – Fluoretos

1. Generalidades

O flúor é o elemento mais leve do grupo 17 da tabela periódica, ocorre como

molécula diatómica na sua forma elementar, tem apenas um isótopo estável e forma sempre iões mononegativos. No grupo dos halogénios é o elemento mais electronegativo e reactivo.

Estima-se que o flúor seja o 13º elemento mais abundante no nosso planeta

(11). Na natureza é ubiquitário e está presente sob a forma de fluoretos (na forma iónica ou associado a outros elementos como o silício, cálcio, sódio, alumínio, enxofre devido às suas propriedades litofílicas (7), os quais podem

ser encontrados, em pequenas quantidades, na água, ar, solo, plantas e animais (13).

O fluoreto está presente nas rochas e no solo, facto pelo qual é muitas vezes associado à actividade vulcânica (3, 30). No solo, o fluoreto ocorre numa

variedade de minerais, como a fluorite (CaF2), a criolite (Na3AlF6) e a chiolite

(Na5Al3F14), formando complexos com o alumínio, ferro, sódio e cálcio. A

mobilidade do fluoreto no solo está dependente do pH, da adsorção de catiões e da concentração de cálcio, ferro, alumínio e fósforo. Em solos ácidos,

predominam complexos de alumínio e fluorsilicatos e em solos alcalinos, o fluoreto de cálcio. A disponibilidade destes complexos solúveis aumenta com a diminuição do pH, pelo que, a elevada solubilidade de fluoreto no solo sob

condições acídicas (pH < 6) é devida à presença de complexos de AlF2+. Assim, a retenção de flúor em solos alcalinos depende em grande parte do

teor de alumínio no solo (2).

A principal fonte natural de fluoreto para os seres humanos é a ingestão de

água subterrânea contaminada por fontes geológicas, principalmente em regiões com actividade vulcânica (concentrações máximas de 30-50 mg/L)

(30, 31). Este tipo de reserva natural de água é seguro a nível bacteriano, no entanto a concentração elevada de determinadas substâncias químicas, como o fluoreto, pode aumentar o risco de toxicidade nas populações (32). Por

exemplo, alguns países da Ásia (Índia, o Sri Lanka e a China), África, América (México), Europa (Espanha, Holanda, Itália e Estónia) e do Médio Oriente

possuem reservas naturais de água com concentrações elevadas de fluoreto (1, 3, 11, 32).

Na água, o fluoreto forma complexos com o cálcio, o magnésio e o alumínio. A concentração de fluoretos na água depende de vários factores, tais como o pH, sólidos dissolvidos totais, alcalinidade, temperatura e profundidade. A pH

inferior a 5, o fluoreto é complexado quase na totalidade com o alumínio. Quando o pH aumenta, aumenta também a formação de hidróxidos,

nomeadamente hidróxido de alumínio, aumentando a concentração de iões fluoreto no meio (1, 3). Por outro lado, a solubilidade do CaF2 aumenta com o

aumento da alcalinidade (presença de carbonatos e bicarbonatos) na água


8

(11, 30). Um elevado teor de sólidos dissolvidos totais melhora a força iónica, levando a um aumento da solubilidade do CaF2 nas águas subterrâneas (11).

Normalmente, as amostras de água naturalmente fluoretada (0,4 – 1 mg/L) apresentam valores ligeiramente mais elevados de alguns dos parâmetros de

qualidade da água como a alcalinidade, a dureza e o pH, o que pode afectar a qualidade destas águas tornando-as impróprias para consumo (11).

Na atmosfera, o flúor encontra-se na forma de fluoreto de hidrogénio, o qual é absorvido pelas gotículas de água atmosférica formando um aerossol de ácido

fluorídrico, atingindo posteriormente o solo através do ciclo da água (32). Por lixiviação dos solos, pode penetrar em lençóis freáticos e/ou acumular-se nas plantas. A retenção de fluoreto nos organismos aquáticos pode potenciar a sua

bioacumulação ao longo da cadeia alimentar.

Outras fontes de exposição humana ao fluoreto são a poluição atmosférica das indústrias de alumínio e aço, a combustão de carvão e a utilização de compostos organofluorados (1, 10). Os compostos organofluorados são cada

vez mais utilizados, principalmente em produtos agroquímicos (pesticidas e fertilizantes), produtos farmacêuticos (Prozac), agentes tensioactivos, agentes

de extinção de incêndio, fibras, sprays e em materiais isolantes (Teflon e Gore-Tex). Cerca de 20% dos produtos farmacêuticos e 30-40% dos agrotóxicos são organofluorados (30). Estes compostos possuem um grande

impacte ambiental e na saúde humana e animal porque são contaminantes ambientais persistentes (1, 3, 30).

Uma vez que, o fluoreto está amplamente distribuído no ambiente e as fontes de exposição humana a este ião são muito variadas, tem ocorrido um

aumento muito acentuado da sua acumulação a nível endógeno (10).

2. Metabolismo do flúor

O metabolismo e cinética do fluoreto dependem, principalmente, da

concentração de fluoreto ingerida. Após ingestão de fluoreto, uma parte é retida na boca e incorporada nos dentes por troca iónica, outra entra

directamente na corrente sanguínea através da mucosa oral, mas a maior parte é absorvida no estômago e intestino (33, 34).

Na forma de fluoreto de sódio, composto solúvel presente na água de consumo público, a biodisponibilidade do fluoreto é próxima de 100% sendo

absorvido quase na totalidade no trato gastrointestinal (na ausência de interferentes como o cálcio, magnésio, iodo e alumínio) (11). Porém, se a ingestão é feita a partir do leite ou outras fontes alimentares (ricas em cálcio e

magnésio) a taxa de absorção é reduzida (50-80%), devido à formação de complexos de fluoreto menos solúveis (fluoreto de cálcio, de magnésio e de

alumínio). No entanto, se no momento da ingestão o estômago estiver vazio, a absorção poderá ser total (33, 35).


9

O fluoreto é muito electronegativo, o que significa que tem uma forte tendência para formar aniões em solução. Em meio ácido, como ocorre no

estômago (pH=2), o fluoreto é convertido em ácido fluorídrico (HF) (30). Cerca de 40% do fluoreto ingerido é absorvido no estômago na forma de HF (HF, pKa=3,4) (34, 36).

O transporte de fluoreto nas membranas biológicas ocorre principalmente por

difusão simples de HF, uma vez que este composto apresenta um coeficiente

de permeabilidade semelhante ao da água. O HF atravessa as membranas

celulares muito mais facilmente que o ião fluoreto, sendo a permeabilidade da

membrana ao HF 5-7 vezes superior à do fluoreto (30). Na mucosa intestinal,

menos ácida, o HF dissocia-se, libertando os iões fluoreto (11).

Assim, quanto mais baixo for o pH, maior e mais rápida será a absorção, e,

consequentemente, maior será o pico de concentração de fluoretos nos fluidos biológicos (34, 37). Em contrapartida, a absorção de fluoreto inorgânico e

orgânico pouco solúvel é mais difícil, o que diminui consideravelmente a concentração de fluoreto absorvido (11). Deste modo, grande parte das

características fisiológicas dos fluoretos são atribuídas à difusão do HF.

A absorção de fluoreto nas crianças é semelhante à dos adultos, no entanto

não ocorre uma diminuição significativa da absorção de fluoreto na presença de uma dieta rica em cálcio (33).

A absorção intestinal de fluoreto é menos sensível ao pH que a absorção estomacal e pode ocorrer por difusão simples e facilitada (30). A concentração

plasmática de fluoreto apresenta normalmente um pico aos 30-60 minutos após a ingestão e normaliza ao fim de 3-11 horas, dependendo da concentração de fluoreto ingerida (33).

Como o ião fluoreto não estabelece ligação com as proteínas plasmáticas, as

concentrações de fluoreto no plasma e nos fluidos intersticiais são idênticas, o que permite a utilização da concentração plasmática de fluoreto como referência para estimar a concentração extracelular de fluoreto (34).

Quando aproximadamente 50% da concentração ingerida de fluoreto for

absorvida, a concentração plasmática começa a diminuir rapidamente devido à excreção renal de fluoreto e à sua incorporação nos tecidos mineralizados (10, 38).

O fluoreto é distribuído para os tecidos moles (rim, fígado, eritrócitos e coração) e mineralizados (ossos e dentes). Do fluoreto retido nos tecidos,

aproximadamente 97-99% fica retido nos tecidos calcificados. No entanto, a ligação do fluoreto aos tecidos calcificados é reversível. Se a ingestão de

fluoreto diminuir consideravelmente durante um longo período de tempo, a concentração de fluoreto nos ossos diminui bastante devido à mobilização do

fluoreto por troca iónica. Nos tecidos moles, estabelece-se um estado de equilíbrio na concentração de fluoreto intra e extracelular (11, 33, 39)

A absorção de fluoreto pelos tecidos ósseos é maior nas crianças e diminui

com a idade, podendo ser nula a partir dos 55 anos (11). Nos bebés, cerca de

80-90% do fluoreto absorvido é absorvido pelos tecidos, mas nos adultos

apenas 60% é bioacumulado (30).


10

O teor de fluoreto no osso é influenciado por vários fatores, incluindo a idade, o tipo de exposição ao flúor e a taxa de renovação óssea. A concentração de

fluoreto no esmalte reflete o nível de exposição durante o período de formação dos dentes, enquanto a concentração de fluoreto presente na dentina e nos ossos está associada a uma exposição crónica ao fluoreto. O aumento da

retenção de fluoreto pelo esqueleto em desenvolvimento deve-se ao baixo fluxo sanguíneo e a uma maior área superficial dos cristalitos ósseos, que são

menores, mais desorganizados e mais numerosos, que no osso maduro (40).

Assim, aproximadamente 50% do fluoreto absorvido é bioacumulado nos

tecidos mineralizados e os restantes 50% são excretados pela urina (35, 39).

A principal via de excreção de fluoreto é através da urina, seguida das fezes,

leite materno, suor e saliva. Estima-se que, apenas, 1% do fluoreto ingerido é excretado na saliva, uma vez que esta é engolida. O fluoreto encontrado nas

fezes corresponde àquele que não foi absorvido e representa cerca de 10% da ingestão diária total de fluoreto em crianças e adultos (33, 41).

O ião fluoreto é filtrado da corrente sanguínea à medida que atravessa os capilares glomerulares, sendo reabsorvido a nível tubular (33).

Vários fatores podem influenciar a excreção renal de fluoreto, como o pH, o fluxo urinário e a taxa de filtração glomerular. O pH da urina é o factor

determinante para a reabsorção de fluoreto nos túbulos renais. A pH ácido, o fluoreto mantem-se na forma de ácido fluorídrico, difundindo mais facilmente

para o fluido intersticial através do epitélio tubular. No fluido intersticial, a pH neutro, o HF seria rapidamente dissociado e os iões fluoreto entrariam de novo na circulação sistémica. Deste modo, quanto mais alcalina for a urina maior

será a excreção deste composto (34).

A dieta pode afetar o pH da urina e, assim, alterar a excreção e bioacumulação de fluoreto (30). Uma dieta vegetariana promove uma urina mais alcalina, o que conduz a um aumento da excreção urinária de fluoreto. Um estudo

realizado na população da Tanzânia confirmou que os indivíduos não-vegetarianos possuem um risco de desenvolvimento de fluorose dentária 7

vezes superior aos indivíduos vegetarianos (41).

Um elevado fluxo nos túbulos renais aumenta a excreção de substâncias com

reabsorção lenta. Da mesma forma, uma diminuição da taxa de filtração glomerular diminui a excreção de fluoreto pela urina. Por exemplo, nos idosos

há uma diminuição significativa da excreção renal de fluoreto como consequência da diminuição da taxa de filtração glomerular (40).

A figura 1 (40) relaciona o metabolismo do flúor com a concentração de flúor no pasma.


11

Figura 1. Metabolismo do flúor (absorção, distribuição e excreção do flúor

pelo organismo) em sobreposição com uma curva de concentração de flúor no

plasma.

3. Mecanismo de acção do flúor

O fluoreto é um oligoelemento essencial benéfico para o crescimento ósseo e dentário e para a redução de fracturas ósseas (37).

São várias as características fisiológicas que distinguem o flúor dos restantes halogéneos. O fluoreto combina-se reversivelmente com os protões (H+) para formar um ácido fraco (HF), é um potente inibidor enzimático, possui excreção

mais rápida que os restantes elementos do mesmo grupo, possui grande afinidade com os tecidos calcificados, estimula a formação de tecido ósseo e,

ainda, inibe e reverte o processo de formação da cárie dentária (42).

O fluoreto promove a remineralização e diminui a desmineralização do

esmalte, tornando o dente mais resistente à cárie dentária. Assim, a redução da solubilidade do esmalte não é o único factor envolvido na acção cariostática

do fluoreto (5, 43).

O fluoreto também possui efeitos antibacterianos uma vez que inibe o

processo pelo qual as bactérias cariogénicas (Streptococcus mutans e Streptococcus lactobacillus) metabolizam os hidratos de carbono em ácidos

(por exemplo, acético, butírico, fórmico, láctico), o que resulta num ataque ácido aos tecidos mineralizados provocando a desmineralização e cavitação do dente (5, 44). Na presença de concentrações baixas de fluoretos, há uma

diminuição da produção de ácidos pelas bactérias (5). Assim, o fluoreto tem uma potente acção cariostática (45).


12

Por muito tempo prevaleceu o conceito de que seria necessário o uso sistemático (pré-eruptivo) de flúor, e que a acção anticariogénica resultava da

incorporação do fluoreto no esmalte, pela substituição do ião hidroxilo da hidroxiapatita pelo ião fluoreto conduzindo à formação de fluorapatita durante a fase de mineralização dentária, o que deixaria o esmalte mais resistente à

desmineralização (34). Porém, estudos posteriores observaram uma redução da cárie dentária em dentes bastante danificados após o início da fluoretação

da água (5, 33).

O efeito protector do fluoreto em relação à cárie dentária tem uma acção

dupla, actuando na fase pré-eruptiva do dente (sistémica) e pós-eruptiva do dente (tópica) (46).

Na fase pré-eruptiva do desenvolvimento dentário, o fluoreto é incorporado na estrutura mineralizada dos dentes, diminuindo a solubilidade da hidroxiapatita

do esmalte, o que aumenta a resistência à desmineralização ácida. Após a erupção do dente, o fluoreto ingerido é dissolvido na saliva contribuindo para a

resistência tópica do dente devido à sua acção directa na mineralização do esmalte (33, 35).

A saliva contém água, proteínas, cálcio, fosfatos, fluoreto, bicarbonatos e imunoglobulinas, pelo que é importante para a remineralização do esmalte e diluição e neutralização dos ácidos (47).

O mecanismo de acção do fluoreto é, principalmente, tópico mas nos sistemas

de abastecimento de água apresenta uma função sistémica quando absorvido e incorporado nos dentes em desenvolvimento. Assim, o fluoreto traz benefícios na redução da cárie dentária, não só durante o período de

desenvolvimento do esmalte, mas também ao longo de toda a vida do indivíduo uma vez que o ciclo de desmineralização e remineralização do

esmalte dentário é contínuo em todas as faixas etárias (5).

Porém, por si só o fluoreto apenas reduz a perda de minerais, sendo

importante a associação do fluoreto com outras medidas preventivas, como a lavagem dos dentes com dentífricos fluoretados (34).

Nos ossos, por troca iónica, os iões fluoreto formam hidroxifluorapatita, alterando assim a estrutura mineral óssea. Ao contrário dos iões hidroxilo, os

iões fluoreto complexam depois os iões cálcio, formando estruturas electrostaticamente mais estáveis. Ocorre assim uma alteração no perfil de

mineralização, contribuindo para uma densidade e dureza óssea mais elevadas (13, 44).

O fluoreto pode estimular a proliferação das células ósseas (osteoblastos) e aumentar a deposição mineral nos ossos. A incorporação óssea de fluoreto aumenta o tamanho dos cristais (apatita) e, portanto, diminui a solubilidade

dos mesmos. Cristais maiores são mais resistentes ao ataque osteoclástico (osteoclastos são células envolvidas na reabsorção óssea) (47).

Alguns estudos sugerem que a dimensão do cristal é inversamente proporcional à resistência de flexão do fémur. Assim, embora ocorra um

aumento na dureza e massa óssea, a mineralização do osso é alterada e a resistência mecânica do osso diminui. A força dos ossos resulta da interface

entre o colagénio e a fracção mineral, logo alterações na mineralização óssea


13

irão afectar a força do mesmo. Os cristais formados após a exposição ao fluoreto não estão associados às fibrilas de colagénio e, portanto, não

contribuem para a resistência mecânica do osso. Como consequência da diminuição da resistência de flexão ocorre um aumento do risco de fracturas não vertebrais (13, 46, 48).

A nível celular, baixas concentrações de fluoreto promovem a proliferação de

osteoblastos, estimulando a formação óssea in vitro e in vivo. A actividade proliferativa do fluoreto nos osteoblastos e também nos ameloblastos é bifásica, sendo mitótica (promove a síntese e actividade de osteoblastos e

ameloblastos) em concentrações na ordem dos micromolares mas inibitória da mitose (inibe a síntese e actividade de osteoblastos e ameloblastos) na ordem

dos milimolares (46).

Por outro lado, elevadas concentrações de fluoreto preveniram a anemia e

infertilidade em ratos provocada pela deficiência de alguns iões, diminuíram a nefrocalcinose induzida pelo fósforo da dieta e a calcificação dos tecidos moles

provocada pela deficiência em magnésio (35).

A dose diária recomendada de fluoreto, para "reduzir a ocorrência de cárie

dentária numa população sem provocar efeitos indesejáveis, como a fluorose dentária", é de 0,05 mg/Kg/dia nas crianças (13, 42, 44).

4. Via de exposição aos fluoretos pela dieta

O fluoreto é utilizado no controlo da cárie dentária há mais de cinco décadas. Desde o início da fluoretação da água, em 1970, este ião ficou disponível para

a população na água de abastecimento público e, desde então, as fontes de exposição ao fluoreto pela dieta aumentaram consideravelmente, o que

aumentou a exposição das crianças ao fluoreto (49)

A água de abastecimento público é, normalmente, a principal fonte de água da

população e, como tal, recorre-se à fluoretação desta para ajudar a prevenir a cárie dentária (32).

Os alimentos e bebidas processadas, a água de consumo público, pastas dentífricas, elixires, suplementos, produtos odontológicos para uso

profissional, pastilhas elásticas e medicamentos são, actualmente, considerados como as maiores fontes de ingestão de fluoreto nas crianças com mais de 12 meses de idade (2, 9, 10, 13). Nos seres humanos, a

biodisponibilidade de fluoreto nos géneros alimentícios é bastante variada, 2-79%. Parâmetros como o pH e o conteúdo mineral dos alimentos podem

alterar a biodisponibilidade do fluoreto nos alimentos (37).

Em algumas regiões, a fluoretação artificial da água inclui a adição à água de

compostos silicofluoretados (silicofluoreto de sódio e ácido fluorsilícico) e fluoreto de sódio (NaF). A pH neutro, o silicofluoreto é dissociado a ácido

sílico, ião fluoreto e fluoreto de hidrogénio (HF) (30). No entanto, este procedimento tem sido alvo de críticas pois algumas águas já apresentam


14

naturalmente fluoreto, podendo ser responsáveis pelo aparecimento de fenómenos de toxicidade nas populações. Por outro lado, não é possível

controlar a quantidade de água que cada pessoa vai consumir e, portanto, pode estar a fomentar-se ingestões desajustadas de fluoretos (50).

A nível mundial, a concentração de fluoreto adicionado à água não é igual porque a concentração de fluoreto nas águas não é igual e porque os vários

factores que influenciam a exposição a este ião também são diferentes. Uma concentração de fluoreto de 0,7-1 mg/L na água é considerada óptima na Áustria, contudo é exageradamente elevada no Sudão, onde a fluorose tem

sido observada para uma concentração de 0,5 mg/L de fluoreto na água. Por exemplo, no Senegal é recomendado um teor de fluoreto na água de consumo

público de 0,6 mg/L (11). Nas zonas temperadas do globo, a concentração de fluoreto adicionado à água de consumo público é 1 mg/L, a qual é definida globalmente como a ''concentração ótima" de fluoreto, com um nível máximo

de proteção da cárie dentária e um risco mínimo de fluorose dentária (36).

As crianças até aos 6 meses bebem cerca de 250 mL de água por dia, não só pela ingestão directa de água mas também através da reconstituição do leite em pó, papas e outros produtos desidratados, o que representa,

aproximadamente, 42-45% da ingestão total de fluoreto. Da mesma forma, as crianças dos 6 aos 12 meses ingerem 27-35% de fluoreto através da dieta,

onde 30-42% do fluoreto ingerido está presente na água de consumo público e em géneros alimentícios processados (37).

Deste modo, ao considerar-se os alimentos processados, a água fluoretada tem, indirectamente, um grande impacte na toxicidade do fluoreto quando é usada no processamento de leites, alimentos e bebidas (49).

Os alimentos transformados e alimentos para bebés destinados a lactentes e

crianças jovens são uma grande fonte de fluoreto para as crianças devido à biodisponibilidade quase total do fluoreto, contribuindo para uma maior ingestão diária de fluoreto nas crianças, independentemente da água utilizada

para a reconstituição do produto (37). Em 1979, por causa do interesse sobre a ingestão de fluoreto por crianças, os fabricantes de fórmulas infantis (nos

EUA) concordaram voluntariamente em diminuir a concentração de fluoreto (36).

Os sumos preparados com água fluoretada contêm 0,9-1,3 mg/L de fluoreto, enquanto sumos preparados com água com uma reduzida concentração de

fluoreto (< 0,2 mg/L) contêm 0,2-0,5 mg F/L (2). Em contrapartida, Heilman et al. analisaram a água usada durante o processo de fabrico em refrigerantes e verificaram que a concentração de fluoreto nos mesmos era 11 % mais

baixa que a concentração de fluoreto na água. Isto pode ser justificado pelo facto de a água sofrer um pré-tratamento que promova a diminuição da

concentração de fluoreto (17). Por exemplo, durante a fervura da água a concentração de fluoreto aumenta proporcionalmente à perda de volume, pelo que a concentração de fluoreto na água é aproximadamente o dobro após

ebulição (11, 37).

Nos primeiros meses de vida de uma criança, para além da água, o leite materno pode ser considerado como uma fonte de exposição ao fluoreto. Contudo, mesmo que a mãe esteja muito exposta ao fluoreto pela dieta (>20


15

mg/dia), a concentração de fluoreto no leite materno representa apenas 0,2% da concentração total ingerida pela mãe (36, 37).

Isto pode estar relacionado com a biodisponibilidade do fluoreto pois o leite interfere com a taxa de absorção deste anião. O leite e os produtos lácteos

diminuem a disponibilidade de fluoreto em 20-50% no trato gastrointestinal humano devido à presença de elevadas concentrações de cálcio. O leite

também é rico em gorduras, que aumentam o tempo de permanência dos alimentos e bebidas no estômago (37, 51).

O leite de vaca é uma alternativa ao leite materno pois apresenta baixo teor de fluoreto (0,07 a 0,1 mg/L (37), porém a exposição destes animais a elevadas concentrações de fluoreto na água, solo e alimentos pode aumentar

a concentração de fluoreto no leite (36).

Em muitas regiões do mundo os produtos agrícolas (batatas, feijões, tomate, pepinos, melancia, etc.) são grandes fontes de exposição ao fluoreto, sendo que as colheitas são regadas com água de pequenos poços contendo elevadas

concentrações de fluoreto (3, 36) e também porque são utilizados fertilizantes e alguns pesticidas que o contêm.

A maioria dos alimentos tem teores de fluoreto inferiores a 0,5 mg/kg, com excepção dos peixes e mariscos (2,12 mg/kg) devido à inclusão deste ião nos

ossos, escamas e conchas (9). O frango pode conter elevadas concentrações de fluoreto, quando os animais são alimentados com farelos de ossos (0,6-

10,5 mg F/L) (49, 52).

O consumo de água mineral engarrafada faz com que estas se tornem

importantes fontes de ingestão crónica de fluoreto (49), podendo conter concentrações de fluoreto superiores a 1 mg/L (0,1 a 9 mg/L) (2, 53). Deste

modo, considerando que a dose diária recomendada de fluoreto nos adultos é de 0,1 mg/kg, o consumo diário de águas engarrafadas durante três meses poderia facilmente ultrapassar este limite (54, 55).

Na Alemanha, por exemplo, foi avaliado o conteúdo de fluoreto em várias

águas comercializadas, verificando-se que a concentração de fluoreto nas mesmas é muito variada (0,007-4,1 mg/L). No Brasil, um estudo semelhante concluiu que apenas 25% das àguas engarrafadas comercializadas apresentam

menção no rótulo sobre o teor de fluoreto (43).

Por outro lado, os sumos e refrigerantes também podem ser uma fonte de

exposição ao fluoreto pela dieta. Nas últimas décadas ocorreram mudanças significativas nos hábitos alimentares das crianças, aumentando o consumo de

bebidas processadas, como os sumos e refrigerantes, que podem conter concentrações elevadas de fluoreto (0,1 - 1,4 mg/L) (9, 17, 49).

Estudos norte-americanos sugerem que as crianças com menos de 1 ano de

idade consomem diariamente, em média, 85 mL de sumos e outras bebidas processadas por dia, as crianças com 1-2 anos consomem 255 - 348 mL e crianças com 3 - 5 anos consomem 298 - 406 mL (17, 56).

A nível europeu, alguns estudos polacos sugerem que 88% das crianças de 6

meses de idade consomem uma média de 114 mL de sumo por dia e as crianças de 12 meses consomem 208 mL de sumo (15).


16

Algumas plantas, principalmente o chá (Camellia sinensis), acumulam fluoreto nos seus tecidos (97%), particularmente nas folhas (3,2-400 mg/ kg), que

após a ebulição fica quase na totalidade disponível no chá (2). O teor de fluoreto nas folhas aumenta com a maturação das mesmas; nas folhas jovens varia entre 100-430 mg/kg, enquanto nas folhas mais antigas pode atingir

concentrações de 530-2350 mg/kg, embora estas últimas não sejam frequentemente usadas para o fabrico de chás e infusões (42, 57).

Deste modo, as pessoas que bebem grandes quantidades de chá podem ser expostas a concentrações elevadas de fluoreto. A concentração de fluoreto nos

chás é variada, podendo atingir máximos de 7 mg/L (2, 42). As infusões são boas alternativas ao chá pois apresentam concentrações mais baixas de

fluoreto (37).

Curiosamente, o teor de fluoreto nos chás e infusões descafeinados (3,19

mg/L) é significativamente mais elevado que nos chás e infusões com cafeína (1,50 mg/L), cuja diferença é atribuída ao uso de água mineral, que contém

naturalmente, um elevado teor de fluoreto, durante o processo de remoção da cafeína (56, 58).

Os produtos odontológicos, como as pastas dentífricas, os elixires e os géis, são também grandes fontes de fluoreto e que podem aumentar o risco de toxicidade, principalmente nas crianças (16).

Desde a sua introdução no mercado europeu nos anos setenta, as pastas

dentífricas enriquecidas com flúor representam 95% dos produtos odontológicos comercializados e conduziram a uma diminuição da incidência de cáries em todos os países europeus (5).

A união europeia homologou que as pastas dentífricas não deviam conter mais

de 1500 mg/kg, no entanto, as crianças com idade inferior a 6 anos, engolem quantidades consideráveis de pasta de dentes, o que contribui consideravelmente para o aumento da ingestão diária de fluoreto (5, 30).

Considerando que a quantidade média colocada nas escovas de dentes, por

crianças com menos de 6 anos de idade (faixa etária sem controlo da deglutição) é de 0,55g e se o dentifrício contém 1000 mg F/L, a exposição ao fluoreto é de 0,55 mg por lavagem de dentes. Em média, 48% dessa

quantidade é ingerida por crianças de 2 - 3 anos, 42% por crianças de 4 anos e 34% por crianças de 5 anos (49, 53).

Assim, recomenda-se aos pais que as crianças iniciem a lavagem dos dentes dos filhos após os 2 anos de idade para evitar a ingestão acidental de pasta

dentífrica, e assim, diminuir o risco de fluorose nas crianças. Além disso, após início da lavagem dos dentes a quantidade de pasta a colocar na escova não deve exceder o tamanho de uma ervilha (0,25-0,3 g) (5).

Os géis fluoretados, utilizados para aplicações tópicas, têm uma concentração

média de 5000 mg/kg (30). A concentração de fluoreto ingerida, após aplicação, oscila entre 10 a 35 mg de fluoreto, quando não é usado o aparelho de sucção, e de 2 a 7 mg, quando o aparelho é aplicado. Embora estas

concentrações excedam os limites estabelecidos como “seguros”, a sua aplicação é realizada com intervalos de tempo de 3 a 12 meses, pois apenas é

utilizado pelo médico dentista. Por outro lado, a aplicação deste tipo de


17

produto odontológico é restrita a crianças com elevado risco de cárie dentária (49, 59).

Por fim, os elixires orais contêm concentrações de fluoreto de 230 - 910 mg/kg. A quantidade de solução ingerida após o bochecho é inversamente

proporcional à idade e directamente proporcional à duração e ao volume de solução usado no bochecho (49).

A suplementação de flúor tem como objectivo principal a redução do risco de cárie dentária, devido ao efeito cariostático do fluoreto (30). Contudo, quando

ingeridos inapropriadamente, os suplementos de flúor constituem um fator de risco de toxicidade para as crianças, nomeadamente a fluorose dentária (5, 36).

A prescrição de suplementos de flúor para a prevenção da cárie dentária só

deveria acontecer em áreas onde a concentração de fluoreto na água é inferior a 0,3 mg/L. A suplementação de flúor é recomendada a indivíduos com elevado risco de cárie dentária, sendo que a dose recomendada é de 0,25 mg

de fluoreto por dia em crianças dos 2 aos 6 anos e 0,5 mg de fluoreto em crianças dos 7 aos 18 anos (16).

Deste modo, os odontologistas e os médicos dentistas devem ser cautelosos na prescrição de suplementos de flúor na dieta de crianças que consomem

quantidades substanciais de fluoreto por outras fontes da dieta (9, 17, 49).

O fluoreto também está presente em muitos medicamentos pediátricos, sem que haja uma finalidade clara. Através da análise da concentração de flúor em 114 medicamentos pediátricos líquidos, verificou-se que 99,12% dos

medicamentos apresentaram fluoreto na sua composição, com variações entre 0,0 e 97,8 mg F/L (49).

Um estudo sugeriu que a dose diária ingerida de fluoreto, tendo em conta as várias fontes de exposição (alimentos, bebidas, água, leite de vaca, pasta de

dentes enriquecida com flúor e suplementos de flúor), em áreas naturalmente fluoretadas é 0,11-0,20mg/Kg/dia (3).

5. Toxicidade dos fluoretos

Os indivíduos particularmente susceptíveis aos efeitos adversos do fluoreto são as crianças, os diabéticos, os doentes renais, os indivíduos com

osteoporose, as grávidas ou as mulheres que estão a amamentar e os indivíduos com carência de micronutrientes específicos como o cálcio, o

magnésio, o iodo e o selénio (13).

Os sintomas de uma intoxicação aguda por fluoreto são náuseas e vómitos,

salivação excessiva, diarreia, broncoespasmo, convulsões, coma (12), fibrilhação ventricular e arritmia, pupilas dilatadas, hemoptise, cãimbras,

hipercalemia, hipocalcemia e diminuição da função renal (34). Pode ainda provocar a morte devido ao bloqueio do metabolismo celular pois o fluoreto inibe processos enzimáticos, especialmente das metaloenzimas, responsáveis


18

por processos vitais importantes (26, 60). Alguns autores estimam que a dose letal de fluoreto nos humanos é de 32 - 64 mg /kg e que, numa intoxicação

aguda, a dose tóxica é de 5 mg /kg (34).

A ingestão de baixas concentrações de fluoreto, por um longo período de

tempo, está relacionada com alterações graves nas estruturas dentárias e ósseas (5). A ingestão crónica de fluoreto também afecta as células dos

tecidos moles, como por exemplo, as células renais, gónadas (30) e glândula pineal (13, 48), promove alterações comportamentais (diminuição da capacidade motora e de memória) (10), bioquímicas e histológicas (diminuição

da atividade enzimática da colinesterase plasmática, diminuição das células de Purkinje cerebelares e de receptores nicotínicos cerebrais) (34).

As manifestações tóxicas mais comuns dos fluoretos são a fluorose dentária e a fluorose esquelética (5, 33, 61).

5.1 Fluorose dentária

A fluorose dentária está relacionada com a exposição a elevadas concentrações de fluoreto durante o período de formação do esmalte (amelogénese) (13), podendo alterar a qualidade de vida, principalmente, das

crianças (59). O tempo de exposição, a idade, a dose ingerida (14) e a predisposição genética à fluorose dentária determinam a severidade da

fluorose (13).

