relatorio final toxico

ENSAIO DE TOXICOLOGIA – Toxicologia geralFACULDADE DE CIÊNCIAS DA UNIVERSIDADE DO PORTO

Inibição do crescimento radicular de alface (Lactuca sativa)por acção tóxica do NaCl

Pedro Pinheiro Nº 080305095

Faculdade de Ciências da Universidade do Porto – Toxicologia GeralJaneiro 2011

RESUMO

Uma das práticas mais recorrentes para analisar a toxicidade das substâncias ou a sua interacção sobre os organismos vivos, são os ensaios de toxicidade. A actividade experimental tem como objectivo avaliar o efeito da toxicidade do cloreto de sódio em diferentes concentrações, sobre a germinação e crescimento de sementes de alface (Lactuca sativa). Para isso, as sementes foram colocadas em placas de Petri com diferentes concentrações da substância em estudo, de maneira a inferir a sua toxicidade na germinação. Depois de 7 dias de incubação, foram contadas as sementes germinadas e medidas as respectivas radículas. Os dados obtidos permitiram aferir que as concentrações mais elevadas de NaCl inibem significativamente o crescimento da radícula da alface, visto que o comprimento médio da radícula varia perante diferentes concentrações. A percentagem de germinação e a percentagem de inibição do crescimento radicular relativamente ao meio de controlo foram calculadas e utilizadas para análise dos resultados. Nesta actividade experimental recorremos a um programa estatístico, SPSS, que permitiu não só validar as conclusões obtidas no trabalho como também calcular a concentração máxima de efeito não observável (NOEC), a concentração mínima de efeito observável (LOEC) e a concentração efectiva mediana (CE50) para o tóxico em estudo.

PALAVRAS-CHAVE:

Toxicidade; Lactuca sativa; Cloreto de sódio; Crescimento radicular; SPSS.

INTRODUÇÃO

A crescente evolução tecnológica e actividade humana têm efeitos adversos sobre o ambiente natural quer pela adição de substâncias químicas resultantes da industrialização quer pelo aumento do uso intensivo dos recursos naturais. A situação actual conduz à necessidade de realizar um maior número de ensaios de toxicidade para as mais variadas substâncias tóxicas, com o objectivo de avaliar e quantificar a capacidade de um tóxico em produzir efeitos adversos nos organismos vivos.Esse foi o objectivo deste protocolo experimental no qual se submeteu um grupo de organismos teste (Lactuca sativa) a diferentes concentrações de um agente nocivo, por um determinado período de tempo. Os resultados obtidos nestes testes são importantes para a análise do impacto ambiental de muitas substâncias usadas em diferentes actividades. Estas substâncias estão muitas vezes em contacto directo com as comunidades animais e com o ambiente, existindo um risco de contaminação muitas vezes desconhecido. Espíndola et al. (2000).Durante o período de germinação e nos primeiros dias de desenvolvimento da plântula ocorrem inúmeros processos fisiológicos que podem ser afectados pela presença de um ou vários agentes nocivos/con-

taminantes. Esta é uma etapa com elevada sensibilidade relativamente a factores adversos externos, nomeadamente a salinidade, pois estes agentes interferem directa ou indirectamente nos mecanismos de desenvolvimento normal da planta. A germinação de sementes é o maior factor limitante do desenvolvimento das plantas, em condições salinas (Al-Kariki et al., 2001). Grande parte das reacções e processos que ocorrem no interior das sementes durante a germinação são comuns à grande maioria das espermatófitas, pelo que a resposta da espécie em estudo, Lactuca sativa, e os resultados obtidos a partir da execução deste ensaio de toxicidade acerca dos efeitos dos compostos nas sementes, são facilmente extrapolados para as plantas em geral.

A salinidade é um dos factores que mais afecta a germinação. Os efeitos mais marcantes da salinidade sobre a planta reflectem-se em alterações no potencial osmótico, na toxicidade iónica e no desequilíbrio da absorção dos nutrientes, provocando a inibição generalizada do seu crescimento.

A alface (Lactuca sativa) por ser um dos vegetais mais consumidos em todo o Mundo é desde logo um

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Figura 1 – Medição da raiz.


importante alvo de estudo com intuito de aferir quais as potenciais contaminações a que estará sujeita. Por apresentar uma elevada sensibilidade a químicos tóxicos e serem de obtenção fácil, são frequentemente utilizadas em testes de toxicidade como este.

