Ressonncia Magntica Nuclear multidimensional: fundamentos e parmetros.Marilena Meira

HISTRICO 1946: F. Bloch e E. Purcell (Prmio Nobel de Fsica de 1952). Dcada de 50: Importncia em anlises qumicas. Sinal de RMN refletia o ambiente qumico. Restrita ao 1H. Baixa sensibilidade da tcnica.

HISTRICO 1966: Ernst e Andrew: Tcnica de pulsos e transformada de Fourier (TF). Aumento da sensibilidade da tcnica. Espectros acumulados.

HISTRICO 1991: R. Ernst Prmio Nobel de Qumica de desenvolvimento da RMN multidimensional. 2002: Kurt Wthrich, Prmio Nobel de Qumica. Estruturas tridimensionais de protenas.

RMN multidimensional 3 dimenses: Ernst et al. (1991). No so rotineiros. Tempo da anlise. Macromolculas. Amostra marcada com 13C, 15N, 1H. Sonda tripla: H, C, N.

Maior dimensionalidade Multidimensionais: 2D, 3D, 4D. Maior dimensionalidade requerida quando: Maior nmero de picos Sobreposio de sinais.

Vantagens da RMN multidimensional Aumento da resoluo espectral: Resolve sobreposio de sinais. Automatizao de parmetros como o efeito Overhauser nuclear (NOE), o acoplamento spin-spin.

Maior dimenso resolve sinais sobrepostos

Dimenso direta e indireta 1 dimenso direta. 1 ou mais dimenses indiretas. 2D: 1 dimenso indireta 3D: 2 dimenses indiretas

2D e 3D2D 3D

N N

C H

H

Visualizaes do espectro 3D

Visualizaes do espectro 3DRepresentao 3D Projeo no plano H-CO

Projeo no plano N-CO

Projeo no plano H-N

COSY COSY: Identifica multipletos acoplados

H-8 H-7

cido ferlico

Relayed-COSY (R-COSY)

COSY

R-COSY: Adiciona um segundo acoplamento

DR-COSY

DR-COSY: Adiciona um terceiro acoplamento

TOCSY: Todos os ncleos do sistema de spin

TOCSY TOCSY: Mostra as correlaes dos hidrognios que esto em um mesmo sistema de spin.H-3 H-5 H-10 OH H-16 H2O

H-9

HETCOR, HMQC, HSQC:Experimentos diferentes com os mesmos objetivos: correlacionar os ncleos de carbono com os hidrognios diretamente ligados a eles.

Codena

H-9

C-9

HMQC

1H-15N1H-15N-HSQC

HSQC

correlaciona os ncleos de nitrognio N-15 com os hidrognios diretamente ligados a eles.

HMBCHMBC: correlaciona hidrognios com carbonos atravs de J3 e J2.H-8 H-7 H-9

C-6 C-4 C-3

C-2 C-1

Codena Expanso do espectro HMBC

Experimento 3D: HNCO

N

C

H

Experimento 3D: HNCO

Plano H - CO

Experimento 3D: HNCAProjeo no plano H-CA50

5513C

60

65

Para cada N-H dois CA10 9,5 9,0 8,51H

8,0

7,5

Experimento 3D: HN(CO)CAProjeo no plano H-CA55

6013C

65

10,5 10,0

9,5

9,01H

8,5

8,0

7,5

Para cada NH, 1 CA

Experimento 3D: HNCACBCA = amarelo CB = azul

Experimento 3D: HNCACBPicos CA so negativos (verde) Picos CB so positivos (azul) ou vice-versaUsualmente cada strip deve conter 4 picos: CAi, CBi do mesmo resduo que NH que so mais fortes e Cai-1, Cbi-1 do outro resduo que so mais fracos.