As amelogeninas, constituem cerca de 90% das proteínas da matriz do

esmalte e estão envolvidas na regulação da forma e tamanho dos cristais de hidroxiapatita, numa reacção dependente de cálcio. Na fase precoce da maturação do dente (fase pré-eruptiva), a exposição ao fluoreto promove a

remoção da amelogenina da matriz do esmalte pelas amelogeninases e, consequentemente, há um aumento da cristalização e tamanho dos cristais de

apatita (5, 36, 62).

No entanto, a exposição a concentrações elevadas de fluoreto diminui a

hidrólise e remoção de amelogenina durante a amelogénese e inibe as proteinases envolvidas na hidrólise de amelogenina pela ligação do fluoreto ao

cálcio, o que resulta numa hipomineralização do esmalte, que se apresenta mais poroso (63-65). A fluorose também provoca lesões na estrutura e função de alguns órgãos, como o cérebro, fígado, rins e medula óssea (66, 67).

A figura 2 (68) ilustra as lesões no esmalte decorrentes da exposição crónica e

aguda aos fluoretos.


19

Figura 2: Lesões no esmalte dentário induzidas pela exposição crónica (A) e aguda (B) ao fluoreto. E: esmalte e D: dentina.

A fluorose dentária pode ser moderada ou severa (36) e caracteriza-se pela

hipomineralização da superfície dentária apresentando pigmentação branca no esmalte dentário (FD moderada) e pigmentação castanha (FD severa), podendo evoluir para cavidades dentárias (14), apresentando repercussões

estéticas, morfológicas e funcionais (43). As formas de fluorose menos severas não são esteticamente incómodas e são reversíveis (33).

A figura 3 (31, 69) apresenta dois casos de fluorose dentária severa.

Figura 3: Opacidade e pigmentação do esmalte em formas severas de fluorose dentária .


20

As crianças com idades inferiores a 8 anos são mais susceptíveis à fluorose dentária pois é neste período que a maturação do esmalte fica completa e que

ocorre a erupção da dentição permanente (15, 70), pelo que após esta faixa etária a vulnerabilidade à fluorose dentária diminui (36). Porém, esta manifestação de toxicidade do fluoreto pode ocorrer em faixas etárias

superioes, embora o risco seja reduzido (43, 71).

O diagnóstico de fluorose dentária é difícil uma vez que a opacidade do esmalte pode ter várias origens (raquitismo e subnutrição). Os índices descritivos são eficazes no diagnóstico e estabelecimento do grau de

severidade da fluorose dentária (5). Os mais importantes são: o índice de Fluorose Dentária de Dean (DFI) e o índice de Thylstrup-Fejerskov (TFI) (13,

48).

Alguns estudos sugerem que as manifestações clínicas e estéticas da fluorose

são irreversíveis. Porém, alguns autores observaram que a ingestão de uma combinação de cálcio, vitamina D e de ácido ascórbico pode diminuir a

toxicidade do fluoreto. Para além disso, a suplementação com proteína ajuda a controlar o estresse oxidativo induzido pelo fluoreto, apresentando benefícios na função hepática (58).

5.2 Fluorose esquelética

A exposição crónica ao fluoreto (4 – 5 anos) ou a ingestão de elevadas

concentrações de fluoreto (superiores a 3,6 mg/L durante 6 meses) pode desencadear a fluorose esquelética, ocorrendo alterações esqueléticas,

articulares, nefrológicas e neurológicas (13, 14, 72). Por exemplo, na África do Sul e na Índia verifica-se a incidência de fluorose esquelética para uma concentração de fluoreto na água de 8 mg/L (41).

As alterações ósseas mais frequentes são osteosclerose, rigidez nas

articulações, exostoses ósseas, cifose acentuada, calcificação dos ligamentos e osteoporose (35, 72).

Ao contrário da fluorose dentária, as deformações ósseas provocadas pela exposição a elevadas concentrações de fluoreto não ocorrem apenas durante os primeiros anos de vida; contudo, se a exposição ocorrer durante os

primeiros anos de vida ocorrerão deformações ósseas principalmente nos ossos de suporte corporal, como o fémur (31). Por outro lado, a fluorose

esquelética pode ser reversível, mesmo após exposição prolongada, desde que a fonte de exposição seja eliminada (13).

Existem vários factores que contribuem para as deformações ósseas e articulares, sendo a carência alimentar aquele que maior impacte tem na

saúde óssea. Primeiro, a carência de cálcio nas crianças pode agravar a fluorose esquelética e provocar a osteoporose, pelo que uma dieta rica em cálcio pode reduzir os efeitos da exposição ao fluoreto pois diminui a sua

absorção. A subnutrição pode provocar um crescimento ósseo raquítico e


21

impedir o desenvolvimento de um esqueleto forte e saudável, o que aumenta a susceptibilidade aos efeitos tóxicos do fluoreto (31).

A figura 4 (31, 72) ilustra as consequências da fluorose esquelética.

Figura 4: Radiografia do antebraço com calcificação do periósteo (membrana

de revestimento ósseo) (A) e deformações ósseas de Genuvalgum numa criança com fluorose esquelética (B).

5.3 Outros efeitos tóxicos

5.3.1 Citotoxicidade

Os epitélios do pulmão, rins, intestino e pele são diariamente expostos ao

fluoreto, no entanto as células do epitélio estão preparadas para suportar agressões externas, pelo que só se verificam efeitos tóxicos se ocorrerem

alterações na formação e desenvolvimento dos tecidos (30, 46).

A acção citotóxica do fluoreto está directamente relacionada com a sua

interação com o cálcio. Por um lado, o fluoreto forma complexos insolúveis com este ião, o que diminui acentuadamente a absorção gastrointestinal de

fluoreto provocando hipocalcemia e inibição de enzimas dependentes de magnésio e manganês (30). Por outro lado, concentrações elevadas de fluoreto aumentam a concentração intracelular de Ca2+ nos eritrócitos,

osteoblastos, túbulos proximais e no epitélio renal (1) uma vez que os ionóferos de cálcio formados pela complexação do fluoreto com o cálcio


22

atravessam facilmente a membrana celular, o que poderá induzir apoptose e/ou necrose e diminuir a proliferação celular (1, 30).

Para além disso, muitos complexos inorgânicos são formados entre o fluoreto e os iões metálicos (alumínio e berílio), e representam compostos

biologicamente activos em alguns processos fisiológicos e toxicológicos. A acção biológica é devida à semelhança estrutural destes compostos com o

grupo fosfato, interferindo com os sistemas enzimáticos responsáveis pelos processos de fosforilação e desfosforilação, como as GTPases e ATPases (30).

Também o transporte vesicular desempenha um papel importante no transporte de proteínas transmembranares entre o retículo endoplasmático e a membrana celular, por exocitose ou endocitose. A exposição a elevadas

concentrações de fluoreto pode comprometer este sistema de transporte. A fluorose dentária é um bom exemplo da influência do fluoreto neste tipo de

transporte pois afecta a fase secretora dos ameloblastos, reduzindo a síntese proteica (30).

5.3.2 Toxicidade no tracto gastrointestinal

Á excepção do monofluorfosfato dissódico (principal ingrediente ativo dos dentifrícios), os compostos fluoretados formam HF no estômago e este pode ser irritante para a mucosa gástrica (33). O monofluorfosfato dissódico é

absorvido após hidrólise enzimática por fosfatases, provocando por esse motivo uma menor irritação da mucosa gástrica comparativamente ao fluoreto

de sódio (34).

Alguns autores avaliaram a prevalência de distúrbios gastrointestinais numa

área endémica de fluorose dentária e esquelética na Índia. Verificaram que cerca de 50% da população em estudo era sintomática e que estavam

expostos a uma concentração média de 3,2 mg/L de fluoreto na água de consumo. Concluíram ainda que os pacientes que passaram a consumir água com concentrações de fluoreto iguais ou inferiores a 1 mg/L, os sintomas

gastrointestinais desapareciam após 2-3 semanas (33).

5.3.3 Nefrotoxicidade e hepatotoxicidade

O rim é um órgão muito susceptível a toxicidade aguda pelo fluoreto,

principalmente as células do epitélio do tubo proximal, devido à sua exposição a concentrações elevadas de fluoreto, pois é a principal via de excreção deste

elemento. A presença do enzima gamaglutamiltranspeptidase (-GT) na urina é um indicador de lesão renal (66).

O fígado, devido á sua elevada taxa metabólica, é particularmente susceptível à toxicidade do fluoreto (66). As enzimas aspartato transaminase (AST) e a Alanina transaminase (ALT) são biomarcadores de hepatoxicidade induzida

pelo fluoreto pois este elemento interfere com a actividade destes enzimas. A fosfatase alcalina (ALP) é um enzima marcador da toxicidade do fluoreto e

patologias ósseas, pelo que a diminuição da atividade da ALP no fígado é


23

atribuída ao aumento da estimulação osteoblástica após exposição ao fluoreto, uma vez que este interfere no metabolismo das células ósseas (26, 73).

5.3.4 Teratogenecidade

O fluoreto atravessa a placenta e é incorporado nos tecidos do feto. Estudos

experimentais em animais e humanos sugerem que a ingestão de elevadas concentrações de fluoreto durante a gravidez pode induzir alterações ósseas

no feto, no entanto a terotogenecidade pelo fluoreto não está bem esclarecida (33).

5.3.5 Neurotoxicidade

A exposição a concentrações elevadas de fluoreto pode desencadear

fenómenos de neurotoxicidade, como diminuir as capacidades cognitivas, de aprendizagem e memória, diminuir as capacidades motoras, conduzir a

distúrbios comportamentais em crianças (34, 71), promover alterações da função do sistema nervoso central, provocar um défice no QI (33, 74) reduzir a mielina das fibras nervosas, aumentar a apoptose neuronal, alterar os níveis

proteicos e de neurotransmissores e modificar a actividade de algumas enzimas cerebrais (10, 12).

São vários os mecanismos que justificam a neurotoxicidade do fluoreto: 1)

inibição da neurotransmissão mediada por fosfolipases; 2) alterações histológicas, provocando lesões neurodegenerativas, como diminuição do

número e tamanho dos neurónios e diminuição das células de Purkinje cerebelares; 3) aumento do estresse oxidativo; 4) redução da atividade de enzimas, como a acetilcolinesterase cerebral e colinesterase plasmática; 5)

redução dos receptores nicotínicos cerebrais (34, 72) e 6) alterações no metabolismo do glutamato, um neurotransmissor excitatório do hipocampo

responsável pelos processos de aprendizagem e memória (10).

5.3.6 Indução do stresse oxidativo

A exposição excessiva ao fluoreto está associada ao stresse oxidativo, à modulação da homeostase redox intracelular e às alterações no mecanismo de defesa antioxidante. O fluoreto induz a produção excessiva de espécies

reactivas de oxigénio, diminui a actividade de alguns enzimas antioxidantes (catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationo peroxidase (GPx)) e

altera o metabolismo do glutationo (GSH), principalmente a nível cerebral, hepático, renal, testicular e nos eritrócitos (26, 73, 75). Também inibe enzimas da via glicolítica (lactato desidrogenase), do ciclo de Krebs e das

reacções de desfosforilação (adenilato ciclase) (30, 46, 73).

O aumento da concentração de espécies reactivas de oxigénio, para além das lesões oxidativas, inibe as ATPases o que provoca a diminuição da síntese


24

celular de ATP, o aumento da concentração celular de ADP, AMP, GDP e fosfato e a alteração do potencial de membrana, perturbando a cadeia

respiratória e a função mitocondrial (30, 76). Há também uma inibição de citocromo C na mitocôndria, que resulta na indução e activação endógena de óxido nítrico (NO), o qual reage com as espécies reactivas de oxigénio, grupos

tiól e metais dos centros activos das proteínas formando aductos nitrosilo. A redução da actividade do citocromo C inibe a respiração mitocondrial devido à

despolarização da membrana mitocondrial (30). O desequilíbrio da homeostase redox induz a peroxidação lipídica (ataque dos fosfoslípidos das biomembranas pelos radicais livres), o que diminui a fluidez e

a permeabilidade membranar e, consequentemente, induz a apoptose celular (75, 76).

As espécies reactivas de oxigénio produzidas pela exposição ao fluoreto também induzem a resposta inflamatória mediada pelos macrófagos, células que participam na formação da placa aterosclerótica, o que faz do fluoreto um

importante factor pró-aterogénico no desenvolvimento de doenças cardiovasculares (75, 76).

5.3.7 Toxicidade do sistema reprodutor

Na Índia, onde a fluorose é endémica, são muitos os casos de infertilidade masculina associada ao fluoreto (77).

A exposição crónica ao fluoreto induz alterações nos níveis das hormonas sexuais, no ciclo menstrual, aumenta o aborto espontâneo e durante a

gravidez diminui a lactação, especialmente em pessoas com fluorose esquelética (33, 77). Os principais efeitos tóxicos do fluoreto na infertilidade

masculina resultam das alterações na estrutura e funcionalidade dos espermatozóides e interrupção da espermatogénese, o que diminui o número de espermatezóides. Para além disso, o fluoreto também interfe com o

metabolismo da hormona da tiróide que, indirectamente, influencia não só a espermatogénese, mas também outras funções reprodutivas (33, 78).

A administração de ácido ascórbico, cálcio e vitaminas D e E beneficia a recuperação das lesões provocadas no sistema reprodutor, principalmente as

lesões oxidativas. No entanto, não reduzem a concentração plasmática de fluoreto, pelo que os seus efeitos benéficos são, na sua totalidade, devido às

suas propriedades antioxidantes (34).

5.3.8 Aumento da toxicidade de metais

O fluoreto pode alterar a absorção, biodisponibilidade e/ou toxicidade do de

alguns metais como o alumínio e o chumbo (33).

O chumbo e o fluoreto possuem uma biodistribuição comum, principalmente

nos tecidos calcificados como o esmalte dentário, o que sugere uma interacção


25

biológica entre o chumbo e o fluoreto. Deste modo, a estrutura da hidroxiapatite também pode ser alterada pela substituição do cálcio pelo

chumbo, aumentando a retenção deste metal nos tecidos mineralizados (30, 60). Da mesma forma, o fluoreto pode afectar a concentração de outros metais nos tecidos calcificados como o zinco e o cádmio (60).

A formação de complexos de fluoreto e alumínio aumenta a absorção de

alumínio, que pode provocar maiores alterações neuronais que o próprio fluoreto, mas diminui a absorção de fluoreto, reduzindo assim os efeitos tóxicos deste ião (34). Estes complexos podem ainda funcionar como

activadores das proteínas G e, consequentemente, modular várias vias de sinalização, alterando a expressão genética, a reorganização do citoesqueleto

e o transporte vesicular intracelular e nucleo-citoplasmático (30).

A administração simultânea de arsénio e fluoreto apresenta uma menor

toxicidade no trato gastrointestinal (efeito antagónico), em comparação com a exposição individual a esses agentes tóxicos. No entanto, alguns estudos

sugerem que a exposição a misturas destes dois elementos aumenta o risco de efeitos genotóxicos e diminui o QI em crianças (30).

5.3.9 Desregulação endócrina

A acumulação de fluoreto na glândula pineal com a idade foi associada a fenómenos de desregulação endócrina. A glândula pineal, que também contém

hidroxiapatita, retém o fluoreto da mesma forma que os tecidos calcificados (13).

O fluoreto também promove o aumento ou a diminuição da secreção de insulina, aumenta a libertação de acetilcolina no cérebro e diminui a libertação

de acetilcolina nos gânglios cervicais (30).

A exposição a elevadas concentrações de fluoreto também provoca alterações

na hormona tiroideia, o que induz alterações no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC), uma vez que a esta hormona intervém na maturação

pós-natal do sistema nervoso central e periférico (34).

6. Avaliação do risco

A aplicação de um modelo de avaliação de risco quantitativo permite avaliar a existência ou não de risco para a população associada à exposição ao fluoreto,

o qual é susceptível de provocar efeitos adversos na saúde (36).

São usados como biomarcadores de fluoreto: 1) o plasma, osso (mas não é viável em vida), dentes, urina, saliva, esmalte, cabelo, unhas, como biomarcadores de exposição (33, 38); 2) fatores genéticos, marcadores ácido-

base, crescimento ósseo e estado nutricional, como biomarcadores de


26

susceptibilidade e 3) redução na atividade e severidade das cáries dentárias, fluorose dentária e fluorose esquelética, como biomarcadores de efeito (50).

O cabelo apresenta vantagens em relação a outras amostras biológicas porque é facilmente recolhido, a recolha da amostra é indolor, fácil de transportar e

armazenar. Além disso, a análise capilar pode fornecer informação sobre a exposição crónica ao fluoreto (3).

As crianças constituem o grupo populacional vulnerável, em virtude da maior ingestão de alimentos face ao seu peso corporal. Logo, a avaliação da

exposição total ao fluoreto deve incluir as várias fontes de exposição a este ião (15).

O NOAEL (dose mais elevada que não provoca nenhum efeito adverso observável na saúde), tendo em conta a manifestação tóxica do fluoreto mais

comum (fluorose dentária) é 0,05 mg F/kg massa corporal/dia (5). Este valor é recomendado para crianças com idade superior a 6 meses; para crianças com idade inferior a 6 meses recomenda-se 0,01 mg F/kg massa corporal/dia

(79) (tabela 1).

O LOAEL (dose mais baixa que provoca efeitos adversos observáveis na saúde), para a fluorose dentária é 0,1 mg F/kg massa corporal/dia (5).

A tabela 1 (35, 70, 79) apresenta os valores da dose diária recomendada para o controlo da cárie dentária nas várias faixas etárias, bem como a respectiva

dose diária tóxica.

Tabela 1: Dose Diária Recomendada (DDR) para uma eficaz proteção da cárie dentária e Dose Diária Tóxica (DDT) com risco de fluorose .

Faixa etária Peso corporal

médio (Kg) DDR* (mg) DDT* (mg)

0 – 6 meses 7 0,01 0,7

7 – 12 meses 9 0,5 0,9

1 – 3 anos 13 0,7 1,3

4 – 8 anos 22 1 2,0

9 – 13 anos 40 2 10

14 – 18 anos 60 3 10

Mulheres ≥ 19

anos 61 3 10

Homens ≥ 19

anos 76 4 10

*: DDR, dose diária recomendada; DDT, dose diária tóxica em relação ao risco de fluorose.


27

A dose letal para adultos é 0,20-0,35 g F/Kg massa corporal (80). Em certas

áreas mundiais, em que a concentração de fluoreto ambiental é elevada, a população pode ingerir diariamente até 27 mg de fluoreto (81).

Para além da existência de várias vias de exposição diária ao fluoreto, existem outros factores que dificultam o estabelecimento de um método de avaliação

do risco do fluoreto. Na maioria dos estudos realizados para avaliar os efeitos tóxicos da exposição aguda e crónica ao fluoreto são utilizadas concentrações deste elemento muito superiores àquela a que o ser humano está exposto

diariamente, o que dificulta bastante o estabelecimento de limites de toxicidade. Por outro lado, a grande maioria destes estudos são realizados em

animais adultos jovens e sãos, expostos por um período relativamente curto, enquanto o ser humano está exposto ao fluoreto durante a sua vida inteira (iniciando pelo período intra-uterino), independentemente do seu estado de

saúde (34).

Face ao exposto, as principais medidas recomendadas para diminuir a exposição crónica ao fluoreto por via oral são: 1) a redução da concentração de fluoreto nos produtos odontológicos de uso diário, 2) rotular as embalagens

dos produtos fluoretados com instruções e precauções sobre o seu uso em crianças, 3) controlar a quantidade de pasta dentífrica utilizada para evitar a

deglutição, 4) contra-indicar o uso de elixires em crianças com idade inferior a 7 anos, 5) diminuir o consumo de refrigerantes, sumos e chás, principalmente nas crianças, 6) reduzir a suplementação de flúor em áreas fluoretadas,

natural ou artificialmente e 7) informar a população relativamente aos efeitos tóxicos do fluoreto (17, 32, 52).

6.1 Relação risco vs benefício

A adição de fluoreto à água de abastecimento público foi uma medida simples

e de baixo custo para reduzir a incidência de cárie dentária nas populações, principalmente na crianças (33). Porém, a redução da cárie dentária foi

acompanhada por um aumento da prevalência de fluorose dentária (15, 82) e de outras manifestações tóxicas.

No entanto, relativamente à fluoretação da água (maior fonte de exposição das populações ao fluoreto), vários autores concluíram que: 1) não existem

estudos suficientes que estabeleçam uma relação entre a fluoretação da água e a indução de cancro; 2) o fluoreto na água, em concentrações até 1 mg/L, não aumenta o risco de fraturas; 3) não há incidência de fluorose esquelética

na população exposta até 4 mg/L de fluoreto pela água de abastecimento público; 4) não há aumento do número de doentes renais ou com deficiências

orgânicas quando expostos até 8 mg/L de fluoreto na água de consumo público; 5) não existem efeitos adversos associados, exclusivamente, à fluoretação da água e 6) a exposição a 1 mg/L de fluoreto pela água, a longo

prazo, não induz alterações na densidade e mineralização óssea (5). Porém, também não existem estudos que garantam a total segurança de uma

exposição crónica ao fluoreto, mesmo para concentrações baixas (34).


28

Actualmente, as formas menos severas da fluorose são esteticamente aceitáveis, tendo em conta que a fluoretação da água e produtos de higiene

foram e continuam a ser os melhores meios de controlo da cárie dentária nas populações. No entanto, o risco de fluorose deveria ser considerado um problema de saúde pública, pois a presença de fluoreto em várias fontes pode

expor a população a concentrações deste ião acima da dose diária recomendada, contribuindo para um aumento do número de casos de

toxicidade pelo fluoreto (61).

Segundo as avaliações de risco dos nutrientes realizadas pela EFSA, o fluoreto

é o único nutriente sujeitado a uma avaliação da relação risco benefício, isto porque é muito ténue a linha que separa o NOAEL e o LOAEL (13, 71).

Capítulo II- Aspectos legais

29

Capítulo II – Aspectos legais

Ao longo das últimas duas décadas, análise de risco em relação aos nutrientes tem-se destacado no âmbito da investigação científica. Este interesse tem sido

estimulado pela crescente disponibilidade e comercialização de alimentos fortificados, alimentos funcionais e de suplementos dietéticos, bem pela necessidade de harmonização das abordagens internacionais, de forma a

diminuir barreiras comerciais e aumentar a protecção da saúde dos consumidores (13, 48).

A nível internacional, os princípios de análise de risco têm sido adoptados pela Comissão do Codex Alimentarius (CCA), a organização inter-governamental

responsável pelo desenvolvimento de directrizes e normas internacionais que visam a protecção da saúde dos consumidores inerentes à alimentação (13,

48).

Na Europa, a European Food Safety Authority (EFSA), com personalidade

jurídica e independente das demais instituições da União Europeia (UE), presta à Comissão Europeia pareceres científicos independentes sobre todas as

matérias com impacto directo ou indirecto na segurança dos alimentos, com base no Regulamento (CE) nº. 178/2002, que constitui a base jurídica da autoridade (83).

Com vista a prestar apoio científico para o trabalho legislativo da Comissão

Europeia nesta matéria, o Comité Científico da Alimentação Humana (CCAH) emitiu, entre 2000 e 2003, uma série de opiniões sobre os níveis de ingestão máxima toleráveis de vitaminas e minerais e factores de segurança em relação

à sua utilização em alimentos fortificados e suplementos alimentares (77).

Sob o ponto de vista da EFSA, o fluoreto não é essencial para o crescimento e

desenvolvimento humano, mas esta entidade cite a sua importância na redução da cárie dentária (13, 48). A EFSA também não considera o fluoreto

como contaminante alimentar (84), pelo que é permitido a sua adição a alimentos segundo o Regulamento (CE) nº. 1925/2006 e a Directiva

2002/46/EC, relativos à presença de minerais em alimentos fortificados e suplementos alimentares, respectivamente (85, 86).

A Directiva 2008/100/CE (87), transposta pelo Decreto-lei nº. 54/2010 (88), relativa à rotulagem nutricional dos géneros alimentícios, no que respeita às doses diárias recomendadas, factores de conversão de energia e definições,

fixa uma DDR para o fluoreto de 3,5 mg, com base em valores de referência populacionais de vários Estados-Membros e de dados provenientes dos EUA e

com vista a proteger os indivíduos mais susceptíveis (13, 48, 77).

Podem ser usados em produtos de higiene oral 20 compostos de flúor (77). A

união europeia estipulou que as pastas dentífricas não deviam conter mais de 1500 ppm de fluoreto. De acordo com a Directiva 2007/53/CE (89), se a única

fonte de exposição ao flúor for pasta dentífrica com flúor entre 1 000-1 500 ppm, há um risco mínimo de que a pasta dentífrica, desde que se sigam as recomendações de uso, provoque fluorose nas crianças com idade não

superior a seis anos. Posteriormente, segundo a Directiva nº. 2009/129/CE (90), da rotulagem das pastas dentífricas que contenham compostos com flúor

Capítulo II- Aspectos legais

30

numa concentração entre 0,1-0,15 %, calculada como fluoreto, excepto se já se indicar que é desaconselhada a utilização em crianças (por exemplo,

“unicamente para adultos”), deve obrigatoriamente constar a seguinte advertência: “Crianças até aos seis anos: utilizar uma quantidade do tamanho de uma ervilha, com supervisão durante a escovagem para minimizar a

deglutição. Se estiver a tomar fluoreto proveniente de outras fontes, consulte o seu dentista ou o seu médico”.»

Relativamente aos suplementos alimentares de flúor, estes são recomendados pelas sociedades médicas de alguns países para a prevenção de cárie, sendo

que a prevenção e/ou tratamento usando fluoretos, na normalização europeia (91), é considerada como uma reivindicação medicinal e não para fins

nutricionais (13, 48). Porém, na UE é permitida a utilização do fluoreto de cálcio, do fluoreto de potássio, do fluoreto de sódio e do monofluorofosfato de sódio como fontes de fluoreto em géneros alimentícios (por exemplo, o sal) e

suplementos nutricionais, segundo o Regulamento (CE) nº. 1170/2009 (92), que apresenta a lista de vitaminas e minerais que podem ser adicionados aos

alimentos e suplementos alimentares.

Em Portugal, tal como já mencionado, a legislação nacional fixou um valor

paramétrico de 1,5 mg/L de fluoretos na água para consumo humano (8), em concordância com a Directiva 98/83/CE (93), relativa à qualidade da água

para consumo humano e que harmoniza o teor máximo de fluoretos nos vários estados membros. Contudo, a água de abastecimento público é cada vez mais substituída pelas águas engarrafadas, sendo que estas últimas podem conter

um teor máximo de fluoretos de 5 mg/L (94). As águas minerais naturais cuja concentração em fluoreto for superior a 1,5 mg/l devem ostentar, no rótulo, a

menção «contém mais de 1,5 mg/l de flúor: não é adequado o seu consumo regular por lactentes nem por crianças com menos de 7 anos» e incluir a indicação do teor real em flúor (95).

A exposição humana ao fluoreto através de tecidos comestíveis, incluindo a

carne, o leite e os ovos, é reduzida (96). No entanto, a homologação dos teores máximos de substâncias indesejáveis nos alimentos, embora possa contribuir simultaneamente para uma redução da exposição humana a

algumas formas tóxicas, é justificada principalmente pela manutenção da saúde animal (96). Neste sentido, a Directiva 2005/87/CE (97) e o Decreto-lei

nº. 236/2009 (98), que transcreve a directiva mencionada relativa às substâncias indesejáveis nos alimentos para animais, no que respeita ao chumbo, flúor e cádmio, estabelece limites máximos de fluoreto presente em

matérias-primas de origem vegetal e animal destinadas a integrar a alimentação animal.

No que respeita aos refrigerantes, sumos, néctares e outras bebidas não alcoólicas não está estabelecido um valor paramétrico de fluoretos uma vez

que a presença de fluoreto nestes géneros alimentícios está associada, principalmente, à água utilizada durante o processo de fabrico, que deve

obedecer ao estabelecido na legislação vigente (8) relativa à qualidade da água para a preparação de alimentos.

Capítulo III- Avaliação do consumo alimentar

31

Capítulo III – Avaliação do consumo alimentar

1. Métodos de avaliação do consumo alimentar

A dieta nacional, bem estabelecida, é a base da definição da política alimentar

nacional (produção, distribuição, consumo dos alimentos necessários) e da promoção da saúde (99). A alimentação está directamente relacionada com a saúde, não só na infância mas também durante a fase adulta, o que justifica o

grande interesse na análise dos hábitos alimentares da população (100).

A alimentação pode ser avaliada sob várias perspectivas que, embora independentes, se complementam: 1) a perspectiva económica, na qual a relação entre a oferta e a procura, os preços dos alimentos e o orçamento

familiar são os principais componentes; 2) a perspectiva nutricional, com ênfase nos constituintes dos alimentos, indispensáveis à saúde e ao bem-estar

do indivíduo (macronutrientes e micronutrientes), nas carências nutricionais e nas relações entre a dieta e a doença; 3) a perspectiva social, centralizada nas associações entre a alimentação e a diferenciação social do consumo, os

ritmos e estilos de vida e 4) a perspectiva cultural, baseada nos gostos e preferências, hábitos, tradições culinárias, práticas, ritos e tabus, isto é, no

aspecto simbólico da alimentação. A união destas perspectivas revela a importância dos factores económicos, sociais, nutricionais e culturais na determinação do tipo de consumo alimentar de uma população (101, 102).

A escolha da metodologia de avaliação do consumo depende de numerosos

factores, tais como a finalidade do estudo, a população alvo, o custo e duração do estudo (103). As técnicas utilizadas para estimar a ingestão dietética podem ser classificadas em dois grupos: métodos quantitativos, como o diário

alimentar e o recordatório alimentar de 24h, que avaliam o consumo do participante num curto período de tempo (dias), e os métodos qualitativos,

tais como a história dietética e o questionário de frequência alimentar, que avaliam o consumo habitual (meses ou anos), permitindo associações com a incidência de determinadas doenças (102). Vários estudos têm demonstrado

uma grande variabilidade entre as metodologias aplicadas na determinação da ingestão diária de nutrientes, o que dificulta a interpretação dos resultados

obtidos, pelo que deve ser realizado um estudo de validação do método precedente à sua aplicação (102, 104).

Nenhum método de avaliação de consumo alimentar está isento de erros, pelo que é de extrema importância minimizar as fontes de erro passíveis de

controlo (105). Existem diversas variáveis que interferem no registo e posterior análise do consumo alimentar, principalmente no que respeita ao entrevistado, nomeadamente a memória, cultura, tabus, estado

socioeconómico e a idade. Para avaliar o consumo alimentar em grandes amostras populacionais, deve-se utilizar instrumentos válidos, económicos e

precisos, sendo necessário aplicar uma metodologia padronizada. A investigação directa do consumo alimentar a partir da aplicação de inquéritos constitui a forma ideal para caracterizar os padrões alimentares vigentes numa

dada população e a sua evolução ao longo do tempo (102).


32

Os inquéritos alimentares são métodos eficazes na avaliação qualitativa e quantitativa do consumo alimentar. Através da sua aplicação é possível

observar hábitos alimentares inadequados e o estado clínico e nutricional, o que permite implementar programas de educação alimentar, cuja finalidade é a prevenção de determinadas doenças, especialmente nas crianças e

adolescentes (100, 102).

Os inquéritos alimentares têm em vista um ou mais dos seguintes objectivos no campo da nutrição e da saúde pública (99):

Conhecer e acompanhar a situação alimentar de um país ou de grupos populacionais e as suas variações ou mudanças;

Comparar a alimentação de grupos da população quer pela sua condição sócio-económica (classe baixa, média ou alta), pelo percurso

profissional (com ou sem qualificação profissional) ou pelo meio de residência (meio urbano ou rural);

Averiguar as relações existentes entre o tipo ou nível da alimentação e

a situação económica dos indivíduos;

Averiguar as deficiências alimentares de um grupo da população num determinado período de tempo;

Servir de base para conhecer as necessidades nutricionais humanas ou

para estudos de investigação;

Avaliar se algum ou alguns nutrientes e/ou contaminantes estão a ser

ingeridos em dosagens que excedem os limites admissíveis podendo pôr em causa a saúde e bem estar dos indivíduos de uma determinada população.

É aliás este último tipo de avaliação que tentámos objectivar neste trabalho.

1.1 Diário alimentar

Neste tipo de metodologia de avaliação do consumo alimentar o entrevistado

regista detalhadamente, em formulário próprio, todos os géneros alimentícios consumidos ao longo do dia, nas respectivas porções. O registo deve ser efectuado após a refeição de modo a minimizar o erro associado à memória do

entrevistado. O diário alimentar deve ser realizado por um período não superior a quatro dias consecutivos, para não desmotivar o participante (99,

102, 106).

A principal vantagem inerente a esta metodologia é, então, a independência

em relação à memória do entrevistado. Os dias de registo podem ser meticulosamente distribuídos, proporcionando uma melhor estimativa do

consumo alimentar habitual e o estabelecimento de padrões alimentares numa população (102, 107).