A germinação das sementes de alface é relativamente simples e rápida, pelo que o ensaio poder-se-á desenrolar em poucos dias (ensaio de toxicidade aguda). Uma das principais vantagens do uso de Lactuca sativa é o facto de esta possuir um crescimento linear insensível às diferenças de pH e aos potenciais osmóticos (SOUZA, 2005).Para a avaliação dos efeitos fitotóxicos determina-se a inibição (%) quer da germinação, quer do crescimento da radícula, sendo que a inibição do crescimento radicular constitui um indicador sub-letal bastante sensível na avaliação dos efeitos de certos compostos em espécies vegetais.A variabilidade dos resultados em testes toxicológicos depende da qualidade do organismo utilizado e das condições bióticas e abióticas mantidas durante o tempo em que decorre a experiência. Segundo Pelegrini et al. (2006), os testes de toxicidade utilizando vegetais constituem um recurso prático de baixo custo e de sensibilidade razoável, na indicação qualitativa da presença de substâncias tóxicas ou inibidores biológicos como os pesticidas e herbicidas.

METODOLOGIA

O material utilizado neste trabalho consistiu em sementes de alface de origem comercial, pelo que, não foi necessário um tratamento prévio com líxivia a 20% e lavagens com água destilada, para eliminar microrganismos patogénicos.

Prepararam-se 6 soluções intermédias de NaCl a partir de uma solução mãe a 24 g/L da seguinte

forma:

Material de laboratório

• Papel de filtro• Placas de Petri• Tubos de ensaio• Micropipetas (5000 μL)• Pipetas (10 mL)• Provetas• Parafilme• Régua• Tesoura

- Material biológico

• Sementes de alface (de origem comercial)

- Reagentes

• Água destilada• Solução-mãe de NaCl (24 g.L-1)

Nesta actividade experimental foram utilizadas sementes de origem comercial como material biológico, pelo que não foi necessário qualquer tipo de tratamento com lixívia a 20% ou água destilada, geralmente importantes na eliminação de microrganismos patogénicos.Foram preparadas 6 soluções intermédias de NaCl a partir da solução mãe a 24 g.L-1 e recortados círculos de papel de filtro destinados a colocar individualmente em cada uma das placas. Pipetaram-se 2 mL de cada uma das soluções-teste para cada uma das placas tendo o cuidado de deixar o papel homogeneamente humedecido. Cinco sementes foram distribuídas pelas placas de Petri de modo a ficarem a distâncias equivalentes entre si, evitando a interferência com o crescimento individual. As placas foram então fechadas, vedadas com parafilme para evitar a desidrataçao, identificadas e finalmente colocadas durante 7 dias num local protegido da luz à temperatura ambiente. No final desse período, o número de sementes germinadas e o tamanho máximo das raízes de cada semente, tal como indicado na figura 1, foram registados e submetidos a posterior análise e tratamento estatístico com SPSS.

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Solução

Concentração (g/L)

Volume da

solução-mãe (ml)

Volume de água

destilada (ml)

1 0 0 22 0.375 0,03125 1,968753 0.75 0,0625 1,93754 1.5 0,125 1,8755 3 0,25 1,756 6 0,5 1,57 12 1 1


RESULTADOS E DISCUSSÃO

Efeito do cloreto de sódio (NaCl)

Procedeu-se então à análise estatística dos resultados obtidos para procurar melhor compreender quais os efeitos do NaCl no crescimento radicular de sementes de alface

Figura 2 - Scatter plot da percentagem de inibição em função da concentração de NaCl

Figura 3 - Percentagem de inibição em função da concentração de NaCl (95%)

Figura 4 – Percentagem das sementes não germinadas em função da concentração de NaCl (scatter plot).

Figura 5 - Percentagem das sementes não germinadas em função da concentração de NaCl (95%).

Estes gráficos permitem visualizar qual a variação da percentagem de inibição radicular, assim como, das sementes não germinadas com o aumento da concentração de NaCl. Facilmente se detecta uma grande variabilidade nas percentagens, não sabendo especificamente qual a razão, pode-se deduzir que uma das razões prende-se com a variabilidade genética inerente a cada grupo de sementes levando a respostas diferentes à mesma concentração.