40Em alguns casos os 4 picos no aparecem

55 60 65 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0

Plano HN, CACB

Experimento 3D: HN(CA)CO174 176

178 10,0 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0

N Projeo no plano HN-CO CO H

Experimento 3D: HSQC-TOCSY

1H-13C

HSQCTOCSY

1H-15N

HSQC-TOCSY

Experimento 3D HCCH-TOCSY

Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY NOE: Interao (espacial) de 2 ncleos (5 ngstron). Dipolo-dipolo. 1/r6 < distncia espacial > NOE. Correlaes

15N-NOESY-HSQC

(3D)

15N-NOESY-HSQC1Cada strip contm NOE de um N-H grupo para todos os outros H prximos

(3D)NOE para Halifticos

2 3 4 5 6 7 8 9 10NOE para Hamida e Haromticos

10,0 9,5

9,0

8,5

8,0

7,5

7,0

6,5

6,0

Plano HN - H

13C-NOESY-HSQC

(3D)

13C-NOESY-HSQCCada strip contm NOEs de um grupo CH para todos os outros H prximos

(3D)

A

2,0

4,0 6,0

8,0 10,0

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

13C-HMQC-NOESY

(3D)

O espectro tem maior resoluo que o 13C-NOESY-HSQC (3D) pois a dimenso diretamente detectada a NOESY.

13C-HMQC-NOESY

(3D)

H-H NOESY (2D)

H-H NOESY (2D)Linhas artefatos do solventeNOEs de metilas aparecem isolados

NH e H-aromticos

Regio de H-alifticos muito congestionada

ESPECTRMETRO BRUKER XWIN-NMR verso 2.5 o programa de pulsos e parmetros dos espectrmetros Bruker. Experimentos 3D, seqncia de pulsos e parmetros. Anlise de protenas, DNA e RNA. Atualizada pela BRUKER.

Experimentos disponveis em XWINNMR verso 2.5 BRUKER

ESPECTRMETRO VARIAN VNMRJ o software da Varian; controla o espectrmetro; anlises multidimensionais. Biopack: adicional ao VNMRJ Conjunto de seqncias de pulsos, macros de calibraes e parmetros Protenas, DNA e RNA. atualizado pela Varian.

Alguns experimentos e seqncias de pulsos disponveis em Biopack

Iniciando VNMRJ

Interface VNMRJ (lquido)

Parmetros em RMN Largura espectral Durao dos pulsos Potncia do campo Pr-saturao Nmero de transiente Intervalo entre os pulsos Desacoplamento Gradiente Tempo de aquisio

Seqncia de pulsos (pulse sequence DPS)Quando aplica o pulso, a durao do pulso, o tempo de espera para o prximo pulso, qual a freqncia, em qual eixo aplica o pulso, etc.

Digite dps na linha de comando.

Jogo de parmetros (parameters set)

Para experimentos padres o equipamento j ajusta automaticamente a maioria destes parmetros.

Parmetros para selecionar ncleo e freqncia (tn, dn, dn2, dn3, sfrq, dfrq, dfrq2, dfrq3): Seleciona o ncleo e a freqncia para cada canal. Exemplo: tn=H1; dn= C13. (tof, dof, dof2, dof3 and satfrq): Ajusta a freqncia exata para cada canal.

Parmetros que definem largura espectral (sw, sw1, sw2): Definem a largura espectral (spectral width) ou a faixa de freqncias em Hz que ser registrada no espectro. Sw1: largura espectral para primeira dimenso Sw: largura espectral para segunda dimenso Sw2: largura espectral para terceira dimenso

Parmetros que definem a durao dos pulsos (pw, pwC, pwN or pwx, pwx2): Definem a durao do pulso (pulse width) ou perodo de tempo que o pulso de radiofreqncia aplicado para a amostra.

Parmetros que definem nvel de fora e desacoplador (tpwr, pwClvl, pwNlvl, pwxlvl, pwxlvl2): Definem o nvel de potncia aplicada e se relaciona com o a durao do pulso: quanto maior a potncia menor o pulso. dm, dmm, dmf, dseq: (Decoupling mode). Definem se o desacoplador est ligado (on) ou desligado (off).