33

Contudo, a alfabetização dos participados, a alteração de hábitos alimentares durante o período de execução e a omissão de alguns tipos de alimentos, são

algumas desvantagens associadas ao diário alimentar. Além disso, quando o registo impõe a definição das porções ou quantidades ingeridas, a necessidade de cooperação torna-se ainda maior. Por ser mais oneroso, o recurso ao diário

alimentar para estimar o consumo alimentar é restrito a pequenas amostras populacionais, que apresentam motivação e que sejam capazes de seguir

procedimentos de pesagem e registo adequados (102, 104).

1.2 Recordatório alimentar de 24h

O recordatório alimentar é amplamente utilizado em estudos de investigação de intervenção nutricional e monitorização de dietas terapêuticas. Este tipo de inquérito tem por objectivo a descrição detalhada do consumo de alimentos e

bebidas durante um período de 24 horas (102, 108).

A quantidade ou porção de cada alimento é definida por uma medida padrão (por exemplo, 200 mL) ou estimada através de fotografia ou imagem do produto alimentar (uma embalagem, por exemplo), o que implica a utilização

de nomes comerciais dos produtos alimentares. O recordatório alimentar deve ser aplicado por entrevistadores devidamente treinados, em entrevista

presencial ou via telefone, para uma eficaz padronização dos dados. Quando a população em estudo são crianças, o recordatório alimentar deve ser aplicado ao adulto responsável pela criança (100, 102).

A principal vantagem deste método é a rapidez e facilidade de aplicação, que

se traduz num elevado número de entrevistas com um custo associado muito reduzido. Contudo, não permite estimar a dieta habitual do entrevistado devido às alterações no consumo diário dos alimentos de cada indivíduo (102,

107). Para minimizar o erro associado às alterações diárias e sazonais da dieta, recomenda-se a realização de dois ou mais recordatórios em diferentes

alturas do ano.

Esta metodologia de avaliação do consumo alimentar é frequentemente

utilizada para estimar o consumo alimentar de crianças e adolescentes (106).

1.3 História alimentar

A história alimentar consiste numa extensa entrevista, realizada por

profissionais experientes, a fim de obter um padrão alimentar habitual (meses ou anos), o que implica a descrição exaustiva da quantidade e variedade de alimentos consumidos durante um período de tempo relativamente longo (99,

102, 109).


34

O método exige um registo alimentar de três dias constituído por uma lista de alimentos, cuja frequência e periodicidade de consumo devem ser

meticulosamente descritos (102).

Deste modo, a utilização da história alimentar permite uma descrição,

completa e detalhada, dos aspectos qualitativos e quantitativos do consumo dos alimentos. Este método ainda tem como vantagens permitir a avaliação da

ingestão habitual de todos os nutrientes, não está dependente das variações sazonais e diárias na dieta e, por isso, é muito utilizado em ambulatório. De entre as desvantagens da utilização deste método em estudos

epidemiológicos, é possível citar: a dependência da memória do indivíduo sujeito a entrevista; os custos com profissionais, inerentes a toda a análise de

dados e, ainda, o tempo dispensado para a obtenção da história alimentar de um elevado número de indivíduos (102, 107, 109).

1.4 Questionário de frequência alimentar

O questionário de frequência alimentar (QFA) é uma das metodologias

geralmente usadas em estudos epidemiológicos para avaliar a exposição nutricional a longo prazo e as possíveis correlações entre a dieta e o

desenvolvimento de doenças crónicas não transmissíveis (101, 110). Permite a avaliação de tendências e hábitos alimentares de uma população (111) e a identificação de indivíduos com padrões extremos de consumo, durante um

período de tempo definido (por exemplo, um ano ou vários meses) (112). A unidade de tempo mais usada para estimar a frequência de consumo é o ano

precedente, já que prevê um ciclo completo de estações do ano, no qual se inserem as alterações sazonais da dieta (113).

O QFA é composto por uma lista de alimentos e bebidas, podendo ser acompanhada da imagem comercial do produto, cuja frequência de consumo é

questionada ao indivíduo (101). Permite uma estimativa quantitativa do consumo alimentar, uma vez que fornece informação sobre a quantidade diária ingerida de determinados alimentos e/ou nutrientes (102, 114).

Para a elaboração de um questionário de frequência alimentar é necessária uma selecção dos alimentos de acordo com o padrão dietético da população

em estudo, a definição de porções alimentares adequadas às quantidades habitualmente consumidas e a formulação de uma lista com quase todos os

alimentos disponíveis para a população (102).

O número de itens alimentares enumerados no QFA é variável, sendo que

alguns autores recomendam que devem estar compreendido no intervalo de 5 a 350 (101).

Quando o objectivo do estudo é a análise de um ou mais nutrientes, a lista de alimentos pode ser elaborada a partir da identificação dos alimentos com

maior conteúdo do nutriente em questão. No entanto, se o objectivo é a estratificação da população em estudo segundo o seu consumo, a lista de


35

alimentos deverá ser constituída pelo maior número possível de alimentos que fornecem os nutrientes pela dieta (113).

Para a elaboração da lista de alimentos podem ser utilizadas diferentes estratégias. A mais simples, porém com maiores limitações, é a selecção dos

géneros alimentícios que contêm os nutrientes de interesse em tabelas de composição de alimentos. Uma outra estratégia corresponde à utilização de

informação epidemiológica que verifique a existência de associações entre o consumo de um determinado alimento e a presença de doença. A terceira abordagem, considerada a mais apropriada, é a obtenção de uma lista não

restrita de alimentos, elaborada através da aplicação de vários registos diários ou recordatórios de 24 horas na população. Posteriormente, é realizada uma

ponderação estatística, tendo em consideração a contribuição do alimento para o consumo total, bem como as diferenças interpessoais da população em estudo (113).

A frequência de consumo é definida em unidades de tempo: dias, semanas,

semestres ou anos, podendo contemplar ou não pequenas subdivisões destas unidades. Sugerem-se questões simples e de resposta fechada, com um número de categorias superior a 5 e inferior a 10, deixando um espaço em

branco para aqueles itens de alimentos que ultrapassam o consumo previsto (por exemplo, “superior a dez vezes por dia” ou “nunca ou inferior a uma vez

por mês”). Um elevado número de categorias permite a inclusão de alimentos minoritários da dieta, com pouca representatividade no consumo diário total, porém importantes para discriminar o perfil de consumo de uma população

(113). Nesse sentido, o número de categorias de resposta, por unidade de tempo, fornece ao entrevistado um grande número de possibilidades de

resposta, o que aumenta a exactidão da estimativa da frequência de consumo alimentar (112).

As categorias frequentemente utilizadas para caracterizar o perfil de consumo neste tipo de inquérito são: mais de três vezes ao dia, 2-3 vezes ao dia, 1 vez

por dia, 5-6 vezes por semana; 2-4 vezes por semana; 1 vez por semana; 1-3 vezes por mês; raramente ou nunca (115).

O QFA apresenta algumas vantagens, nomeadamente, baixo custo, fácil aplicação, capacidade de caracterizar a dieta habitual dos indivíduos, classificando-a de acordo com níveis de consumo e pode ser aplicado a uma

grande amostra populacional (101-103). Comparativamente a outros métodos, o QFA substitui a avaliação da ingestão alimentar de um ou vários

dias pela informação global de consumo por um período de tempo mais abrangente (65).

Pode ser aplicado por um entrevistador ou de auto-preenchimento em formato papel, sendo que esta última modalidade diminui o tempo e o custo do estudo

(116) mas exige o total esclarecimento do participante no que respeita às regras de preenchimento (117). Em estudos cuja amostra populacional inclui crianças, recomenda-se que o QFA seja preenchido pelos pais ou pelo adulto

responsável pela mesma (117).

Existe, ainda, a possibilidade de adaptar o QFA em formato electrónico, o que permite um uso mais eficiente do tempo, a criação directa de uma base de dados, reduz o risco de perda de dados, não há custos com impressão, o


36

cálculo do consumo é automático e evita questões sem resposta, estatisticamente denominadas de “missing values” (103, 116).

A determinação do consumo alimentar de forma fidedigna e credível ainda é um desafio, face às dificuldades metodológicas impostas (118). Deste modo,

apesar das muitas vantagens no que respeita à facilidade de aplicação e análise, os QFA apresentam algumas limitações, tais como a possibilidade de

apresentação de uma lista incompleta dos alimentos, o agrupamento erróneo ou inadequado dos alimentos e está sujeito a erros na estimativa da frequência e porções de consumo (99, 105, 118, 119).

Um QFA deve ser desenvolvido e validado tendo em conta a população em estudo, por forma a que este esteja de acordo com o tipo de alimentos que

incluem a dieta habitual, bem como assegurar a total perceptibilidade do questionário pela população alvo (114). Deste modo, os estudos de validação

irão determinar os erros de medição inerentes ao método, o que permitirá garantir uma maior precisão e exactidão dos resultados (113, 120).

A tabela 2 (102, 107) apresenta de forma resumida, as vantagens e desvantagens dos vários métodos de avaliação do consumo alimentar.

A possibilidade de caracterização da dieta habitual de uma criança, a facilidade de aplicação e o baixo custo justificam a escolha do QFA como metodologia de

avaliação do consumo alimentar. Neste sentido, foi elaborado um questionário de frequência alimentar com a finalidade de avaliar o consumo de

refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões em crianças dos 6 aos 10 anos de idade. Porém, durante a realização do presente trabalho a falta de tempo impossibilitou a validação prévia do QFA

elaborado. É ainda importante referir que a amostra populacional, à qual o método foi aplicado, não é representativa da população infantil de uma região

ou de Portugal Continental.


37

Tabela 2: Aspectos comparativos entre os métodos de avaliação do consumo alimentar.

Método de

avaliação do

consumo

alimentar

Vantagens Desvantagens

Diário alimentar

método quantitativo

independente da

memória do entrevistado

permite uma estimativa

mais exacta do consumo

alimentar.

pode modificar os hábitos

alimentares

omissão no registo de

alguns alimentos

exige grande cooperação do

entrevistado

requer motivação do

participante.

Recordatório

alimentar de 24h

método quantitativo

rápido e de fácil

aplicação

baixo custo

exige pouco esforço do

entrevistado

permite determinar a

média e a distribuição do

consumo numa

população.

possibilidade de erros na

estimativa das porções

dependente da memória do

entrevistado

omissão no registo de certos

alimentos

pode não representar o

consumo habitual.

História alimentar

fornece informação

detalhada sobre o padrão

alimentar

permite avaliação da

ingestão habitual de todos

os nutrientes.

dependente da memória do

entrevistado

custo elevado

entrevista é muito longa.

Questionário de

frequência

alimentar

baixo custo e fácil

aplicação

caracteriza a dieta

habitual

permite a aplicação a

um grande número de

indivíduos.

possibilidade de haver uma

lista incompleta dos alimentos

possibilidade de

agrupamento inadequado dos

alimentos

requer memória de hábitos

do passado

método semi-quantitativo

possibilidade de erros na

estimativa da frequência e

porções de consumo.

Capítulo IV- Metodologia analítica

39

Capítulo IV - Metodologia analítica

1. Generalidades

A vasta exposição ao flúor e, consequentemente ao fluoreto, a que a população infantil está sujeita diariamente contribuiu significativamente para a

necessidade de desenvolver métodos analíticos selectivos e sensíveis para o doseamento de fluoretos em bebidas, tendo como base métodos normalizados.

De um modo geral, o método analítico utilizado para a determinação de

fluoretos deve possuir limiares analíticos suficientemente baixos. Para além disso, deve ser específico para evitar interferências analíticas, facilmente aplicado nos laboratórios de rotina e pouco dispendioso.

Paralelalamente foram realizados outros parâmetros da qualidade das bebidas

em estudo, nomeadamente, pH, ácido ascórbico e potencial redox, os quais, complementaram a caracterização das amostras.

2. Métodos de análise de fluoretos em alimentos

Vários métodos são descritos na literatura para a análise de fluoretos, em

água e matrizes alimentares, nomeadamente métodos potenciométricos (elétrodos seletivos a ião fluoreto), métodos cromatográficos (cromatografia

iónica), métodos colorimétricos (SPADNS e Alizarina) (121-123), eletroforese capilar (124) e, mais recentemente, a fluorometria (125). No entanto, de

entre os métodos mais difundidos, encontram-se os métodos colorimétrico e potenciométrico.

Existem métodos normalizados para a determinação quantitativa do ião fluoreto, os quais devem ser implementados em laboratórios de rotina após validação interna, como:

EPA 300.0 e Standard Methods 4110 B (cromatografia iónica) (126, 127);

ISO 10359-1:1992 e Standard Methods 4500-F C (eléctrodo selectivo a

ião fluoreto) (128, 129);

EPA 340.3 e Standard Methods 4500-F E (métodos complexométricos)

(130, 131);

Standard Methods 4500F-D (Método SPANDNS) (132).


40

Esta secção apresenta um resumo das principais metodologias analíticas

utilizadas para a determinação do ião fluoreto em soluções, com maior destaque para os métodos potenciométricos, nomeadamente o eléctrodo selectivo a ião fluoreto, o qual foi utilizado no presente trabalho para a

determinação do teor de fluoretos nas bebidas comercializadas em Portugal Continental.

2.1 Métodos colorimétricos

Existem dois métodos complexométricos frequentemente utilizados para a

determinação do ião fluoreto: o método colorimétrico SPADNS ((2-parasulfofenilazo)-1,8-dihidroxi-3,6-naftaleno dissulfonato de sódio) e o

método complexométrico alizarina (133).

O método colorimétrico SPADNS é baseado na reacção entre o ião fluoreto e o

corante zircónio de cor vermelha (reagente SPADNS). O fluoreto forma com o corante um complexo aniónico incolor (ZrF6

2-). A concentração de fluoreto é

inversamente proporcional à cor produzida, ou seja, a cor torna-se progressivamente mais clara quando a concentração de fluoreto aumenta (134), sendo determinada espectrofotometricamente a 550-580 nm.

A reacção entre o ião fluoreto e o corante zircónio é influenciada pela acidez

do meio. A pH ácido, a reacção ocorre instantaneamente e a análise pode ser influenciada pelos iões interferentes (134). O intervalo de linearidade para a quantificação do ião fluoreto por este método é de 0,1 a 1,4 mg/L (132).

É um método que apresenta elevada sensibilidade (122), de rápida execução e

que envolve um custo reduzido (o único equipamento necessário à sua execução, um espectrofotómetro de UV/Vis, é um equipamento bastante utilizado em rotina), o que justifica a implementação deste método para a

análise de fluoretos em rotina (134). Porém, actualmente é pouco utilizado em laboratórios de rotina pois é um método com baixa selectividade (122).

O método SPADNS apresenta como principal vantagem, relativamente aos restantes métodos colorimétricos, a rápida reacção do corante com o ião

fluoreto. Para além disso, o reagente SPADNS também apresenta elevada estabilidade (133).

As principais interferências inerentes a este método colorimétrico são a alcalinidade, o alumínio, o ferro, o cloro residual livre, a cor e turvação, os

fosfatos e sulfatos. Sempre que uma destas substâncias estiver presente em quantidade suficiente para produzir erro de 0,1 mg/L ou na presença de matrizes coradas ou turvas, deve-se destilar previamente a amostra. A

interferência da alcalinidade pode ser reduzida com àcido clorídrico ou ácido nítrico. Relativamente ao cloro residual (agente desinfectante das águas


41

consumo público), este deve ser eliminado recorrendo a um agente redutor, como o arsenito de sódio, que é bastante tóxico (134).

No método complexométrico alizarina, os iões fluoreto reagem com o complexo lantânio-alizarina formando o complexo fluoro-lantânio-alizarina. A

reacção é realizada a pH 4,5 e em meio de acetona a 16% (V/V) para estabilizar a cor e aumentar a sensibilidade. A absorvência do complexo

ternário azul é medida a 620 nm (135, 136). O intervalo de linearidade para a quantificação de fluoreto por este método é de 0,1 a 1,5 mg/L (130, 137).

O principal interferente do método da alizarina é o alumínio, que forma com o fluoreto um complexo extremamente estável, pelo que é necessário o tratamento da amostra com 8-hidroxiquinolina e posterior extracção com

clorofórmio. Porém, para teores de alúminio inferiores a 0,2 mg/L, a extracção não é necessária. Analogamente ao método SPADNS, as amostras devem ser

destiladas previamente (136, 138).

Comparativamente ao método SPADNS, o método alizarina possui maior

tempo de análise porque a formação do complexo fluoro-lantânio-alizarina é lenta (aproximadamente uma hora). Os iões sulfato e fosfato constituem

interferências dos métodos colorimétricos (133).

Apesar de apresentarem algumas vantagens, nomeadamente a simplicidade

da metodologia, boa precisão e reprodutibilidade (125), os métodos colorimétricos são cada vez menos utilizados para a análise de fluoretos, não

só por apresentarem algumas interferências, o que diminui a selectividade do método, mas também pela necessidade de pré-tratamento das amostras (39, 139).

2.2 Métodos potenciométricos

Em potenciometria directa mede-se a diferença de potencial entre um

eléctrodo indicador e um eléctrodo de referência, ambos mergulhados na

solução a analisar. O eléctrodo de referência é uma semi-pilha cujo potencial é

independente da solução a analisar. O eléctrodo indicador pode ser um

eléctrodo de membrana selectiva a um dado ião (140, 141).

O eléctrodo selectivo a ião fluoreto é muitas vezes utilizado para a

quantificação de fluoretos na água, poluentes industriais, ar, aerossóis, gases,

solos, urina, soro, plasma, plantas, alimentos, bebidas e outras amostras

biológicas (2).

A concentração de fluoretos é determinada com um elétrodo combinado

selectivo a ião fluoreto, que tem como membrana sensível um cristal de

fluoreto de lantâneo (LaF3) (142, 143), na qual se estabelece uma diferença

de potencial através do cristal quando o eléctrodo está em contacto com uma solução contendo iões fluoreto (144). A diferença de potencial estabelecida

está relacionada com o logaritmo da concentração de fluoreto, obedecendo à lei de Nernst (142, 143) no intervalo de concentrações de fluoreto de 0,1 a


42

1000 mg/L, abaixo do qual a solubilidade do LaF3 contribui para a

concentração dos iões fluoreto na solução do analito (145). A medição de

fluoretos é influenciada pela força iónica, pelo pH e por espécies catiónicas polivalentes (141).

A célula electroquímica que incorpora o eléctrodo de membrana de LaF3, pode

ser representada por (142, 143):

Ag|AgCl, Cl (0,1M), F (0,1M)|cristal de LaF3||Solução||Eléctrodo de referência

Os fluoretos formam complexos com os catiões polivalentes, como o cálcio,

magnésio, alumínio e ferro, cuja formação depende do pH da solução, da

concentração de iões fluoreto e da presença de outros compostos

complexantes (146).

A pH ácido há formação de ácido fluorídrico (HF), o que diminui a

concentração de iões fluoreto em solução. Por outro lado, o ião hidróxido é

uma interferência do método de doseamento de fluoreto a pH > 8,

verificando-se a formação de um sólido de hidróxido de lantâneo La(OH)3

segundo a equação (141, 145):

FOHLaOHLaF SS 3)(3 )(3)(3 (equação 1)

Em meio básico verifica-se assim um aumento da concentração de iões de

fluoreto em solução (145). A leitura a pH 5–7 evita estas interferências, uma

vez que a esse pH o fluoreto inorgânico é totalmente ionizado (141).

As interferências pelos catiões polivalentes podem ser eliminadas pela

utilização de ajuste da força iónica, a solução tampão TISAB (Total Ionic

Strength Adjustment Buffer). O ácido trans 1,2-diaminociclo-hexano-N,N,N’,N’

tetracético (CDTA), um dos componentes da solução tampão TISAB, é um

agente complexante mais forte que o fluoreto e por isso complexa os catiões

interferentes, libertando os iões fluoreto em solução e mantendo o pH do meio

(146, 147).

Deste modo, a determinação de fluoretos é sempre efectuada após uma

diluição em partes iguais com uma solução TISAB, que funciona como solução

de acerto e estabilização da força iónica das soluções amostra e padrão,

evitando interferências de catiões polivalentes tais como o Al (III), Fe (III) e

Si (IV), que são capazes de complexar ou precipitar os fluoretos e reduzir a

concentração destes na amostra (2).


43

Tabela 3. Interferências mais comuns referentes ao método potenciométrico

para o doseamento de fluoretos.

Substância Concentração

(mg/L)

Tipo de erro

Alcalinidade (CaCO3) 7000 +

Alumínio (Al3+) 3,0 -

Cloretos ( Cl-) 20000

Cloro 5000

Cor e turvação

Ferro 200 -

Hexametafosfato

(NaPO3)6

50000

Fosfato (PO43-) 50000

Sulfato (SO42-) 50000 -

+ erro positivo - erro negativo

As vantagens deste método potenciométrico incluem: a eliminação de pré-tratamento da amostra na maioria dos casos, a redução de possíveis efeitos

de matriz (adição de solução tampão TISAB) (147), um grande intervalo de

linearidade, não é destrutivo e gama de temperatura do eléctrodo é de 0 50 ° C (144, 145).

Actualmente, os elétrodos seletivos a ião fluoretos têm sido amplamente

utilizados no doseamento de fluoretos, substituindo os métodos cromatográficos e espetrofotométricos, que embora mais sensíveis, são mais demorados e substancialmente mais caros. Como estes eléctrodos são fáceis

de usar, relativamente económicos, selectivos e sensíveis e possuem tempos de análise curtos são adequados para a monitorização de fluoretos em

produtos alimentares (2, 122, 144).

3. Análise do pH, do potencial redox e do ácido

ascórbico

A análise de ácido ascórbico nos alimentos é frequentemente utilizada como parâmetro de qualidade alimentar. A literatura existente refere vários métodos


44

para a determinação quantitativa de ácido ascórbico nos alimentos, nomeadamente métodos volumétricos, espectrofotométricos, electroforese

capilar de zona e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (21, 22). Porém, de entre os citados, os métodos espectrofotométricos são os mais utilizados não só para a análise de produtos alimentares mas também como

base de comparação para novas metodologias (21, 148).

O método espectrofotométrico do 2,6-diclorofenol-indofenol baseia-se numa titulação usando como indicador o corante 2,6-diclorofenol-indofenol (azul). Neste método, o ácido ascórbico reduz o corante e, no ponto final da titulação,

o excesso de corante não reduzido confere à solução ácida uma coloração rosa, que facilita a visualização do ponto final da titulação, o qual é

quantificado espectrofotometricamente a 500 nm. Esta é uma técnica de fácil aplicação e baixo custo, comparativamente às restantes técnicas (148). Os pigmentos de xileno e as espécies redutores são substâncias interferentes

nesta metodologia, que devem ser eliminadas previamente com hidroquinona e formaldeído respectivamente (149). Esta técnica é referida pela AOAC

(Association of Official Analytical Chemists) para o doseamento de vitamina C em sumos de fruta (148).

As técnicas potenciométricas utilizadas para a determinação do pH e do potencial redox são amplamente utilizadas nos ensaios de rotina e, por isso

muito conhecidas, pelo que se dá uma informação elementar sobre as mesmas.

Para a determinação do pH por potenciometria é utilizado um eléctrodo combinado de vidro uma vez que está menos sujeito a interferências. O eléctrodo de vidro é constituído por um bolbo de vidro sensível à concentração

hidrogeniónica (H+) e contém no seu interior uma solução de ácido clorídrico

(HCl) 0,1M saturada com cloreto de prata (AgCl). Nesta solução está

mergulhado um fio de prata revestido de AgCl formando o eléctrodo de referência(150).

Para um bom funcionamento do eléctrodo a membrana deve estar hidratada. Quando se mergulha o eléctrodo na solução em análise, ocorre um processo

de troca catiónica entre os iões H+ da solução externa e os iões Na

+ ou Li

+ da

membrana de vidro, estabelecendo-se uma diferença de potencial entre o

eléctrodo de vidro e o eléctrodo de referência. Apenas estão envolvidos iões

monovalentes. A concentração de iões H+ no interior da membrana é

constante e a concentração destes iões na amostra em análise é variável, pelo

que é a diferença entre as concentrações interna e externa de H+ que produz

a diferença de potencial que é medida pelo potenciómetro. O pH de uma dada amostra depende da temperatura e ionização da mesma (150).

O potencial redox indica a “proporção” entre as substâncias oxidantes e redutoras presentes no meio, permitindo uma avaliação quantitativa da

tendência do meio para ser oxidante ou redutor. A sua determinação consiste na medição do potencial de um eléctrodo de platina, usando como referência um eléctrodo de calomelanos saturado. A medição do potencial redox é

influenciada pelo pH do meio ou pela presença de iões complexantes (150).

Quanto maior for o potencial redox, mais oxidante será o meio, pelo que as substâncias presentes na solução serão reduzidas (150).


45

4. Validação de métodos analíticos

A validação de um método analítico é uma etapa fundamental da garantia da

qualidade analítica. As normas internacionais (ISO) e sistemas da qualidade (Boas práticas de laboratório; ISO/IEC 17025:2005) requerem a validação de métodos analíticos e a documentação do trabalho de validação, para a

obtenção de resultados confiáveis e adequados ao uso pretendido.

Segundo a NP EN ISO/IEC 17025:2005 (151), a validação de uma metodologia analítica é a confirmação através de exame e apresentação de evidência objectiva de que os requisitos específicos relativos a uma utilização

pretendida são satisfeitos”. Ou seja, a validação de um método analítico é um processo dinâmico que permite demonstrar que o método é “adequado” para o

fim a que se destina.

A estratégia a ser seguida na validação de um método analítico apresenta uma

natureza cíclica, de ações e procedimentos, como esquematizado na figura 5 (152, 153).

Figura 5. Natureza cíclica da estratégia a ser seguida na validação de um

método analítico.


46

Deste modo, o estabelecimento e optimização de um método analítico exige uma primeira fase de desenvolvimento e validação do método analítico, na

qual se definem e seleccionam as melhores condições analíticas, e uma segunda fase de aplicação do método à análise de amostras (153).

Recomenda-se que a validação de métodos seja adaptada a cada caso, sendo progressivamente mais exigente e exaustiva (grau de validação superior) para

as situações sucessivamente indicadas (151):

a) Método normalizado;

b) Uma modificação menor da técnica, do equipamento ou do tipo de

produto a ensaiar relativamente a uma norma (ou documento normativo) existente; pressupõem-se que neste caso, as alterações não levantam dúvidas sobre a equivalência técnica de resultados;

c) Uma modificação maior da técnica e/ou equipamento e/ou tipo de

produto a ensaiar relativamente a uma norma (ou documento normativo) existente - neste caso, as alterações originam dúvidas sobre a equivalência técnica de resultados;

d) Método baseado em técnicas de ensaio/calibração ou medição

conhecidas, cuja aplicação ao ensaio/calibração pretendida venha descrita em literatura científica, não existindo norma de ensaio/calibração correspondente;

e) Método baseado em técnicas de ensaio/calibração ou medição

conhecidas, mas cuja aplicação ao ensaio/calibração pretendida não venha descrita na literatura científica;

f) Método baseado em técnicas (ou princípios) de ensaio/calibração ou medição inovadoras, não descritas na literatura científica.

Os parâmetros a partir dos quais se efectua a optimização e validação de métodos analíticos são (152, 154):

Seletividade/Especificidade;

Linearidade/Gama de trabalho;

Limiares analíticos (Limites de Detecção e Quantificação);

Sensibilidade;

Precisão;

Exatidão.


47

4.1 Selectividade/Especificidade

A selectividade de um método analítico representa a capacidade que esse método possui de identificar e distinguir de forma inequívoca um determinado analito de outras substâncias, nomeadamente interferentes e outros

componentes de uma amostra (152).

Este parâmetro de validação pode ser avaliado através da realização de ensaios de fortificação da amostra ou de soluções padrão com os principais interferentes, verificando que o método não é influenciado pela sua presença

para recuperações de 100%. Quando se desconhecem quais as substâncias interferentes, a selectividade do método pode ser investigada por comparação

dos resultados obtidos com outros métodos (153, 154).

Algumas entidades internacionais, tais como a IUPAC ( International Union of

Pure and Applied Chemistry) (155) dão preferência ao termo “selectividade”, reservando a terminologia “especificidade” para procedimentos que são

completamente selectivos. Neste sentido, a especificidade refere-se a um método analítico específico para um determinado analito enquanto a seletividade reporta um método utilizado para a determinação de vários

analitos com capacidade de distinção entre eles.

4.2 Linearidade

A linearidade de um método é a capacidade de produzir resultados de ensaios que sejam directamente proporcionais à concentração de analito nas

amostras, num determinado intervalo de concentração (152).

A linearidade pode ser observada através da representação gráfica do sinal instrumental em função da concentração do analito (curva de calibração) ou

recorrendo a uma regressão linear pelo método dos mínimos quadrados (anexo 3) (156).

Os coeficientes de correlação linear são frequentemente utilizados para avaliar a linearidade de um método, porém estes parâmetros por si só não são

suficientes para justificar a linearidade de um método analítico. Devem por isso ser efectuados outros testes de linearidade, nomeadamente o teste dos

valores normalizados (anexo 4), o teste de análise de resíduos (anexo 5) e o teste de Mandel ou teste de Fisher/Snedecor (anexo 6)(156).


48

4.3 Gama de trabalho

A gama de trabalho de um método analítico é definida como o intervalo de concentrações do analito de uma amostra (limites inferior e superior), para o

qual o método analítico é preciso, exacto e linear. É normalmente mais extensa que a gama de linearidade e é expressa nas mesmas unidades dos

resultados obtidos pelo método analítico (152, 154).

O Guia Relacre 13 (152) relativo à validação de métodos internos de ensaio

em análise química recomenda a avaliação da gama de trabalho através do teste de homogeneidade de variâncias (anexo 7) e a utilização da norma ISO 8466-1 (156) para modelos lineares e da norma ISO 8466-2 (157) para

modelos polinomiais. Se VT ≤ F ( n-1, n-1; 0,99), a diferença entre as variâncias não é significativa, então a gama de trabalho está bem ajustada.

A gama de trabalho deve incluir o intervalo de concentrações do analito na matriz em estudo, a concentração de cada amostra deve situar-se numa zona

robusta da curva de calibração e o limite inferior da gama de trabalho de ser igual ou superior ao limite de quantificação do método (157).

4.4 Limiares analíticos

Os limiares analíticos do método incluem o limite de detecção e o limite de

quantificação. São parâmetros de sensibilidade do método de análise, dependentes do analito e da matriz da amostra, e que devem ser

determinados a cada novo desenvolvimento metodológico.

4.4.1 Limite de detecção (LOD)

De acordo com a IUPAC (155), o limite de detecção, expresso em

concentração de analito, define-se como a concentração mínima de analito medida que é possível detectar com razoável certeza estatística num

determinado método analítico. Ou seja, a determinação do limite de detecção permite a estimativa da concentração a partir da qual a detecção do analito pode ser distinguida do ruído instrumental, não permitindo por isso uma

determinação quantitativa exacta do mesmo (153).

O limite de detecção pode ser matematicamente definido por:

03 SLOD (equação 2)

Em que,


49

Desvio padrão correspondente a várias leituras do branco ou da solução com a concentração mais baixa do intervalo de linearidade.

Em métodos analíticos cuja metodologia requer a utilização de uma curva de

calibração, o limite de detecção pode ser determinado a partir do desvio padrão residual da curva de calibração, segundo a expressão matemática:

b

xy

SLOD

3 (equação 3)

Em que

Desvio padrão correspondente a várias leituras do branco ou da

solução com a concentração mais baixa do intervalo de linearidade.

b Declive da curva de calibração.

4.4.2 Limite de quantificação (LOQ)

O limite de quantificação é uma característica de ensaios quantitativos definido

como a menor concentração do analito que pode ser quantificada numa amostra com precisão e exatidão aceitáveis, nas condições experimentais

definidas (153). Pode ser calculado através da expressão:

010 SLOQ (equação 4)

Em que

Desvio padrão correspondente a várias leituras (entre 10 e 20) do branco ou da solução com a concentração mais baixa do intervalo de linearidade.

Em métodos analíticos cuja metodologia requer a utilização de uma curva de calibração, o limite de quantificação pode ser determinado a partir do desvio padrão residual da curva de calibração, segundo a expressão matemática:


50

b

xy

SLOQ

10 (equação 5)

Em que

Desvio padrão residual da curva de calibração.

b Declive da curva de calibração.

A gama de concentrações entre o limite de detecção e o limite de

quantificação deve ser entendida como uma zona de detecção qualitativa, e não quantitativa, pelo que não se devem reportar valores numéricos nesta gama de concentrações bem como, na gama de trabalho, o primeiro padrão

de calibração deve corresponder ao limite de quantificação.