Para comprovar que o NaCl é um factor de influência foi posteriormente feita uma análise de variância (anova). Para isso a população em estudo teve de obedecer a três critérios: (1) apresentar distribuição normal; (2) amostragem aleatória e amostras independentes e ainda (3) homogeneidade das variâncias.

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TESTE DE NORMALIDADE

Para avaliar a normalidade de uma distribuição, geral-mente utilizam-se dois testes estatísticos de normali-dade: Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk. Na tabela

seguinte (tabela 1) estão apresentados os testes de nor-malidade para as diferentes concentrações de NaCl.

NaCl (mg.L-1)

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

% inibição 0 ,100 15 ,200* ,990 15 ,999

,375 ,198 15 ,116 ,898 15 ,090

,750 ,180 16 ,177 ,910 16 ,118

1,500 ,121 16 ,200* ,955 16 ,567

3,000 ,172 14 ,200* ,930 14 ,302

6,000 ,158 13 ,200* ,920 13 ,249

12,000 ,134 9 ,200* ,961 9 ,806a. Lilliefors Significance Correction*. This is a lower bound of the true significance.

Tabela 3- Testes de normalidade da percentagem de inibição.

Observando os resultados obtidos através do teste Shapiro-Wilk, verifica-se que a significância (sig ou P-value) é superior a 0,05 (5%) em todas as concentrações.

Ao analisar-se o teste Kolmogorov-Smirnov (com cor-recção de Lillefors), verifica-se que o sig. (P-value) é maior que 0,05 (5%) em todas as concentrações. Não se poderão rejeitar, por isso, as respectivas hipóteses nulas (H0), ou seja, não se rejeita a normalidade das distribuições, assim, todas as subpopulações de resultados apresentam distribuição normal. Cumpre-se assim o primeiro dos pressupostos da análise de variância paramétrica. O segundo requisito está também à partida satisfeito face ao método experimental utilizado.

Ao contrário do observado no teste de normalidade da percentagem de inibição, aqui a significância (sig ou P-value) em ambos os teste é inferior a 0,05 (5%) em to-das as concentrações. Neste caso, pode-se rejeitar a hipótese de uma distribuição normal por parte dos resultados.

Para

comprovar que o NaCl é um factor de influência foi posteriormente feita uma análise de variância (anova). Esta análise procura demonstrar a homogeneidade das variâncias, pelo teste de Levene que nos dirá se estamos perante um caso de homogeneidade ou não.

ANOVA

Neste modelo estatístico são usados a variabilidade como método de comparação das várias médias. A análise da variância a um único factor é chamado de One-Way Anova (admite que todas a observações de um grupo têm a mesma resposta esperada sendo que explica as diferenças por uma variação aleatória).

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Tests of Normality

NaCl (mg.L-1)

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

% sementes não germinadas

0 ,387 15 ,000 ,658 15 ,000

,375 ,365 16 ,000 ,697 16 ,000

,750 ,347 16 ,000 ,645 16 ,000

1,500 ,329 16 ,000 ,718 16 ,000

3,000 ,391 16 ,000 ,700 16 ,000

6,000 ,346 16 ,000 ,701 16 ,000

12,000 ,275 16 ,002 ,769 16 ,001a. Lilliefors Significance Correction

Tabela 2 - Testes de normalidade da percentagem de sementes não germinadas.


Test of Homogeneity of Variances

% inibição

Levene Statistic df1 df2 Sig.

2,592 6 91 ,023Tabela 4 - Teste da homogeneidade de variâncias da percentagem de inibição.

Segundo os dados obtidos pelo One-Way Anova na experiência efectuada podemos concluir que não existe homogeneidade das variâncias, assim pode-se anular a hipótese nula (hipótese de igualdade das variâncias). Isto deve-se ao facto do valor de sig. (P-value) ser bem inferior a 0,05 (0,023). Deste modo não se cumpre um dos pressupostos da análise One-Way Anova , a homogeneidade das variâncias.

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ANOVA

% inibição Sum of Squares df

Mean Square F Sig.

Between Groups 63149,360 6 10524,893 6,322 ,000Within Groups 151486,962 91 1664,692

Total 214636,322 97

Tabela 5 - Comparação das médias com o anova

Como o tamanho da amostra é suficientemente elevado procede-se então a uma análise ANOVA. Segundo a significância obtida por este teste (P-value = 0) confirma-se que não existe igualdade dos valores médios para o nível de significância admitido (5%). A variação total presente nas amostras situa-se nos 214636.322, sendo na sua maioria devida à variabilidade dentro de cada grupo.

