relatÓrio de estÁgio curricular supervisionado · o estágio curricular foi realizado no período...
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO
Biotecnologias da Reprodução Animal
ALINE CAMPELO CENTENO
Pelotas, 10 de Janeiro de 2005
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO
Biotecnologias da Reprodução Animal
ALINE CAMPELO CENTENO
Relatório apresentado como requisito de complementação curricular para graduação em
Medicina Veterinária na Universidade Federal de Pelotas.
Pelotas, 10 de Janeiro de 2005
IDENTIFICAÇÃO DO ESTÁGIO
Nome da Estagiária: Aline Campelo Centeno
Área do Estagio: Biotecnologias da Reprodução Animal
Local: Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto de Bem, localizado
no Centro de Ciências Agroveterinárias - CAV, da Universidade do Estado de
Santa Catarina - UDESC
Endereço: Av. Luiz de Camões, 2090, Lages-SC
Orientador do Estágio: Alceu Mezzalira
Orientador Acadêmico: Marcio Nunes Corrêa
Período do Estágio: 04/10/04 a 10/12/04
Carga horária: 50 horas semanais
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, não poderia deixar de agradecer a Deus, pelo dom da
vida e por ter me concedido saúde para chegar até aqui.
Aos meus pais, Rita e Valmir, que sempre foram o meu apoio nas horas mais
difíceis e os maiores aplausos nas vitórias, nunca mediram esforços e fizeram
tudo que estava ao alcance para que eu realizasse o meu maior sonho, ser uma
Médica Veterinária. Não podendo esquecer de pedir desculpa pela irritação
constante na época das provas finais e agradecer, do fundo do coração, todo
tempo dedicado a mim, muitas vezes esquecendo dos seus próprios sonhos para
que eu pudesse realizar os meus. Sem dúvida, eles são os melhores pais do
mundo.
Aos meus irmãos, Rogério e Fábio, que também não mediram esforços para
a realização do meu maior sonho.
As minhas cunhadas, Simone e Maria Helena, que sempre estiveram
dispostas a ajudar.
Aos meus amigos e, quase irmãos, Jaque e Cássio, pela grande amizade
que cultivamos durante a faculdade e que, com certeza será eterna. Vocês
moram no meu coração, e se por acaso, a vida profissional nos levar para
caminhos diferentes, podem ter certeza que jamais esquecerei de vocês e quando
forem profissionais respeitados pela competência, que sempre demonstraram,
estarei na primeira fila, aplaudindo os meus “irmãos” em pé.
Aos meus colegas de faculdade, com quais, durante esses cinco anos,
passei mais tempo do que com minha família, obrigada pela companhia e
amizade.
A minha amiga Anna, pela força e estímulo e também pela compreensão de
muitas vezes, não podermos estar juntas, pois os estudos eram mais importantes.
As amigas ”Lu” e “Angel”, que mesmo um pouco distantes, pela tumultuada
vida de universitária, sempre torceram pelo meu sucesso.
Ao meu gatinho, Rafael, pelo carinho e compreensão, por agüentar minha
irritação na época das provas e por me ajudar na realização deste relatório, pois
sem ele, meu relatório não seria o mesmo.
Ao meu orientador do estágio, Alceu, pela atenção dedicada e pela
transmissão de conhecimentos.
Aos meus colegas de estágio, Joana, Fernanda, Kelyn, Dennys, Rodrigo,
Fabiano, Márcio, Diego, Marcos, Tiago e Júnior pelo companheirismo e
ensinamentos repassados.
Ao meu orientador acadêmico, Marcio, que mesmo na correria, sempre
achou tempo para responder as minhas dúvidas e me orientar da melhor maneira
possível.
A minha ex-orientadora, Ligia, pelo apoio e serenidade nas horas em que
precisei.
A minha nova família, Elisio, Cleide e Emely, que me acolheram com muito
amor e carinho. Sem eles eu não teria chegado aqui, eles foram fundamentais na
realização do meu estágio, me dando todo o apoio e carinho de uma família. Os
guardarei pra sempre no meu coração.
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS......................................................................................vii
LISTA DE FIGURAS......................................................................................viii
LISTA DE QUADROS.....................................................................................ix
1) INTRODUÇÃO...........................................................................................01
2) DESENVOLVIMENTO...............................................................................04
2.1) PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES.................................................04
2.1.1) Introdução............................................................................................04
2.1.2) Etapas da produção in vitro de embriões............................................06
2.1.2.1) Coleta dos ovócitos..........................................................................06
2.1.2.2) Maturação in vitro.............................................................................10
2.1.2.3) Separação e capacitação espermática.............................................14
2.1.2.4) Fecundação in vitro...........................................................................18
2.1.2.5) Desnudamento..................................................................................19
2.1.2.6) Cultivo in vitro...................................................................................20
2.1.2.7) Avaliação da clivagem......................................................................22
2.1.2.8) Avaliação embrionária......................................................................23
2.2) OPU (OVUM PICK-UP)..........................................................................27
2.3) VITRIFICAÇÃO......................................................................................30
2.3.1) Protocolo para vitrificação de ovócitos................................................31
2.3.2) Protocolo para vitrificação de embriões..............................................32
2.4) PROCEDIMENTOS DE SEGURANÇA E HIGIENE ADOTADOS
NO LABORATÓRIO DE REPRODUÇÃO ANIMAL PROF. ASSIS ROBERTO
DE BEM.........................................................................................................36
2.5) SUPEROVULAÇÃO EM CAMUNDONGAS..........................................43
2.5.1) Diluição dos hormônios para superovulação em camundongas........44
2.5.2) Coleta de embriões de camundongas................................................45
3.0) COMENTÁRIOS SOBRE O ESTÁGIO..................................................46
4.0) CONCLUSÃO........................................................................................47
5.0) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................48
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Atividades desenvolvidas durante o Estágio Curricular, no
Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De
Bem.....................................................................................03
TABELA 2 - Rotinas de PIV realizadas durante o estágio no Laboratório
de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De
Bem.....................................................................................05
TABELA 3 - Desenvolvimento de embriões produzidos in vitro
depois da maturação de COCs com diferente número de
capas de células da granulosa...........................................11
TABELA 4 - Desenvolvimento de embriões produzidos in vitro, utilizando
dois meios de cultivo...........................................................26
TABELA 5 - Resultados da OPU realizada durante o estágio................29
TABELA 6 - Rotinas de vitrificação acompanhadas durante o
estágio.................................................................................35
TABELA 7 - Resultados do reaquecimento de embriões
vitrificados da rotina 2.........................................................35
TABELA 8 - Embriões de camundongas coletados durante o período de
estágio................................................................................45
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto de
Bem..........................................................................................02
FIGURA 2 - Punção folicular utilizando scalp..............................................08
FIGURA 3 - Tubos prontos para Swim-up...................................................15
FIGURA 4 - Embriões clivados....................................................................23
FIGURA 5 - Aparelho produtor de vácuo utilizado no processo
de vitrificação..........................................................................34
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 - Meio de maturação utilizado no Laboratório de
Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De
Bem..................................................................................11
QUADRO 2 - Meio de migração (TALP Sperm), para Swim-up.............16
QUADRO 3 - Meio de fecundação (TALP Fert)......................................18
QUADRO 4 - Diluição da heparina, adicionada ao meio de fecundação,
para capacitação dos espermatozóides...........................19
QUADRO 5 - Meio utilizado para cultivo de embriões............................22
QUADRO 6 - Protocolo para superovulação em camundongas.............44
1) INTRODUÇÃO
O Estágio Curricular foi realizado no período de 4 de Outubro a 10 de
Dezembro de 2004, junto ao Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis
Roberto de Bem, localizado no Centro de Ciências Agroveterinárias (CAV), da
Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC), na cidade de Lages-SC.
Totalizando 500 horas.
Em 1977, com o reconhecimento do curso de Medicina Veterinária, pelo
Decreto Federal 79.851, começaram a surgir as primeiras iniciativas de pesquisa
e extensão, onde se destacou a atuação do Dr. Assis Roberto De Bem, o qual
iniciou trabalhos pioneiros em coleta e transferência de embriões bovinos no
Estado de Santa Catarina, inicialmente pelo método cirúrgico. Nos anos 90, o
Laboratório de Reprodução Animal passou a adotar uma linha de pesquisa
voltada para a criopreservação. Os trabalhos iniciais realizados com embriões de
camundongos foram extrapolados para bovinos, resultando em trabalhos
pioneiros no país na criopreservação de embriões bovinos pelo método ultra-
rápido. Em 1999, após a adequação do Laboratório, foram iniciados os trabalhos
com produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, obtendo-se o nascimento do
primeiro produto em outubro do mesmo ano. Desde então, a orientação da
pesquisa foi voltada, principalmente, para a criopreservação de ovócitos bovinos
por vitrificação. Resultados ainda mais promissores foram alcançados com a
vitrificação de ovócitos imaturos em OPS (palhetas espichadas), com o
nascimento de Victra, a primeira terneira da América do Sul nascida de embrião
derivado de ovócito imaturo vitrificado. Na seqüência do trabalho, obteve-se o
nascimento de Glacial e Nitro, os primeiros terneiros do mundo obtidos de
embriões vitrificados, derivados de ovócitos imaturos também vitrificados. A figura
1 demonstra a vista externa do Laboratório.
FIGURA 1 – Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto de Bem.
Durante o período de estágio no Laboratório de Reprodução Animal Prof.