4.5 Sensibilidade

Sensibilidade é um parâmetro que demonstra a variação da resposta instrumental em função da concentração do analito, permitindo avaliar a

capacidade de um método para distinguir pequenas concentrações de um analito. Pode então ser definida como o quociente entre o acréscimo do valor lido ΔL e a variação da concentração ΔC correspondente a esse acréscimo

(153, 155).

C

LadeSensibilid

(equação 6)

A sensibilidade depende da natureza do analito e do método utilizado, sendo

que em método cuja sensibilidade é elevada qualquer diferença na concentração do analito, mesmo que pequena, provoca uma grande variação

do sinal instrumental medido.

4.6 Precisão

A precisão de um método analítico define-se como o grau de concordância entre resultados de vários ensaios independentes obtidos nas mesmas


51

condições experimentais, permitindo avaliar a dispersão dos resultados dos ensaios sobre uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões (158).

É geralmente expressa em desvio padrão ou desvio padrão relativo (coeficiente de variação) do resultado dos ensaios experimentais, sendo que

grandes valores de desvio padrão estão associados a uma baixa precisão analítica. O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a

metodologia utilizada, a concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do método de ensaio, não se admitindo valores superiores a 10% (152, 153).

A dispersão dos resultados é verificada através da repetitividade, da precisão intermediária e da reprodutibilidade (152, 153).

No entanto, durante este trabalho apenas foram realizados estudos de

precisão de índole intralaboratorial, ou seja, em condições de repetibilidade e precisão intermédia.

4.6.1 Repetibilidade

A repetibilidade exprime a precisão de um método analítico através da

realização de ensaios em condições idênticas, nomeadamente no mesmo laboratório, pelo mesmo analista, utilizando o mesmo equipamento, reagentes

e realizados em curtos intervalos de tempo, permitindo avaliar a variabilidade dos resultados associada a erros aleatórios (152, 153).

A precisão em condições de repetibilidade é expressa em termos de desvio

padrão (DP) ou desvio padrão relativo (DPR), a partir do qual calcula-se o limite de repetibilidade (r), definido como o valor abaixo do qual se deve situar, com uma probabilidade específica (95%), a diferença absoluta entre

dois resultados de ensaio (159).

O limite de repetibilidade (r) pode ser calcula segundo a expressão:

rSr 8,2 (equação 7)

Em que

Desvio padrão, calculado a partir dos resultados obtidos em condições de repetibilidade.


52

O Coeficiente de variação de repetibilidade ( ) ou desvio padrão relativo da

repetibilidade ( ) para cada nível de concentração, expresso em

percentagem é obtido por (152):

100)( x

SDPRCV r

rr (equação 8)

Em que

Concentração média do analito obtida em condições de repetibilidade.

Em rotina, a avaliação da precisão (repetibilidade) faz-se através da análise de

duplicados. A percentagem (%) da diferença de duplicados (DD) é calculada através da seguinte equação:

100% x

DDD (equação 9)

Em que

Diferença entre a concentração de analito obtida na análise de duas réplicas, |X1 -X2|.

Concentração média de analito (análise das duas réplicas, X1 e X2)

4.6.2 Precisão intermédia

A precisão intermédia expressa a precisão avaliada sobre a mesma amostra, amostras idênticas ou padrões, utilizando o mesmo método, no mesmo

laboratório ou em laboratórios diferentes, mas definindo exactamente as condições a variar, podendo estas incluir o analista, o equipamento e o intervalo de tempo (normalmente maior que em condições de repetibilidade)

(152, 153).


53

4.6.3 Reprodutibilidade

A reprodutibilidade refere-se à precisão de um método efectuado em

condições diferentes, sobre uma mesma amostra fazendo variar as condições de ensaio. Nesse sentido, avalia o grau de concordância entre os resultados de

ensaios obtidos em laboratórios diferentes e em estudos de colaboração (152, 153).

Este parâmetro de avaliação da precisão é expresso em desvio padrão de reprodutibilidade, o qual permite calcular o limite de reprodutibilidade (R)

definido como o valor abaixo do qual se deve situar, com uma probabilidade específica (95%), a diferença absoluta entre dois resultados de ensaio, em condições de reprodutibilidade (159).

O limite de reprodutibilidade (RL) pode ser calculo segundo a expressão:

LRL SR 8,2 (equação 10)

Em que

Desvio padrão, calculado a partir dos resultados obtidos em

condições de reprodutibilidade.

O Coeficiente de variação de reprodutibilidade (CVRL) ou desvio padrão relativo da reprodutibilidade (DPRRL) para cada nível de concentração, expresso em percentagem é obtido por:

100)( x

SDPRCV RL

RLRL (equação11)

Em que

Concentração média do analito obtida em condições de

reprodutibilidade.


54

4.7 Exactidão

A exactidão é definida como o grau de concordância entre o resultado de um

ensaio e o valor de referência aceite como convencionalmente verdadeiro, cuja avaliação está dependente (152, 153).

A exactidão é normalmente avaliada através de:

Materiais de Referência Certificados (MRC)

Ensaios interlaboratoriais

Testes comparativos

Ensaios de recuperação

Este parâmetro de validação analítica é geralmente expresso em percentagem

de recuperação de amostras em ensaios de fortificação ou em percentagem de erro relativo entre o valor medido e o valor aceite como verdadeiro, segundo

as seguintes expressões (152):

100(%)Re

PP

AARR

VC

VCVCc (equação12)

Em que

Concentração do analito na amostra fortificada.

Volume de amostra fortificada.

Concentração do analito na amostra.

Volume de amostra.

Concentração do padrão de fortificação.

Volume do padrão de fortificação.

E,

100)(

(%)

v

vlab

X

XXEr (equação13)

Em que


55

Valor obtido experimentalmente (ou a média aritmética de valores

obtidos).

Valor aceite como verdadeiro, ou seja, o valor do material de referência interno ou do material de referência certificado.

A exatidão do método deve ser determinada após o estabelecimento do intervalo de linearidade e da especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de, no mínimo, nove determinações contemplando a gama de trabalho

do procedimento, ou seja, três concentrações, baixa, média e alta, em triplicado.

4.8 Descrição de métodos analíticos

Os métodos analíticos a validar no presente trabalho têm como principal

objectivo a determinação dos teores de fluoretos e de ácido ascórbico em refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões consumidas por crianças dos 6 aos 10 anos.

O procedimento de validação dos métodos de doseamento de fluoretos e de ácido ascórbico foi elaborado com base em guias Eurachem (153-155), guia

Relacre 13 (152) e normas nacionais e internacionais (151, 156-158, 160) utilizadas neste tipo de procedimentos.

Para o doseamento de fluoretos seleccionou-se um método do Standard

Methods for the Examination of Water and Wastewater Analysis (SMEWW 4500-F C) (128, 150).

Para o doseamento de ácido ascórbico seleccionou-se um método espectrofotométrico, método do 2,6-diclorofenol-indofenol (NP-3030, 1985) (149).

Para a determinação do pH seleccionou-se um método do Standard Methods

for the Examination of Water and Wastewater Analysis (SMEWW 4500-H+ B)

(150, 161).

Para a determinação do potencial redox seleccionou-se um método do

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater Analysis (SMEWW 2580) (150, 162).


56

5. Questionário de frequência alimentar

Considerando a inexistência de trabalhos nacionais utilizando o questionário de

frequência alimentar (QFA) para a avaliação do consumo de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões por crianças e a necessidade de aperfeiçoar a avaliação do consumo por este grupo, foi

desenvolvido um questionário de frequência alimentar para crianças dos 6 aos 10 anos de idade (anexo 9).

O principal objectivo da elaboração de um inquérito de frequência de consumo alimentar neste grupo etário foi avaliar a ingestão diária destes produtos e,

consequentemente, estimar a dose diária ingerida de fluoreto por esta via de exposição.

O questionário de frequência de consumo alimentar desenvolvido no âmbito deste estudo teve como modelo um questionário de frequência de consumo

alimentar desenvolvido pelo departamento de alimentação e nutrição do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (163).

5.1 Selecção dos géneros alimentícios

A selecção dos géneros alimentícios a colocar no QFA é feita com base no consumo dos mesmos por crianças dos 6 aos 10 anos de idade. Existe uma

extensa gama de bebidas destinadas ao consumo infantil e, ainda, muitas outras, que embora não o sejam, são susceptíveis de fazer parte da dieta das crianças.

Assim, os géneros alimentícios foram agrupados em sete grupos: refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e

infusões, segundo a Directiva 2001/112/CE (164) e a Portaria nº 703/96 (165) (anexo 2).

5.2 Elaboração de um questionário de frequência

alimentar

No presente estudo, as informações de cada criança foram obtidas através de

um questionário em papel de preenchimento pelos pais ou encarregados de educação das mesmas, englobando questões que permitem a identificação da

criança, o conhecimento do seu historial clínico, nomeadamente de higiene e saúde oral, e a obtenção de informação sobre a frequência de consumo de

bebidas. Para o preenchimento do mesmo, foram considerados os seis meses anteriores à aplicação do QFA.

O questionário foi dividido em duas partes. A primeira parte contempla dezassete questões que recolhe informação pessoal de cada participante, tais como o nome da escola que frequenta, o concelho e localidade de residência,


57

ano de escolaridade e idade, género, peso (kg) e altura (cm), o número de elementos do agregado familiar e a escolaridade dos pais, se toma ou não

habitualmente medicamentos, se utilizou ou não no último ano suplementos de flúor ou elixires orais, se utiliza ou não pasta dentífrica enriquecida com flúor, a frequência diária de lavagem dos dentes, se já teve ou não diagnóstico

de cáries e, por fim, o número de refeições diárias que faz fora de casa. A segunda parte possui o questionário de frequência de consumo alimentar,

apresentando questões relativas à frequência e quantidade de consumo das bebidas seleccionadas.

A segunda parte do QFA exige a estruturação dos géneros alimentícios de forma clara e objectiva para o participante, a definição de porções e

frequência de consumo.

5.2.1 Elaboração de uma lista dos géneros alimentícios

De entre os vários produtos comercializados, importa avaliar a frequência de consumo de bebidas para consumo infantil ou que são susceptíveis de serem consumidas pelas crianças. Neste sentido, foi realizada uma pesquisa relativa

às bebidas comercializadas em grandes superfícies das regiões de Lisboa e Santarém.

Foram seleccionados vários tipos de bebidas, num total 159 produtos de diferentes marcas e sabores, representativos da totalidade da oferta no

mercado. Após selecção e identificação das bebidas a incluir no QFA, foi definida e estruturada a lista de bebidas, as quais foram divididas em sete grupos de acordo com o tipo de produto que representam, nomeadamente

refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões (Tabela 4).

Tabela 4: Caracterização do tipo de bebidas incluídas no questionário de

frequência alimentar.

Grupo de bebida Número de amostras

seleccionadas

Refrigerantes 76

Sumos 16

Néctares 10

Bebidas de sumo 35

Concentrados 17

Chás 2

Infusões 3

Total 159


58

5.2.2 Definição de porções e da frequência de

consumo

Com o objectivo de facilitar o preenchimento do QFA e, assim, reproduzir dados mais exactos do consumo do participante, cada bebida tem associada uma porção padrão, correspondendo a uma porção habitualmente consumida

em casa (um copo de 200 mL) ou equivalente a uma embalagem (uma lata de 330 mL, um pacote de 200 mL).

A frequência de consumo foi definida como número de vezes por dia, semana ou mês. Nesse âmbito, foram definidas dez categorias como opção de

resposta, nomeadamente: 1) dez ou mais vezes por dia, 2) oito a nove vezes por dia, 3) cinco a sete vezes por dia, 4) dois a quatro vezes por dia, 5) uma

vez por dia, 6) cinco a seis vezes por semana, 7) duas a quatro vezes por semana, 8) uma vez por semana, 9) uma a três vezes por mês e 10) nunca ou inferior a uma vez por mês.

Cada participante indica uma das dez categorias para cada bebida correspondente à sua frequência de consumo e na ausência de preenchimento

assume-se a décima categoria definida (nunca ou inferior a uma vez por mês).

5.2.3 Aplicação do questionário de frequência alimentar

Os questionários de frequência alimentar foram realizados em 217 alunos dos 5 aos 10 anos de idade de escolas do 1º Ciclo do Ensino Básico dos distritos

de Santarém e de Lisboa. Os QFA foram aplicados entre os meses de Maio e Outubro de 2011, o que justifica que algumas crianças do 1º ano ainda não

tenham completado os 6 anos de idade. Participaram no estudo duas escolas do distrito de Santarém, uma privada (escola A) e outra de ensino público (escola B), que enquadram a categoria de região rural. Ainda foram

consideradas duas escolas do distrito de Lisboa, uma pública (escola C) e outra de ensino privado (escola D), às quais foi atribuída a categoria de região

urbana (Tabela 5).

Após selecção das escolas foi realizado o convite para participação no estudo

através de entrevista presencial e entregue documento com os objectivos e síntese do presente estudo aos órgãos de gestão da escola (anexo 8).


59

Tabela 5: Distribuição dos participantes por escola e distrito.

Escola Localização Número de

participantes

Região

rural

A Torres Novas

Distrito de Santarém 51

B Alcanena

Distrito de Santarém 72

Região

urbana

C Alvalade

Distrito de Lisboa 70

D Lapa

Distrito de Lisboa 24

É importante salientar que os pais e/ou encarregados de educação dispunham de todo e qualquer esclarecimento inerente ao preenchimento do questionário

de frequência alimentar na primeira folha que precede a primeira parte do questionário, bem como o objectivo do presente estudo em folha anexa ao

QFA.

5.3 Análise estatística dos dados

A análise dos dados é realizada através da utilização do programa informático de análise estatística SPSS (Statistical Package for Social Sciences), versão

18.0 para a Microsoft Windows©.

Todos os dados contemplados nos questionários de frequência alimentar são

detalhadamente inseridos numa base de dados no mesmo programa, com vista a armazenar e tratar informaticamente a informação do QFA.

Na análise estatística, recorreu-se inicialmente à estatística descritiva dos dados, a qual consiste na recolha, organização, análise e interpretação de

dados empíricos através da determinação de medidas de localização e dispersão. Assim, para descrever as variáveis em estudo são utilizadas

frequências relativas e absolutas (%) e percentis (variáveis qualitativas) e média, mediana e desvio-padrão (variáveis quantitativas).

Numa segunda fase, foi realizada a estatística inferencial que visa retirar conclusões inerentes à população em estudo, com base na análise dos resultados obtidos para um ou mais subconjuntos (amostras ou variáveis

compostas), através de testes T e regressão binária logística. As relações entre variáveis são estatisticamente significativas para valores de p inferiores

a 0,05.

Capítulo V- Parte experimental

61

Capítulo V – Parte experimental

1. Equipamento e material

1.1 Equipamento

Balança Mettler Toledo, modelo AB204-S.

Balança Mettler Toledo, modelo P1210.

Banho ultrasons, Selecta.

Centrifuga Sigma, modelo 2K15.

Eléctrodo combinado de pH, Crison.

Eléctrodo combinado seletivo de fluoretos Thermo Scientific, modelo

9609BNWP.

Espectrofotómetro UV-Visível Hitachi, modelo U-2000.

Placa de agitação e aquecimento, com agitador magnético (com

revestimento de teflon) Cole Parmer, modelo 04644.

Potenciómetro Metter, modelo GLP22.

Sistema de obtenção de água desmineralizada, resinas de leito misto, Desminágua.

Sonda de potencial redox Eutech Instruments, modelo GE7960201B.

Sonda de temperatura, Crison.

Vortex Heidolph Reax, modelo 2000.

1.2 Material

Nesta secção descreve-se apenas o material específico utilizado no presente estudo e não, o material de uso corrente de laboratório.

Células de vidro com percurso óptico de 1 cm, LightPath Optical.

Micropipetas de 200 μL e 1000 μL, Gilson.

Tubos de centrífuga com rosca, PVC, 50 mL, Sarstedt.


62

2. Reagentes

No âmbito deste trabalho entende-se por reagente qualquer substância ou solução de uma dada marca comercial. As soluções preparadas no laboratório

serão apresentadas na secção 3 (soluções).

2.1 Análise de fluoretos

2.1.1 Reagentes gerais

Água desmineralizada, condutividade inferior a 1 S/cm.

Acetato de sódio anidro (CH3COONa), 99%, Carlo Erba.

Ácido 1,2-ciclo-hexilenodiaminotetraacético(CDTA), 99%, Merck.

Ácido acético glacial, (CH3COOH), 99,9%, Carlo Erba.

Cloreto de sódio (NaCl), 98%, Farma-Química.

Hidróxido de sódio (NaOH), 98%, Panreac.

2.1.2 Padrões

Fluoreto de sódio anidro (NaF), 99%, Merck.

2.1.3 Controlos

Solução mãe controlo de ião fluoreto (1000 mg/L), Eutech Intruments.

2.2 Análise de ácido ascórbico

2.2.1 Reagentes gerais

Água desmineralizada.

Acetato de sódio anidro (CH3COONa), 99%, Carlo Erba.

Ácido acético glacial, (CH3COOH), 99,9%, Carlo Erba.

Ácido ascórbico (C6H8O6), 99,7%, Panreac.

Ácido metafosfórico (H3PO4), 33,5-36,5%, Sigma-Aldrich.

Hidrogenocarbonato de sódio, (NaHCO3), 99,5%, Merck.

Sal sódico do 2,6-diclorofenol-indofenol (OC6H2Cl2NC6H4ONa), 90%,

Riedel-de Haën.

Xileno (C6H4(CH3)2), mistura de isómeros, 96%, António M.S. Cruz.


63

2.3 Determinação do pH

2.3.1 Padrões de calibração

Solução tampão pH=7,01±0,01 (25 ºC), Hanna Instruments. Solução tampão pH=4,01±0,01 (25 ºC), Hanna Instruments.

2.3.2 Controlos

Solução tampão pH=6,0±0,05 (20 ºC), Merck. Solução tampão pH=6,8±0,05 (20 ºC), Carlo Erba.

2.4 Determinação do potencial redox

2.4.1 Padrões de calibração

Padrão ORP Pretreatement 475 mV, Eutech Instruments.

Padrão ORP Quinydrone 86 mV, Eutech Instruments.

2.4.2 Controlos

Padrão ORP Quinhydrone 255 mV, Eutech Instruments.

3. Soluções


Todas as soluções são preparadas e armazenadas em frascos de polietileno. As soluções são armazenadas à temperatura ambiente e ao abrigo da luz.

3.1.1 Soluções gerais

Solução de acetato de sódio a 15%

Dissolver 150 g de acetato de sódio (CH3COONa) em água desmineralizada e diluir para 1000 mL.


64

Solução de hidróxido de sódio, 6N

Dissolver 240g de hidróxido de sódio (NaOH) em água desmineralizada isenta de CO2. Arrefecer e diluir para 1000 mL.

Solução tampão e de ajustamento da força iónica (TISAB)

Em copo de 1 L dissolver 57 mL de ácido acético glacial (CH3COOH), 58 g de

cloreto de sódio (NaCl) e 4,0 g de ácido 1,2-ciclo-hexilenodiaminotetraacético (CDTA) em 500 mL de água desmineralizada. Ajustar o pH da solução a 5,3-5,5 com solução de hidróxido de sódio, NaOH 6N (são necessários cerca de

125 mL). Agitar e arrefecer durante a adição de hidróxido de sódio. Transferir a solução para um balão volumétrico de 1000 mL e perfazer o volume com

água desmineralizada.

3.1.2 Soluções de calibração

Solução mãe de ião fluoreto, 100 mg/L (F)

Dissolver 0,221g de fluoreto de sódio anidro (NaF) previamente seco durante

1 hora na estufa a 102 - 104 ºC, em água desmineralizada e diluir para 1000 mL.

Solução padrão de ião fluoreto, 10 mg/L (F)

Diluir 100 mL de solução mãe de ião fluoreto (100 mg/L) para 1000 mL com

água desmineralizada.

3.1.3 Soluções padrão de controlo

Solução intermédia de controlo de ião fluoreto, 100 mg/L (F) Para balão volumétrico de 100 mL, pipetar 10 mL de solução mãe controlo de ião

fluoreto, 1000 mg/L. Perfazer o volume com água desmineralizada. Homogeneizar.

Solução padrão de controlo de ião fluoreto, 10 mg/L (F)

Diluir 100 mL de solução intermédia de controlo de ião fluoreto (100 mg/L)

para 1000 mL com água desmineralizada.


65

Solução padrão de controlo de ião fluoreto, 0,06 mg/L (F)

Diluir 600 μL de solução padrão de controlo de ião fluoreto (10 mg/L) para

100 mL com água desmineralizada.

3.1.4 Soluções de controlo instrumental

As soluções a seguir apresentadas foram preparadas de acordo com as especificações do fabricante (Thermo Scientific).

Solução de TISAB + 1 mL solução intermédia de controlo de fluoreto

(100 mg/L)

Para um frasco rolhado de 150 mL, pipetar 50 mL de água desmineralizada e 50 mL de TISAB. Adicionar 1 mL de solução mãe fluoretos 100 mg/L.

Homogeneizar e rolhar.

Solução de TISAB + 11 mL solução intermédia de controlo de fluoreto (100 mg/L)

Para um frasco rolhado de 150 mL, pipetar 50 mL de água desmineralizada e

50 mL de TISAB. Adicionar 11 mL de solução intermédia de ião fluoreto 100 mg/L. Homogeneizar e rolhar.


Todas as soluções são preparadas e armazenadas em material de vidro

escuro.

As soluções são armazenadas ao abrigo da luz a uma temperatura de 5 ± 3 ºC.

3.2.1 Soluções gerais

Solução de ácido metafosfórico (H3PO4) a 6%

Em balão volumétrico de 500 mL, introduzir 30 g de ácido metafosfórico, 80 mL de ácido acético glacial e 200 mL de água desmineralizada. Dissolver por

agitação.

Perfazer o volume do balão com água desmineralizada, filtrar rapidamente e

guardar em frasco de vidro escuro. No frigorífico, esta solução tem uma duração de 7 a 10 dias.

Solução de ácido metafosfórico (H3PO4) a 3% (solução de extração)


66

Diluir 250 mL da solução de ácido metafosfórico a 6% e de ácido acético para 500 mL, com água desmineralizada.

Solução de 2,6-diclorofenol-indofenol (solução corante)

Dissolver em balão volumétrico de 200 mL, 42 mg de hidrogenocarbonato de

sódio, 50 mg de sal sódico de diclorofenol-indofenol com 150 mL de água quente (50 a 60 ºC). Arrefecer e completar o volume do balão. Filtrar e

guardar no frio.

Solução de acetato de sódio/ácido acético (solução tampão)

Dissolver 300 g de acetato de sódio anidro em 700 mL de água desmineralizada. Adicionar 1000 mL de ácido acético glacial.

3.2.2 Soluções de calibração

Solução mãe de ácido ascórbico (C6H8O6), 1000 mg/L

Pesar 50±0,01 mg de ácido ascórbico.Transferir quantitativamente para um

balão volumétrico de 50 mL, dissolver com a solução de extração (ácido metafosfórico a 3%) e perfazer o volume com a mesma.

Solução de calibração de ácido ascórbico (C6H8O6) a 3 mg/L

Diluir 150 L de solução mãe de ácido ascórbico para 50 mL com solução de extração (ácido metafosfórico a 3%).

3.2.3 Soluções padrão de controlo

Solução mãe controlo de ácido ascórbico (C6H8O6), 1000 mg/L

Pesar 50 ± 0,01 mg de ácido ascórbico. Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 50 mL, dissolver com a solução de extração (ácido

metafosfórico a 3%) e perfazer o volume com a mesma.

A pesagem do padrão de ácido ascórbico do controlo deve ser independente do da solução de calibração.

Solução controlo de ácido ascórbico (C6H8O6), 3 mg/L

Diluir 150 L de solução mãe de controlo de ácido ascórbico para 50 mL com solução de extração (ácido metafosfórico a 3%).


67

4. Implementação e validação dos métodos de ensaio


A figura 6 resume a sequência de ensaios utilizada ao longo do trabalho experimental.

Figura 6: Sequência do trabalho experimental para o controlo instrumental, optimização, validação e análise potenciométrica de fluoretos em

refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões.

4.1.1 Técnica

Analisar todas as tomas de ensaio (soluções de calibração, soluções controlo

e amostras) de acordo com o seguinte procedimento:

Adicionar a cada 25 mL de amostra, 25 mL de TISAB.

Colocar sobre a placa de agitação com agitador magnético.

Mergulhar os eléctrodos na amostra e deixar a agitar cerca de 3 minutos antes de fazer a leitura (ou até valor constante de leitura).

Ler no equipamento o valor da voltagem.

Diariamente fazer o controlo instrumental.


68

4.1.2 Controlo instrumental

Diariamente, antes da calibração, efectuar um controlo do estado eléctrodo combinado, de acordo com as especificações do fabricante.

Para dois frascos rolhados de 150 mL, pipetar 50 mL de água desmineralizada e 50 mL de TISAB.

Pipetar para cada frasco 1 mL e 11 mL de solução mãe fluoretos 100 mg/L, respectivamente. Homogeneisar e rolhar.

Medir o potencial de cada uma das soluções preparadas e registar.

A diferença entre o potencial das soluções de TISAB+1 mL e TISAB+11 mL deve estar compreendida entre 54-60 mV.

4.1.3 Estudo da linearidade

Preparar dezasseis soluções padrão de ião fluoreto com concentrações compreendidas entre 0,02 e 10 mg/L.

Medir os volumes correspondentes de solução padrão de fluoretos, 10 mg/L, para balões volumétricos de 25 mL e perfazer o volume com água desmineralizada.

Transferir para um copo de precipitação de 100 mL e seguir o procedimento técnico descrito na secção 4.1.1.

Colocar sobre a placa de agitação com agitador magnético.

Registar o valor da voltagem correspondente a cada ponto da curva de calibração e traçar a curva de calibração de fluoretos (mV vs concentração).

Efectuar a regressão linear pelo método dos mínimos quadrados (anexo 3). Determinar o coeficiente de determinação da recta (R2) e o coeficiente de

variação do método (CVm, %). Definir o intervalo de linearidade após aplicação de vários testes estatísticos, nomeadamente, análise de resíduos (anexo 5), teste dos valores normalizados (anexo 4) e teste de Mandel (teste de Fisher-

Snedecor) (anexo 6).

Na tabela 6 apresentam-se os critérios de aceitação para a avaliação do

intervalo de linearidade.


69

Tabela 6: Critérios de aceitação para a definição do intervalo de linearidade.

Parâmetro Critério de aceitação

Coeficiente de determinação (R2) ≥ 0,995

Coeficiente de variação do método (CVm) ≤ 10%

Análise de resíduos ≤ 10%

Teste das áreas normalizadas ≤ 10%

Teste de Mandel VT ≤ F (1, N-3)95%

4.1.4 Gama de trabalho

Depois de definido o intervalo de linearidade, analisar 10 réplicas da solução padrão da concentração mais baixa da gama de concentração (0,06 g/L) e 10 réplicas da solução padrão de concentração mais alta da gama de

concentração (10 mg/L). Determinar o desvio padrão (S) e a variância (S2) das dez leituras referentes a cada nível de concentração.

A gama de trabalho foi avaliada pelo teste de homogeneidade das variâncias de acordo com a norma ISO 8466-1 (156)(anexo 7). A gama de trabalho está bem ajustada se VT ≤ F (N-1, N-1), 99%.

4.1.5 Limiares analíticos (LOD e LOQ)

Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) do método foram determinados por dois métodos diferentes. Um deles baseia-se no desvio

padrão residual da curva de calibração (Sx/y) e no declive (b). O outro baseia-se nos ensaios de repetibilidade, isto é, na determinação do desvio padrão das

leituras de 10 soluções padrão independentes, cuja concentração corresponde ao primeiro nível de concentração do intervalo de linearidade (0,06 mg/L).


70

4.1.6 Precisão

4.1.6.1 Repetibilidade

Analisar 10 soluções padrão de três níveis de concentração (baixo, intermédio e elevado): 0,06 mg/L, 0,8 mg/L e 10 mg/L, num total de 30 réplicas.

Determinar o desvio padrão relativo para cada nível de concentração.

4.1.6.2 Precisão intermédia

Analisar 10 soluções padrão para cada um de três níveis de concentração em

cada série de trabalho (0,06 mg/L, 0,8 mg/L e 10 mg/L), as quais foram analisadas em séries de trabalho independentes (2 dias: 10 análises/dia). Determinar o desvio padrão relativo das vinte determinações para cada nível

de concentração.

4.1.7 Exactidão

A exactidão do método foi avaliada através de estudos de recuperação (efeito

de matriz) e da análise de soluções controlo. Para avaliar as interferências de matriz na análise de fluoretos por potenciometria efectuar ensaios de recuperação em diferentes matrizes, incluindo sumos, bebidas de sumo,

néctares, refrigerantes, concentrados, chás e infusões.

Analisar seis réplicas de cada matriz após fortificação com 0,8 mg/L de

fluoreto (0,2 mL de solução intermédia de fluoretos a 100 mg/L e perfazer com amostra para um volume de 25 mL).

Analisar em cada série de trabalho duas soluções controlo de fluoretos (0,06 e

10 mg/L) e determinar o erro relativo. Determinar o erro médio obtido ao longo das várias séries de trabalho e respectivo desvio padrão relativo

(percentagem).

4.1.8 Limite de determinação do método (LD)

Após os estudos de recuperação é possível calcular o limite de determinação

(LD) do método potenciométrico para cada uma das matrizes estudadas. A determinação do LD é calculada de acordo com a seguinte equação:


71

(%)Re

100

cCLD P

(equação 14)

Em que

Cp Concentração de fluoretos no padrão de calibração (mg/L), correspondente

ao padrão de menor concentração.

Rec (%) Percentagem de recuperação.

4.1.9 Efeito do pH

Efectuar estudos de estabilidade a partir da análise de soluções padrão de fluoretos e a partir da análise de amostras de bebidas fortificados com fluoretos.

Selecionar uma amostra com pH ácido para o estudo do efeito do pH.

Para um balão de 25 mL, pipetar 5 mL de solução de acetato de sódio a 15%.

Perfazer o volume do balão com a amostra selecionada e homogeneisar.

Transferir a mistura anterior para um copo de precipitação de 100 mL e adicionar 25 mL de TISAB (copo I).

Num outro copo de precipitação de 100 mL, adicionar 25 mL de TISAB e 25 mL da amostra em estudo (copo II).

Seguidamente, preparar ensaios de fortificação da amostra selecionada, a três níveis de concentração de fluoretos.

Para três balões volumétricos de 25 mL, medir 5 mL de solução de acetato de

sódio a 15%.

Pipetar para cada balão 0,25 mL, 0,5 mL e 1 mL de solução padrão intermédia

de fluoretos 100 mg/L), de modo a obter concentrações finais de fluoretos de 1, 2 e 4 mg/L, respectivamente.

Perfazer o volume com a amostra em estudo e homogeneisar.

Em copos de precipitação de 100 mL (copos III, IV e V), adicionar 25 mL de TISAB e 25 mL das amostras fortificadas preparadas anteriormente.

Ler o potencial das amostras dos copos I a V de acordo com a técnica descrita na secção 4.1.1.


72

4.1.10 Análise das amostras

Diariamente preparar uma curva de calibração com quatro níveis de concentração (0,06 - 10 mg/L) em ião fluoreto.

Em cada série de trabalho, por cada 20 amostras, efectuar um ensaio em branco, um ensaio de recuperação e um ensaio duplicado.

Analisar 2 controlos correspondentes aos níveis de concentração extremos da gama de trabalho (0,06 e 10 mg/L).

Para o ensaio de recuperação, pipetar 0,5 mL de solução intermédia de

controlo de ião fluoretos para um balão volumétrico de 25 mL, perfazer o volume com a amostra seleccionada e agitar.

Analisar todas as soluções (calibradores, controlos, branco e amostras) de

acordo com o procedimento técnico descrito na secção 4.1.1..

Determinar a concentração de ião fluoreto (mg/L) nas soluções a partir da

curva de calibração correspondente.


O doseamento do ácido ascórbico baseia-se na extração do ácido ascórbico por

uma solução de ácido metafosfórico e de ácido acético. Seguidamente dá-se a redução quantitativa do corante (2,6 diclorofenol-indofenol) pelo ácido ascórbico, extração do corante em excesso pelo xileno e sua determinação por

leitura espectrofotométrica a 500 nm.

A figura 7 resume a sequência de ensaios utilizada ao longo do trabalho

experimental.

Figura 7. Sequência do trabalho experimental para a optimização, validação e análise de ácido ascórbico por espetrofotometria de absorção molecular em

refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões.


73

4.2.1 Verificação da pureza do xileno

Verificar a pureza do xileno descorando uma pequena quantidade da solução

corante (2,6 diclorofenol-indofenol) com o ácido ascórbico e agitar com 10 mL de xileno.

Se, após 10 minutos de repouso, aparecer qualquer coloração na fase do xileno, proceder à sua destilação.