Pode então afirmar-se que o NaCl, nas condições testadas, interferiu e inibiu a germinação de sementes de uma forma relevante, do ponto de vista observacional e estatístico. Apesar da variabilidade entre grupos não ser a que mais determina o total de variação neste caso, esta é ainda considerável pelo que

aplicou-se o teste Post-Hoc para perceber quais os grupos que mais diferiam entre si.

TESTE POST-HOC

Os dados obtidos pelo teste post-hoc permitem determinar qual o valor de NOEC (concentração máxima sem efeito observável) e o de LOEC (concentração mínima com efeito observável) por comparação com o controlo (concentração NaCl = 0). O valor de LOEC do NaCl é de 1,5 mg/L. O valor de NOEC encontra-se entre a concentração de 0 mg/L e 1,5 mg/L.

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Multiple Comparisons

Dependent Variable:% inibição

(I) NaCl (mg.L-1) (J) NaCl (mg.L-1)Mean

Difference (I-J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

Tukey HSD 0 ,375 -2,837 14,898 1,000 -47,76 42,09

,750 -1,637 14,664 1,000 -45,85 42,58

1,500 -11,538 14,664 ,986 -55,75 32,68

3,000 -29,173 15,162 ,470 -74,89 16,55

6,000 -51,278* 15,461 ,021 -97,90 -4,66

12,000 -79,975* 17,203 ,000 -131,85 -28,10

,375 0 2,837 14,898 1,000 -42,09 47,76

,750 1,200 14,664 1,000 -43,02 45,42

1,500 -8,701 14,664 ,997 -52,92 35,51

3,000 -26,336 15,162 ,593 -72,05 19,38

6,000 -48,441* 15,461 ,036 -95,06 -1,82

12,000 -77,139* 17,203 ,000 -129,01 -25,27

,750 0 1,637 14,664 1,000 -42,58 45,85

,375 -1,200 14,664 1,000 -45,42 43,02

1,500 -9,901 14,425 ,993 -53,40 33,60

3,000 -27,536 14,932 ,522 -72,56 17,49

6,000 -49,641* 15,235 ,025 -95,58 -3,70

12,000 -78,338* 17,000 ,000 -129,60 -27,08

1,500 0 11,538 14,664 ,986 -32,68 55,75

,375 8,701 14,664 ,997 -35,51 52,92

,750 9,901 14,425 ,993 -33,60 53,40

3,000 -17,635 14,932 ,900 -62,66 27,39

6,000 -39,740 15,235 ,136 -85,68 6,20

12,000 -68,437* 17,000 ,002 -119,70 -17,18

3,000 0 29,173 15,162 ,470 -16,55 74,89

,375 26,336 15,162 ,593 -19,38 72,05

,750 27,536 14,932 ,522 -17,49 72,56

1,500 17,635 14,932 ,900 -27,39 62,66

6,000 -22,105 15,715 ,797 -69,49 25,28

12,000 -50,802 17,432 ,065 -103,36 1,76

6,000 0 51,278* 15,461 ,021 4,66 97,90

,375 48,441* 15,461 ,036 1,82 95,06

,750 49,641* 15,235 ,025 3,70 95,58

1,500 39,740 15,235 ,136 -6,20 85,68

3,000 22,105 15,715 ,797 -25,28 69,49

12,000 -28,698 17,692 ,669 -82,05 24,65

12,000 0 79,975* 17,203 ,000 28,10 131,85

,375 77,139* 17,203 ,000 25,27 129,01

,750 78,338* 17,000 ,000 27,08 129,60

1,500 68,437* 17,000 ,002 17,18 119,70

3,000 50,802 17,432 ,065 -1,76 103,36

6,000 28,698 17,692 ,669 -24,65 82,05

Tamhane 0 ,375 -2,837 16,504 1,000 -58,06 52,39


Tabela 6 - comparação múltipla da análise post-hoc para a percentagem da inibição da radícula

PROBIT

A regressão linear consiste num tipo de regressão no qual se analisam dados independentes e normalmente distribuídos. Contudo a relação dose/efeito não é linear pelo que a sua análise é feita através de um método de regressão não linear ou linearizando-se os dados através de métodos de transformação (transformação log Probit).