Assis Roberto De Bem, foram desenvolvidas atividades como lavagem e
esterilização de materiais utilizados nas rotinas do Laboratório, preparo de meios,
produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, OPU (Ovum pick-up),
criopreservação de embriões bovinos, superovulação em camundongas, coleta de
embriões de camundongas.
As atividades desenvolvidas estão relacionadas na Tabela 1.
TABELA 1 - Atividades desenvolvidas durante o estágio curricular, no Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem Atividade Nº
Lavagem e esterilização de materiais *
Preparo de meios 54
Punções 17
Produção in vitro de embriões 17
OPU 24
Vitrificação de ovócitos 4
Vitrificação de embriões 6
Superovulação em camundongas 2
Coleta de embriões de camundongas 2
TOTAL 126
* Realizadas diariamente.
2) DESENVOLVIMENTO
2.1) PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES (PIV)
2.1.1) Introdução
A Produção in vitro (PIV) de embriões é um sistema alternativo de produção
de embriões, principalmente bovinos, que utiliza ovócitos imaturos coletados de
ovários de doadoras de várias idades e estados fisiológicos.
A PIV é uma biotécnica utilizada alternativamente para acelerar a produção
de animais geneticamente superiores e impedir através, da punção in vivo (OPU),
o descarte precoce de fêmeas geneticamente privilegiadas portadoras de
alterações adquiridas, que impedem a reprodução de forma natural
(GONÇALVES et al., 2002).
Inicialmente a PIV foi utilizada como ferramenta de pesquisa e foi empregada
para recuperar ovócitos de doadoras abatidas. Em bovinos, comparando este
uso, a PIV vem sendo importante para a produção de embriões de doadoras
vivas, como alternativa, ou para integrar com a superovulação e transferência de
embriões, devido à flexibilidade e vantagens que esta oferece (GALLI et al.,
2003).
A PIV também é uma técnica fundamental para o uso de todas as novas
biotécnicas de reprodução animal, pois através dela é possível produzir embriões
pré-sexados e embriões ou zigotos em vários estágios de desenvolvimento, para
o estudo de transgênese e clonagem. Recentemente, também tem sido sugerido
o uso da PIV para avaliar o potencial reprodutivo de touros, avaliando com mais
precisão a fertilidade do reprodutor (EMBRAPA / CENARGEN, 2000).
Segundo DE BEM et al., (1995), podemos resumir algumas aplicações da
PIV que se enquadram a todas as espécies de animais domésticos: obter uma
maior quantidade de embriões a menor custo; obter um grande número de pró-
núcleos para experiências de microinjeção de DNA exógenos, visando a obtenção
de animais transgênicos; estudar alguns mecanismos ainda desconhecidos da
capacitação espermática e da fecundação propriamente dita; testar in vitro a
fertilidade potencial de machos utilizados em programas de melhoramento
genético; determinar novos meios e cultivos celulares para incrementar a
produção de bons embriões; abrir espaço para trabalhos científicos e iniciação de
novos pesquisadores.
As rotinas de PIV realizadas durante o estágio, estão relacionadas na Tabela
2.
TABELA 2 - Rotinas de PIV realizadas durante o período de estágio DESCRIÇÃO Nº
Rotinas realizadas 17
Ovários puncionados 1676
Ovócitos recuperados 8842
Ovócitos selecionados 4931
2.1.2) Etapas da produção in vitro de embriões
A PIV envolve a coleta, maturação e fecundação de ovócitos e ainda, o
cultivo de zigotos e embriões.
2.1.2.1) Coleta dos ovócitos
Os ovócitos para PIV podem ser obtidos de diferentes tipos de doadoras e
também por diferentes métodos, como por exemplo: in vitro através de punção
folicular de ovários provenientes de abatedouro ou in vivo através da OPU ou
laparotomia de flanco, sendo esta pouco utilizada atualmente.
Os ovários de abatedouro, apesar de serem uma importante fonte de
ovócitos para serem utilizados na pesquisa, são geralmente provenientes de
animais sem valor econômico. Entretanto, o desenvolvimento de outros métodos
de aspiração folicular tem permitido a recuperação de ovócitos de animais vivos,
proporcionando a multiplicação de animais de interesse econômico, superando os
índices da Transferência de Embriões (TE) clássica, no que diz respeito à
produção de terneiros/vaca/ano (EMBRAPA/CENARGEN, 2000).
No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem os
ovários eram obtidos, na maioria das rotinas, do Frigorífico Verdi, localizado no
município de Pouso Redondo-SC, distante cerca de 100 Km do Laboratório. Logo
após o abate, os ovários eram colocados em PBS (Phosphated Buffered Saline
Solution) a uma temperatura de 30-35ºC, sendo transportados até o laboratório
em recipiente hermético. Como os ovócitos são sensíveis a choques térmicos, é
importante um cuidadoso monitoramento da temperatura durante os
procedimentos de coleta e transporte (GALLI et al., 2003). O tempo desde o abate
até a chegada no laboratório não deve ser superior a 3 horas.
Ao chegar no laboratório, a temperatura do PBS onde foram transportados
os ovários era medida, em seguida eram retirados os tecidos adjacentes aos
ovários, quando necessário. Após, os ovários eram submetidos a 2 lavagens em
PBS, na mesma temperatura de chegada, a fim de evitar choque térmico. Depois
das lavagens, os ovários eram colocados em um recipiente contendo PBS
aquecido, onde permaneciam até o inicio da punção.
A punção dos folículos, com diâmetro entre 2 e 8 mm, era realizada com
scalps (18 G), utilizando 2,0 a 2,5 de pressão na bomba de vácuo (20-30
mL/minuto), sendo o líquido folicular depositado em tubos cônicos de 15 mL,
esperando de 5 a 10 minutos para sedimentação. Durante o repouso os tubos
eram mantidos em fluxo laminar e sobre placa aquecedora. O tempo de
sedimentação não deve ser superior a 15 minutos, pois assim as sujidades do
líquido folicular irão sedimentar junto com os ovócitos, o que dificultará a busca
dos mesmos.
Marcar o momento do início e final da punção, contar e pesar os ovários. A
figura 2 ilustra o procedimento de punção folicular.
FIGURA 2 – Punção folicular utilizando scalp.
Logo após o tempo de repouso, o sedimento dos tubos era retirado, com o
auxílio de uma pipeta de Pasteur e transferidos para placas de Petri milimetradas,
onde era realizada a busca dos complexos cumulus oophoros (CCOs), sob a
lupa-estereomicroscópica, em fluxo laminar. Os CCOs encontrados eram
colocados em placas de Petri pequenas (30x10mm) contendo líquido folicular
centrifugado, para posterior seleção. Estas placas eram mantidas sob fluxo
laminar e sobre placa aquecedora.
A seleção dos ovócitos era feita em líquido folicular, também sob fluxo
laminar e sobre placa aquecedora. Eram selecionados os ovócitos com tamanho
médio, ovoplasma de coloração marrom homogênea e cobertura de células do
cumulus (compacto em toda a superfície do ovócito), descartando ovócitos muito
grandes, retraídos ou de contorno irregular; com ovoplasma com coloração muito
clara ou apresentando granulação escura e ovócitos com cumulus incompleto,
frouxo ou expandido.
Existem diversas categorias para classificação de ovócitos, as quais variam
segundo os autores e são importantes para fins científicos e controle de
qualidade, tanto da produção quanto da coleta dos CCOs.
Os critérios para seleção dos ovócitos estão descritos a seguir por
LEIBFRIED et al., 1979, adaptado por GONÇALVES et al. (2002):
a) Grau I: Cumulus compacto, contendo mais de três camadas de células.
Citoplasma com granulações finas e homogêneas, de coloração marrom,
preenchendo o interior da zona pelúcida.
b) Grau II: Cumulus compacto parcialmente presente ou com menos de três
camadas celulares rodeando completamente o ovócito. Citoplasma com
granulações distribuídas heterogeneamente.
c) Grau III: Cumulus expandido. Citoplasma contraído, com espaço entre a
membrana celular e a zona pelúcida.
d) Grau IV: Ovócito sem cumulus (desnudo).
Após a seleção os ovócitos eram colocados em TCM Hepes (Meio de
manipulação), para uma rápida lavagem antes de serem colocados na placa de
maturação. Procurar não ultrapassar 20 minutos desde a punção até a colocação
em TCM Hepes.
2.1.2.2) Maturação in vitro
A maturação é essencial no processo de PIV, pois é onde o ovócito adquire
capacidade para ser fecundado posteriormente. Portanto, a maturação dos
ovócitos depende da eficiência do método de coleta e, principalmente, dos meios
e métodos de maturação in vitro.
Quando os ovócitos são retirados de folículos terciários e cultivados in vitro,
a maturação ocorre tanto no núcleo quanto no citoplasma. Somente ovócitos com
maturação nuclear e citoplasmática podem ser fecundados. A primeira
modificação visível do núcleo é a condensação da cromatina e a dissolução da
membrana nuclear, processo conhecido como ruptura da vesícula germinativa
(PALMA et al., 2001).
A maturação do ovócito está ligada a uma série de mudanças estruturais e
bioquímicas que tornam o gameta feminino apto para ser fecundado e ter
desenvolvimento embrionário subseqüente. In vivo, esse processo tem início,
coincidentemente, com o pico pré-ovulatório de LH e, in vitro, com a simples
retirada do ovócito do folículo (GONÇALVES et al., 2002).
