Equipe:

Jéssica FurtadoVictor Teixeira

Juliana Noronha

Prática de Biofísica Espectrometria de Massas

Biotecnologia

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1. Introdução

A espectrometria de massa é uma ferramenta indispensável para a

determinação da massa de moléculas em geral. Nessa técnica, moléculas em

fase gasosa previamente ionizadas são introduzidas em um campo elétrico

e/ou magnético, apresentando diferentes percursos através desse campo em

função de suas razões massa por carga (m/z), propriedade que permite a

dedução de suas massas com altíssima precisão.

Há vários modelos de espectrômetros de massa, cada um com

características próprias. As principais variações estão presentes nas fontes de

ionização e nos analisadores de massa.

As principais fontes de íons são: matrix-assisted laser desorption/ionization

mass spectrometry (MALDI-MS) e electro-spray ionization mass spectrometry

(ESI-MS).

Na fonte do tipo MALDI, as proteínas são misturadas a uma matriz que

absorve luz ultravioleta. A matriz contendo as amostras é bombardeada por

curtos pulsos de laser, absorvendo energia do laser e transferindo,

posteriormente, esta energia para os analitos. Este mecanismo de

transferência de energia da matriz para os analitos ainda não está totalmente

desvendado. Os íons carregados, agora em fase gasosa, são direcionados

diretamente através de um campo elétrico para o analisador de massas.

Na fonte do tipo ESI, macromoléculas em solução são passadas

diretamente para a fase gasosa. A solução contendo os analitos é introduzida

ao espectrômetro através de uma agulha mantida em alto potencial elétrico

(cerca de 3 kV), dispersando a solução em uma fina bruma de microgotas

carregadas. O solvente que envolve as macromoléculas evapora rapidamente

causando uma explosão da gota em reação à densa distribuição de cargas na

superfície das microgotas. Com a evaporação total do solvente as

macromoleculares carregadas são introduzidas ao analisador na fase gasosa.

As cargas acrescentadas durante a passagem pela agulha dão carga adicional

as macromoléculas, ou seja, cada molécula tende a ser carregada por dois ou

mais íons. Dessa forma, cada pico visualizado no espectro é resultado de uma

razão m/z, na qual cada molécula é carreada por um número diferente de

cargas (prótons, no caso de análise em modo positivo).

A espectrometria de massa também pode ser usada para seqüênciar

polipeptídios curtos. Para isso utiliza-se uma técnica chamada de tandem MS

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ou MS/MS. Em análises do tipo MS/MS, os íons formados são induzidos à

fragmentação por alta energia. Os dois principais processos de fragmentação

são a fragmentação induzida por colisão (Collision Induced Fragmentation -

CID) e o decaimento pós-fonte (Post Source Decay - PSD). Em ambas as

análises as amostras são injetadas em um aparelho que é composto

basicamente por dois analisadores de massa em série. O primeiro analisador

de massa é usado para selecionar um íon especifico recebido pela fonte de

ionização. Na fragmentação do tipo CID, este íon é direcionado para a câmara

de colisão, onde a amostra é fragmentada pelo impacto de alta energia com um

gás inerte (o argônio, por exemplo). Na fragmentação por decaimento pós-fonte

(PSD), que é realizada apenas em fonte do tipo MALDI, a matriz contendo o

analito é bombardeada por pulsos de laser de alta energia induzindo a

formação de íons meta-estáveis, ou seja, com alta energia interna que se

fragmentam ao longo do tubo de vôo. O segundo analisador de massa mede,

então, as razões m/z de todos os fragmentos carregados oriundos da câmara

de colisão, gerando um espectro bastante complexo. Na fragmentação de uma

cadeia polipeptídica, a diferença entre picos adjacentes identifica o resíduo

aminoácido que foi perdido em cada caso, revelando então a seqüência do

peptídeo investigado. Os fragmentos obtidos podem ser formados pela

clivagem no lado N-terminal (íons b) ou no lado C-terminal (íons y),

dependendo da localização da carga no fragmento molecular.

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2. Objetivos

A realização desta prática teve como objetivo revisar alguns conceitos como massa média e massa monoisotópica, bem como, realizar o seqüenciamento de uma cadeia polipeptídica através do uso da espectrometria de massas.

3. Parte Experimental

No primeiro experimento, houve a ionização da mioglobina de cavalo para determinação da massa molecular. Foi preparada uma solução de 10 ρMol da proteína de interesse em uma solução com 50 % de acetonitrila e 0,2 % de ácido fórmico. A solução foi centrifugada e infundida no equipamento através da fonte de ionização e seu espectro foi obtido.

No segundo experimento, foi preparada uma solução de 200 fMol de Fibrinopeptídeo B humano em um solução contendo 50 % de acetonitrila e 0,2 % de ácido fórmico. A solução foi centrifugada e infundida no equipamento através da fonte de ionização para que por meio de seu espectro o peptídeo pudesse ser seqüenciado.

4. Resultados e Discussão

Acerca dos dados obtidos foram propostos os seguintes questionamentos:

Com base no espectro obtido no primeiro experimento, calcular a massa molecular da proteína em estudo. Tal valor refere-se à massa média ou a massa monoisotópica? Justificar as respostas e descrever a diferença entre as duas medidas.

Calcular a massa molecular da proteína em estudo.

Com base no espectro obtido através do segundo experimento, determinar a sequência do peptídeo.

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Com base no primeiro espectro obtido (acima), constatamos a obtenção das massas monoisotópicas (relações massa/carga que possuem o mesmo número de prótons, entretanto, divergem nesta relação em virtude da presença de isótopos dos átomos que compõem as moléculas analisadas). A massa média seria a média da relação massa/carga destas massas monoisotópicas.

Para se encontrar a massa da proteína deve-se descobrir, primariamente, a carga desta proteína (n).

Para isto, podemos utilizar a relação:N2 = (M1 – H)/ (M2 – M1)

Utilizando o íon 893,1649 como referência 2 e o íon 846,5631 como referência 1, temos:

N2 = (848,5631 – 1)/ (893,1649 – 848,5631)N2 = +19

Se a relação m/z é igual a 893,1649 e a carga é igual a +19, temos:

m/z = 893,1649m = 893,1649 X 19m = 16970,1331 Da

Com base no segundo espectro obtido, pode-se determinar a sequência da cadeia polipeptídica, utilizando-se as massas monoisótópicas dos

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aminoácidos disponíveis na literatura. Para esta determinação, devemos encontrar a diferença de massa/carga dos picos obtidos e comparar com a dos aminoácidos.

A sequência obtida foi:

N-D-N-E-E-G-F-F-S-A-C.

5. Conclusão

A partir dos resultados observados, conclui-se que é possível determinar a massa molecular de uma proteína através do seu espectro de massa, bem como, obter a sequência de aminoácidos de um peptídeo utilizando a espectrometria de massa como ferramenta.

6. Referências Bibliográficas

a) DOS SANTOS, D.M. Caracterização do veneno de Lycosa erythrognatha e purificação de uma fração com atividade antibacteriana e inseticida. Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil. 2004.

b) PAVIA, D. L., et al. Introduction to Spectrometry. 4ª. Belmont : Brooks/Cole, 2009

c) BIBIANA, M.S. Fundamentos em Análise Proteômica - Espectrometria de Massas Sequencial (PSD-MS). 2004.

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