Na tabela estão representados os valores estimados (Estimate), desvio padrão (Std. Error), nível de significância (Sig.) e intervalo de confiança (95% Confidence Interval), provenientes da análise de regressão linear dos resultados já transformados como acima descrito.

Data Information

N of Cases

Valid 24Rejected Missing 0

LOG Transform Cannot be Done

0

Number of Responses > Number of Subjects

0

Control Group 4Tabela 7 - Probit informação dos dados da percentagem de sementes não germinadas

Convergence Information

Number of Iterations

Optimal Solution Found

PROBIT 12 YesTabela 8 - Dados de informação convergente.

Parameter Estimates

Parameter Estimate Std. Error Z Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

PROBITa Concentração ,856 ,125 6,864 ,000 ,611 1,100

Intercept -,852 ,081 -10,550 ,000 -,932 -,771

a. PROBIT model: PROBIT(p) = Intercept + BX (Covariates X are transformed using the base 10,000 logarithm.)

Tabela 9 - resultados da análise de regressão linear sobre os resultados transformados (transformação log-probit)

Como o coeficiente de regressão (Concentração, Parameter) possui um valor de significância inferior a 0,05 (5%), ou seja é significativo, rejeita-se a hipótese nula de que não existe correlação linear entre as duas

variáveis que foram transformadas, sendo elas a concentração ou dose e a resposta (percentagem de inibição).

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QUI-QUADRADO

Chi-Square Tests

Chi-Square dfa Sig.

PROBIT Pearson Goodness-of-Fit Test

83,522 22 ,000b

a. Statistics based on individual cases differ from statistics based on aggregated cases.b. Since the significance level is less than ,150, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits

Tabela 10 – Teste do qui-quadrado

A significância do teste de Qui-Quadrado foi de 0, logo inferior aos 5%, o que revela a inadequação da transformação do LogProbit para descrever a relação dose-resposta. Assim é necessário recorrer

a um factor de correcção (heterogeneity factor) para o cálculo dos intervalos de confiança, processado de forma automática pelo programa estatístico SPSS.

Cell Counts and Residuals

Number ConcentraçãoNumber of Subjects

Observed Responses

Expected Responses Residual Probability

PROBIT 1 -,426 10 0 1,120 -1,120 ,112

2 -,426 30 8 3,360 4,640 ,112

3 -,426 30 6 3,360 2,640 ,112

4 -,426 10 0 1,120 -1,120 ,112

5 -,125 10 0 1,689 -1,689 ,169

6 -,125 30 9 5,068 3,932 ,169

7 -,125 30 2 5,068 -3,068 ,169

8 -,125 10 2 1,689 ,311 ,169

9 ,176 10 1 2,417 -1,417 ,242

10 ,176 30 7 7,251 -,251 ,242

11 ,176 30 6 7,251 -1,251 ,242

12 ,176 10 0 2,417 -2,417 ,242

13 ,477 10 0 3,288 -3,288 ,329

14 ,477 30 13 9,863 3,137 ,329

15 ,477 30 11 9,863 1,137 ,329

16 ,477 10 0 3,288 -3,288 ,329

17 ,778 10 0 4,263 -4,263 ,426

18 ,778 30 13 12,789 ,211 ,426

19 ,778 30 15 12,789 2,211 ,426

20 ,778 10 0 4,263 -4,263 ,426

21 1,079 10 1 5,286 -4,286 ,529

22 1,079 30 27 15,858 11,142 ,529

23 1,079 30 21 15,858 5,142 ,529

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24 1,079 10 2 5,286 -3,286 ,529

Tabela 11 - Contagem de células e resíduos

a. A heterogeneity factor is used. b. Logarithm base = 10.

Tabelas 11 – Valores Probit

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PROBITa


A partir dos dados desta tabela podemos saber a CE50 estimada e o seu intervalo de confiança. CE50: 9,892 Intervalo de confiança: 4,616; 88,629 Conclui-se que, através dos valores obtidos a concentração 0,995 mg.L-

1 de NaCl produziu efeito adverso ou tóxico (inibição radicular) em 50% das sementes de alface.

CONCLUSÃO

Após a análise de todos os dados obtidos neste protocolo experimental, conclui-se que as concentrações testadas de NaCl inibiram a germinação das sementes de alface testadas. Verifica-se ainda que em concentrações elevadas este composto produz um efeito tóxico agudo no organismo teste com uma inibição bem acima dos 50% da germinação das sementes.

PROBITa

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