O efeito da aspiração dos ovócitos sobre sua capacidade de
desenvolvimento pode variar se os CCOs são obtidos de vacas vivas. Os CCOs
recorrem maiores distâncias no tubo coletor, a presença de ar é maior na
tubulação, em conseqüência o efeito traumático da pressão negativa pode
aumentar e desta forma se observou um número menor de camadas de células
da granulosa (PALMA et al., 1996).
TABELA 3 - Desenvolvimento de embriões produzidos in vitro depois da maturação de COCs com diferente número de camadas
de células da granulosa Nº de capas da Nº de ovócitos Desenvolvimento (%)
granulosa recuperados 2 a 4 céls., D2 embriões, D7 4-6 81 25** 4** > 6 58 32** 18**
** nas mesmas colunas diferem significativamente (p< 0,01) Fonte: PALMA et al.,2001.
Estudos realizados nas décadas de 70 e 80 por LEIBFRIED & FIRST (1979)
e SÜSS & MADISON (1983), indicaram que somente os ovócitos que apresentam
um cumulus completo, possuem capacidade de completar a maturação in vitro e
alcançar o estado de embrião transferível. Mas estudos realizados por PALMA et
al., (2001), demonstraram que mesmo ovócitos com cumulus incompleto podem
desenvolver-se corretamente, chegando a embriões viáveis.
Na maioria dos laboratórios, as condições de maturação utilizadas envolvem
o uso de TCM (Tissue Culture Medium) 199, suplementado com soro fetal bovino
(SFB) e gonadotrofinas (FSH e LH) em 5% de CO2 em ar a 38,5ºC. O quadro 1
demonstra a composição do meio de maturação utilizado no Laboratório.
QUADRO 1 - Meio de maturação Produto Quantidade
5 mL 10 mL TCM bicarbonato 4,5 mL 9,0 mL Sol. Piruvato (Sol. I) 57,5 µl 115 µl Soro de égua em estro (10%) 0,5 mL 1,0 mL LH * 5 µg / mL FSH * 0,01 UI / mL
- * Adicionar uma alíquota de FSH (50 µl) e LH (50 µl) ao meio, pois estas alíquotas já contêm a quantidade necessária de gonadotrofinas.
- Colocar 400 µl do meio em cada poço da placa Nunc. - Manter a placa identificada em estufa por no mínimo 12 horas antes do uso. Fonte: Protocolo para PIV utilizado no Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem.
As chamadas soluções base utilizadas no Laboratório de Reprodução Animal
Prof. Assis Roberto De Bem, eram feitas no próprio Laboratório, pelo Prof. Alceu
Mezzalira, coordenador do Laboratório. As soluções produzidas no Laboratório
devem ter a osmolaridade corrigida, pois esta deve ficar entre 275 e 285 mOsm.
Quando são utilizadas soluções comerciais, não é necessária a correção da
osmolaridade antes do uso, pois esta já está nos valores normais (entre 275 e
285 mOsm). Esses valores são ligeiramente inferiores ao do plasma sangüíneo,
que é de aproximadamente 290 mOsm, entretanto esta condição ligeiramente
hipotônica da solução é para compensar a evaporação que ocorre durante a
incubação. A verificação da osmolaridade é um dos controles de qualidade
imprescindíveis em um laboratório que produz seus próprios meios, a fim de evitar
os erros de pesagem e diluição de seus componentes, bem como para controlar a
qualidade da água utilizada e dos suplementos dos meios (PALMA et al., 2001).
Outro fator que deve ter uma atenção especial é o pH das soluções, este
deve ser mantido em valores similares ao do plasma sangüíneo, por meio do
sistema ácido carbônico/bicarbonato (H2CO3/HCO3). A enzima anidrase
carbônica, presente nas células, catalisa tanto a formação quanto à
decomposição do ácido carbônico. Quanto mais elevada é a concentração de CO2
(normalmente para ovócitos e embriões 5%), maior é a dissolução de CO2 que se
combina com a água, gerando bicarbonato e íons de H+, aumentando a acidez do
meio. Contrariamente a isto, quanto menor é sua concentração, mais CO2 passa
da forma líquida para gasosa, diminuindo a concentração de íons de H+, tornando
a solução alcalina. Por isso, para cada solução e particularmente para cada
concentração na estufa de CO2, existe uma quantidade preestabelecida de
bicarbonato de sódio no meio (PALMA et al., 2001).
Para um efetivo controle visual das variações de pH, se utiliza nos meios o
corante vermelho de fenol. O indicador é vermelho a um pH de 7,4 (ideal);
alaranjado a 7,0; amarelo a 6,5; vermelho escuro a 7,6 e púrpura a 7,8.
O SFB (Soro Fetal Bovino) é utilizado como fonte protéica. O soro junto com
a albumina bovina, é o complemento orgânico mais importante dos meios,
levando a uma perfeita expansão do cumulus e maturação do ovócito. Além do
SFB, pode ser utilizado o soro de vaca em estro (SVE), ambos em concentrações
de 2 a 10%.
A função das gonadotrofinas (FSH e LH) é assegurar níveis semelhantes aos
existentes in vivo, proporcionando condições adequadas para uma perfeita
fecundação e desenvolvimento embrionário (GONÇALVES et al., 2002).
No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem, após a
seleção retirava-se uma placa com meio de maturação da estufa, preparada na
noite anterior ao abate, preferencialmente, ou na manhã do abate, efetuando-se a
transferência dos ovócitos da placa contendo o meio de manipulação, procurando
levar o mínimo possível deste meio, e retornando o mais breve possível para a
estufa, a fim de evitar alteração de pH, o que poderia prejudicar a viabilidade dos
ovócitos.
Após 20-24 horas de incubação em 5% de CO2 em ar e 38,5ºC, os ovócitos
estão completamente maturados, com expulsão do primeiro corpúsculo polar e
estão prontos para a fecundação. Terminado o tempo de maturação, verificava-se
a expansão das células dos CCOs, o que indicava uma correta maturação dos
ovócitos.
2.1.2.3) Separação e capacitação espermática
A capacitação espermática é a condição fisiológica que devem cumprir os
espermatozóides (sptz) para adquirir sua capacidade fecundante in vivo. Isto é
feito através da remoção dos fatores decapacitantes, derivados das vias genitais
masculinas e da interação das células espermáticas com os chamados “fatores
capacitantes”, que se encontram no trato genital feminino. Os mecanismos de
capacitação são poucos conhecidos, entretanto sabe-se que ocorrem
modificações bioquímicas e estruturais que levam a eliminação de componentes
aderidos à membrana do espermatozóide, modificação da composição lipídica da
membrana plasmática, aumento da permeabilidade aos íons de Ca++, modificação
do pH interno e um incremento na permeabilidade e no metabolismo celular.
Todas estas modificações levam a reação acrossômica cuja ativação prematura é
evitada pelos mesmos fatores que regulam a capacitação (PALMA et al., 2001).
Para capacitação in vitro, emprega-se a heparina, a qual desencadeia a
capacitação, finalizando a reação acrossômica e permitindo a penetração do
espermatozóide através da zona pelúcida (PALMA et al., 2001).
A técnica de separação espermática tem a finalidade de remover os
espermatozóides mortos, os crioprotetores, substâncias tóxicas e recuperar a
maioria dos espermatozóides móveis sem produzir alterações espermáticas. Além
disso, deve permitir o controle da concentração e volume final da suspensão
espermática (GONÇALVES et al., 2001).
As técnicas mais utilizadas para a separação dos espermatozóides vivos dos
demais componentes do sêmen e dos crioprotetores são: o Swim-up (técnica de
migração ascendente) e o gradiente Percoll. Ambas técnicas têm os mesmos
objetivos: separar os espermatozóides do líquido seminal e do diluente e obter
espermatozóides com no mínimo 70% de motilidade retilínea progressiva.
No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem, a
técnica utilizada era o Swim-up, desenvolvida por PARRISH et al. (1984), a qual
se baseia na capacidade migratória dos espermatozóides incubados em meio de
cultivo a 39ºC, por seus próprios movimentos.
FIGURA 3 – Tubos prontos para Swim-up.
No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem os
meios para migração (TALP Sperm) e para fecundação (TALP Fert), eram feitos
na noite anterior ou na manhã da fecundação.
QUADRO 2 - Meio de migração (TALP Sperm), para Swim-up Produto Quantidade
5 mL 10 mL TALP Sperm 5,0 mL 10,0 mL BSA fração V 0,03 g 0,06 g Sol. Piruvato 70µl (Sol.II)/250 µl (Sol. I) 140 µl (Sol. II)/500µl(Sol. I) - Acertar o pH em 7,3 – 7,4 com HCl 0,1 N (fica amarelado - se acidificar muito agitar até subir o
pH). - Filtrar (usar seringa limpa e o mesmo filtro do Fert - desprezar as primeiras gotas), colocar em
tubo cônico e armazenar na geladeira. Fonte: Protocolo para PIV utilizado no Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem.
Uma hora antes de completar o período de maturação dos ovócitos, era
aquecido em banho-maria uma quantidade suficiente de tubos cônicos com 1 mL
de TALP Sperm (meio de migração). Em seguida, descongelava-se a palheta de
sêmen em água a 35°C por 30 segundos, secava-se a palheta e vertia-se o
conteúdo em um Eppendorf. Eram depositados 100 µl do sêmen sob o meio de
migração, de forma lenta para evitar a suspensão. Após, os tubos eram colocados
em banho-maria por uma hora a 38,5°C para que os espermatozóides aptos
migrem para a porção superior do meio de migração, enquanto os demais
constituintes do sêmen, juntamente com espermatozóides mortos, permaneçam
no fundo.