O xileno usado na determinação pode ser recuperado por agitação com

solução de hidróxido de sódio a 20% (m/m), seguida da redestilação.

4.2.2 Aferição da solução corante

Diluir 2 mL da solução padrão de ácido ascórbico a 3 mg/L com 2 mL da

solução de extração (ácido metafosfórico 3%).

Titular rapidamente com a solução corante (2,6 diclorofenol-indofenol) até

coloração rosa persistente durante 5 segundos.

Repetir a titulação mais duas vezes e registar o volume da solução corante gasto de cada vez. Os três valores obtidos não devem diferir entre si mais que

0,1 mL.

Proceder do mesmo modo para o ensaio em branco, substituindo os 2 mL da

solução padrão de ácido ascórbico (3 mg/L), por igual volume de solução de extração (ácido metafosfórico 3%).

Subtrair ao volume médio da solução corante gasto nas três titulações, o volume gasto no ensaio em branco e expressar a concentração da solução corante (miligramas de ácido ascórbico equivalente a 1,0 mL da solução

corante).

4.2.3 Estudo da linearidade

Adicionar a onze tubos de centrifugação, 3 mL solução de extração (ácido

metafosfórico 3%), 3 mL da solução padrão de ácido ascórbico a 3 mg/L e 3 mL de solução-tampão (acetato de sódio/ácido acético).

Adicionar a cada tubo de centrifugação diferentes volumes da solução corante

(2,6 diclorofenol-indofenol), 0-1 mL, em intervalos de 0,1 mL.

Adicionar 10 mL de xileno, rolhar os tubos e agitar. Centrifugar os tubos a

3000 g durante 3 minutos para que se processe a separação das fases.


74

Transferir com precaução a fase orgânica (xileno) para a célula do espectrofotómetro e medir a absorvência a 500 nm, utilizando como referência

a solução contida no primeiro tubo de centrifugação (branco).

Traçar a curva de calibração correspondente aos onze níveis de concentração de ácido ascórbico, absorvência versus volume da solução corante.

Efectuar a regressão linear pelo método dos mínimos quadrados. Determinar o coeficiente de determinação da recta (R2) e o coeficiente de variação do

método (CVm, %). Definir o intervalo de linearidade após aplicação de vários testes estatísticos, nomeadamente, análise de resíduos, teste das áreas normalizadas e teste de Mandel (teste de Fisher-Snedecor).

4.2.4 Gama de trabalho

Depois de definido o intervalo de linearidade, analisar 10 réplicas da solução

padrão da concentração mais baixa da gama de concentração (200 L) e 10 réplicas da solução padrão de concentração mais alta da gama de

concentração (900 L) e aplicar o teste da homogeneidade das variâncias.

4.2.5 Limiares analíticos (LOD e LOQ)

Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) do método foram

determinados através do desvio padrão residual da curva de calibração (Sx/y) e do declive (b) e com base em ensaios de repetibilidade.

Os limiares analíticos (LOD e LOQ) expressos em miligramas de ácido

ascórbico por 100 g de produto, são calculados com base na equação 2, secção 4.2.3.3. do presente capítulo, a qual corrige o volume máximo de

corante em excesso (V2) extrapolado da curva de calibração, usando a massa

de 10 g de amostra.

4.2.6 Análise das amostras

4.2.6.1 Preparação da amostra

Pesar, com rigor, 10 ± 0,0001 g e transferir para um balão volumétrico de

100 mL. Perfazer o volume do balão com a solução de extração (ácido metafosfórico 3%). Rolhar e homogeneisar. Guardar ao abrigo da luz.


75

4.2.6.2 Calibração do método analítico

Diariamente preparar uma curva de calibração com quatro níveis de concentração em ácido ascórbico.

Em quatro tubos de centrifugação introduzir 3 mL solução de extração (ácido metafosfórico 3%) e igual volume da solução padrão de ácido ascórbico, 3 mg/L.

Adicionar a cada tubo 3 mL de solução tampão (acetato de sódio/ácido

acético) e introduzir, respectivamente, 0, 200 L, 600 L e 1000 L da solução corante (2,6 diclorofenol-indofenol).

Adicionar 10 mL de xileno, rolhar os tubos e agitar. Centrifugar os tubos a 3000 g. Transferir com precaução a fase superior para a célula do

espectrofotómetro e medir a absorvência a 500 nm, utilizando como referência a solução contida no primeiro tubo de centrifugação (branco).

Traçar a curva de calibração de ácido ascórbico, absorvência vs volume da

solução corante.

4.2.6.3 Análise do ácido ascórbico

Num tubo de centrifugação, introduzir 3 mL da solução-amostra (4.2.3.1.), 3 mL de solução tampão (acetato de sódio/ácido acético) e 1 mL de corante

(2,6-diclorofenol-indofenol).

Adicionar 10 mL de xileno, rolhar o tubo e agitar vigorosamente durante 6

segundos. Centrifugar a 3000 g durante 3 minutos para que se processe a separação das fases.

Transferir com precaução a fase superior, de xileno, para a célula do

espectrofotómetro. Medir a absorvência da fase orgânica a 500 nm utilizando o xileno como branco e ler na curva de calibração, absorvência vs volume da

solução corante (registar o volume de corante).

O teor de ácido ascórbico, expresso em miligramas por 100 g de produto, é dado pela seguinte equação:

(equação 15)

Onde:

m0 massa, em miligramas, de ácido ascórbico, equivalente a 1,0 mL da solução corante;

m1 massa, em gramas, contida na alíquota da amostra utilizada na redução;

100

1

021 xm

mxVVascórbicoácidoteor


76

V1 volume, em mL, da solução corante adicionado à amostra para análise;

V2 volume, em mL, da solução corante em excesso, correspondente à absorvência lida da amostra, determinado na curva de calibração.

Em cada série de trabalho, por cada 20 amostras, efectuar um ensaio em

branco, um ensaio de recuperação e um ensaio duplicado.

Para o ensaio de recuperação, pipetar 0,5 mL de solução padrão de ácido

ascórbico a 3 mg/L para um balão de 25 mL e perfazer o volume com a

solução amostra (4.2.3.1.). Rolhar e homogeneisar. Seguir a técnica descrita

para a calibração analítica (4.2.3.2.).

Analisar 2 controlos correspondentes aos níveis de concentração extremos da

gama de trabalho (200 L e 900 L).

4.3 Determinação do pH

Calibrar o aparelho de pH diariamente, antes de se efectuar qualquer medição.

Desde que a sonda de temperatura esteja ligada, o aparelho faz a

compensação automática da temperatura (20 ºC). Sendo assim, introduzir sempre a sonda juntamente com o eléctrodo. Efectuar a calibração do

aparelho por meio de duas soluções tampão, pH=7,0 e pH=4,0.

Após calibração e antes de analisar as amostras, proceder à análise de uma solução controlo (pH=6,0 ou pH=6,8).

Em cada série de trabalho de 20 amostras, efectuar um ensaio duplicado.

O valor do pH vem expresso de acordo com a Escala Sörensen (0 – 14

unidades), seguida do valor da temperatura da amostra (na leitura).

4.4 Determinação do potencial redox

Antes de efectuar qualquer medição, mergulhar o eléctrodo de potencial redox no padrão de 475 mV (15 minutos).

Calibrar o potenciómetro com os calibradores de 475 mV e 86 mV. Analisar um controlo de potencial redox a 255 mV.

Em cada série de trabalho de 20 amostras, efectuar um ensaio duplicado.

O valor do potencial redox vem expresso em milivolte (mV) e o valor de

potencial lido corresponde directamente ao poder oxidante da amostra.


77

5. Selecção das amostras

Foram adquiridas 199 amostras entre Outubro de 2010 e Dezembro de 2010, em supermercados e hipermercados de Lisboa. As amostras adquiridas são

amostras destinadas ao consumo infantil ou susceptíveis de serem consumidas por crianças. As amostras foram agrupadas em refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões. De entre as

amostras, salienta-se a existência de uma grande variedade de refrigerantes, sumos e néctares em contraste com a pouca variedade existente de bebidas

de sumo, concentrados, chás e infusões para crianças.

O consumo destes produtos por crianças tem aumentado consideravelmente, não só em Portugal mas um pouco por todo o mundo. Em Portugal não

existem estudos que forneçam dados sobre o consumo destes produtos por crianças e, como tal, não é possível avaliar qual dos grupos de bebidas

mencionados é mais consumido pela população infantil. Uma vez que existe uma grande variedade de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo,

concentrados, chás e infusões em termos de marca e sabor disponíveis no mercado, realizou-se uma seleção destas amostras.

Os critérios de selecção das amostras foram os seguintes:

Amostras de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo e concentrados representativas das marcas e sabores existentes no

mercado, destinadas ao consumo infantil ou suscetíveis de o ser. Amostras de chás e infusões rotuladas especificamente para crianças.

No anexo 1 apresenta-se a lista das amostras analisadas.

Capítulo VI- Resultados e discussão

79

Capítulo VI – Resultados e discussão

O desenvolvimento de um método analítico implica a realização de vários estudos com vista à sua validação e posterior implementação em rotina. O

trabalho experimental centrou-se na optimização e validação do método potenciométrico com eléctrodo combinado selectivo de fluoretos. Com este objectivo definiu-se o intervalo de lineridade e gama de trabalho, os limiares

analíticos, a precisão e a exactidão do método. Após validação do método de ensaio, procedeu-se à análise das amostras e implementação em rotina de

ferramentas de controlo de qualidade, nomeadamente, análise de brancos, soluções controlo e estudos de recuperação.

Embora não se tenham optimizado e validado os outros métodos utilizados (determinação do pH, determinação do potencial redox e determinação da

vitamina C), foram utilizados os mesmos critérios de controlo de qualidade dos resultados obtidos.

As tabelas e figuras a seguir apresentadas estão organizadas pelo método de análise.

Apresenta-se também neste capítulo os resultados dos inquéritos de frequência de consumo alimentar, nomeadamente a caracterização da

população infantil em estudo, a avaliação do risco de toxicidade pelos fluoretos por regressão binária e o estabelecimento de relações entre o consumo de bebidas, bem como a ingestão diária de fluoretos por esta fonte da dieta, e

algumas variáveis de interesse no âmbito deste trabalho.

1. Análise de fluoretos

1.1 Controlo instrumental

O elétrodo combinado seletivo a iões fluoreto apresenta uma resposta linear quando a diferença entre o potencial das soluções de TISAB+1 mL e

TISAB+11 mL (secção 4.1.2., capítulo V) está compreendida entre 54-60 mV.

A figura 8 apresenta os valores das diferenças de potencial do elétrodo

registadas nas várias séries de trabalho e os limites (superior e inferior) definidos pelo fabricante como critério de aceitação.


80

Figura 8. Diferença dos potenciais do elétrodo (LS – Limite Superior e LI –

Limite Inferior).

Os valores mínimo e máximo da diferença de potencial do elétrodo foram de

54 e 58,5 mV, respectivamente, com um valor médio de 56 1,2 mV. Todas as séries de trabalho apresentaram diferenças de potencial dentro do intervalo

de potenciais definido pelo fabricante.

1.2 Estudo da linearidade

A tabela 7 apresenta os resultados iniciais dos testes de linearidade do método potenciométrico, para a gama de concentrações de 0,02 a 10 mg/L.

O intervalo de concentrações estudado não apresenta uma boa correlação (R2=0,97) e o limite de quantificação provisório (determinado a partir do

declive e da ordenada na origem) é muito superior ao primeiro ponto da curva de calibração (0,02 mg/L), indicando que os primeiros valores da recta de

calibração não estão bem ajustados. A análise de resíduos e o teste dos valores normalizados apresentam valores superiores a 10% confirmando a falta de correlação entre os resultados.

53

54

55

56

57

58

59

60

61

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33

Po

ten

cia

l (m

V)

N.º de leituras

X1 Média LS LI


81

Tabela 7. Parâmetros da primeira curva de calibração dos fluoretos para a

avaliação da linearidade do método potenciométrico.

Parâmetro Resultado

Número de pontos de calibração (N) 16

Intervalo de concentrações (mg/L) 0,02 10

Equação da recta y = -50,0966 x + 94,5382

Coeficiente de determinação (R2) 0,9792

Coeficiente de variação do método (CVm, %) 7,2

Análise de resíduos (%) - 11; 5,8

Teste dos valores normalizados (%) 95; 113

Teste de Mandel, VT ≤ F (1, N -3), 95% 3,1 ≤ 4,7

Limite de detecção (LOD), mg/L 0,38

Limite de quantificação (LOQ), mg/L 1,3

O intervalo de concentrações da curva de calibração foi reduzido para 0,06-10

mg/L, prepararam-se novas soluções padrão de fluoreto e efectuaram-se de novo todos os testes estatísticos de avaliação da linearidade.

A figura 9 apresenta os resultados dos testes estatísticos para o estudo da linearidade do método na gama de concentrações entre 0,06 e 10 mg/L (F).

O método é linear no intervalo de concentrações estudado (0,06 – 10 mg/L) apresentando um bom coeficiente de determinação (R2=0,9956), CVm < 10%

(2,4 %) e o valor teste (VT) é inferior ao valor tabelado F de Fisher/Snedecor (F(1;N-3;95%). A análise de resíduos e o teste dos valores normalizados apresentaram uma variação inferior a 10%.


82

Figura 9. Testes estatísticos para o estudo da linearidade. (a) Curva de calibração e bandas de incerteza (superior e inferior), (b) análise de resíduos,

(c) valores normalizados e (d) teste de Mandel.

y = -54,704x + 95,472R² = 0,9956

0

30

60

90

120

150

180

-1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Pote

ncia

l (m

V)

log C

(a) Equação da reta e bandas de incerteza N = 14CVm (%) = 2,4

-15

-10

-5

0

5

10

15

-1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Resíd

uos (

%)

log C

(b) Análise de resíduos [-3,9; 2,7]

85

90

95

100

105

110

115

-1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Va

lore

s n

orm

aliza

do

s (

%)

log C

(c) Teste dos valores normalizados [98; 104]

Ajuste polinomialy = -3,355x2 - 55,727x + 97,024

R² = 0,997

0

30

60

90

120

150

180

-1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Pote

ncia

l (m

V)

log C

(d) Teste de Mandel VT = 1,1F (1; N-3: 95%) = 4,8


83


Após a definição do intervalo de linearidade aplicou-se o teste de

homogeneidade de variâncias aos extremos de concentração deste intervalo, nomeadamente, 0,06 e 10 mg/L.

Como o valor de VT (1,0) foi inferior ao valor tabelado (5,4) de F (9, 9; 99%), a gama de trabalho está bem ajustada.

1.4 Limiares analíticos (LOD e LOQ)

Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) foram determinados com base no declive e na ordenada da origem da curva de calibração e em ensaios de repetibilidade (tabela 8).

Tabela 8. Limiares analíticos do método potenciométrico com base nos

parâmetros da curva de calibração e em condições de repetibilidade.

Limiares Recta de

calibração

Condições de

repetibilidade

LOD, mg/L (F) 0,15 0,003

LOQ, mg/L (F) 0,50 0,009

Os valores de LOD e LOQ determinados com base na recta de calibração são

0,15 e 0,5 mg/L, respectivamente. Os mesmos limites calculados com base em estudos de repetibilidade são de 0,003 e 0,009 mg/L, respectivamente. Como o LOQ determinado com base em ensaios de repetibilidade é muito

inferior ao primeiro nível de concentração da gama de trabalho, o LOQ foi ajustado para 0,06 mg/L. Em rotina este LOQ será testado, introduzindo um

controlo diário com 0,06 mg/L.

1.5 Precisão

A tabela 9 apresenta os resultados do estudo da repetibilidade e da precisão

intermédia avaliadas com base no desvio-padrão relativo (DPR, %) de três níveis de concentração e dos limites de repetibilidade (r) e de precisão

intermédia (RI), respectivamente.


84

Tabela 9. Repetibilidade e precisão intermédia do método potenciométrico.

Concentração

fluoretos (mg/L)

Repetibilidade

n=10

Precisão intermédia

n=20, 2 dias

DPR (%) r DPR (%) RI

0,06 2,0 0,010 5,3 0,009

0,80 2,4 0,043 2,8 0,053

10 2,0 0,53 1,8 0,46

O método potenciométrico com eléctrodo selectivo de fluoretos é preciso. Nos

ensaios de repetibilidade os valores de DPR variam entre 2,0 e 2,4% e nos ensaios de precisão intermédia variam entre 1,8 e 5,3%, cumprindo os

critérios de aceitação definidos.

1.6 Exactidão

A exatidão do método foi avaliada através da análise de seis réplicas de 20

amostras fortificadas com 0,8 mg/L de fluoretos: 3 refrigerantes, 4 sumos, 4 néctares, 2 bebidas de sumo, 2 concentrados, 2 chás e 3 infusões. A tabela 10

apresenta os resultados das recuperações (Rec, %) médias obtidas para cada matriz, em condições de repetibilidade.

Tabela 10. Estudos de recuperação dos fluoretos em várias matrizes alimentares em condições de repetibilidade.

Refrigerante Sumo Néctar

Bebida

de

sumo

Concentrado Chá Infusão

Rec

(%),

n = 6

114 90 101 101 83 95 95

DPR

(%) 7,3 4,0 6,7 8,4 0,5 1,0 1,1

A vacompadiobesin Asso0,devamcore

Fim

recuperaçariou entroncentrado

médio de radrão relaiferenças btidas nastatisticamnfusões.

s figuras oluções co,06 mg/L,esvio padralor médio

mg/L e umontrolo deespectivam

igura 10:mg/L (n=10

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

Co

nce

ntr

açã

o (

mg

/L)

ção médiare 83 e 1os, apresrecuperaçãativo de 7estatistica

as 7 mmente sig

10 e 11 rontrolo. A apresentrão relativo de 10 m

m desvio e 0,06 e 1mente.

: Erro rela0).

1,1 1,1

1 2

VaEr

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matrizes enificativas

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1

0,5

0

3

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%. A soluçresentandoelativo de variaram e

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0,9

0,4

4 5Nº Con

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associadoa da soluçariam entção controo valores 1,2%. O entre 0,37

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1,8

2,2

6 7ntrolos

CC

ítulo VI- Re

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2

3,3

0

8

Controlo 0Critério de

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a de cadalo de 0,06e 0,062 mmg/L aprem entre 9ociado às entre 0,6

e fluoreto

0,9

3,5

9 10

,06 mg/Le aceitação

discussão

85

etibilidade,ponde aos. O valorum desvioe existemuperaçõesdiferençass, chás e

uma das60 mg/L é

mg/L e umesenta um9,9 e 10,2s soluções62- 1,6%,

os de 0,06

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

Err

o (

%)

o

5

, s r o

s s e

s é

m m 2 s ,

6


86

Figura 11: Erro relativo da análise de soluções controlo de fluoretos de 10 mg/L (n=10).

Os resultados dos estudos de recuperação (80≤ Rec,% ≤120) e da análise de

soluções controlo (erro < 5%) mostram que o método potenciométrico para a análise de fluoretos é exacto.

1.7 Limite de determinação do método (LD)

O valor do limite de determinação (LD) foi calculado com base nos valores médios de recuperação nas diferentes matrizes analisadas.

A tabela 11 apresenta os limites de determinação do método para

refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões e a respectiva média.

Tabela 11. Limite de determinação do método potenciométrico para a análise de fluoretos em refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões.

Refrigerante Sumo Néctar Bebida

de sumo

Concentrado Chá Infusão

LD,

mg/L

0,05 0,07 0,06 0,06 0,07 0,06 0,06

1,6

0,6

1,4

1,1

0,7 0,7

1,3 1,1

0,3

1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Erro

(%

)

Co

ncen

tração

(m

g/

L)

Nº Controlos

Valor experimental Controlo 10 mg/L

Erro (%) Critério de aceitação


87

O limite de determinação médio do método de potenciométrico é de 0,06

mg/L. Como os valores de recuperação nas várias matrizes são próximos dos 100%, o limite de determinação médio é igual ao limite de quantificação e corresponde ao primeiro nível de concentração da gama de trabalho.

1.7.1 Efeito do pH

Uma das principais interferências do método potenciométrico é a formação de

ácido fluorídrico em condições acídicas que reduz substancialmente a concentração de iões fluoreto em solução, o que influencia as determinações.

A maioria das amostras analisadas possui pH ácido e, como tal, é importante verificar se a acidez das matrizes em estudo não interfere com o doseamento

de fluoreto nas mesmas.

A figura 12 apresenta os valores da recuperação para os 3 níveis de

fortificação da amostra, com e sem a adição de acetato de sódio a 15 %.

Figura 12. Efeito do pH nas recuperações de amostras ácidas.

0

20

40

60

80

100

120

0,25 0,5 1

Recu

peração

(%

)

Volume de fortificação (mL)

Amostra com acetato Amostra sem acetato


88

Considerou-se como valor de referência ou padrão, a recuperação da amostra com a adição da solução de acetato de sódio a 15 %, pois apresenta um valor

de pH no intervalo 5-7, garantindo a ausência da interferência do ácido fluorídrico (HF). Os valores das recuperações de referência para os três níveis de fortificação (0,25 , 0,5 e 1 mL) foram 80, 87 e 100%, respectivamente.

Os valores das recuperações das amostras sem a adição de solução de acetato

de sódio para os níveis de fortificação de 0,25, 0,5 e 1 mL foram 87, 85 e 97%, com um desvio padrão relativo de 5,8 , 1,9 e 2,4 %, respectivamente.

O erro associado aos valores de recuperação das amostras sem a adição de solução de acetato de sódio a 15% apresentou valores de 8,6 , 2,6 e 3,4 % para os níveis de fortificação 0,25 , 0,5 e 1 mL, respectivamente.

Quando analisados como duplicados, os valores de recuperação com e sem

adição de acetato de sódio a 15 % apresentam diferenças de duplicados (DD %) inferiores a 10 % para os 3 níveis de fortificação (0,25, 0,5 e 1 mL), apresentando valores de 8,2 , 2,7 e 3,4 %, respectivamente.

Os resultados sugerem que na análise de fluoretos em meio ácido não existem

perdas significativas de ião fluoreto livre (DD% ≤ 10% e erro ≤ 10%), não sendo necessário o controlo de pH durante a análise das amostras.

1.8 Controlo de qualidade interno (CQI)

Ao longo das várias séries de trabalho, os valores dos parâmetros da curva de

calibração (coeficiente de determinação, declive e ordenada na origem), dos padrões de controlo, das recuperações e dos duplicados foram introduzidos

numa folha de cálculo com o objectivo de delinear as primeiras cartas de controlo (de médias e amplitudes) do método potenciométrico.

Em função dos valores individuais de cada parâmetro foram definidos os valores limite das cartas de controlo, nomeadamente a média (valor médio

dos valores obtidos para o parâmetro em análise), limite superior de controlo (LSC), limite superior de aviso (LSA), limite inferior de aviso (LIA) e o limite inferior de controlo (LIC).

A tabela 12 apresenta os resultados do controlo de qualidade relativos à determinação dos fluoretos.

Verifica-se que os valores do coeficiente de determinação (R2) oscilam em torno de um valor médio de 0,9984 registando um mínimo e um máximo de

0,9954 e de 0,9999, respectivamente. Comparando estes valores com o critério estabelecido para o coeficiente de determinação (R2

≥ 0,995) verifica-se que todas as séries de trabalho cumprem o requisito do critério de

aceitação.


89

Os declives apresentam um valor médio de -54,8 com um desvio padrão relativo de 3,7%. A ordenada na origem oscila entre 95,5 e 111, apresentando

um valor médio de 104 e um desvio padrão relativo de 4,3%.

A exactidão foi avaliada através de padrões de controlo e de ensaios de

recuperação. Ao longo das várias séries de trabalho, o erro associado aos controlos foi sempre inferior a 10%, à excepção do controlo correspondente ao

primeiro ponto da curva de calibração, 0,06 mg/ L (14%). Isto sugere que o limite de quantificação do método deverá ser superior a 0,06 mg/L, uma vez que nesta concentração o desvio padrão relativo não cumpre o critério de

aceitação e é muito superior aos valores obtidos para os restantes controlos ( 5%). Como a concentração de fluoretos nas amostras é muito superior a este valor e como analisámos mais controlos nas séries de trabalho, validámos

todos os resultados obtidos. Em trabalhos futuros, o primeiro ponto da curva de calibração deverá ser 0,1 mg/L.

Nos ensaios de fortificação das várias matrizes com fluoreto, a recuperação média foi de 90%, oscilando entre 80-103% com um desvio padrão relativo de

6,9%. O método mostrou-se exacto (80≤ Rec,% ≤120).

A precisão foi avaliada em termos de repetibilidade através da análise de duplicados ao longo das várias séries de trabalho. Uma vez que o desvio padrão e o valor médio têm valores muito próximos, as variáveis LIA (limite

inferior de aviso) e LIC (limite inferior de controlo) teriam valores negativos. Então, estas variáveis não são representativas da diferença de duplicados (%),

cujos valores são sempre positivos. Por esse motivo, a carta de controlo apresenta apenas as LSC e LSA e o valor médio.

Os valores de diferença de duplicados oscilaram entre 0,11- 2,9%, embora o valor de 2,9% seja único e corresponda à análise de um refrigerante com 0,2

mg/ L de fluoreto. O desvio padrão relativo associado à análise de duplicados é de 0,72% indicando que o método potenciométrico com eléctrodo de fluoretos é muito preciso.


90

CQ

IP

arâm

etro

N

Carta d

e c

on

trolo

Ou

tros p

arâm

etros

Média

LIA

LS

ALIC

LS

CM

ínim

oM

áxim

oD

PR

(%

)

Curva

calibração

Declive

8-5

4,8

-58,8

-50,7

-60,9

-48,6

-57,9

-52,2

3,7

Orden

ada n

a

orig

em

9104

94,9

113

90,5

117

95,5

111

4,3

Coefi

cie

nte

determ

inação (

R2)

90,9

984

0,9

949

1,0

02

0,9

932

1,0

04

0,9

954

0,9

999

0,1

7

Padrões

Controlos

0,0

6 m

g/L

20

0,0

726

0,0

525

0,0

926

0,0

425

0,1

03

0,0

593

0,0

883

14

0,3

mg/L

12

0,3

04

0,2

74

0,3

34

0,2

59

0,3

49

0,2

71

0,3

20

5,0

0,8

mg/L

17

0,7

90

0,7

16

0,8

64

0,6

79

0,9

01

0,7

25

0,8

67

4,7

10

mg/L

18

10,1

9,5

410,6

9,2

710,9

9,5

210,5

2,7

Du

plicados

DD

(%

)48

0,8

4-

2,1

-2,7

0,1

12,9

0,7

2

Recu

peração

Rec (

%)

12

90

78

102

71

109

80

103

6,9

Tab

ela

12

. Parâ

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os d

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olo

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ela

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análise d

e flu

ore

tos p

elo

méto

do p

ote

ncio

métr

ico.


91

1.9 Análise de amostras

Depois de validado, o método potenciométrico foi aplicado à análise de 183 géneros alimentícios: 106 refrigerantes, 23 sumos, 37 néctares, 6 bebidas de sumo, 5 concentrados, 3 chás e 3 infusões. No anexo 1 apresentam-se as

características das amostras analisadas.

A tabela 13 apresenta os teores de fluoretos nas 183 amostras analisadas.

Tabela 13. Concentração de fluoretos em refrigerantes, sumos, néctares,

bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões comercializados em Portugal continental.

Amostra N Média ±DP

(mg/L)

Mínimo

(mg/L)

Máximo

(mg/L) DPR %

Refrigerantes 106 0,39 ± 0,34 0,10 2,0 88

Refrigerantes à

base de extratos 26 0,86 ± 0,35 0,50 2,0 41

Refrigerantes

gaseificados 15 0,18 ± 0,07 0,10 0,34 38

Refrigerantes à

base de sumo 65 0,25 ± 0,14 0,10 1,1 58

Sumos 23 0,37 ± 0,11 0,18 0,59 29

Néctares 37 0,33 ± 0,16 0,11 0,65 48

Bebidas de

sumo 6 0,40 ± 0,24 0,24 0,83 59

Concentrados 5 0,29 ± 0,12 0,12 0,43 40

Chás 3 0,16 ± 0,04 0,12 0,19 22

Infusões 3 0,12 ± 0,01 0,11 0,13 11

Total 183 0,37 0,28 0,10 2,0 76


92

Todas as amostras analisadas apresentam níveis de concentração de fluoretos superiores ao LOQ (0,06 mg/ L).

Comparando os diferentes tipos de matriz, verifica-se que a concentração média de fluoretos é mais elevada em bebidas de sumo, apresentando um

valor médio de 0,40 ± 0,24 mg/L, seguida dos refrigerantes e dos sumos com 0,39 ± 0,34 mg/L e 0,37 ± 0,11 mg/L, respectivamente. A concentração

média de fluoretos mais baixa foi observada nas infusões, com um valor médio de 0,12 ± 0,01 mg/L, seguida dos chás com uma concentração média de fluoretos de 0,164 ± 0,122 mg/L. Os néctares e os concentrados possuem

teores de fluoretos muito idênticos, apresentando valores médios de 0,33 ± 0,16 mg/L e 0,29 ± 0,12 mg/L, respectivamente.

Considerando a totalidade das amostras analisadas, os valores de concentração mais elevados correspondem a refrigerantes, nomeadamente ice

teas e tisanas, correspondendo a um máximo de 2,0 mg/ L de fluoreto. Contudo, a concentração de fluoreto mais baixa também foi determinada num

refrigerante (0,10 mg/L). Verifica-se ainda, que não existe uma correspondência entre a concentração de fluoreto e a marca e/ou o sabor.

A análise de variância (ANOVA) indica que não existem diferenças estatisticamente significativas entre a concentração de fluoretos nos refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e

infusões (p= 0,48).

A literatura apresenta alguns estudos de análise de fluoretos em refrigerantes, sumos, chás e infusões. Segundo Heilman e colaboradores (17) a concentração de fluoreto nos refrigerantes analisados variou entre 0,07 e 1,37

mg/L, sendo que a maioria dos refrigerantes apresentou teores de fluoretos próximos de 1 mg/L. No entanto, no presente estudo a média do teor de

fluoretos nos refrigerantes foi bastante mais baixa (0,39 mg/L).

Opydo-Szymaczek e colaboradores (56) dosearam fluoretos em refrigerantes e

sumos. Verificaram que os ice teas apresentam teores mais elevados de fluoretos (1,28 mg/L) e que o teor de fluoreto em sumos é baixo (0,01- 0,29

mg/L), o que está de acordo com o verificado no presente trabalho.

Num outro trabalho de Tokalioglu e colaboradores (2) a concentração média

de fluoreto em sumos de fruta foi de 0,23 mg/L (0,05-0,50 mg/L) e de 0,85 mg/ L em chás e em infusões (0,4 - 2,8 mg/L). Porém, neste estudo não foi

observado teores de fluoretos nos chás e infusões nesta ordem de grandeza. Isto pode ser devido ao reduzido número de exemplares analisados destes produtos, uma vez que a variedade de chás e infusões destinados ao consumo

infantil é muito pequena.

Relativamente aos refrigerantes, verifica-se que não existe uniformidade nas

concentrações das várias amostras analisadas, o que é visível na grande discrepância entre os valores mínimo e máximo de concentração de fluoretos

destas amostras. Deste modo, assume-se que existem várias gamas de concentração dentro deste grupo de amostras.

As amostras de refrigerantes à base de extrato, refrigerantes gaseificados e refrigerantes à base de sumo representam três gamas de concentração de

fluoreto distintas. Os refrigerantes à base de extractos representam a primeira


93

gama de concentrações e possuem um valor médio de 0,86 mg/L, com teores compreendidos entre 0,50 e 2,0 mg/L de fluoreto. A segunda gama de

concentração, na qual se inserem os refrigerantes gaseificados, apresenta um valor médio de 0,18 mg/L, com teores de fluoreto mínimo e máximo de 0,10 e 0,34 mg/L, respectivamente. Por fim, a terceira gama de concentrações de

fluoreto inclui os refrigerantes à base de sumo e apresenta teores de fluoreto entre o LOQ e 1,1 mg/L, com um valor médio de 0,25 mg/L.

A análise estatística (ANOVA) indica que existem diferenças estatisticamente

significativas entre a concentração de fluoreto nos refrigerantes (p < 0,01). No

entanto, esta diferença é devida exclusivamente ao subgrupo dos refrigerantes

à base de extractos, uma vez que não existem diferenças estatisticamente

significativas entre o teor de fluoretos nos refrigerantes à base de sumo e os

refrigerantes gaseificados (p > 0,05).

Os resultados obtidos estão de acordo com a literatura. Heilman e

colaboradores (17) verificaram que certa de 71% dos refrigerantes

gaseificados analisados excedia os 0,60 mg/L de fluoreto, com valores entre

0,02 a 1,3 mg/ L. Opydo-Szymaczek e colaboradores (56) verificaram que nos

refrigerantes à base de extractos de chá, o teor de fluoreto é mais elevado

(0,35-1,1 mg/L).