Parmetros que controlam prsaturao Pr-saturao o mtodo usado para suprimir o intenso sinal da gua. Aplicao de RF fraco no sinal da gua. satmode: tempo de pulso satfrq: freqncia aplicada satdly: tempo de pr-saturao Satpwr: nvel de fora

Parmetros que controlam a relao sinal/rudo nt: nmero de transiente d1: tempo de espera da reciclagem ou tempo de relaxao durante o qual o sistema retorna ao equilbrio. ss: "steady-state" scans: tempo em que o espectrmetro processa a sequncia de pulsos mas, no coleta qualquer dado.

Parmetros que controlam o tempo de aquisio at: tempo de aquisio np, ni, ni2: nmero de incrementos ou nmero de pontos em t1. Quanto maior ni melhor a resoluo do espectro 2D: Valores tpicos: 128 ou 256 em 2D; 50 ou 60 em 3D.

Inserindo a amostra

Inserindo a amostra

Regulando a temperatura

Cada sonda ou probe tem sua temperatura de calibrao

Sintonizando a sonda (Tuning the probe) A sonda ou probe sintonizada de maneira a encontrar a freqncia correta afim de obter a melhor recepo.Um rdio sintonizado para se obter a melhor recepo. Um rdio tem dois canais de freqncias: AM e FM

Sintonizando a sonda (Tuning the probe) Um espectrmetro para anlise multidimensional deve ter no mnimo quatro canais cada um sintonizado com a freqncia do correspondente ncleo a ser detectado: Hidrognio Deutrio Carbono Nitrognio

Locking Ajuste para manter o campo magntico constante durante o experimento. Usa a freqncia do deutrio do solvente como referencia.

Locking

1. Clique Setup, lock, Lock Scan e desmarque o boto Activate lock. 2. Ajuste lock power e lock gain at poder ver a frequencia do deutrio. 3. Ajuste Z0 e lock Pase at maximizar o the lock amplitude. 4. Marque o boto Activate lock e clique Lock Scan.

Shimming Ajuste para tornar o campo magntico homogneo em todo o comprimento do tubo de amostra.

Shimming

1. 2. 3. 4.

Ajuste Z1, Z2, Z3 (Z1), Z4 (Z2) at Lock amplitude atingir o mximo. Ajuste Z5 e Z6 apenas se o tubo for de qualidade regular. Ajuste do mesmo modo X, Y, XZ, YZ, XY e X2Y2 nesta ordem Volte a otimizar Z1 e Z2.

Adquirindo um espectro 2D usando VNMRJ 1. Adquira um espectro RMN 1H na exp1. 2. Selecione a regio de interesse. 3. Mova o FID para experincia 3, digite: mf(1,3) 4. V para a experincia 3: digite: jexp3. 5. Em Experiments Menu selecione a experincia 2D que voc quer.

Adquirindo um espectro 2D usando VNMRJEm Defaut e Pulse Sequence defina os parmetros para o seu experimento. Para comear a aquisio digite go na linha de comando ou clique no boto Acquire.

Uso do Biopack Biopack contm experimentos adequados para para anlise de protenas, DNA e RNA. Biopack contm seqncias de pulsos, macros de calibraes e parmetros. Necessita calibrao.

Experimentos Biopack

Experimentos Biopack

Instalando Biopack Na linha de comando VNMR digite: loadbiopack. Uma janela abrir com algumas questes. Responda yes. A seguir: Clique 'Main Menu'->'Setup'->'Activate Biopack'->'Create new probefile'

Para rodar um experimento multidimensional:Calibrao do biopack: "Main menu">"Setup"->"Proteins"-"Calibrate". Abre janela com opes de calibrao. Digitao do nome do experimento na linha de comando do VNMR. Exemplo: Para HNCO digite: ghn_co Ajustes de parmetros bsicos: nt, ni, pw, sw.