Após o período de migração, retirava-se 850 µl do sobrenadante com
pipetador, tendo cuidado para não aspirar a camada inferior, onde encontram-se
os espermatozóides imóveis, substâncias decapacitantes e crioprotetores. O
sobrenadante era depositado em um tubo, previamente aquecido, e centrifugado
por 5 minutos na intensidade 1 (200 rpm). O pellet formado no fundo do tubo era
recolhido, com um volume de meio relativo ao número de tubos utilizados para a
migração (70 µl por tubo). A quantidade de pellet recolhida por tubo é
determinada em função da qualidade do sêmen. Quanto melhor o sêmen, menor
o volume recolhido do pellet por tubo. A quantidade total retirada do pellet era
depositada em Eppendorf previamente aquecido. Do total retirado pegava-se uma
amostra de 5 µl que era colocada em 95 µl de água destilada (diluição 1:20) para
determinar a concentração espermática em câmara de Neubauer. Era feita a
contagem dos espermatozóides presentes em 5 quadrados de cada hemi-câmara,
e somava-se os valores encontrados, dividia-se por 2, e aplicava-se a fórmula,
permitindo o uso de uma dose inseminante, com 1.000.000 células por mL (1x106
sptz/mL). No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem,
este cálculo da dose inseminante só era feito quando o sêmen era utilizado pela
primeira vez, ou em novas partidas do sêmen. Não sendo necessário, portanto, o
cálculo da dose inseminante em cada rotina. O sêmen utilizado era de um touro
da raça Devon, da Fazenda Arapari, localizada no município de Água Doce-SC.
Para a fecundação com este sêmen utilizava-se, uma dose inseminante fixa, de
20 µl.
A fórmula para cálculo da dose inseminante é a seguinte:
C1 x V1 = C2 x V2
C1 (Concentração inicial) = Média de sptz contados / 0,02/ 0,05 ou média/1/1000
C1 = média x 1000/mm3 ou C1 = média x 106 sptz/mL
0,02 = Volume da câmara de Neubauer (0,2 = área x 0,1 = altura)
0,05 = Diluição usada, 1:20; Contando 5 quadrados de cada câmara
V1 = Volume inicial
V2 = Volume final (é o volume do poço da placa de fecundação) = 400 µl
C2 = Concentração final (1 x 106 sptz/mL)
Exemplo:
Nº de sptz contados = 60; Média = 30
C1 = 30/0,02/0,05 = 30 x 103 ou 30 x 105 sptz/mL
C1 x V1 = C2 x V2
30 x 106 x V1 = 1 x 106 x 400
V1 = 400/30
V1 = 13,3 µl é a dose inseminante.
2.1.2.4) Fecundação in vitro
A fecundação resume os eventos iniciados pela penetração do
espermatozóide através das diferentes capas celulares e não celulares que
rodeiam o ovócito e culminam com a formação dos pró-núcleos. É uma reação em
cascata, desencadeada pela passagem do espermatozóide pela zona pelúcida,
penetração na membrana plasmática e seu alojamento no interior do citoplasma
ovocitário (PALMA et al., 2001).
QUADRO 3 - Meio de fecundação (TALP Fert) Produto Quantidade
5 mL 10 mL TALP Fert 5,0 mL 10,0 mL BSA fração V 0,03 g 0,06 g Sol. Piruvato 50 µl (Sol. I) 100 µl (Sol. I) Sol. PHE 50 µl 100 µl Sol. de Heparina * 0,0006 g/mL - Filtrar o meio e preparar os poços na placa de fecundação. - *Adicionar 20 µl de Sol. de Heparina em cada poço da placa. - Manter a placa e o meio restante em estufa por 12 horas antes do uso. Fonte: Protocolo para PIV utilizado no Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem.
Segundo GONÇALVES et al. (2001), a adição de PHE (Penicilamina,
hipotaurina, epinefrina) tem a finalidade de aumentar a atividade espermática e
facilitar a sua penetração, incrementando os índices de fecundação.
Após a maturação, os ovócitos eram transferidos, com o auxílio de uma
ponteira de vidro de espessura média, diretamente para uma placa Nunc (4
poços) com 400 µl de meio de fecundação (TALP Fert) em cada poço,
previamente equilibrado em estufa, e já contendo a heparina, que deve ser
colocada na véspera. O volume de sêmen era depositado em cada poço, ao redor
dos ovócitos, verificando-se a seguir a motilidade dos espermatozóides. A
transferência deve ser realizada no menor tempo possível, retornando para a
estufa logo após a colocação dos espermatozóides junto com os ovócitos. A
incubação dos ovócitos com os espermatozóides deve durar de 18 a 22 horas. O
dia da fecundação era considerado como o dia 0 (D0), da produção in vitro.
QUADRO 4 - Diluição da heparina, adicionada ao meio de fecundação, para capacitação dos espermatozóides
2.1.2.5) Desnudamento
Consiste na remoção parcial das células do cumulus e também de
espermatozóides aderidos a elas. É feito com o auxílio de um agitador de tubos,
Vórtex.
Após a fecundação, colocava-se 400 µl de meio de manipulação (TCM
Hepes) em tubo de ensaio e com micropipeta média as estruturas eram
HEPARINA 3,0 mg de heparina em 5,0 mL de água ultrapura – Filtrar e aliquotar.
transferidas da cada poço da placa de fecundação para o tubo de ensaio
contendo TCM Hepes. Em seguida, os tubos eram submetidos ao vórtex por 1,20
minutos na intensidade 6. Com micropipeta fina, as estruturas eram retiradas dos
tubos de ensaio e depositadas em placa de Petri para busca. Lavava-se o tubo 2
vezes com 400 µl de meio de manipulação de cada vez, com a finalidade de
retirar as estruturas da parede e leva-las para o fundo do tubo, logo após
depositava-se o conteúdo na mesma placa. Os zigotos eram agrupados, em
números semelhantes, sempre procurando fazer grupos com qualidades
diferentes, para que durante o cultivo, os embriões possam ter melhores
condições de desenvolvimento. Com micropipeta fina, os zigotos eram
transferidos para uma placa com TCM Hepes, chamada placa de manutenção,
para uma rápida lavagem, antes de serem transferidos para a placa de cultivo. A
micropipeta para transferência dos zigotos deve ser fina para evitar excesso de
células e também para levar o mínimo possível de meio de manipulação. O dia do
desnudamento era considerado o dia 1 (D1).
2.1.2.6) Cultivo in vitro
É o desenvolvimento de ovócitos fecundados até o estágio de blastocisto (Bl)
(GALLI et al., 2003).
No final da década de 80, foram muitos os meios de cultivo avaliados e
diversas as combinações estudadas para obter adequadas taxas de blastocistos
transferíveis e congeláveis no dia 7 (BERG et al., 1993). Atualmente, o interesse
se volta para dois aspectos básicos: desenvolver meios de cultivo que atendam
as necessidades metabólicas dos embriões durante seu desenvolvimento e que
evitem em sua composição as células somáticas, pois estas, após o quarto dia
de cultivo, começam a competir com os embriões.
Para que se chegasse ao desenvolvimento embrionário dos dias atuais, foi
preciso conhecer as necessidades bioquímicas dos embriões, durante seu
desenvolvimento até o estágio de blastocisto, tanto in vivo quanto in vitro . Foram
estudadas as características bioquímicas do meio, as quais variavam com o
tempo de cultivo, indicando a existência de uma completa interação entre o
metabolismo embrionário e os substratos do meio (PALMA et al., 2001).
É necessário, no cultivo embrionário, o uso de meio simples que suporte a
nutrição celular e o desenvolvimento durante a fase de pré-implantação
embrionária (GONÇALVES et al., 2002).
A fonte de energia dos embriões durante seu desenvolvimento in vitro, se
baseia na fosforilação oxidativa, através da oxidação do piruvato e aminoácidos,
durante os três primeiros dias do desenvolvimento embrionário e da glicose
durante os próximos três a quatro dias. Os aminoácidos (AA) são componentes
essenciais utilizados nos meios de cultivo, que também atuam como fonte de
energia, reguladores de pH e precursores de proteínas e ácidos nucléicos. Seu
uso permitiu o aumento da proporção de embriões viáveis de várias espécies
domésticas (muares, ovina e bovina). A água constitui quase 99% do conteúdo do
meio de cultivo (PALMA et al., 2001).
KIM et al. (1993) relataram que ovócitos bovinos maturados e fecundados
in vitro podem desenvolver até blastocisto em meios simples, quimicamente
definidos e livres de proteínas. Nesse caso, a adição de aminoácidos, fosfatos,
piruvato e lactato é essencial.
No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem, o meio
utilizado para cultivo dos embriões era o SOF.
QUADRO 5- Meio utilizado para cultivo de embriões
Produto Quantidade 5 mL 10 mL
SOF 4,75 mL 9,5 mL Sol. Piruvato 50µl (Sol.II) / 82,5 µl (Sol. I) 100 µl(Sol. II)/165µl(Sol. I) Soro de égua em estro (10%) ou soro fetal bovino (5%)
0,25 mL 0,5 mL
- Filtrar e depositar 400 µl de meio de cultivo sob 400 µl de óleo mineral, manter em estufa por 12 horas antes do uso. Fonte: Protocolo para PIV utilizado no Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem.