Considerando que a dose diária recomendada de fluoreto para uma criança de

8 anos é de 1 mg F/Kg peso corporal, se uma criança com essa idade e com

25 kg consumir 200 mL de uma das amostras analisadas, com concentração

média de fluoretos de 0,37 mg/ L, contribui com, aproximadamente 0,3% da

DDR (0,003 mg/ kg). A dose diária a partir da qual há risco de toxicidade pelo

fluoreto nessa criança é 2,0 mg/Kg, logo seria necessário que esta criança

consumisse diariamente cerca de 135 litros da bebida em questão para

manifestar efeitos tóxicos.

2. Análise de ácido ascórbico

2.1 Estudo da linearidade

A tabela 14 apresenta os resultados referentes ao estudo da linearidade do

método espectrofotométrico do 2,6-diclorofenolindofenol para a análise do ácido ascórbico.


94

Tabela 14. Avaliação da linearidade do método espetrofotométrico para a análise de ácido ascórbico.

PARÂMETRO RESULTADOS

Número de pontos de calibração

(N) 10 9

Volume de corante (mL) 0,1 1,0 0,2 – 1,0

Equação da recta y = 0,3062x – 0,0131 y = 0,3208x – 0,0238

Coeficiente de determinação

(R2) 0,9912 0,9965

Coeficiente de variação método

(CVm, %) 6,5 2,9

Análise de resíduos (%) -13; 100 -5,4; 4,1

Valores normalizados (%) 72; 121 80; 114

Teste de Mandel

VT ≤ F (1, N -3), 95%

9,6 > 5,6 2,3 6,0

Limite de detecção (LOD) 0,09 0,05

Limite de quantificação (LOQ) 0,30 0,17

No primeiro intervalo de volumes testado (0,1-1,0 mL), o método não

apresenta uma boa correlação (R2 ≤ 0,995), embora apresente um coeficiente de variação do método (CVm) inferior a 10%. A análise de resíduos, o teste dos valores normalizados e o teste de Mandel não cumprem os critérios de

aceitação definidos, logo, o intervalo testado não é linear.

O limite de quantificação provisório (determinado a partir do declive e da ordenada na origem da curva de calibração) é superior ao primeiro ponto da curva de calibração (0,1 mL), indicando que o primeiro valor da recta de

calibração não está bem ajustado.

A gama de volumes da solução corante da curva de calibração foi reduzida de 0,1-1,0 mL para 0,2-1,0 mL e efectuaram-se de novo todos os testes estatísticos de avaliação da linearidade.


95

Neste intervalo, o método cumpre todos os requisitos inerentes ao estudo da linearidade.


Após a definição do intervalo de linearidade aplicou-se o teste de homogeneidade de variâncias. Como o valor de VT (4,24) foi inferior ao valor

tabelado (5,35) de F (9, 9; 99%), a gama de trabalho 0,2-1,0 mL está bem ajustada.

Em rotina, a curva de calibração obedeceu a esta gama de trabalho, tendo-se seleccionado três volumes: 0,2 mL, 0,6 mL e 1,0 mL.

2.3 Limiares analíticos (LOD e LOQ)

Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) foram determinados com base no declive e na ordenada da origem da curva de calibração e em

ensaios de repetibilidade (tabela 15).

Tabela 15. Limares analíticos do método espetrofotométrico com base na

curva de calibração e em condições de repetibilidade.

Limiares Recta de

calibração

Condições de

repetibilidade

LOD (mL corante) 0,05 0,016

LOQ (mL corante) 0,17 0,055

Os valores de LOD e LOQ determinados em condições de repetibilidade são inferiores aos determinados com base na curva de calibração (declive e ordenada na origem). Como a gama de trabalho é de 0,2 a 1,0 mL, o limite de

quantificação foi ajustado ao ponto da recta de calibração correspondente a 0,95 mL uma vez que quanto maior for o volume de corante em excesso,

menor é a concentração de ácido ascórbico presente na solução para reduzir o corante. Assim, 0,95 mL corresponde a uma concentração de ácido ascórbico de 0,1 mg/ 100g.


96

2.4 Precisão

A tabela 16 apresenta os resultados do estudo da repetibilidade e da precisão intermédia, que foram avaliadas com base no desvio-padrão relativo (DPR, %) de três níveis de volume e respectivos limites de repetibilidade (r) e limites de

precisão intermédia (RI).

Tabela 16. Repetibilidade e precisão intermédia do método espetrofotométrico do 2,6-diclorofenolindofenol para a análise do ácido ascórbico.

Volume

corante

(mL)

Repetibilidade

n=10

Precisão intermédia

n=20, 2 dias

Média

(mL)

DPR

(%) r

Média

(mL)

DPR

(%) RI

0,20 0,21 2,3 0,014 0,20 8,0 0,045

0,60 0,53 1,9 0,029 0,54 3,3 0,050

1,0 0,97 3,3 0,088 0,92 5,6 0,14

O método é preciso porque em condições de repetibilidade e de precisão intermédia, apresenta valores de DPR (%) inferiores a 10%. No entanto, tal

como era esperado, em condições de precisão intermédia, os valores de DPR são superiores aos obtidos em condições de repetibilidade, sendo mais significativo para o padrão mais baixo (0,2 mL).

2.5 Exactidão

A exatidão do método foi avaliada através da análise de 10 réplicas de 3 soluções controlo (0,2, 0,6 e 1 mL). A figura 13 apresenta os resultados dos

volumes médios obtidos para cada controlo, em condições de repetibilidade.


97

Figura 13: Análise de soluções controlo de ácido ascórbico, n=10.

O volume médio do padrão de controlo de 0,2 mL é 0,21 mL, apresentando

valores que variam entre 0,19 e 0,21 mL e um desvio padrão relativo de 3,8 %. O padrão de controlo de 0,6 mL apresenta um valor médio de 0,56 mL,

apresentando valores que variam entre 0,55 e 0,57 mL e um desvio padrão relativo de 1,4 %. O volume médio do padrão de controlo de 1 mL é 0,98 mL, apresentando valores que variam entre 0,96 e 0,98 mV e um desvio padrão

relativo de 0,9 %.

O desvio padrão relativo associado a cada um dos padrões foi sempre inferior ao critério de aceitação dos padrões controlo (DPR< 10%).

O erro associado a cada padrão controlo variou entre 2,6-6,8%, 4,3-9,0% e

1,5-4,3% para os padrões controlo de 0,2, 0,6 e 1 mL, respectivamente. Os resultados mostram que o método espectrofotométrico para a análise de ácido

ascórbico é exacto (erro < 10%).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0,2 mL 0,6 mL 1 mL

Volu

me (

mL)

Padrões Controlo

Valor Referência

Valor experimental


98


Como controlo de qualidade interno procedeu-se à avaliação da curva de calibração (coeficiente de determinação, declive e ordenada na origem), soluções padrão controlo correspondentes aos extremos e meio da curva de

calibração (0,2, 0,6 e 1 mL de corante), ensaio de recuperação e análise de duplicados.

Os valores obtidos ao longo das séries de trabalho permitiram elaborar as primeiras cartas de controlo de médias e amplitudes do método

espetrofotométrico do 2,6-diclorofenolindofenol para a análise do ácido ascórbico (Tabela 17).

Todas as séries de trabalho cumprem o requisito do critério de aceitação definido para o coeficiente de determinação (R2

≥ 0,995), uma vez que os

valores oscilaram entre 0,997 e 1,000.

Os declives apresentam um valor médio de 0,32 com um desvio padrão relativo de 2,5%. A maior dispersão verifica-se ao nível da ordenada na origem (DPR=34%), em virtude da oscilação em torno de valores positivos e

negativos.

Ao longo das várias séries de trabalho o erro associado aos controlos foi sempre inferior a 10%, uma vez que para este critério de aceitação, os controlos poderiam oscilar entre 0,18-0,22 mL (controlo de 0,20 mL), 0,54-

0,66 mL (controlo de 0,60 mL) e 0,90-1,1 mL (controlo de 1,0 mL). Podemos assim concluir que, o método é exacto na gama de trabalho validada.

A exactidão do método também foi avaliada através da fortificação das várias matrizes analisadas com ácido ascórbico (ensaio de recuperação). A

recuperação oscilou entre 94 e 122 %, embora apenas duas amostras tivessem ultrapassado o critério de aceitação de 20% (121% e 122%). O método confirmou que é exacto, apresentando um valor médio de recuperação

de 101% com um desvio padrão de 11%.

A precisão associada à análise dos controlos é boa, com um desvio padrão relativo inferior a 4,0% para os três controlos em análise.

A precisão também foi avaliada através da análise de duplicados ao longo das várias séries de trabalho, obtendo-se um desvio padrão na ordem dos 4,0%.

A análise de duplicados permitiu verificar que o método é preciso. Há uma grande concordância entre os valores das réplicas ao longo das várias séries

de trabalho, obtendo-se uma diferença de duplicados média de 5,3%, com um desvio padrão de 3,6%.


99

CQ

IP

arâm

etro

N

Carta d

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(%

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8

0,3

18

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34

0,2

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42

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0,3

27

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0,9

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0,9

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0,9

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1,0

00

0,1

3

Padrões

Controlos

0,2

mL

14

0,2

04

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89

0,2

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0,1

81

0,2

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0,1

90,2

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0,5

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0,5

59

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42

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12,8

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éto

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tom

étr

ico d

o 2

,6-d

iclo

rofe

nolindofe

nol.


100

Uma vez que o desvio padrão e valor médio têm valores muito próximos, as variáveis LIA (limite inferior de aviso) e LIC (limite inferior de controlo) teriam valores negativos. Como estas variáveis não são representativas da diferença

de duplicados (%), cujos valores são sempre positivos, a carta de controlo apresenta apenas as LSC e LSA e o valor médio.

Como definimos como critério de aceitação da precisão 10%, definimos este valor como limite superior de controlo (LSC). Considerou-se como limite

superior de aviso 8%, isto é, o dobro do desvio padrão obtido arredondado à

unidade superior (23,6=7,2).


Depois de validado, o método espetrofotométrico foi aplicado à análise de 166 géneros alimentícios, incluindo 110 refrigerantes, 17 sumos, 26 néctares, 3

bebidas de sumo, 4 concentrados, 3 chás e 3 infusões (tabela 18). No anexo 1 apresentam-se as características das amostras analisadas.

Tabela 18. Teor médio de ácido ascórbico em refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões comercializados em Portugal

continental.

Amostra n Média ±DP

(mg/100g)

Mínimo

(mg/100g)

Máximo

(mg/100g)

Refrigerantes 110 0,82 ± 0,49 0,01 2,2

Sumos 17 1,1 ± 0,39 0,57 2,0

Néctares 26 1,3 ± 0,45 0,58 1,9

Bebidas de sumo 3 1,0 ± 0,23 0,82 1,3

Concentrados 4 0,79 ± 0,17 0,58 0,99

Chás 3 0,22 ± 0,19 0,10 0,44

Infusões 3 0,47 ± 0,05 0,44 0,52

Total 166 0,90 0,50 0,01 2,2


101

Apenas algumas amostras de refrigerantes apresentam teores de ácido ascórbico inferior ao LOQ expresso em mg/100g de produto (0,1 mg/ 100g).

Comparando os diferentes tipos de matriz, verifica-se que a concentração média de ácido ascórbico é maior em néctares, seguida dos sumos e bebidas

de sumo. A concentração de ácido ascórbico mais baixa foi observada em amostras de chá e em infusões com concentração média de ácido ascórbico

inferior a 0,50 mg/100 g. Os refrigerantes e os concentrados possuem teores de ácido ascórbico muito idênticos, apresentando valores médios de 0,82 mg/100g e 0,79 mg/100g, respectivamente.

Verifica-se que algumas marcas apresentam maiores teores de ácido ascórbico para produtos idênticos (tipo de bebida e/ou sabor). Para além disso, os

produtos infantis apresentam uma concentração de ácido ascórbico superior face aos restantes produtos analisados. Tal como esperado, os produtos à

base de laranja ou de outros citrinos possuem teores de ácido ascórbico mais elevados.

Os teores em ácido ascórbico nas várias matrizes apresentam diferenças

estatisticamente significativas (p < 0,01). No entanto, não existem diferenças

estatisticamente significativas dos teores de ácido ascórbico nas matrizes de

refrigerantes, sumos, bebidas de sumo e concentrados (p > 0,05) e, ainda,

entre as matrizes de chás e infusões (p > 0,05).

É importante referir que a adição de ácido ascórbico sintético como antioxidante durante o processamento destes produtos aumenta a sua

qualidade e o seu valor nutricional, uma vez que também aumenta consideravelmente o seu teor de ácido ascórbico (22). A maioria das amostras analisadas possui como ingrediente o aditivo E300 (ácido ascórbico) de acordo

com o princípio quantum satis (166), à excepção dos chás e infusões, pelo que podemos concluir que o teor de ácido ascórbico nas amostras analisadas pode

ter origem natural e sintética.

3. Determinação do pH


A análise do pH das amostras foi precedida da análise de dois padrões controlo de pH, pH=6,0±0,1 (20 ºC) e pH=6,8±0,1 (20 ºC).

As figuras 14 e 15 representam o erro associado à leitura de cada um dos padrões controlo. O pH médio do controlo de pH=6,0 é 6,01, apresentando

valores entre 5,9 e 6,1 e um desvio padrão relativo de 0,67%. O controlo de pH 6,8 apresenta um valor médio de 6,81, apresentando valores entre 6,7 e

6,9 e um desvio padrão relativo de 0,66%.

Capítulo V

102

Figura

Figura

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0p

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0,0

1,0

2,0

3,0

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pH

VI- Resultad

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1 2

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1

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dos e discus

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1,0

0,7

1,2

3 4 5

Valor expeErro (%)

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0,7

0,2

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2

0,7

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erimental

de padrõe=15).

de padrõe= 15).

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0,2

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8 9 10trolos

0,1

0,4

0,6

8 9 10trolos

es de contr

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0,3

0,7

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11 12 1

Controlo pH=Critério de a

6

0,7

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0,

0 11 12 1

Controlo pH=Critério de ac

rolo de pH

rolo de pH

,0

0,2 0,2

0

13 14 15

=6,0ceitação

,7

0,4

0,6

0

13 14 15

=6,0ceitação

H=6,0±0,1

=6,8±0,1

,00,0

0,5

1,0

1,5

Err

o (

%)

0,3

0,0

0,5

1,0

1,5

Err

o (

%)

()


103

O erro associado aos controlos de pH=6,0 e pH=6,8 variaram entre 0-1,3% e entre 0,1- 1,2%, respectivamente.

A análise de duplicados referentes a 15 amostras apresentou um valor médio de diferença de duplicados igual a 1,0% com um desvio padrão relativo de

0,71%.

Os resultados mostram que o método potenciométrico para a determinação do

pH é preciso (DPR1%) e exacto (erro < 1,5%).


Analisaram-se 164 géneros alimentícios, incluindo 110 refrigerantes, 17 sumos, 24 néctares, 3 bebidas de sumo, 4 concentrados, 3 chás e 3 infusões. No anexo 1 apresentam-se as características das amostras analisadas.

A tabela 19 apresenta os valores médios do pH nas 166 amostras analisadas.

Tabela 19. Valores médios do pH de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões comercializados em Portugal

continental.

Amostra N Média ±DP Mínimo Máximo DPR

(%)

Refrigerantes 110 3,1 ± 0,27 2,4 3,7 8,6

Sumos 17 3,7 ± 0,15 3,2 3,9 4,2

Néctares 24 3,6 ± 0,24 3,0 3,8 6,8

Bebidas de sumo 3 3,6 ± 0,16 3,4 3,7 4,5

Concentrados 4 3,0 ± 0,38 2,7 3,5 13

Chás 3 6,0 ± 0,38 5,7 6,4 6,3

Infusões 3 5,7 ± 0,23 5,5 5,9 4,1

Total 164 3,4 0,59 2,4 6,4 18


104

Existem diferenças estatisticamente significativas entre os valores de pH das amostras (p<0,05). O pH das amostras é maior nas amostras de chá

(pH=6,0± 0,38) e nas infusões (pH=5,7±0,23). As restantes amostras

apresentam valores de pH muito próximos e ácido (pH3-4). O valor de pH mais baixo foi observado nos refrigerantes (pH=2,4). A maior variação de pH

ocorre dentro dos refrigerantes, apresentando valores de pH mínimo e máximo de 2,4 e 3,7, respectivamente, sendo que as colas possuem pH mais ácido.

4. Determinação do potencial redox


Ao longo de 15 séries de trabalho analisaram-se três padrões de controlo de potencial redox 475 mV, 255 mV e 86 mV (figura 16).

Figura 16. Análise dos padrões de controlo de potencial redox, n=15.

0

100

200

300

400

500

600

86 mV 255 mV 475 mV

mV

Padrões Controlo

Valor Referência

Valor experimental


105

O potencial redox médio do padrão de controlo de 475 mV é 469 mV, apresentando valores entre 438 e 484 mV e um desvio padrão relativo de 2,6

%.

O padrão de controlo de 255 mV apresenta um valor médio de 258 mV,

apresentando valores entre 252 e 264 mV e um desvio padrão relativo de 1,5 %.

O potencial redox médio do padrão de controlo de 86 mV é 85 mV, apresentando valores que variam entre 81 e 90 mV e um desvio padrão

relativo de 3,3 %.

O desvio padrão associado a cada um dos padrões foi muito inferior ao critério

de aceitação dos padrões controlo (DPR=10%).

O erro associado a cada padrão controlo variou entre 0,81-6,3%, 0,24-3,7% e 0,06-7,7% para os padrões controlo de 86 mV, 255 mV e 475 mV, respectivamente.

Os resultados mostram que o método tem uma boa precisão e exactidão, a

qual foi comprovada pelos valores satisfatórios de DPR (< 1%) e pelos baixos valores de erro relativo obtidos na análise de controlos.

A análise de duplicados referentes a 15 amostras apresentou um valor médio de diferença de duplicados igual a 1,3% com um desvio padrão relativo de 0,90%.

Os resultados mostram que o método potenciométrico para a determinação do

potencial redox é preciso (DPR<2%) e exacto (erro<8%).


Analisaram-se 164 géneros alimentícios, incluindo 110 refrigerantes, 17

sumos, 24 néctares, 3 bebidas de sumo, 4 concentrados, 3 chás e 3 infusões. No anexo 1 apresentam-se as características das amostras analisadas.

A tabela 20 apresenta o potencial redox médio das 164 amostras analisadas.

Existem diferenças estatisticamente significativas entre os potenciais redox das matrizes em estudo (p<0,05). Todas as amostras analisadas possuem

potenciais redox positivos, portanto os meios são pouco oxidantes e as substâncias presentes nas matrizes alimentares não são oxidadas.


106

Tabela 20. Potencial redox médio de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas

de sumo, concentrados, chás e infusões comercializados em Portugal

continental.

Amostra N Média ±DP Mínimo Máximo DPR

(%)

Refrigerantes 110 216± 65 119 450 30

Sumos 17 134 ± 21 105 184 16

Néctares 24 154 ± 20 125 194 13

Bebidas de sumo 3 140 ± 17 125 158 12

Concentrados 4 222 ± 47 166 275 21

Chás 3 105 ± 10 93 113 9,8

Infusões 3 120 ± 8,6 110 127 7,2

Total 164 193± 65 93 450 34

O potencial redox é maior em concentrados e nos refrigerantes com valores

médios na ordem dos 220 mV. No grupo dos refrigerantes, os valores mais elevados de potencial redox corresponderam às colas e ice teas. Os chás e as

infusões apresentam um potencial redox muito inferior, cerca de metade do valor dos refrigerantes e concentrados. Estas bebidas possuem propriedades

anti-oxidantes inerentes às plantas do chá e das infusões.

5. Questionários de frequência alimentar

A apresentação dos resultados resultantes da análise da informação recolhida nos questionários de frequência alimentar foi dividida em duas partes. A

primeira parte apresenta a caracterização e distribuição dos participantes envolvidos no presente estudo em função da idade, escola, região, peso, altura e escolaridade dos pais. A segunda parte compreende o tratamento e

análise de resultados dos questionários para estimativa da ingestão diária de fluoreto (DDI) a partir dos itens alimentares enumerados no QFA, a verificação

de relações entre a dose diária ingerida de fluoretos e algumas variáveis de interesse, bem como avaliar o risco de toxicidade pelos fluoretos a partir da

dieta.


107

5.1 Caracterização da amostra

A amostra populacional é constituída por 217 crianças de ambos os sexos, com idades compreendidas entre os 5 e os 10 anos de idade.

5.1.1 Distribuição das crianças por idade e género

Das 217 crianças inquiridas, 110 (50,7%) são do sexo feminino e 107 (49,3%)

do sexo masculino. Verifica-se que existe uniformidade em relação ao género dos participantes inquiridos e que a amostra é maioritariamente representada

por crianças dos 6 aos 8 anos, inclusive (80,6%) (Figura 17). A média ± desvio padrão (DP) de idades é de 7,0 ± 1,2 anos.

Figura 17: Número de participantes distribuídos por idade e género,

n=217.


108

5.1.2 Distribuição das crianças por peso e altura

Não foram considerados 9 inquiridos que não mencionaram o seu peso e 25 crianças que não fizeram referência à sua altura (n=192).

A distribuição das crianças por peso e altura em função da idade consta da figura 18.

A média do peso das crianças foi de 29 ± 6,8 kg, com valores compreendidos entre 16 e 61 kg. As crianças apresentam alturas, em cm, que variaram entre

93 e 156 cm, apresentado um valor médio de 131 ± 12 cm. Tal como seria expectável há um aumento do peso e da altura com a idade.

Figura 18: Descrição dos participantes por altura e peso em função da

idade.

5.1.3 Distribuição das crianças por escola e ano de

escolaridade


109

A distribuição das crianças por escola e ano de escolaridade consta da figura 19.

Verifica-se que as escolas com maior participação de alunos no estudo foram as escolas de ensino público, nomeadamente as escolas A e C, apresentando

uma percentagem de participação de 33 e 32,3 %, respectivamente. Assim, 75 crianças (35%) frequentam o ensino privado e 142 (65%) o ensino público.

Figura 19: Distribuição dos participantes por escola e ano de escolaridade.


110

Atendendo à escolaridade, é possível afirmar que estão bem representados os

quatro níveis de escolaridade, à excepção da escola D que não possui um número de participantes representativo dos três primeiros níveis de escolaridade, 1º, 2º e 3º anos respectivamente. A percentagem de

participantes dos 4 níveis de escolaridade (1º, 2º, 3º e 4º ano) é 20, 20, 29 e 31%, respectivamente.

5.1.4 Distribuição das crianças por região

As crianças foram categorizadas em duas regiões, urbana e rural, em função da escola que frequentavam. Os alunos das escolas C e D integram a região urbana e os alunos da escola A e B foram incluídos na região rural.

Da figura 20 consta a distribuição das crianças inquiridas por região urbana e

rural.

Das 217 crianças inquiridas, 94 (43%) frequentam escolas em meio urbano e

123 (57%) têm a sua escola situada em meio rural.

Figura 20: Número de participantes por região.

94

43%

123

57% Região Urbana

Região Rural


111

5.1.5 Distribuição das crianças por nível de

escolaridade dos pais

A figura 21 apresenta a distribuição dos inquiridos por nível de escolaridade da mãe e do pai.

A partir da distribuição das crianças por escolaridade dos pais, observa-se que os níveis de escolaridade dos pais com maior representação são o ensino

secundário e a licenciatura, correspondendo 12% ao ensino básico, 37% ao ensino secundário, 13% a bacharelato, 31% a licenciatura e 7% a mestrado

ou doutoramento. Conclui-se, ainda, que a percentagem de pais com graus académicos superiores à licenciatura é pouco representativa, representando 6,3 e 6,7% da escolaridade do pai e da mãe, respectivamente. Do total de

participantes, 4% não apresentou resposta para o item escolaridade dos pais, pelo que da distribuição constam 209 crianças (Figura 5).

Figura 21: Nível de escolaridade dos pais e/ou encarregados de educação

dos participantes.

0 10 20 30 40

Ensino Básico

Ensino Secundário

Bacharelato

Licenciatura

Mestrado/Doutoramento

7,0

39

12

35

6,7

16

35

15

28

6,3

Percentagem (%)

Escolaridade do Pai

Escolaridade da Mãe


112

5.2 Resultados dos questionários de frequência

alimentar

Foram recolhidas informações, através de QFA, que permitiram estimar a

frequência de consumo de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões. A estimativa diária da ingestão de fluoretos por

kg de peso corporal foi determinada através dos dados de consumo de cada criança obtidos no QFA, bem como pela utilização do teor de fluoretos em cada bebida, determinado analiticamente.

Tendo em conta que as crianças também ingerem quantidades apreciáveis de

fluoreto através da deglutição de pasta dentífrica, estimou-se a dose diária ingerida de fluoreto através das duas fontes de exposição, bebidas e pasta dentífrica, e através de regressão binária logística avaliou-se o risco de

toxicidade pelos fluoretos.

5.2.1 Estimativa da ingestão diária de fluoretos

Os 217 alunos inquiridos afirmaram consumir, em média, pelo menos uma vez por mês algumas das bebidas no período dos seis meses que precederam a aplicação do QFA. Conclui-se que os refrigerantes representam 85% do

consumo de bebidas pelas crianças e que os refrigerantes à base de extracto integram o tipo de bebida mais consumido pelos participantes (70%), sendo

que 29% das vezes este tipo de bebida é consumido pelo menos 1 vez por semana. As bebidas de sumo representam a menor opção de consumo por parte das crianças (0,52%) (Figura 22).


113

Figura 22: Distribuição do consumo por tipo de bebida.

Tendo em conta, que dos 159 itens alimentares colocados no questionário de

frequência alimentar 98 foram sujeitos a análise para doseamento de fluoretos, determinou-se a quantidade média de fluoreto ingerido diariamente (mg fluoreto/kg de peso corporal) a partir destas fontes alimentares. Por outro

lado, a lavagem dos dentes pode aumentar a ingestão de fluoreto, principalmente nas crianças pois estas engolem toda ou uma grande parte da

pasta de dentes. Está legislado na União Europeia (89) que o teor de fluoreto em pastas dentífricas não deve exceder 1500 ppm por isso, considerando um teor médio de fluoreto de 750 ppm por pasta dentífrica e uma massa

recomendada de pasta por lavagem de 0,25 g, e ainda que a maioria da pasta seria engolida pela criança, determinou-se a contribuição de duas lavagens

diárias dos dentes na ingestão total de fluoretos (mg fluoreto/ kg de peso corporal/ dia).

Dos 217 inquiridos, 11 não responderam à questão relativa ao peso (kg), pelo que foram considerados como “missing values” e não foram contabilizados

para a estimativa da ingestão diária de fluoretos. Assim, os resultados a seguir apresentados reflectem o tratamento dos dados de 206 inquiridos.

Para a determinação da ingestão média de fluoretos a partir das bebidas, considerou-se o valor médio de cada categoria de frequência de consumo

alimentar assinalado no QFA. Os resultados da ingestão média de fluoretos foram discutidos em percentis (P95, P97,5 E P99) de modo a avaliar a dispersão da dose diária ingerida de fluoretos pelas crianças.

A tabela 21 apresenta os valores médios de ingestão diária de fluoreto a partir do consumo de bebidas e a média da estimativa de ingestão diária de fluoreto

70%

8,8%

5,8%

4,6%

4,4%

2,6%

1,5%

1,4%

0,52%

Refrigerante à base de

extracto

Néctares

Refrigerante à base de

sumo

Sumos

Refrigerante com gás

Concentrados

Chás

Infusões

Bebidas de sumo


114

associada à exposição através do consumo de bebidas e de pasta dentífrica. Refere ainda o número de crianças que excedem a dose diária recomendada

(DDR) por esta via de exposição.

Tabela 21: Ingestão diária de fluoreto (mg/kg de peso corporal) dos inquiridos pelo consumo de bebidas e deglutição de pasta dentífrica.

Fonte DDI Mínimo Máximo P95 P97,5 P99 n

(>DDR)

Bebidas 0,011 0,0 0,12 0,041 0,077 0,12 9

Refrigerante 0,009 0,0 0,112 0,039 0,076 0,11 9

Sumo 0,0003 0,0 0,007 0,0017 0,003 0,004 0

Néctar 0,0013 0,0 0,032 0,006 0,080 0,020 0

Bebida de

sumo 0,0 0,0 0,001 0,0 0,0 0,00 0

Concentrado 0,0 0,0 0,006 0,0 0,001 0,002 0

Chá 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0

Infusão 0,0 0,0 0,001 0,0 0,0 0,0 0

Bebidas e

pasta

dentífrica

0,024 0,010 0,14 0,057 0,094 0,13 12

A ingestão diária de fluoreto a partir do consumo de bebidas é superior ao valor legislado de DDR em 9 inquiridos (4,3%), sendo que, em todos os casos, é o consumo de refrigerantes que contribui com teores mais elevados de

fluoreto. A ingestão diária média de fluoretos pelas bebidas é de 0,011 mg/kg de peso corporal/dia.

No entanto, quando são consideradas as duas fontes de exposição ao fluoreto, verifica-se que, pelo menos 5% dos inquiridos (P95) ingerem uma dose de

fluoreto superior a 0,05 mg/kg de peso corporal/dia. A análise de variância (ANOVA) permite concluir que existem diferenças estatisticamente

significativas entre a ingestão diária de fluoreto nas duas fontes de fluoretos consideradas (bebidas e bebidas mais pasta) (p<0,01), cujo valor médio de ingestão aumenta com o aumento do número de fontes de exposição ao

fluoreto.

De modo a estimar o risco de toxicidade pelo fluoreto para uma frequência de consumo superior, no cálculo da ingestão diária de fluoreto e posterior estimativa do risco de toxicidade por regressão binária logística, considerou-se

o extremo superior de cada categoria assinalada no QFA, por exemplo, se o inquirido respondeu “1 a 3 vezes por mês” considera-se como frequência de

consumo 3 vezes por mês.

A tabela 22 apresenta os valores de ingestão diária de fluoreto pelas crianças

através do consumo de bebidas e de pasta dentífrica, considerando o extremo do intervalo da categoria de frequência de consumo alimentar.


115

Tabela 22: Ingestão diária de fluoreto (mg/kg peso corporal) pelo consumo

de bebidas e deglutição de pasta dentífrica.

Fonte DDI Mínimo Máximo P90 P95 P99 n

(>DDR)

Bebidas

0,019 0,005 0,13 0,035 0,052 0,13 11

Bebidas e

pasta

dentífrica

0,032 0,013 0,15 0,049 0,069 0,14 20

O valor médio de ingestão diária de fluoretos através do consumo de bebidas

é 0,019 mg/kg de peso corporal e a ingestão diária de fluoretos pelas duas fontes de exposição, bebidas e pasta dentífrica, é 0,032 mg/kg de peso corporal/dia. Verifica-se que existem diferenças estatisticamente significativas

entre a ingestão diária de fluoretos e a partir do consumo de bebidas e a ingestão diária de fluoretos a partir do consumo de bebidas e de pasta

dentífrica (p<0,01), pelo que a deglutição de pasta durante a escovagem dos dentes aumenta consideravelmente a exposição ao fluoreto pela dieta.

É de salientar que, pelo menos, 5 % da população inquirida (P95) apresenta uma ingestão de fluoretos superior à dose diária recomendada (0,05 mg/kg

peso corporal/dia) através do consumo de bebidas. Quando considerada também a ingestão de pasta dentífrica como fonte de exposição ao fluoreto, cerca de 10% das crianças estão expostas a uma dose de fluoreto igual ou

superior à dose diária recomendada. Este valor poderia aumentar consideravelmente se fossem contabilizadas outras fontes de exposição ao

fluoreto, tais como a água de consumo público.

5.2.2 Regressão binária para avaliar o risco de

toxicidade por fluoretos

O objectivo da regressão logística é determinar a melhor relação entre a

variável resposta (a variável dependente, que neste estudo é o risco de toxicidade pelos fluoretos) e um conjunto de variáveis explicativas ou preditivas, cujo modelo final é aquele que minimiza o número de variáveis e

maximiza a precisão do modelo (167).

Com essa finalidade, foi aplicado o método de regressão logística binário, método stepwise foward, para definir um modelo que avalia o risco de toxicidade pelo fluoreto a partir de uma DDI de fluoreto superior a 0,05 mg/kg

de peso corporal. De entre os inquiridos, foram retiradas duas crianças por representarem outliers, pelo que a o modelo de regressão apresentado diz

respeito a 215 inquiridos.


116

O modelo inicial apenas com uma constante, ou seja, considerando que todos os inquiridos não apresentam risco de toxicidade pelos fluoretos pelo consumo

dos itens alimentares em estudo, apresenta uma percentagem de acerto de 91,2 % (sendo que a percentagem de erro do método é de 8,8%).