2.1.2.7) Avaliação da clivagem
A clivagem inicia-se com uma série de divisões mitóticas, por meio das quais
o zigoto, que possui uma célula com grande volume, se divide em numerosas
células nucleadas de menor tamanho, chamadas blastômeros, até a formação do
blastocisto.
Era feita no dia 2 (D2), seguinte ao dia do desnudamento. As estruturas
eram movimentadas com micropipeta fina, para melhor visualização e os zigotos
não clivados e aglomerados de células do cumulus, aderidos à placa, eram
removidos.
Separava-se um bag (pacote de plástico resistente), o vaporizador era
retirado do banho-maria e conectado ao cilindro de CO2. Acondicionava-se a
placa no bag, inflava-se com gás e selava-se na seladora. Os bags eram
colocados na estufa, para posterior avaliação dos embriões. A taxa de clivagem
considerada aceitável é de 80%, o que indica um correto e satisfatório
desenvolvimento dos embriões.
FIGURA 4- Embriões clivados.
2.1.2.8) Avaliação embrionária
A ativação partenogenética deve ser considerada na avaliação da eficácia da
PIV. Ovócitos bovinos não fecundados podem ser ativados e iniciarem a divisão
celular, porém, esses ovócitos produzem baixos índices de blastocistos. Por isso,
é interessante que cada laboratório tenha conhecimento dos seus índices de
partenogênese, que deve variar, no máximo, entre 1% e 5%.
Para a avaliação da PIV, alguns laboratórios usam, como critério, o estágio
de 2-4 células, todavia, a maioria dos laboratórios utiliza a produção de mórulas e
blastocistos, considerando os índices de produção e qualidade embrionária,
ressaltando-se que o índice de blastocisto expandido é o parâmetro mais
confiável da eficácia de todo o processo de PIV (GONÇALVES et al., 2002).
A avaliação dos embriões era realizada no dia 7 (D7), considerando-se a
fecundação o D0. Os bags eram abertos para observação do número e tipo das
estruturas.
A classificação dos embriões, conforme o estágio de desenvolvimento, era
feita de acordo com as normas da Sociedade Brasileira de Tecnologia de
Embriões (SBTE), onde os embriões são divididos em sete categorias:
Mo – Mórula: apresenta-se como uma massa de células com separação nítida
entre os blastômeros, ocupando quase a totalidade do espaço perivitelino
(E.P.V.).
Mc – Mórula Compacta: os blastômeros estão agregados entre si, formando uma
massa compacta e ocupam 60-70% do E.P.V.
Bi – Blastocisto Inicial: formação da blastocele e ocorre o início da diferenciação
entre trofoblasto e botão embrionário. O embrião ocupa 70-80% do E.P.V.
Bl – Blastocisto: evidente diferenciação entre células do trofoblasto e do botão
embrionário; as células do botão embrionário estão compactas, a blastocele é
proeminente e o embrião ocupa a totalidade do E.P.V.
Bx – Blastocisto expandido: o embrião aumenta 1,5 x o seu diâmetro e a
membrana pelúcida diminui em 1/3 sua espessura.
Bn – Blastocisto em Eclosão: o embrião está iniciando o processo de saída da
membrana pelúcida.
Be – Blastocisto Eclodido: o embrião está completamente livre da membrana
pelúcida; ainda é nítida a presença da blastocele.
Só serão considerados os Blastocistos Iniciais (Bi), Blastocistos (Bl),
Blastocistos Expandidos (Bx), Blastocistos em Eclosão (Bn) e Blastocistos
Eclodidos (Be). Visto que, neste dia os embriões deveriam ter alcançado no
mínimo, o estágio de Blastocisto Inicial, a maioria estando no estágio de
Blastocisto e alguns no estágio de Blastocisto Expandido. Alguns embriões só
alcançarão estes estágios no dia 8 ou 9, sendo estes considerados embriões de
baixa qualidade (GALLI et al., 2003).
A taxa mínima aceitável de embriões, para se ter sucesso com a PIV é de
30%, a partir dos zigotos desnudados.
A avaliação da qualidade dos embriões era feita segundo os parâmetros de
qualidade propostos pela IETS (Sociedade Internacional de Transferência de
embriões) (1998):
Excelente ou Bom: estágio de desenvolvimento correspondente ao
esperado; massa embrionária simétrica esférica com blastômeros individuais que
são uniformes em tamanho, cor e densidade; forma regular, a zona pelúcida (ZP)
não deve apresentar superfície côncava ou plana, deve ser lisa,
preferencialmente intacta, especialmente se o embrião é destinado à exportação;
células extrusadas da massa celular do embrião compreendem menos de 15% do
material celular total.
Regular: estágio de desenvolvimento correspondente ao esperado; forma
regular, ZP intacta ou não, irregularidades moderadas na forma geral da massa
embrionária ou no tamanho, cor e densidade das células individuais; células
extrusadas da massa celular do embrião compreendem mais de 15% do material
total celular; pelo menos 50% das células compõem uma massa embrionária
viável, intacta.
Pobre: estágio de desenvolvimento não corresponde ao esperado;
irregularidades maiores na forma geral da massa embrionária ou no tamanho, cor
e densidade das células individuais; menos de 75% das células degeneradas;
pelo menos 25% das células compõem uma massa embrionária viável, intacta.
Morto ou degenerado: estágio de desenvolvimento não corresponde ao
esperado, embrião em degeneração; massa embrionária de menos de 25% de
todo material presente no interior da ZP; ovócitos ou estruturas unicelulares
degeneradas.
TABELA 4 - Desenvolvimento de embriões produzidos in vitro, utilizando dois meios de cultivo
MEIO DE CULTIVO % CLIVAGEM % EMBRIÕES SOF Lab 70,5% 25,38% SOF Nutricell 58,0% 17,33% TOTAL 64,25% 21,35%
2.2) OPU (OVUM PICK-UP)
É uma técnica de alta flexibilidade e repetibilidade para produção in vitro de
embriões, vindos de qualquer doadora viva. Este método, associado a PIV, é
ainda de fundamental importância para produzir embriões de vacas prenhes, de
vacas que não respondem a superovulação, de animais portadores de patologias
reprodutivas adquiridas, de animais senis e pré-púberes. Esses podem ser
coletados semanalmente, sem causar transtornos para o ciclo estral ou para a
prenhez (EMBRAPA/CENARGEN, 2000).
Essa técnica, conhecida como aspiração folicular guiada por ultra-som, é
feita utilizando-se uma sonda ultra-sonográfica, via vaginal, de maneira a obter
imagem do ovário e dos folículos. Tem-se acoplada à sonda, uma agulha e a esta
uma bomba de vácuo, para aspiração do líquido folicular e juntamente os
ovócitos.
Em terneiras, pela limitação de tamanho, a aspiração dos folículos era
realizada por laparotomia ou laparoscopia, mas devido ao acesso limitado aos
ovários e traumas consideráveis, atualmente foi desenvolvida uma sonda que
permite a aspiração transvaginal em terneiras a partir de 6 meses de idade
(EMBRAPA/CENARGEN, 2000).
Os principais fatores relacionados com o êxito da OPU, podem ser divididos
em duas grandes categorias. A primeira categoria se refere aos aspectos
técnicos: procedimento de aspiração, tipo e diâmetro da agulha, pressão de
aspiração e a possibilidade de influência do bisel da agulha. A segunda categoria
inclui os fatores biológicos, como: estimulação hormonal prévia a punção folicular,
o momento do ciclo estral em que é realizado o procedimento, raça e estado
fisiológico da doadora (PETER BOLS, 2001).
Segundo dados da EMBRAPA/CENARGEN (2000), a média de ovócitos
viáveis obtidos por coleta in vivo de vacas, é de cinco ovócitos viáveis por punção,
o que pode ser duplicado, se os animais receberem uma estimulação hormonal
prévia. As taxas de blastocisto, após a PIV, estão em torno de 30%, com 40-50%
de prenhez. Entretanto, existe uma grande variação na produção de blastocisto,
que pode ser devida não só à doadora, mas também ao sêmen utilizado. Tendo
como base as taxas médias relatadas na literatura, pode-se considerar a
obtenção de 10 ovócitos viáveis por semana (duas punções semanais), com 30%
de blastocisto, o que resultaria em 3 embriões transferíveis por semana. Em um
período de 3 meses, a aspiração folicular associada a PIV, renderia em torno de
36 embriões, valores três vezes maiores que os obtidos com transferência
clássica, no mesmo espaço de tempo.
Nas rotinas de OPU, realizadas na Fazenda Arapari, localizada no município
de Água Doce-SC, era utilizado um ultra-som da marca Pie Medical, com probe
retilínea de 8MHz e agulhas 40 x 10 ou 40 x 8, acoplada a um tubo cônico de 50
mL contendo PBS e heparina (para evitar a formação de coágulos sangüíneos) e
também a uma bomba de vácuo para aspiração do líquido folicular e também dos
ovócitos. A velocidade de aspiração era de 10mL/minuto.
Os CCOs recuperados pela OPU, durante o procedimento, eram mantidos
em PBS com heparina. Após eram filtrados com PBS e colocados em placas de
Petri milimetradas, para busca dos CCOs. Estes eram colocados em placas de
Petri pequenas, contendo TCM Hepes, sobre placa aquecedora. Depois de
terminada a busca, os CCOs eram classificados, conforme descrição anterior. Os
CCOs de grau I e II eram vitrificados. Posteriormente, o processo de vitrificação
será descrito.
TABELA 5- Resultados da OPU realizada durante o estágio
DESCRIÇÃO Nº
Vacas aspiradas* 24
Ovócitos recuperados 138
Ovócitos selecionados 88
Ovócitos vitrificados 83
* As vacas aspiradas eram todas da raça Devon.
Durante as coletas foram utilizadas duas agulhas: 40 x 10, com a qual se
obtinha maior número de ovócitos, porém de baixa qualidade, provavelmente pelo
maior turbilhonamento dos ovócitos; e 40 x 8, com a qual o número de ovócitos
recuperados era menor, entretanto a qualidade destes era melhor.
2.3) VITRIFICAÇÃO
A criopreservação de embriões produzidos in vitro é uma alternativa
importante se o objetivo é obter índices de prenhez semelhantes àqueles obtidos
com embriões produzidos in vivo (CABODEVILA & TERUEL, 2001).
Apesar da grande quantidade de trabalhos realizados, os resultados de
desenvolvimento in vitro e as porcentagens de prenhez após a transferência de
embriões congelados produzidos in vitro são menores que os obtidos com
embriões frescos. Diversos fatores seriam responsáveis por tais resultados, entre
eles características morfológicas, bioquímicas e fisiológicas pertencentes aos
embriões produzidos in vitro, as condições de cultivo, o método de congelamento
utilizado, o crioprotetor, o estado de desenvolvimento e a idade do embrião. Por
sua vez, a suplementação da solução utilizada para o congelamento, com
diferentes açúcares tem sido realizada em busca de uma maior sobrevivência
após o descongelamento. Também se tem suplementado a solução de
estabilização utilizada para o congelamento de blastocistos, com Albumina Sérica
Bovina (BSA), buscando uma maior tolerância das membranas celulares as
baixas temperaturas (CABODEVILA & TERUEL, 2001).
A vitrificação é um processo termodinâmico, no qual um fluido incrementa
sua viscosidade durante o resfriamento, adquirindo propriedades de um sólido. A
diferença do que ocorre durante o congelamento, é que na vitrificação não se
formam cristais e sim o fluido passa do estado líquido para o sólido, formando
uma estrutura semelhante ao vidro, de onde vem a denominação da técnica
(BAUTISTA & KANAGAWA, 1998).
Em condições práticas, a vitrificação consiste na imersão direta da palheta
em nitrogênio líquido, o que representa uma velocidade de resfriamento de,
aproximadamente, 2500ºC/minuto, sendo necessário o emprego de soluções
altamente concentradas com um ou mais crioprotetores permeáveis, os quais
podem ser tóxicos para as células (PALASZ & MAPLETOFT, 1996).
No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem, os
protocolos utilizados para vitrificação de ovócitos e embriões eram os seguintes:
2.3.1) Protocolo para vitrificação de ovócitos:
1) Solução de Vitrificação:
- Poço 1: 400 µl de meio de manutenção + 50 µl EG + 50 µl DMSO - 30 seg;
- Poço 2: 300 µl Sol. de Sacarose + 100 µl EG + 100 µl DMSO - 20 seg;
- Poço 3: 400 µl de meio de manutenção;
- Poço 4: 400 µl de meio de manutenção.
2) Solução Reaquecimento:
- Poço 1: 800 µl meio de manutenção + 400 µl de Sol. de Sacarose
(0,30M);
- Poço 2: 400 µl de meio de manutenção + 200 µl de Sol. de Sacarose
(0,15M) - 5 minutos;
- Poço 3: 400 µl de meio de manutenção + 100 µl de Sol. de Sacarose
(0,30M) - 5 minutos;
- Poço 4: 400 µl de meio de manutenção.
2.3.2) Protocolo para vitrificação de embriões:
1) Protocolos:
• Protocolo 1:
- 400 µl meio de manipulação + 50 µl EG + 50 µl DMSO - 1 min;
- 300 µl meio de manipulação + 100µl EG + 100 µl DMSO -20 seg;
• Protocolo 2:
- 9 mL PBS (Dulbbecos) + 1 mL G - 5 minutos;
- 7 mL PBS (Dulbbecos) + 1 mL G + 2 mL EG - 1 minuto;
- 5 mL PBS (Dulbbecos) + 2,5 mL G + 2,5 mL EG - 30 segundos;
• Protocolo 3:
- Exposição por 2 minutos a uma solução com 1,5 M de EG;
- Exposição por 2 minutos a uma solução com 3,5 M de EG;
- Exposição por 30 segundos a uma solução com 7,0 M de EG;
• Protocolo 4:
- 8 mL PBS (Dulbbecos) + 1mL EG + 1 mL Propanediol – 1 minuto;
- 6mL PBS (Dulbbecos)+ 2mL EG + 2mL Propanediol - 20
segundos;
Durante o período de estágio, o protocolo utilizado para a vitrificação dos
embriões era o Protocolo 1.
2) Envase:
- Envase em OPS (palhetas espichadas) , com grupos de 3 embriões em
cada recipiente;
- Após o envase, as OPS devem ser submersas em nitrogênio líquido e
armazenadas em botijões criogênicos até o momento do reaquecimento.
3) Reaquecimento e Remoção dos Crioprotetores:
- Soluções decrescentes de sacarose (0,3M; 0,15M; 0,0M) permanecendo
5 minutos em cada solução em todos os tratamentos;
- Em seguida, os blastocistos serão cultivados em estufa a 38,5°C, por 72
horas;
- A avaliação da viabilidade será procedida com 12 horas, pelas taxas de
re-expansão e com 48 e 72 horas pelas taxas de eclosão.
• Reaquecimento:
- Poço 1: 400 µl TCM 400 µl Sacarose - Poço 2: 200 µl TCM 200 µl Sacarose - Poço 3: 400 µl TCM 200 µl Sacarose - Poço 4: 400 µl TCM Obs.: Adicionar 250 µl de SEE (Soro de Égua em Estro) na sacarose.
No Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto de Bem, foi
desenvolvido, artesanalmente, um aparelho que produzia vácuo no interior do
recipiente onde era colocado o nitrogênio líquido, baixando mais ainda a
temperatura do nitrogênio líquido, que é de -196ºC, passando para -200ºC.
Acredita-se que a temperatura obtida com o vácuo, era inferior a -200ºC, mas sem
a possibilidade de um termômetro adequado, a medida correta da temperatura
não foi realizada. A figura 5 demonstra o aparelho produtor de vácuo utilizado
para a vitrificação.
FIGURA 5- Aparelho produtor de vácuo utilizado no processo de
vitrificação.
Durante o estágio foram acompanhadas algumas rotinas de vitrificação, as
quais estão descritas na tabela 6. Destas rotinas acompanhadas, apenas em uma
foi realizado o reaquecimento dos embriões vitrificados, sendo os resultados
apresentados na tabela 7.
TABELA 6- Rotinas de vitrificação acompanhadas durante o estágio
ROTINA Nº DE EMBRIÕES Nº DE EMBRIÕES COM VÁCUO SEM VÁCUO
1 19 21
2 21 21
3 10 10
4 9 9
5 12 8
6 3 3
TOTAL 74 72
TABELA 7- Resultados do reaquecimento de embriões vitrificados da rotina 2
POÇO 1 – SEM VÁCUO POÇO 2 – COM VÁCUO
D0 – 21 Bx D0 – 21Bx
D1 – 12Bx e 1Be D1 – 8Bx e 2Be
D2 – 4Bx e 3Be D2 – 7Bx e 1Be
D3* – 4Bx e 2Be D3* – 2Bx
* Os resultados no D3 correspondem somente aos embriões que continuaram seu desenvolvimento normal, chegando aos estágios de Bx ou Be.
2.4) PROCEDIMENTOS DE SEGURANÇA E HIGIENE ADOTADOS NO
LABORATÓRIO DE REPRODUÇÃO ANIMAL PROF. ASSIS ROBERTO DE
BEM
Em um laboratório de Produção in vitro de embriões, é muito importante a
adoção de procedimentos tanto de segurança quanto de higiene, a fim de
alcançar sucesso com a PIV. A seguir serão descritos alguns, dos mais
importantes, procedimentos adotados no Laboratório de Reprodução Animal Prof.