A primeira variável a ser incluída é a que tiver a estatística Wald mais alta. No modelo final obtido, encontram-se as variáveis categóricas “Refrigerantes à

base de extracto” e “idade”, que apresentam estatísticas de Wald de 15,4 e 5,4, respectivamente.

Posteriormente, foram analisadas algumas estatísticas de avaliação do ajuste geral dos modelos de regressão logística, que constam da tabela 23. A estatística de probabilidade -2log likelihood diminui à medida que é incluída

uma variável no modelo. Por outro lado, as medidas pseudo R2 aumentaram à medida que as variáveis preditivas foram incorporadas no modelo. Isto indica

uma melhoria no ajuste do modelo. O pseudo R2 de Nagelkerke no último passo foi de 0,234, o que indica que 23,4% do risco de toxicidade pelo

fluoreto é explicado pelo consumo de refrigerantes à base de extracto e pela idade.

Tabela 23: Estatísticas de validação do modelo de regressão logística.

Passo -2 Log

likelihood

R2Cox &

Snell

R2

Nagelkerke

1 99,677 0,077 0,171

2 93,669 0,105 0,234

A medida Hosmer e Lemeshow avalia as diferenças estatísticas entre as

classificações previstas pelo modelo e as observadas da variável dependente, neste caso o risco de toxicidade, através da estatística chi-square. Um bom

ajuste de modelo é verificado por uma estatística chi-square não significativa (p>0,05) (167). Conclui-se que não existem diferenças estatisticamente significativas entre os resultados observados e os previstos pelo modelo de

regressão (tabela 24).

Tabela 24: Teste de Hosmer e Lemeshow.

Passo Qui-

quadrado Significância

1 1,919 0,589

2 9,306 0,231


117

Estas medidas, no seu todo, provam um bom ajuste do modelo e sugerem a aceitação do modelo final como um modelo significativo de regressão binária.

A percentagem de acerto do modelo final de 2 variáveis é 92,2%, verificando-se que há um aumento na percentagem de acerto relativamente ao modelo

inicial (91,2%). Além disso, as taxas de acerto individuais são elevadas, o que sugere a ausência de erros na previsão de qualquer uma das variáveis.

Conclui-se que a estimativa do risco de toxicidade pelo fluoreto no modelo é precisa e que o modelo tem uma ótima sensibilidade (98,9%), porém baixa especificidade (23,5%).

Da tabela 25 consta a classificação do modelo final proposto por regressão binária para avaliação do risco de toxicidade por fluoretos.

Tabela 25: Classificação do modelo final de regressão binária logística.

Observado

Previsto

Risco de

toxicidade Percentagem

0 1

Passo 1

Risco de toxicidade

0 175 1 99,4

1 16 1 5,90

Percentagem global 91,2

Passo 2

Risco de toxicidade

0 174 2 98,9

1 13 4 23,5

Percentagem global 92,2

Assim, o modelo de regressão binária logística utilizado neste trabalho permite

identificar o risco de toxicidade pelo fluoreto a partir do consumo de refrigerantes à base de extractos e da idade, segundo a equação (167):

1,482 - idade 0,626 - extrato de base à tesrefrigeran Consumo 0,464 Risco

A tabela 26 apresenta os coeficientes e razão de chance do modelo de

regressão binária proposto.


118

Tabela 26: Coeficientes (B) e razão de chance (Exp(B)) da regressão binária para avaliação do risco de toxicidade por fluoretos.

B Exp (B)

Passo 1

Refrigerantes à base de

extracto 0,450 1,569

Constante -3,16 0,043

Passo 2

Idade -0,626 0,534

Refrigerantes à base de

extracto 0,464 1,591

Constante -1,482 0,227

Verifica-se que o consumo de refrigerantes à base de extracto explica melhor

o risco de toxicidade (1,591) do que a idade (0,534).

Por exemplo, sempre que a categoria definida como frequência de consumo de refrigerantes à base de extracto aumenta uma unidade, o risco de toxicidade

aumenta 59% (1,59 1 = 0,59). Da mesma forma se verifica que o aumento

de um ano na idade da criança diminui o risco de toxicidade pelo fluoreto, o que está de acordo com o expectável devido ao aumento do seu peso corporal.

Deste modo, tomando como exemplo, uma criança com 6 anos (definida com

um número 2 na variável idade na base de dados) e com uma frequência de consumo de refrigerantes à base de extracto de 1 vez por dia (definida como número 6 na variável consumo na base de dados), tem-se que:

0,05 1,482 - 2 0,626 - 6 0,464 Risco

Assim, pode conclui-se que esta criança estaria no limiar máximo admissível e bastaria um pequeno aumento do consumo para ficar sujeita a risco de

toxicidade pelo fluoreto.


119

5.2.3 Relações entre o consumo e variáveis de interesse

A fim de verificar possíveis diferenças entre o consumo de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões e algumas

variáveis de interesse, foram realizados testes t para comparação de médias, uma vez que este teste é suficientemente robusto para distribuições que não estejam dentro da normalidade (168).

Importa referir que as relações a seguir apresentadas foram as que

consideramos serem as mais relevantes no âmbito deste trabalho.

5.2.3.1 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e o

género e idade

Verifica-se que não existem diferenças estatisticamente significativas entre a dose diária ingerida de fluoretos e o género, informação que consta da tabela

27.

Verifica-se que não existe exposição diária ao fluoreto (DDI igual a zero)

através do consumo de bebidas de sumo, chás e infusões em ambos os sexos e de néctares no sexo feminino.

Embora se observe que os valores médios de ingestão diária de fluoreto a partir de sumos, néctares e concentrados são superiores no sexo feminino

relativamente ao sexo masculino, estes não são estatisticamente diferentes. Os rapazes apresentam um maior valor médio de ingestão diária de fluoreto a partir de refrigerantes face às raparigas. A ingestão diária média de fluoretos é

0,010 e 0,011 mg/kg de peso corporal nas raparigas e nos rapazes, respectivamente.

Relativamente à frequência de consumo da totalidade das bebidas por género, conclui-se que não existem diferenças estatisticamente significativas entre o

consumo médio e o género (p>0,05). No entanto, quando a análise é feita por tipo de bebida (refrigerante, sumo, néctar, bebida de sumo, concentrado, chá

e infusão), verifica-se que a frequência de consumo de sumos é estatisticamente superior (p<0,05) nas raparigas, em relação aos rapazes.


120

Tabela 27: Valores médios da dose diária ingerida de fluoreto por género.

Bebida

Significância

estatística

(p-value)

Género

DDI de fluoretos

(mg/kg peso

corporal/dia)

Refrigerantes p >0,05

M 0,0101

F 0,0080

Sumos p >0,05

M 0,0002

F 0,0003

Néctares p >0,05

M 0,0011

F 0,0015

Bebidas de

sumo p >0,05

M 0,0

F 0,0

Concentrados p >0,05

M 0,0

F 0,0001

Chás p >0,05

M 0,0

F 0,0

Infusões p >0,05

M 0,0

F 0,0

Em relação à idade, não se observaram diferenças estatisticamente significativas na ingestão diária de fluoretos a partir do consumo de bebidas

entre as crianças dos 5 aos 10 anos. Também não existem diferenças significativas na frequência de consumo e a idade das crianças, pelo que não é

possível definir um perfil de consumo ao longo da faixa etária estudada. Contudo, verifica-se uma tendência de maior consumo de chás e infusões nas crianças mais velhas, cuja significância estatística não foi possível determinar

uma vez que o consumo destes itens alimentares não foi representativo da amostra populacional.


121

5.2.3.2 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e a região

Da tabela 28 consta a distribuição dos valores médios da ingestão diária de fluoretos por região rural e urbana.

Tabela 28: Valores médios de ingestão diária de fluoretos, por região.

Bebida

Significância

estatística

(p-value)

Região

DDI de fluoretos

(mg/kg peso

corporal/dia)

Refrigerantes p < 0,01 Rural 0,0118

Urbana 0,0052

Sumos p < 0,05 Rural 0,0001

Urbana 0,0004

Néctares p >0,05 Rural 0,0013

Urbana 0,0013

Bebidas de sumo p >0,05 Rural 0,0

Urbana 0,0

Concentrados p >0,05 Rural 0,0

Urbana 0,0001

Chás p >0,05 Rural 0,0

Urbana 0,0

Infusões p >0,05 Rural 0,0

Urbana 0,0

Pela comparação dos valores médios de ingestão de fluoretos entre as regiões

rural e urbana verifica-se que apenas existem diferenças estatisticamente significativas no caso dos refrigerantes e sumos, sendo que a ingestão diária

de fluoretos via refrigerantes é superior nas crianças da região rural enquanto isso acontece com as crianças da região urbana relativamente aos sumos.

Relativamente ao consumo de bebidas, verifica-se que a frequência de consumo de refrigerantes à base de extracto é estatisticamente superior (p<

0,05) na região rural, face à região urbana. Não existem diferenças significativas entre consumo dos restantes tipos de bebidas nas duas regiões.


122

5.2.3.3 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e a escolaridade dos pais

Avaliou-se a possível influência da escolaridade do pai e da mãe no consumo de bebidas refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados,

chás e infusões e, consequentemente, a ingestão diária de fluoretos através das bebidas.

Verificou-se haver uma maior frequência de consumo de refrigerantes (p< 0,01) e chás (p< 0,05) quando a escolaridade do pai é mais baixa, . Porém,

quanto à ingestão diária de fluoretos só são verificadas diferenças estatisticamente significativas quando estes são veiculados através de refrigerantes (p< 0,05), ou seja, quando o nível de escolaridade do pai é

menor o consumo de refrigerantes e, consequentemente, a ingestão diária de fluoretos é maior.

Conclui-se assim que a escolaridade do pai ao nível do Ensino Básico e Secundário tem um maior impacte no consumo e na ingestão diária de

fluoreto (p< 0,01) comparativamente a pais com grau de Mestre ou de Doutor.

Procedendo-se de igual modo relativamente ao nível de escolaridade da mãe, verificou-se que a frequência de consumo de sumos (p< 0,05) e concentrados

(p< 0,01) é significativamente superior para níveis de escolaridade mais baixa. O consumo de sumos e concentrados é maior (p< 0,05) quando as

mães só possuem o Ensino Secundário completo comparativamente às mães com Licenciatura. Quanto à ingestão diária de fluoretos só se verificam diferenças estatisticamente significativas (p< 0,05) ao nível dos sumos, sendo

que a ingestão de fluoretos é maior (p< 0,05) em crianças cuja mãe possui apenas o Ensino Secundário , face à Licenciatura.

Em suma, pode estimar-se que a baixa escolaridade dos pais potencia o consumo de alguns dos géneros alimentícios em estudo, o que aumenta a

ingestão diária de fluoretos nas crianças e, consequentemente, o risco de manifestações tóxicas induzidas por este elemento.

5.2.3.4 Relação entre a ingestão diária de fluoreto e o tipo de escola

O tipo de escola, pública ou privada, não discrimina a ingestão diária de fluoretos através do consumo de bebidas pelas crianças. Não se observam

diferenças estatisticamente significativas entre a ingestão diária de fluoretos, bem como na frequência de consumo de bebidas, em escolas do mesmo tipo mas de regiões distintas ou em escolas de tipo de ensino diferente de uma

mesma região.


123

No entanto, tendo em conta que se verificaram diferenças estatisticamente significativas na frequência de consumo de bebidas e na dose diária ingerida

de fluoretos nas regiões rural e urbana (secção 5.2.3.2.), pode sugerir-se que não é a escolha do tipo de escola para os filhos que estará relacionada com consumos diferentes mas sim as regiões onde vivem os pais e as crianças.

6. Relação entre os resultados analíticos e os resultados da avaliação de consumo alimentar

As bebidas analisadas com maior teor médio de fluoretos são as bebidas de sumo (0,40 mg/L), seguida dos refrigerantes (0,39 mg/L) e dos sumos (0,37

mg/L), embora este último em menor quantidade. Porém, as bebidas de sumo e os sumos são consumidos em pequena percentagem pela população em

estudo, apresentando um consumo de apenas 0,52 e 4,6% respectivamente. Conclui-se assim que, tanto as bebidas de sumo como também os sumos, não constituem fontes apreciáveis de exposição ao fluoreto nas crianças.

Em contrapartida, os refrigerantes para além de apresentarem um teor de

fluoretos elevado face às restantes bebidas, são também o tipo de bebida eleito para consumo pelas crianças, representando cerca de 85% do consumo total de bebidas. Para além disso, alguns refrigerantes à base de extracto,

nomeadamente ice teas e tisanas, podem conter teores de fluoretos na ordem dos 2,0 mg/ L, aumentando consideravelmente a ingestão de fluoretos nas

crianças visto que este subgrupo dos refrigerantes também é um dos mais consumido (70%) pela população infantil inquirida. Através da análise de regressão binária também se verificou que o consumo de refrigerantes à base

de extracto é a variável que maior influência tem no risco de toxicidade pelos fluoretos

Conclui-se assim que o consumo de refrigerantes, principalmente de refrigerantes à base de extracto, pode ser responsável por uma ingestão diária

de fluoretos superior a 0,05 mg/kg de peso corporal (DDR), valor que poderá aumentar consideravelmente se consideradas todas as vias de exposição

diária das crianças a este elemento.

Os restantes tipos de bebidas apresentam teores médios de fluoretos entre

0,16 e 0,33 mg/L e apresentam um consumo inferior a 9%, pelo que não constituem por si só veículos maioritários de exposição ao fluoreto pela dieta.

Capítulo VII- Conclusões

125

Capítulo VII - Conclusões

O trabalho apresenta várias secções experimentais, nomeadamente, optimização e validação de métodos, estudos de ocorrência nas várias

matrizes alimentares em estudo (refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões) e questionário de frequência alimentar e

respectiva avaliação da ingestão de fluoretos. Por este motivo, as conclusões foram divididas em duas secções, em que na primeira se apresentam as conclusões sobre optimização, validação e controlo de qualidade dos métodos

instrumentais e na segunda a análise e interpretação dos resultados obtidos nas amostras e com os QFA.

1. Optimização, validação e controlo de qualidade dos métodos instrumentais

O método potenciométrico com eléctrodo combinado selectivo ao ião fluoreto permite a análise em rotina dos fluoretos em refrigerantes, sumos, néctares,

bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões.

O método optimizado e validado é linear na gama entre 0,06-10 mg/L (F), apresentando um limite de determinação (R2) de 0,9956 e um coeficiente de variação (CVm) de 2,4 %. O método apresenta uma boa precisão no intervalo

de linearidade estudado, quer em condições de repetibilidade, quer em condições de precisão intermédia.

O limite de detecção e limite de quantificação determinados em condições de

repetibilidade foram de 0,003 e 0,009 mg/L (F), respectivamente, sendo que o limite de quantificação foi ajustado ao primeiro nível de concentração da gama

de trabalho (0,06 mg/L).

O método é preciso apresentando desvios padrão relativos inferiores a 10 %,

em condições de repetibilidade e de precisão intermédia, na gama de trabalho do método.

Os estudos de recuperação permitiram concluir que existem diferenças estatisticamente significativas (p< 0,05) entre as várias matrizes estudadas

(refrigerantes, néctares, sumos, bebidas de sumo, infusões e chás), verificando-se que nos néctrares, chás e infusões as interferências de matriz são menores face às restantes matrizes alimentares.

No intervalo de valores de pH das amostras não existem diferenças

estatisticamente significativas para os teores de fluoretos a vários valores de pH e, deste modo, não há necessidade de métodos de pré-tratamento da amostra (correcção do valor de pH) no doseamento de fluoretos.

O limite de determinação do método é coincidente com o limite de

quantificação, apresentando um valor de 0,06 mg/L.


126

Os resultados dos ensaios de controlo de qualidade realizados em rotina (declive e ordenada da origem da curva de calibração, brancos, análise de

duplicados, análises de controlos e estudos de recuperação) cumpriram os critérios de aceitação definidos, à excepção do controlo correspondente ao primeiro ponto da curva de calibração, 0,06 mg/ L, sugerindo que em estudos

futuros o limite de quantificação do método, e consequentemente o primeiro ponto da curva de calibração, deverá ser igual a 0,1 mg/L.

O método espetrofotométrico do 2,6-diclorofenol-indofenol permite a determinação do teor em vitamina C nas várias bebidas e é linear na gama

entre 0,2-1,0 mL de corante. Em condições de repetibilidade, o limite de detecção e o limite de quantificação foram de 0,016 e 0,055 mL,

respectivamente. O limite de quantificação foi ajustado a 0,2 mL, correspondendo ao primeiro nível de volume da gama de trabalho (0,1 mg/100g de produto).

O método para a análise de ácido ascórbico é preciso, com desvios padrão

relativos inferiores a 10% em condições de repetibilidade e de precisão intermédia. O erro associado à análise de padrões de controlo apresenta uma variação inferior a 10% indicando que o método espectrofotométrico é exacto.

O controlo de qualidade interno (curva de calibração, soluções padrão controlo, ensaio de recuperação e análise de duplicados) cumpre os critérios

de aceitação definidos.

O método potenciométrico para a determinação do pH foi exato e preciso, apresentando valores de erro percentual inferiores a 1,5 % na análise de controlos e desvio padrão relativo de 0,71 % na análise de duplicados.

Em relação à determinação do potencial redox, o método é exato e preciso,

apresentando valores de erro inferiores a 8,0 % na análise de controlos e valores de desvio padrão relativo inferiores a 2 % na análise de duplicados.

2. Ácido ascórbico, pH, potencial redox e ocorrência de fluoretos

nas bebidas em estudo e avaliação da exposição aos fluoretos

em crianças dos 6 aos 10 anos

Relativamente à análise das amostras, o teor médio de ácido ascórbico é mais

elevado em néctares (1,25 ± 0,45 mg/100 g) e mais baixo em chás (0,22 ± 0,19 mg/100g) uma vez que, à excepção dos chás e infusões, o aditivo E300

(ácido ascórbico) é adicionado a estas matrizes alimentares com a finalidade de aumentar a qualidade do produto e/ou o seu valor nutricional. Os refrigerantes e os concentrados possuem teores de ácido ascórbico muito

idênticos, apresentando valores médios na ordem dos 0,8 mg/100g.

Existem diferenças estatisticamente significativas entre as concentrações de ácido ascórbico de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões (p < 0,01), cuja diferença está associada

principalmente à grande dispersão de teores médios de ácido ascórbico entre os néctares e os chás.


127

As bebidas, vulgarmente conotadas como alimentação infantil, bem como os produtos à base de citrinos, possuem um maior teor de ácido ascórbico,

comparativamente às restantes amostras analisadas.

Relativamente ao pH, verifica-se que todas as matrizes analisadas são

ligeiramente ácidas. O pH é maior em chás (6,00 ± 0,38) e menor em concentrados de frutos (3,00 ± 0,38). No entanto, a nível individual, alguns

refrigerantes apresentam valores de pH inferiores a 3,0, nomeadamente as colas.

A análise de variância (ANOVA) indica que o pH em chás e infusões é significativamente mais elevado que nas restantes matrizes (p < 0,05) e que não existem diferenças estatisticamente significativas entre o pH de sumos,

néctares e bebidas de sumo. A maior variação de pH ocorre nos refrigerantes.

No que respeita ao potencial redox, conclui-se que este parâmetro é maior em concentrados (222 mV). Os chás e as infusões apresentam valores de potencial redox médios mais baixos (105 mV e 120 mV, respectivamente). No

entanto, foi dentro do grupo dos refrigerantes que se verificaram os valores mais elevados de potencial redox, nomeadamente nas cocas e ice teas. Todas

as matrizes estudadas são meios pouco oxidantes.

O potencial redox nas matrizes de concentrados e refrigerantes é

significativamente superior (p<0,05), face aos restantes tipos de bebidas analisados.

Em relação à análise de fluoretos, observa-se que a concentração média de fluoretos é mais elevada em bebidas de sumo (0,40±0,24 mg/L) e

refrigerantes (0,39 ± 0,34 mg/L) e mais baixa nas infusões (0,12±0,01 mg/L). Os néctares e os concentrados possuem teores de fluoretos muito

semelhantes (0,3 mg/L).

A maior dispersão de valores de fluoretos ocorre nas amostras de

refrigerantes (0,18 - 0,86 mg/L), sendo que o teor de fluoretos nos refrigerantes à base de extractos é significativamente superior (p<0,05) relativamente aos refrigerantes gaseificados e refrigerantes à base de sumo.

No entanto, não existem diferenças estatisticamente significativas na concentração de fluoretos em refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de

sumo, concentrados, chás e infusões (p>0,05).

Os resultados deste estudo mostram que os produtos consumidos por crianças

apresentam níveis consideráveis de fluoretos, principalmente as bebidas de sumo, os sumos e refrigerantes à base de extracto, podendo ser uma via de

exposição adicional aos fluoretos pela dieta. Porém, uma criança de 8 anos teria de consumir em média 135 L de uma destas bebidas para atingir a dose diária tóxica de fluoretos (2 mg/kg de peso corporal/dia).

A análise dos inquéritos de frequência de consumo alimentar permitiu verificar

que os refrigerantes, principalmente os refrigerantes à base de extracto, e os néctares são, dos tipos de bebidas estudados, aqueles que são mais consumidos pelas crianças da faixa etária estabelecida (5 a 10 anos). As

bebidas de sumo constituem o tipo de bebidas menos consumidas pelas crianças, apresentando uma percentagem de consumo inferior a 1%.


128

A ingestão diária média de fluoretos a partir do consumo de bebidas é 0,011 mg/kg de peso corporal, valor que aumenta consideravelmente quando

contabilizada também a deglutição de pasta dentífrica (0,024 mg/kg de peso corporal).

Das crianças inquiridas, 9 excedem a dose diária recomendada de fluoretos (0,05 mg/kg de peso corporal/dia), principalmente devido ao consumo de

refrigerantes. Se considerarmos também a deglutição de pasta dentífrica, 12 crianças excedem a dose diária recomendada de fluoretos. Conclui-se, porém, que não existem diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre a

ingestão diária de fluoretos veiculados pelas bebidas e a ingestão diária de fluoretos através do consumo de bebidas e deglutição de pasta dentífrica.

O modelo de regressão binária estimado para avaliação do risco de toxicidade dos fluoretos é preciso, possui uma percentagem de acerto elevada (92,2%) e

apresenta uma ótima sensibilidade (98,9%), porém baixa especificidade (23,5%). Segundo o modelo, o risco de toxicidade pelo fluoreto nas crianças

inquiridas também é explicado pelo consumo de refrigerantes à base de extracto e ainda pela idade, sendo que a primeira variável possui maior influência no modelo.

A utilização de testes t para comparação de médias permitiu concluir que o consumo de sumos é estatisticamente superior nas raparigas (p < 0,05),

porém o género não discrimina o consumo médio da totalidade das bebidas analisadas (p > 0,05). Relativamente à ingestão diária de fluoretos a partir de

bebidas, embora se verifique uma tendência de maior consumo nas raparigas face aos rapazes, esta não é significativo.

Não existem diferenças estatisticamente significativas (p > 0,05) no consumo de bebidas e, consequentemente, na ingestão diária de fluoretos a partir

destas fontes e a idade das crianças, o que não permite definir um perfil de consumo e/ou de ingestão diária de fluoretos na faixa etária estudada.

Considerando a distribuição das crianças por regiões, rural e urbana, apenas existem diferenças no consumo de refrigerantes à base de exctrato nas duas

regiões, verificando-se que o consumo é estatisticamente superior na região rural (p < 0,05). A ingestão diária de fluoretos via refrigerantes e sumos é significativamente diferente nas regiões urbana e rural, concluindo-se que a

ingestão de fluoretos através de refrigerantes é superior nas crianças da região rural enquanto a ingestão de fluoretos via sumos é maior nas crianças

da região urbana.

Também a escolaridade dos pais permite discriminar o consumo de bebidas e

a ingestão diária de fluoretos a partir destas fontes da dieta. Relativamente à escolaridade do pai, verifica-se que o consumo de refrigerantes e,

consequentemente, a ingestão diária de fluoretos é maior para níveis de escolaridade mais baixos, apresentando o ensino básico e secundário um maior impacte face ao grau de mestre e doutor.

No que respeita à escolaridade da mãe, o consumo de sumos e concentrados

pelas crianças é superior quando a mãe apresenta o ensino secundário, relativamente à licenciatura. Contudo, a ingestão diária de fluoretos apenas é significativamente superior via sumos nas mães com ensino secundário face às

mães com licenciatura.


129

Conclui-se assim que níveis baixos de escolaridade dos pais potenciam o consumo de algumas bebidas pelas crianças e, consequentemente, a ingestão

diária de fluoretos.

Quanto ao tipo de escola frequentada pelas crianças, pública ou privada, não

se observam diferenças significativas (p > 0,05) no consumo de bebidas, bem como na ingestão diária de fluoretos por esta fonte de exposição, sugerindo

que o tipo de escola frequentada pela criança não tem influência no consumo de refrigerantes, sumos, néctares, bebidas de sumo, concentrados, chás e infusões.

Após relacionar os resultados de determinação do teor de fluoretos nas bebidas com os resultados dos inquéritos de frequência de consumo alimentar,

verifica-se que os refrigerantes, para além de representarem um dos tipos de bebidas analisadas com maior teor de fluoretos (0,39 mg/L), são também as

bebidas mais consumidas (85%), com maior destaque os refrigerantes à base de extracto. Da mesma forma, a análise de regressão binária justifica o risco

de toxicidade pelos fluoretos com o aumento do consumo de refrigerantes à base de extracto.

Conclui-se então que o consumo de refrigerantes, nomeadamente refrigerantes à base de extractos, pode ser responsável por uma ingestão diária de fluoretos superior a 0,05 mg/ kg de peso corporal, face às restantes

bebidas que apresentam baixa percentagem de consumo (< 9%). Refere-se ainda que nenhuma das amostras analisadas ultrapassa a dose diária tóxica de

fluoretos (a nível individual). Os dados de consumo sugerem igualmente que a dose tóxica não é atingida.

Desta forma, relativamente aos fluoretos, ainda que sejam uma ferramenta de extrema importância no combate à cárie dentária e saúde oral das populações,

é pertinente o controlo da sua ingestão a partir do momento em que as crianças adoptam uma alimentação semelhante à dos adultos (a partir dos 12 meses). Deste modo, a consciencialização das populações quanto à relação

risco/benefício do flúor deve ser valorizada, principalmente em relação às crianças, pois são um grupo de elevada susceptibilidade à toxicidade pelo

fluoreto.

Em estudos futuros deveria-se ter em atenção os seguintes itens:

Aumentar o número de inquiridos e de regiões nacionais, com vista a

estimar e definir um padrão de consumo alimentar e/ou de ingestão diária de fluoretos pelas bebidas representativos do país, uma vez que o

número de participantes no presente estudo para a avaliação do consumo alimentar não é representativo da população infantil de Portugal Continental.

Comparar ou combinar o método de QFA com outras metodologias de avaliação de consumo, nomeadamente o método de diário alimentar,

pois em virtude do curto período de tempo disponível para a realização do presente trabalho não foi possível proceder à validação prévia do

QFA aplicado para a avaliação do consumo alimentar de crianças, o que poderá constituir uma limitação da metodologia aplicada pela ausência de prova de reprodutibilidade e exactidão dos resultados.


130

Deverá aumentar-se o número de bebidas estudadas na análise de fluoretos, aumentando o número de lotes de cada bebida, de forma a

aumentar a representatividade dos produtos que se encontram no mercado em Portugal.

No entanto, podemos concluir que, a exposição das crianças aos fluoretos tem aumentado, nomeadamente através da dieta, embora não sejam só as

bebidas que contribuem para esse aumento. Como tal, estudos que combinassem várias vias de exposição seriam uma forma de avaliar a

exposição aos fluoretos, não só das crianças mas da população portuguesa.

Anexos

131

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Anexos

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Anexos

139

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Ion Chromatography. EPA 30001993.

127. Standard Methods for Examination of Water and Wastewater. IC with

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140

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Anexos

141

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158. International Organization for Standardization ISO. Accuracy (trueness

and precision) of measurement methods and results - Part 1: General principles and definitions. ISO 5725-1. Geneva1994.

http://www.eurachem.org/guides/mval.htm

http://www.eurachem.org/guides/accr.htm


142

159. International Organization for Standardization ISO. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 6: Use in

paractice of accuracy values. ISO 5725-6. Geneva1994.

160. International Organization for Standardization ISO. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 2: basic

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163. Porto AA. "Contributo para a estimativa de edulcorantes intensos num

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164. Jornal Oficial das Comunidades Europeias. Directiva 2001/112/CE do Conselho de 20 de Dezembro de 2001, relativa aos sumos de frutos e a

determinados produtos similares destinados à alimentação humana., (2002).

165. Portaria nº 703/96 de 6 de Dezembro, Diário da República, Iª Série - B,

nº 282, 6 de Dezembro de 1996. 1996.

166. Decreto-Lei n.º 363/98 de 19 de Novembro,Diário da República, Iª Série,

n.º 268, 19 de Novembro de 1998, (1998).

167. Maroco J. Análise Estatística com Utilização do SPSS. 3ª Edição ed: Silabo; 2007. 824 p.

168. Lumley T, Diehr P, Emerson S, Chen L. The importance of the normality assumption in large public health data sets. Annual Review of Public

Health. 2002;23:151-69.

169. Barreira MJMM. "Ocorrência de patulina em alimentos destinados a

lactentes e crianças: optimização e validação do método de análise por SPE-HPLC-UV", Dissertação para a obtenção do grau de Mestre.: Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa.; 2009.

Anexos

143

Anexos


144


Tabela 29. Características das amostras de refrigerantes.

Código

da

amostra

Amostra Porção Grupo etário

recomendado Ingredientes

RAa1I

Refrigerante de

extrato de chá

e sumo á base

de concentrado

200 mL N.A

Sumo de limão

(0,1%), extrato de

chá preto (0,12%)

RAa1II

Refrigerante de

extrato de chá

e sumo á base

de concentrado

200 mL N.A

Sumo de limão

(0,1%), extrato de

chá preto (0,12%)

RAa2IV

Refrigerante de

extrato de chá

e sumo á base

de concentrado

200 mL N.A

Sumo de manga

(0,2%), extrato de

chá preto (0,1%)

RAa2V

Refrigerante de

extrato de chá

e sumo á base

de concentrado

200 mL N.A

Sumo de manga

(0,2%), extrato de

chá preto (0,1%)

RAa2VI

Refrigerante de

extrato de chá

e sumo á base

de concentrado

200 mL N.A

Sumo de manga

(0,2%), extrato de

chá preto (0,1%)

RAa3VII

Refrigerante de

extrato de chá

e sumo á base

de concentrado

200 mL N.A

Sumo de pêssego

(0,2%), extrato de

chá preto (0,12%)

RAa3VIII

Refrigerante de

extrato de chá

e sumo á base

de concentrado

200 mL N.A

Sumo de pêssego

(0,2%), extrato de

chá preto (0,12%)

RAa3IX

Refrigerante de

extrato de chá

e sumo á base

de concentrado

200 mL N.A

Sumo de pêssego

(0,2%), extrato de

chá preto (0,12%)


145

Tabela 30. Características das amostras de refrigerantes (continuação).

Código

da

amostra



RAb1X1

Bebida

refrigerante de

sumo de fruta

200 mL N.A

Sumo de fruta (18%)

maçã, laranja,

ananás e manga,

polpa de goiaba

(1,5%), polpa de

banana (0,5%)

RAb1X2

Bebida

refrigerante de

sumo de fruta

200 mL N.A

Sumo de fruta (18%)

maçã, laranja,

ananás e manga,

polpa de goiaba

(1,5%), polpa de

banana (0,5%)

RAb1X3

Bebida

refrigerante de

sumo de fruta

200 mL N.A

Sumo de fruta (18%)

maçã, laranja,

ananás e manga,

polpa de goiaba

(1,5%), polpa de

banana (0,5%)

RAb2XI2

Bebida

refrigerante de

sumo de fruta

200 mL N.A

Sumo de laranja

(10%) maçã, ananás

e manga (9%), polpa

de alperce (0,5%)

RAb2XI3

Bebida

refrigerante de

sumo de fruta

200 mL N.A

Sumo de laranja

(10%) maçã, ananás

e manga (9%), polpa

de alperce (0,5%)

RAb3XII1

Bebida

refrigerante de

sumo de fruta

200 mL N.A

Sumo de ananás

(10%), maçã e

laranja (4,5%) e

polpa de banana

(0,5%)


146


Código

da

amostra



RAb3XII2

Bebida

refrigerante de

sumo de fruta

200 mL N.A

Sumo de ananás

(10%), maçã e

laranja (4,5%) e

polpa de banana

(0,5%)

RAb3XII3

Bebida

refrigerante de

sumo de fruta

200 mL N.A

Sumo de ananás

(10%), maçã e

laranja (4,5%) e

polpa de banana

(0,5%)

RAc1XIII

Refrigerante

gaseificado de

extratos

vegetais

1500

mL N.A Extratos Vegetais

RBa1I1 Refrigerante de

sumo de fruta 200 mL N.A

Sumo de laranja a

partir de concentrado



Sumo de laranja a




Sumo de laranja a


RBb1II1 Refrigerante de


Puré concentrado de

pêssego e maçã,

extrato de maçã.




pêssego e maçã,

extrato de maçã.




pêssego e maçã,

extrato de maçã.