Assis Roberto De Bem.
a) Ao entrar no laboratório (diariamente):
- Verificar a estufa de cultivo (38,5°C e 5% de CO2);
- Verificar desumidificadores do laboratório de PIV, andrológico e
almoxarifado e, se necessário, retirar a água;
- Lavar e umedecer os panos colocados na porta do laboratório;
- Verificar se os botijões de água destilada e bidestilada estão cheios (se
não, produzir água);
- Verificar se o botijão de PBS está cheio (se não preparar mais, usando
água bidestilada);
- Varrer os laboratórios e passar pano úmido com desinfetante *;
- Retirar o pó dos móveis e equipamentos e passar álcool 70° *;
* Duas vezes por semana.
b) Laboratório de PIV:
b.1) Capela de fluxo horizontal:
- Antes de qualquer procedimento efetuar a limpeza da capela com álcool
70°;
- Reunir todos os materiais e meios a serem utilizados no procedimento,
inclusive recipiente para colocação de material usado;
- Ao final de cada procedimento, limpar a capela com álcool 70°;
- Periodicamente, lavar a capela com alvejante.
b.2) Pipetadores:
- Devem ser mantidos sempre inclinados (ponta para baixo);
- Na alteração do volume, movimento lento para evitar desgaste;
- Usar sempre o pipetador com a graduação mais próxima a necessária,
para evitar excesso de desgaste;
- Ao colocar a ponteira, assegurar que está bem conectada, pois
ponteira frouxa pode cair e altera o volume aspirado;
- Na aspiração, soltar o êmbolo lentamente, para não contaminar o
pipetador com meio;
- Não colocar o pipetador com a ponta para cima quando existir meio na
ponteira, para não contaminar o pipetador com meio;
- Ao pipetar, colocar somente a ponta da ponteira no meio;
- Ao pipetar, não encostar a ponta da ponteira no fundo do frasco, pois
dificulta a entrada do meio, comprometendo a exatidão do volume;
- Usar o gatilho do pipetador para retirar a ponteira (retirar com a mão
pode afrouxar a rosca do pipetador);
- Ao final do procedimento, guardar todos os pipetadores na gaveta.
b.3) Capela de fluxo vertical (estereomicroscópio):
- Antes de cada manipulação limpar com álcool 70°;
- Ligar platina e mesa térmica;
- Reunir todo o material a ser utilizado (recipiente para colocação do
material usado, pipetadores, ponteiras, placas, tubos, meios, pescador,
micropipetas).
- No momento da utilização, ligar fonte de luz do estereomicroscópio
(menor intensidade possível para evitar superaquecimento);
- Ao final do procedimento, desligar todos os equipamentos e limpar a
capela com álcool 70°.
b.4) Estufa de cultivo:
- Abrir somente quando necessário;
- Antes de abrir, passar álcool 70° nas mãos;
- A porta não deve ser totalmente aberta, abrir somente o necessário
para colocar ou retirar o material, a fim de evitar contaminação e
alterações de atmosfera e temperatura;
- Ao colocar ou retirar material, não tocar nas prateleiras, para evitar
contaminação;
- Não falar ou respirar diretamente dentro da estufa, para evitar
contaminação.
b.5) Banho-maria:
- Manter sempre a água limpa (lavar periodicamente);
- Usar apenas água destilada;
- Não colocar recipientes que entram em contato com superfícies
contaminadas;
- Manter flutuadores e estantes de tubos dentro da água somente
enquanto estiverem sendo utilizados.
c) Reciclagem do material:
c.1) Lavagem do material:
Obs.: - Não misturar materiais de laboratórios diferentes e materiais
identificados como tóxicos;
- Manter a pia sempre seca, limpa e desobstruída;
- Não deixar o material de molho por mais de dois dias, pois danifica o
material;
- Primeiro, enxaguar em água corrente;
- Segundo, colocar de molho (recipiente específico com água destilada e
detergente especial para louça)
- Após duas horas de molho, efetuar a lavagem de acordo com a
característica de cada material:
• Frascos de vidro siliconado (esfregar com esponja específica,
com cuidado para não riscar a película de silicone);
• Placas Nunc, ponteiras, tubos tipo Eppendorf = colocar no
vibrador ultra-sônico (3 ciclos);
• Pipetas de vidro devem ser conectadas a uma torneira, sendo
mantido um fluxo de água suficiente para remover qualquer
produto de seu interior.
- Esfregar o material com esponja macia ou escovas (cuidado para não
riscar – presença de arame desprotegido);
- Colocar em bandeja com água;
- Enxaguar 10 vezes com água de torneira (remover detergente) e
colocar na bandeja de material limpo;
- Enxaguar 3 vezes com água destilada e deionizada (remover íons) e
colocar em um balde (previamente lavado com água deionizada);
- Eliminar o excesso de água e levar o material para a estufa:
• Estufa de secagem: material plástico (as placas devem ser
colocadas de lado e os tubos e seringas em pé, para que a água
evapore rapidamente);
• Estufa de esterilização: material de vidro ou metal; colocar todo o
material de boca para cima e ligar a estufa até atingir 100°C para
que a água evapore rapidamente.
Obs.: O material não deve ser mantido na estufa de secagem por muito
tempo (pode acumular pó). Na impossibilidade de seu envase, deve-se colocar o
material em saco plástico limpo.
c.2) Envase e esterilização:
Antes de envasar, sempre verificar se o material encontra-se realmente
limpo (a qualquer suspeita colocar novamente para lavar).
•••• Material de vidro:
- Vedar a boca do frasco com papel alumínio (lado fosco para dentro);
- Pipetas: envolver completamente ou apenas as extremidades;
- Colocar na estufa de esterilização: timer = duas horas a 150°C;
- Colocar plaqueta de esterilização na porta da estufa.
•••• Material de plástico, silicone ou borracha:
O responsável pelo procedimento de envase deve se identificar e colocar a
data de envase do material.
•••• Resistente a autoclave: ponteiras, tubos cônicos, seringas, Eppendorfs,
filtros recicláveis, tampas e mangueiras de borracha ou silicone.
- Ponteiras: verificar se realmente estão limpas e colocar em suas
respectivas caixas. O restante deve ser envasado em embalagem apropriada
(plástico e papel);
- Tubos cônicos: verificar se estão limpos, colocar as tampas (sem apertar)
e envasar em embalagem apropriada. Tubos identificados devem receber as
respectivas tampas (punção/punção,...);
- Seringas: verificar se estão limpas, encontrar os respectivos êmbolos e
envasar em embalagem apropriada. Colocar a ponta do êmbolo no mesmo
sentido do canhão da seringa;
- Filtros recicláveis: montar o filtro:
* Primeiro: colocar água bidestilada em uma placa
grande o suficiente para colocar a membrana dentro.
* Segundo: colocar o primeiro disco raiado (raias para
cima), colocar a membrana filtrante molhada, colocar o anel de borracha,
colocar o segundo disco raiado (raias para baixo) e fechar o filtro sem
apertar a rosca. Atenção para a posição do anel de borracha.
* Terceiro: envasar em papel cartão, prendendo com
fita apropriada.
- Eppendorfs: verificar se estão limpos e envasar em embalagem
apropriada;
- Mangueiras de silicone: verificar se estão limpas, enrolar com voltas
pequenas e de forma que fiquem presas (para não romper o papel quando
molhar). Envasar em papel cartão e identificar (diâmetro e comprimento).
- Tampas de silicone ou borracha: verificar se estão limpas e envasar de
acordo com o tamanho: pequenas em embalagem de autoclave, e grandes em
papel cartão.
•••• Não resistente a autoclave: placas, garrafas plásticas, bandejas de
pesagem, tampas plásticas.
Devem ser esterilizadas no forno de microondas:
- 1° ciclo:
- 1° colocar o material aberto dentro do recipiente próprio (dentro do
forno microondas), colocar o recipiente com água (150 mL de água
bidestilada);
- 2° ajustar a potência (4 toques no botão potência);
- 3° ajustar o tempo (7 minutos) e ligar.
- 2° ciclo:
- 1° retirar o recipiente com água;
- 2° ajustar a potência (4 toques no botão potência);
- 3° ajustar o tempo (7 minutos) e ligar.
Envase:
- Após o final do 2° ciclo, ligar o fluxo da capela, colocar a tampa no
recipiente com o material (dentro do forno) e transferí-lo para a capela;
- Dentro da capela, acertar as placas com suas respectivas tampas
(nunca pegar na parte interna das placas ou tampas);
- Envasar em pacotes plásticos usando a seladora (comprimir por alguns
segundos, reduzir levemente a pressão e tracionar o pacote);
- Verificar se não ficaram aberturas;
- Datar, identificar o responsável e guardar.
2.5) SUPEROVULAÇÃO EM CAMUNDONGAS:
Para superovulação em camundongas eram utilizados os hormônios PMSG
(Gonadotrofina Sérica Eqüina), extraído de éguas gestantes, e o hCG (Hormônio
Coriônico Gonadotrófico). Na dose de 10 UI.
O PMSG é um hormônio folículo estimulante, tendo portanto ação
semelhante ao FSH (Hormônio Folículo Estimulante), sendo aplicado no dia 1 do
protocolo de superovulação. O hCG tem função semelhante ao LH (Hormônio
Luteinizante), sendo portanto responsável pela indução da ovulação, sendo
aplicado no dia 3 do protocolo de superovulação.
Na noite, posterior ao dia da aplicação do hCG, as fêmeas, são colocadas
junto com os machos para acasalar. Na manhã seguinte, na primeira hora, as
fêmeas eram observadas, para visualização do tampão vaginal, a presença deste
indicava que houve a cópula. As fêmeas que apresentavam o tampão eram
separadas e, no dia 6 fazia-se a coleta dos embriões.
Os embriões coletados eram colocados em PBS acrescido de soro de égua
em estro (SEE) e mantidos em estufa, preferencialmente a 37°C; no Laboratório
de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto De Bem eles eram mantidos a
38,5°C. O desenvolvimento era observado a cada 24 horas e os embriões que
expandissem bem, até, no máximo 48 horas pós-coleta, eram congelados através
do método de congelamento ultra-rápido.