RBb2III1 Sumo de fruta 200 mL N.A Sumo de laranja á

base de concentrado


base de concentrado


base de concentrado


147


Código

da

amostra



RBc1IV1 Refrigerante de


Sumo de laranja,

limão, maçã,

maracujá e ananás,

puré concentrado de

alperce, manga,

banana, goiaba,

papaia e pêssego.



Sumo de laranja,

limão, maçã,



alperce, manga,

banana, goiaba,

papaia e pêssego.



Sumo de laranja,

limão, maçã,



alperce, manga,

banana, goiaba,

papaia e pêssego.

RBc2V1 Refrigerante de



pêssego e maçã,

extrato de maçã,

aroma de pêssego




pêssego e maçã,

extrato de maçã,

aroma de pêssego




pêssego e maçã,

extrato de maçã,

aroma de pêssego

RBd1VI1 Refrigerante de



pêssego e maçã




pêssego e maçã


148


Código

da

amostra






pêssego e maçã

RBd2VII1 Refrigerante de



pêssego e maçã




pêssego e maçã




pêssego e maçã

RBe1VIII1 Refrigerante de


Sumo de laranja a




Sumo de laranja a




Sumo de laranja a


RBe2IX1 Refrigerante de


Sumo de laranja,

maçã, limão, ananás

e maracujá. Puré

concentrado de

alperce, manga ,

banana, goiaba,

papaia e pêssego



Sumo de laranja,


e maracujá. Puré

concentrado de

alperce, manga ,

banana, goiaba,

papaia e pêssego


149


Código

da

amostra




sumo de Fruta 200 mL N.A

Sumo de laranja,


e maracujá. Puré

concentrado de

alperce, manga,

banana, goiaba,

papaia e pêssego

RBe3X1 Refrigerante de



pêssego e maçã,

extrato de maçã.




pêssego e maçã,

extrato de maçã.




pêssego e maçã,

extrato de maçã.

RBa2XI1 Refrigerante de


Sumo de laranja,

limão, maçã ananás e

maracujá, puré de

concentrado de

alperce, manga,

banana, goiaba,

papaia e pêssego.



Sumo de laranja,


maracujá, puré de

concentrado de

alperce, manga,

banana, goiaba,

papaia e pêssego.



Sumo de laranja,


maracujá, puré de

concentrado de

alperce, manga,

banana, goiaba,

papaia e pêssego.


150


Código

da

amostra



RCa1I1

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

200 mL N.A

Sumo de limão á

base de concentrado

(1%), extrato de chá

preto (0,12%)

RCa1I2

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

200 mL N.A

Sumo de limão á

base de concentrado


preto (0,12%)

RCa1I3

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

200 mL N.A

Sumo de limão á

base de concentrado


preto (0,12%)

RCa2II1

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

200 mL N.A

Sumo de manga á

base de concentrado

(0,2%), extrato de

chá preto (0,07%)

RCa2II2

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

200 mL N.A

Sumo de manga á

base de concentrado

(0,2%), extrato de

chá preto (0,07%)

RCa2II3

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

200 mL N.A

Sumo de manga á

base de concentrado

(0,2%), extrato de

chá preto (0,07%)

RCa3III1

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

200 mL N.A

Sumo de pêssego á

base de concentrado

(0,2%), extrato de

chá preto (0,06%)

RCa3III2

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

200 mL N.A

Sumo de pêssego á

base de concentrado

(0,2%), extrato de

chá preto (0,06%)


151

Tabela 36.Características das amostras de refrigerantes (continuação).

Código

da

amostra



RCa3III3

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

200 mL N.A

Sumo de pêssego

(0,2%), extrato de chá

preto (0,06%)

RCb1IV Refrigerante de


Sumo de maçã,

laranja, ananás,

banana, alperce,

goiaba, limão, toranja,

uva e kiwi

RCb1V1 Refrigerante de


Sumo de maçã,

laranja, ananás,

banana, alperce,


uva e kiwi

RCb1V2 Refrigerante de


Sumo de maçã,

laranja, ananás,

banana, alperce,


uva e kiwi

RCb1VI1 Refrigerante de


Sumo de maçã,

laranja, ananás,

banana, alperce,


uva e kiwi



Sumo de maçã,

laranja, ananás,

banana, alperce,


uva e kiwi



Sumo de maçã,

laranja, ananás,

banana, alperce,


uva e kiwi

RD1I1 Refrigerante de

sumos de fruta 200 mL N.A

Sumo e polpa de

ananás (10%), sumo

de maçã, laranja,

maracujá, alperce,

goiaba, manga e

banana


152


Código

da

amostra





Sumo e polpa de

ananás (10%), sumo

de maçã, laranja,

maracujá, alperce,

goiaba, manga e

banana



Sumo e polpa de

ananás (10%), sumo

de maçã, laranja,

maracujá, alperce,

goiaba, manga e

banana

RD2II1 Refrigerante de


Sumos de maçã,

laranja, maracujá,

ananás, alperce,

goiaba, manga e

banana



Sumos de maçã,

laranja, maracujá,

ananás, alperce,

goiaba, manga e

banana



Sumos de maçã,

laranja, maracujá,

ananás, alperce,

goiaba, manga e

banana

RD3III1 Refrigerante de


Sumo e polpa de

morango (6%), sumo

de laranja, ananás,

maracujá, ananás,

alperce, goiaba,

manga e banana


153


Código

da

amostra





Sumo e polpa de

morango (6%), sumo


maracujá, ananás,

alperce, goiaba,

manga e banana



Sumo e polpa de

morango (6%), sumo


maracujá, ananás,

alperce, goiaba,

manga e banana

REa1I

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

200 mL N.A

Sumo de limão (1%)

á base de

concentrado, extrato

de chá (0,1%)

REa1II

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

200 mL N.A

Sumo de limão (1%)

á base de


de chá (0,1%)

REa1III

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

200 mL N.A

Sumo de limão (1%)

á base de


de chá (0,1%)

REa2IV

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

200 mL N.A

Sumo de pêssego

(0,2%) á base de


de chá (0,1%)

REa2V

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

200 mL N.A

Sumo de pêssego

(0,2%) á base de


de chá (0,1%)


154


Código

da

amostra



REa2VI

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

200 mL N.A

Sumo de pêssego

(0,2%) á base de


de chá (0,1%)

RFa1I Refrigerante de


Sumo de limão, sumo

de ananás (3%),

sumo de laranja

(3%), sumo de

tangerina

RFb1II Refrigerante de


Sumo de fruta de

laranja (4%), limão

(3,5%) sumo de

ananás (1,5%), polpa

de graviola á base de

graviola (1%)

RFc1III Refrigerante de


Sumo de maçã

(8,9%), romã (1%),

arando

RFd1IV Refrigerante de


Sumo de laranja

(3,9%), sumo de

limão (3,6%), sumo

de ananás (1,5%),

sumo de maracujá

(1%).

RFe1V Refrigerante de


Sumo de maçã

(8,3%), sumo de

morango (1%), sumo

de framboesa, sumo

de amora a partir de

um concentrado.

RHa1I

Refrigerante

aromatizado

com frutos

2000

mL N.A

Sumo de maçã

proveniente de

concentrado (0,8%)


155


Código

da

amostra



RHa2II

Refrigerante

aromatizado com

frutos

2000

mL N.A Frutos tropicais

RHb1III

Refrigerante á

base de extratos

vegetais

2000

mL N.A

Sumo de ananás

proveniente de

concentrado (0,5%)

RIa2II Refrigerante de

sumo 500 mL N.A

Sumo de maçã

(28%), sumo de

limão (1,6%), extrato

de ginkgo biloba

(0,01%)

RIa3III Refrigerante de

sumo 500 mL N.A

Sumo de maçã

(28%),sumo de limão

(1,6%), extrato de

gingko biloba

(0,01%)

RIa4IV

Refrigerante de

extratos de

ervas

500 mL N.A

Sumo de maçã (23%)

,sumo de abacaxi

(5,1%) sumo de

limão (1,3%), extrato

de erva-mate

(0,03%)

RIb1IV

Refrigerante de

extratos de

ervas

330 mL N.A

Sumo de limão

(0,6%), extrato de

chá preto com aroma

de bergamota

(0,14%)

RIb2V

Refrigerante de

extratos de

ervas

330 mL N.A

Sumo de

limão(0,5%), extrato

natural de ervas:

tilia, camomila, e

cidreira (0,25%)

RJaI

Refrigerante á

base de extratos

vegetais

1000


RJbII

Refrigerante á

base de extratos

vegetais

1000



156


Código

da

amostra



RJcIII

Refrigerante á

base de extratos

vegetais

1000


RJcIV

Refrigerante á

base de extratos

vegetais

330 mL N.A Extratos Vegetais

RLI

Refrigerante á

base de extratos

vegetais

1000


RLaII

Refrigerante á

base de extratos

vegetais

330 mL N.A Extratos Vegetais

RM1I

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

500 mL N.A

Chá: água e extrato

de chá preto (4,7%),

sumo de limão á base

de concentrado

(0,1%)

RM2II

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

500 mL N.A



sumo de manga á

base de concentrado

(0,13%)

RM3III

Refrigerante de

extrato de chá

com sumo

500 mL N.A



sumo de pêssego á

base de concentrado

(0,1%)

RN1I

Refrigerante de

extratos

vegetais

500 mL N.A Extrato de chá

RO1I

Refrigerante

aromatizado

com água de

nascente

500 mL N.A Água de nascente e

aroma de limão

RO2II

Refrigerante

aromatizado

com água de

nascente

500 mL N.A Água de nascente e

aroma de limão


157


Código

da

amostra



RO3III

Refrigerante

aromatizado

com água de

nascente

500 mL N.A Água de nascente

RP1I Refrigerante de

sumo de frutas 250 mL N.A

Sumo concentrado de

ananás (6%)

RQ1I Refrigerante de


Sumo de laranja,

limão, toranja e

tangerina proveniente

de concentrado

(12%), polpa de

laranja (2%) e Extrato

de casca de laranja

RR1I Refrigerante de


Sumo e polpa de

laranja (10%)

RR1II Refrigerante de


Sumo e polpa de

laranja (10%)

RS1I Refrigerante de

sumo

1000

mL N.A

Sumo de limão

(13,5%) á base de

concentrado, polpa de

limão

RT1I Refrigerante de

sumo de frutas

1500

mL N.A

Sumo de laranja

(12%), sumo de

limão(5%), sumo de

cenoura(3%),sumo de

maçã

RT2II Refrigerante de

sumo de frutas

1000

mL N.A

Sumo de ananás

(20%) e extrato de

erva-cidreira (0,02%)

RU1I Refrigerante de

sumo de frutos

1500

mL N.A

Sumo de ananás

proveniente de

concentrado (9,2%)


158


Código

da

amostra



RU2II Refrigerante de

sumo de frutos

1500

mL N.A

Sumo de laranja

proveniente de

concentrado (8,7%)

RV1I Refrigerante de

sumo de frutos

1000

mL N.A

Sumo de laranja á

base de concentrado

(8 %)

RV2II Refrigerante de

sumo de frutos

1000

mL N.A

Sumo de laranja á

base de concentrado

(8 %)

RX1I Refrigerante de

sumo de frutas

1500

mL N.A

Sumos de Laranja

(14%) proveniente de

concentrado

RX2II Refrigerante de

sumo de frutas

1500

mL N.A

Sumos de maracujá

(5%) e Laranja (5%)

provenientes de

concentrados

RWI Refrigerante

aromatizado 330 mL N.A

Refrigerante

aromatizado de lima-

limão

RZ1I

Refrigerante de

extratos

vegetais

250 mL N.A extratos vegetais de

lima-limão


159

Tabela 44. Características das amostras de sumo.

Código

da

amostra



SAa1I1

Sumo á base

de

concentrado

200 mL N.A

Sumo de ananás (51%)

e sumo de uva á base

de concentrado (49%)

SAa1I2

Sumo á base

de

concentrado

200 mL N.A

Sumo de ananás (51%)

e sumo de uva á base

de concentrado (49%)

SAa2II1

Sumo á base

de

concentrado

200 mL N.A Sumo de laranja á base

de concentrado

SAa2II2

Sumo á base

de

concentrado


de concentrado

SAa2II3

Sumo á base

de

concentrado


de concentrado

SAa3III1

Sumo á base

de

concentrado

200 mL N.A

Sumo de pêssego

(51%) e sumo de uva á

base de concentrado

(49%)

SAa3III2

Sumo á base

de

concentrado

200 mL N.A

Sumo de pêssego


base de concentrado

(49%)

SAa3III3

Sumo á base

de

concentrado

200 mL N.A

Sumo de pêssego


base de concentrado

(49%)

SAb1IV Sumo

Biológico

1500

mL N.A

100% sumo de laranja

biológica

SAb2V Sumo

Biológico 1 Litro N.A

100% sumo de maçã

biológica

SB1I1

Sumo á base

de

concentrado

300 mL N.A

Sumo de maçã

reconstituído (81,9%),

banana (11,5%) e

alperce (5%)


160

Tabela 45. Características das amostras de sumo.

Código

da

amostra



SB1I2 Sumo á base de

concentrado 300 mL N.A

Sumo de maçã

reconstituído

(81,9%), banana

(11,5%) e alperce

(5%)



Sumo de maçã

reconstituído

(81,9%), banana

(11,5%) e alperce

(5%)



Sumo de maçã à base

de sumo concentrado

reconstituído 100%




de sumo concentrado

reconstituído 100%

SC1I1 Sumo á base de


Sumo de frutas

(laranja, maçã, pêra e

ananás) á base de

concentrado

SC1I2 Sumo á base de


Sumo de frutas

(laranja, maçã, pêra e

ananás) á base de

concentrado

SC2II1 Sumo á base de



de concentrado

SD1I Sumo de fruta 250 mL N.A

Sumo de uva e

framboesa à base de

concentrado

SEa1I Sumo á base de



de concentrado

SEa2II Sumo á base de


Sumo de laranja à

base de concentrado

SEa2III Sumo á base de


Sumo de laranja à

base de concentrado

SF1I Sumo 750 mL N.A 100% sumo de

beterraba

SF2II Sumo 750 mL N.A

80% sumo de maçã,

20% sumo de

groselha


161

Tabela 46. Características das amostras de néctares.

Código da

amostra Amostra Porção

Grupo etário


NAa1I Néctar 330 mL N.A Sumo e polpa de

manga

NAa2II Néctar 330 mL N.A Sumo e polpa de

pêra

NAa3III Néctar 330 mL N.A Sumo e polpa de

pêssego

NAa4IV

Néctar á base de

sumo

concentrado

330 mL N.A

Sumo de uva e

ananás, polpa de

maçã, sumo de

laranja

NAb1V

Néctar á base de

sumo

concentrado

330 mL N.A

Polpa de Laranja

(23%), cenoura

(14%), manga

(12%), limão (1%)

NAb2VI

Néctar á base de

sumo

concentrado

330 mL N.A

Sumo de uva tinta,

amora, maçã,

morango,

framboesa

NAc1VII

Néctar á base de

sumo

concentrado

330 mL N.A Sumo e polpa de

maracujá

NAb3VIII Néctar de sumo 1000

mL N.A

Sumo e polpa de

framboesa (28%)

e maçã (22%)

NB1I1 Néctar á base de

puré 200 mL N.A

Puré de pêra

(50%)


puré 200 mL N.A

Puré de pêra

(50%)

NB2II1 Néctar á base de

puré 200 mL N.A

Puré de pêssego

(50%)


puré 200 mL N.A

Puré de pêssego

(50%)


puré 200 mL N.A

Puré de pêssego

(50%)


puré 200 mL N.A

Puré de manga

(40%)


puré 200 mL N.A

Puré de manga

(40%)


puré 200 mL N.A

Puré de manga

(40%)


162

Tabela 47. Características das amostras de néctares (continuação).

Código da


Grupo etário


NB4III Néctar á base de


Sumo de ananás

(60%)

NB4IV Néctar á base de


Sumo de ananás

(60%)

NCa1I1 Néctar 200 mL N.A Polpa de pêra

(50%)


(50%)


(50%)

NCa2II1 Néctar 200 mL N.A Polpa de alperce

(40%)


(40%)


(40%)

NCa3III1 Néctar 200 mL N.A Polpa de manga

(35%)


(35%)


(35%)

NCa4II1 Néctar 200 mL N.A

Sumo de uva,

cereja, morango,

amora, framboesa

(40%) polpa de

morango (10%)

NCa4II2 Néctar 200 mL N.A

Sumo de uva,

cereja, morango,

amora, framboesa

(40%) polpa de

morango (10%)

NCa5II1 Néctar 200 mL N.A Polpa de pêssego

(50%)


(50%)


(50%)

NCb1IV1 Néctar Light 330 mL N.A

Sumo de laranja,

maçã e maracujá

(48%), polpa de

banana (2%)


163

Tabela 48. Características das amostras de néctares (continuação).

Código da


Grupo etário


NCb1IV2 Néctar Light 330 mL N.A

Sumo de laranja,

maçã e maracujá

(48%), polpa de

banana (2%)

NCb2IV Néctar Light 330 mL N.A

Sumo de laranja

(30%) polpa de

manga (15%)

NCb3V Néctar Light 330 mL N.A

Polpa de morango

e maçã (35%),

sumo de maçã

(10%)


164

Tabela 49. Características das amostras de bebidas de sumo

Código

da

amostra



BSB1I Bebida de

sumo 200 mL N.A

Sumo de laranja

(12%) à base

sumo de laranja

concentrado.

BSB2II Bebida de

sumo 200 mL N.A

Sumo de fruto

concentrado á

base de sumo de

morango (7%),

maçã (1%), kiwi

e sabugo

BSB3III Bebida de

sumo 200 mL N.A

Sumo de fruto á

base de sumo de

maçã (5%) e

pêssego (7%)

BSA1I

Bebida de

sumo e de

concentrado

proveniente de

agricultura

Biológica

1000

mL N.A

Sumo de laranja

(50%), sumo de

cenoura

(11,5%), sumo

Concentrado de

limão (0,5%)

BSCa1I

Bebida de

sumo de fruta

com leite

330 mL N.A

Sumo de

pêssego (17%),

leite magro

(10%), polpa de

manga (3%)

BSDa1I Bebida á base

de sumo 330 mL N.A

Sumo de ananás

á base de

concentrado,

extracto de coco

(0,1%)


165

Tabela 50. Características das amostras de concentrados.

Código

da

amostra



TA1I Concentrado 1000

mL N.A

Sumo de frutas

(50%) (ananás,

laranja e maracujá

e polpa de manga,

banana e alperce)

TA2II Concentrado 840 mL N.A

Sumo de ananás

(25%) uva e laranja

á base de

concentrado

TB1I Produto em

pó 30 g N.A

Sumo de maçã

desidratado (0,7%)

TB2II Produto em

pó 31 g N.A

Sumo de laranja

desidratado (0,6%)

TC1I

Produto em

pó para

preparar

uma bebida

refrigerante

40 g N.A

Sumo de beterraba

em pó, sumo de

laranja em pó

(0,1%)

Tabela 51. Características das amostras de chá.

Código

da

amostra



CA1I1 Chá 200 g > 4 Meses

Extracto de ervas e

óleo de : camomila,

erva-cidreira,

hortelã-pimenta,

funcho, erva-doce e

tomilho (1,4%)

CA1I2 Chá 200 g > 4 Meses

Extracto de ervas e

óleo de : camomila,

erva-cidreira,

hortelã-pimenta,

funcho, erva-doce e

tomilho (1,4%)

CA2II Chá 200 g > 4 Meses

Extracto de ervas

(funcho, erva doce e

camomila)


166

Tabela 52. Características das amostras de infusões.

Código

da

amostra



IA1I

Infusão

com

extractos

de

plantas

199 g N.A

Extracto solúvel

de tília (2,4%),

erva-cidreira

(1,2%) e flor de

laranjeira (0,4%)

IA2II

Infusão

com

extractos

de

plantas

200 g N.A

Extracto solúvel

de camomila

(1,8%), funcho

(1,6%) e lúcia-

lima (0,5%)

IB1I

Infusão

de

plantas

50 g Do nascimento

á idade adulta

Extracto solúvel

de erva-doce

(0,45), extracto

solúvel de

camomila

(0,35%)

Anexo 2 – Definições de tipos de bebidas

167

Anexo 2 – Definições de tipos de bebidas (91, 165)

Refrigerantes

Refrigerantes à base de extracto

Refrigerante resultante da diluição em água de extractos e

aromatizantes, podendo eventualmente incluir sumo, polme ou respectivos derivados e ainda outros ingredientes comestíveis de origem vegetal.

Refrigerantes gaseificados

Refrigerante com teor de dióxido de carbono superior a 2 g/L.

Refrigerantes à base de sumo Refrigerante, turvo ou límpido, resultante da diluição em água de sumo

ou polme de frutos, respectivos concentrados ou desidratados, com um teor de sumo compreendido entre os limites mínimos a seguir indicados (m/m) e a concentração mínima fixada para o néctar do mesmo fruto,

podendo conter aromatizantes naturais ou idênticos aos naturais:

I) Ananás, morango, limão, toranja e frutos ácidos diversos — 6%; II) Laranja —8%;

III) Alperce e pêssego—12%; IV) Maçã, pêra e uva —16%;

V) Outros frutos e misturas de frutos—10%.

Sumos (Sumo de frutos)

Designa o produto fermentescível, mas não fermentado, obtido a partir de uma ou mais espécies de frutos sãos e maduros, frescos ou conservados pelo

frio, com a cor, o aroma e o gosto característicos dos sumos dos frutos de que provém.

Anexo 2 – Definições de tipos de bebidas

168

Néctares (Néctar de frutos)

Designa o produto fermentescível, mas não fermentado, obtido por adição de água e de açúcares e/ou mel a sumo de frutos, sumo de frutos fabricado a

partir de um produto concentrado, sumo de frutos concentrado, sumo de frutos desidratado/em pó, a polmes de frutos ou a uma mistura destes

produtos.

Bebidas de sumo (Sumo de frutos fabricado a partir de um produto concentrado)

Designa o produto obtido por reposição num sumo de frutos concentrado da

água extraída do sumo durante a concentração e por restituição das substâncias aromáticas e, se for caso disso, da polpa e das células eliminadas

do sumo, mas recuperadas durante o processo de produção do sumo de frutos de partida ou de sumo da mesma espécie de frutos.

Concentrados (Sumo de frutos concentrado ou sumo de frutos desidratado/em pó)

Designa o produto obtido a partir de sumo de uma ou mais espécies de frutos

por eliminação física de uma parte determinada da água. Quando o produto se destinar a consumo directo, a água eliminada não poderá representar menos

de 50 % ou,

designa o produto obtido a partir de sumo de uma ou mais espécies de frutos

por eliminação física de quase toda a água.

Anexo 3 – Método dos mínimos quadrados

169

Anexo 3 – Método dos mínimos quadrados (156, 169)

A forma algébrica da equação de uma recta é dada por:

abxy (equação 16)

Onde:

b Declive da recta.

α Ordenada na origem.

Valores individuais de concentração conhecida na solução padrão.

Esta recta é formada por um conjunto de pares ordenados e independentes,

(x1, y1);…; (xn, yn) onde n é o número de pontos da recta. A média dos valores

de (concentração dos padrões utilizados) representa-se por e a média dos

valores de (sinal instrumental) representa-se por , e a posição é

designada por centróide.

O cálculo do coeficiente de correlação, R , pode ser usado como um dos

parâmetros para avaliar uma calibração analítica:

i

i

i

i

i

i

i

yyxx

yyxx

R22

(equação 17)

As curvas de calibração devem apresentar valores de coeficiente de correlação

superiores a 0,995, no entanto quanto mais próximo do valor de 1 (correlação

positiva) ou de -1 (correlação negativa) estiver este coeficiente maior será a

qualidade dos resultados. Para o cálculo do coeficiente de correlação é

necessário ter em conta algumas precauções para que não se cometam erros

de interpretação, pois um bom coeficiente correlação não é sinónimo da

existência de uma relação linear. Assume-se ainda que todos os erros

associados aos valores de são desprezáveis face aos valores de .

O coeficiente de determinação da recta (R2) é dado pelo quadrado do

coeficiente de correlação.


170

Neste método demonstra-se que os coeficientes e b da recta de regressão

de em , são dados por:

N

i

i

N

i

ii

xx

yyxx

b

1

2

1

(equação 18)

E,

xbya (equação 19)

Onde:

Valores individuais de concentração conhecida na solução padrão.

Valores individuais do sinal instrumental.

Média dos valores de x (concentração dos padrões utilizados).

Média dos valores de y (sinal instrumental).

Os coeficientes e b dão uma estimativa verdadeira da função que é limitada

pela dispersão inevitável do método. A precisão da estimativa é quantificada

pelo desvio padrão residual ( ) da recta de regressão:

2

1

2

N

bxay

S

N

i

ii

xy

(equação 20)

Este desvio padrão exprime a dispersão dos valores do sinal em torno da

curva de calibração. Os desvios padrão de declive, , e da ordenada da

origem, , são dados por:


171

N

i

i

xy

b

xx

S

S

1

2 (equação 21)

N

i

i

N

i

i

xya

xxN

x

SS

1

2

1

2

(equação 22)

e podem ser usados para calcular os limites de confiança de e :

btSb (equação 23)

atSa (equação 24)

sendo t o valor da variável de Student para o nível de confiança desejado de

(n-2) graus de liberdade.

Cálculo da concentração

Após ter determinado o declive e a ordenada na origem de uma recta de

regressão, pode-se calcular o valor de correspondente a um valor médio de

. A concentração de uma amostra por interpolação da curva de calibração é

calculada pela seguinte equação:

b

ayx i

i

(equação 25)


172

Desvio Padrão do método (Sm)

Este parâmetro permite ao analista verificar a qualidade do seu trabalho:

b

S

S xy

m (equação 26)

Coeficiente de variação do método (CVm)

Este parâmetro permite comparar diferentes calibrações e métodos analíticos

e é expresso pela equação (em %):

100x

SCV m

m (equação 27)

Anexo 4 – Teste dos valores normalizados

173

Anexo 4 – Teste dos valores normalizados (169)

A distribuição dos valores normalizados tem como objectivo avaliar a dispersão dos valores obtidos na calibração em relação aos valores óptimos, por forma a que não seja superior a um intervalo previamente estabelecido.

A partir da equação da recta obtida na regressão linear, estimou-se o sinal

instrumental (potencial, mV), para as concentrações usadas. Para cada um desses valores, calculou-se a razão entre o valor da diferença de potencial obtida experimentalmente e o valor da diferença de potencial estimada

através da regressão linear.

A diferença de potencial para a qual esta razão se aproxima mais de 1 é denominada V100, ou seja é a diferença de potencial correspondente ao ponto experimental com melhor correlação. Aplicou-se então a equação seguinte

para cada uma das concentrações:

100100

exp

V

V

VosnormalizadValores est

(equação 28)

Em que: Valor de diferença de potencial estimado a uma determinada

concentração.

Valor da diferença de potencial obtida experimentalmente a uma

determinada concentração.

Diferença de potencial correspondente ao ponto experimental com

melhor correlação.

Após o cálculo destes valores, foi traçado um gráfico de valores normalizados versus a logarítmo da concentração.

Para admitir a existência de linearidade, numa determinada gama de concentração, foi definido que os valores normalizados não podiam ter um

desvio superior a 10% isto é, deverão estar compreendidos entre 90 e 110%.

Sempre que existirem valores normalizados que apresentem um desvio superior a 10% devem ser excluídos, reduzindo a gama de concentrações e aplicando-se novamente o teste até que estes requisitos sejam satisfeitos.

Anexo 5 – Análise de resíduos

174

Anexo 5 – Análise de resíduos (169)

Um bom indicador da linearidade é a determinação dos resíduos, a qual se

baseia na avaliação da distância entre os valores de experimentais e os

valores ideais da recta de calibração. Uma representação gráfica destes

valores em função das concentrações deve dar origem a um conjunto de

pontos que se dispõem aleatoriamente em torno do eixo dos . Caso contrário

poderá ser indicativo de que a função que melhor se ajusta ao conjunto de pontos experimentais poderá ser uma curva e não uma recta.

Para admitir a existência de linearidade numa determinada gama de concentração, foi definido que os valores deviam ter um desvio igual ou

inferior a 10%, ou seja, estar compreendidos entre 0 e 10%. Sempre que existirem resíduos que apresentem um desvio superior a 10% devem ser

excluídos, reduzindo a gama de concentrações e aplicando-se novamente o teste até que estes requisitos sejam satisfeitos.

Calcula-se a concentração estimada ( ) com base na equação da recta obtida para o composto em questão:

abxy ,

(equação 29)

Onde:

b Declive da recta.

α Ordenada na origem (correspondente à equação da recta de calibração para o analito).

Valores individuais do logaritmo da concentração da solução padrão.

O resíduo representa o quociente entre os valores experimentais e os valores estimados da diferença de potencial da recta de calibração, em percentagem.

Após o cálculo destes valores, foi traçado um gráfico de resíduos (%) versus logaritmo da concentração.

Anexo 6 – Teste de Mandel

175

Anexo 6 – Teste de Mandel (156, 169)

A linearidade pode ser avaliada estatisticamente, de acordo com a norma ISO 8466-1, pelo teste de Fisher/Snedecor ou teste de Mandel.

A partir do conjunto de resultados obtidos (sinal instrumental versus

concentração), conjunto de pares ordenados, calcula-se a função de calibração

linear (ISO 8466-1) e a função de calibração não-linear (ISO 8466-2), bem

como os respectivos desvios padrão residuais, e , do seguinte modo:

2

1

2

N

yy

S

N

i

ii

xy

(equação 30)

3

1

2

2

2

N

yy

S

N

i

ii

y

(equação 31)

Onde:

N Número de padrões de calibração.

Sinal obtido para um padrão de determinada concentração.

Sinal estimado pela função de calibração linear para um padrão da mesma concentração.

Sinal estimado pela função de calibração polinomial do segundo

grau para um padrão da mesma concentração.

Calcula-se a diferença de variâncias ( ) através da equação:

2

2

22 32 yx

y SNSNDS

(equação 32)

Anexo 6 – Teste de Mandel

176

Obtém-se o valor teste, VT :

2

2

2

yS

DSVT

(equação 33)

O valor teste ( VT ) é comparado com o valor tabelado da distribuição F de

Fisher/Snedecor, para um grau de confiança de 95%.

Critérios de aceitação:

a) Se VT ≤ F: a função de calibração polinomial não conduz a um ajustamento significativamente melhor, e por isso, a função de calibração

é linear.

b) Se VT > F: a função de calibração é não linear e por isso a gama de trabalho deve ser reduzida tanto quanto possível de forma a cumprir a alternativa a). Caso não seja possível, deverá ser utilizada uma função de

calibração não linear.

Anexo 7 – Teste de homogeneidade de variâncias

177

Anexo 7 – Teste de homogeneidade de variâncias (169)

A gama de trabalho pode ser avaliada pelo teste de homogeneidade de

variâncias, quando se utiliza uma metodologia que envolve o traçado de uma curva de calibração.

O primeiro e o último ponto do intervalo de linearidade são analisados em 10 réplicas independentes. Este teste avalia se o intervalo de concentrações do intervalo de linearidade está bem ajustado, por análise das variâncias dos

padrões que delimitam a recta de calibração. O valor da variância de cada padrão foi determinado, de acordo com a equação:

1

10

1

2

2

i

j

j

i

in

yy

S

(equação 34)

Sendo

i

j

ji

in

y

y

10

1

,

(equação 35)

As variâncias foram testadas para examinar se existem diferenças significativas entre elas nos limites do intervalo de linearidade, efectuando o cálculo do valor teste VT:

2

1

2

22

1

2

2 SSseS

SVT

(equação 36)

Ou

2

2

2

12

2

2

1 SSseS

SVT

(equação 37)

O valor VT é comparado com o valor tabelado da distribuição F de

Snedecor/Fisher, de acordo com o número de graus de liberdade envolvidos, para um grau de confiança de 99%.

Anexo 7 – Teste de homogeneidade de variâncias

178

Se VT ≤ F ( ; ; 0,99), a diferença entre as variâncias não é significativa, logo a gama está bem ajustada.

Se VT > F ( ; ; 0,99) a diferença entre as variâncias é significativa o

que implica que a gama de trabalho tem que ser reduzida, até que VT ≤ F.

Nota: , =( n-1 ) e F 0,99 = 5,35 , para n =10

Anexo 8 – Convite às escolas

179



180

Anexo 9 – Questionário de Frequência Alimentar

181

Anexo 9 – Questionário de frequência alimentar


182


183


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185


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187


188


189


190


191


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196

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