QUADRO 6 - Protocolo para superovulação em camundongas
SEG TER QUA QUI SEX SAB DOM PMSG G Sab G Dom G 1 G 2 G 3 G 4 G 5
hCG G 4 G 5 G Sab G Dom G 1 G2 G 3
Tampão G 3 G 4 G 5 G Sab G Dom G 1 G 2
Coleta G 1 G 2 G 3 G 4 G 5 G Sab G Dom
2.5.1) Diluição dos hormônios para superovulação em camundongas: - FOLLIGON 1000 UI (PMSG) - Intervet Frasco com 5 mL → 1000 UI 1 mL → 200 UI 1 mL de hormônio + 1 mL PBS = 2 mL → 200 UI 0,2 mL → 20 UI
Aliquotar em Eppendorfs com 500 µl = 5 doses de 10 UI. - CHORULON 5000 UI – Intervet Frasco com 5 mL → 5000 UI 1000 UI → 1 mL de hormônio + 9 mL PBS = 10 mL → 1000 UI 1 mL → 100 UI 0,1 mL → 10 UI Aliquotar em Eppendorfs com 500 µl = 5 doses de 10 UI.
10 UI = 100 µµµµl →→→→ 0,1 mL / fêmea
2.5.2) Coleta de embriões de camundongas:
Para a coleta dos embriões, era necessário o sacrifício da fêmea. Em
seguida, era feita uma incisão na linha peritoneal com bisturi, penetrava-se o
peritônio, o qual era rebatido cranialmente para completa exposição das vísceras.
Localizava-se os ovários e o útero. Juntamente com os ovários, era retirada a
porção do oviduto, de ambos os cornos uterinos. A porção retirada era colocada
em uma gota de PBS, em uma placa de Petri de vidro.
Em um estereomicroscópio, fazia-se a localização do orifício do oviduto, com
uma agulha de insulina injetava-se PBS, e com esta lavagem, os embriões
localizados no oviduto, eram transportados para fora, juntamente com o PBS. Os
embriões eram colocados em PBS acrescido de SEE para cultivo, e mantidos em
estufa a 38,5ºC.
Durante o período de estágio, foram realizadas duas coletas de embriões de
camundongas, mas todos os embriões coletados degeneraram até 48 horas após
a coleta. Isto ocorria, provavelmente, pela elevada temperatura de cultivo, sendo
estes embriões muito sensíveis.
TABELA 8 – Embriões de camundongas coletados durante o período de estágio
COLETAS Nº DE EMBRIÕES FÊMEA 1 FÊMEA 2
1 8 6
2 12 9
TOTAL 20 15
3.0) COMENTÁRIOS SOBRE O ESTÁGIO
Durante o período de estágio no Laboratório de Reprodução Animal Prof.
Assis Roberto De Bem, tive a oportunidade de ter contato com excelentes
pesquisadores, os quais buscam desenvolver técnicas diferenciadas e avançadas
na área de reprodução animal, sempre com o objetivo de obter resultados cada
vez melhores, contribuindo assim, para a evolução e aperfeiçoamento das
biotécnicas de reprodução. Um exemplo disso, foi a criação artesanal de um
aparelho produtor de vácuo, o qual baixava a temperatura do nitrogênio líquido,
para aproximadamente -220ºC, causando menos danos aos ovócitos ou
embriões, durante o processo de vitrificação.
As avançadas biotécnicas desenvolvidas durante o estágio, além de serem
extremamente interessantes, correspondem ao futuro na área de reprodução e
um amplo mercado de trabalho, pois atualmente a procura por estas técnicas está
aumentando cada vez mais, visto que o melhoramento animal tem importância
fundamental para o desenvolvimento da pecuária.
Tenho grande satisfação, pelo contato com estes profissionais com
excelentes perspectivas e, mais ainda, coragem para aprimorar, sempre
buscando o avanço da tecnologia empregada em prol do melhoramento animal.
Talvez o único ponto negativo seja que em época de provas o Laboratório
diminui suas atividades, visto que a maioria dos estagiários faz faculdade.
4.0) CONCLUSÃO
Durante o período de estágio no Laboratório de Reprodução Animal Prof.
Assis Roberto De Bem, todos os meus objetivos e perspectivas foram plenamente
atingidos, aprimorando os meus conhecimentos e contribuindo muito para a
minha formação profissional. Acredito ser, após este período de aprendizado,
capaz de enfrentar o mercado de trabalho e satisfazer as necessidades
constantes desse mercado na área de reprodução animal.
5.0) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BAUTISTA, J. N. & KANAGAWA, H. Current status of vitrification of embryos and oocytes in domestic animals: Ethylene glycol as an emerging cryoprotectant of choice. J Vet. Res. 45, p. 183-191. Citado por CABODEVILA, J. & TERUEL, M. Criopreservación de Embriones Bovinos, p. 149-167. In: PALMA, G. Biotecnologia de la Reprodución, Argentina, 1Ed. INTA Editora, 2001. 701 p. BOLS, P. Punción folicular en la vaca. In: PALMA, G. Biotecnologia de la Reprodución, Argentina, 1Ed. INTA Editora, 2001. p. 185-216. CABODEVILA, J. & TERUEL, M. Criopreservación de Embriones Bovinos. In: PALMA, G. Biotecnologia de la Reprodución, Argentina, 1Ed. INTA Editora, 2001, p. 149-167. DE BEM, A. R.; RUMPF, R.; SOUZA, R. V. de, et al. A biotecnologia animal, pesquisas e resultados no CENARGEN. In: Simpósio Nacional de Biotecnologia da Reprodução de Mamíferos Domésticos, Fortaleza. Anais... v 1, 1995. EMBRAPA/CENARGEN, 2000. Artigos Embrapa. Fecundação in vitro para o melhoramento animal. Publicado em 19 jun. 2000. Disponível em: < http:// www.cenargen.embrapa.br. Acesso em 18 dez. 2004. GALLI, C.; DUCHI, R.; CROTTI, G.; TURINI, P.; PONDERATO, N.; COLLEONI, S.; LAGUTINA, I.; LAZZARI, G. Bovine embryo technologies. Theriogenology, v.59. p.599-616. 2003. GONÇALVES, P. B. D.; VISINTIN, J. A.; OLIVEIRA, M. A. L.; MONTAGNER, M. M.; COSTA, L. F. S. Produção in vitro de Embriões. In: GONÇALVES, P. B. D.; FIGEUIREDO, J. R.; FREITAS, V. J. F. Biotécnicas Aplicadas à Reprodução Animal. São Paulo: Varela Editora e Livaria Ltda. p. 195-226, 2002. KIM, J.; NIWA, K.; LIM, J., et al. Effects of phosphate, energy substrates, and amino acids on development of in vitro matured, in vitro fertilized bovine oocytes in a chemically defined, protein-free culture medium. Biology of Reproduction, v. 48, p. 1320-1325, 1993. In: GONÇALVES, P. B. D.; FIGEUIREDO, J. R.; FREITAS, V. J. F. Biotécnicas Aplicadas à Reprodução Animal. São Paulo: Varela Editora e Livaria Ltda. p. 195-226, 2002.
LEIBFRIED, L.; FIRST, N. L. Characterization of bovine follicular oocytes and their ability to mature in vitro. Journal of Animal Science, v.48, p. 76-86, 1979. In: GONÇALVES, P. B. D.; FIGEUIREDO, J. R.; FREITAS, V. J. F. Biotécnicas Aplicadas à Reprodução Animal. São Paulo: Varela Editora e Livaria Ltda. p. 195-226, 2002. MANUAL DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES. 3 Ed. 1998, 180 p. PALASZ, A. T. & MAPLETOFT, R. J. Criopreservación of mammalian embryos and oocytes. Biotechnologies Advances 14, p. 127-149, 1996. Citado por CABODEVILA, J. & TERUEL, M. Criopreservación de Embriones Bovinos, p. 149-167. In: PALMA, G. Biotecnologia de la Reprodución, Argentina, 1Ed. INTA Editora, 2001. 701 p. PALMA, G. Producción in vitro de embriones. In: PALMA, G. Biotecnologia de la Reprodución, Argentina, 1Ed. INTA Editora, 2001. 701p.
ANEXOS
Anexo 1:
ORGANOGRAMA
Chegada dos ovários
Aspiração dos folículos
Busca dos CCOs
Seleção dos CCOs
MATURAÇÃO (20-24 h)
FECUNDAÇÃO (18-22 h – D0)
DESNUDAMENTO (D1)
CULTIVO (120 h)
Avaliação da clivagem (D2)
Avaliação da taxa de blastocistos (D7)
Vitrificação (D7ou D8)
Colocação das placas em Bags
Anexo 2: MEIOS E SOLUÇÕES PARA PRODUÇÃO IN VITRO:
•••• Meio de manipulação:
Produto
Quantidade
5 mL 10 mL TCM Hepes 4,5 mL 9,0 mL Soro de égua em estro (10%) 0,5 mL 1,0 mL - Manter na geladeira e aquecer antes do uso. →→→→ SOLUÇÕES: •••• LH (estoque):
Produto Quantidade Lutropin V (25mg/5mL) (concentrado: 5000µg/mL) 1 mL H2O (sigma ou milli Q) (ou sol. Fisiológica comprada) 4 mL - Aliquotar em 20 µl = qsp* 2 mL de TCM, ou completar 100 µl e depositar 20 µl por poço. * qsp: quantidade suficiente para. •••• FSH:
Produto Quantidade Foltropin V (400 mg/20mL=20mg/mL) 1 mL H2O (sigma ou milli Q) (ou sol. Fisiológica comprada) 19 mL - Aliquotar em 20 µl = qsp 2 mL de TCM, ou completar 100 µl e depositar 20 µl por poço. •••• Ácido pirúvico – Soluções I e II:
Produto Quantidade Sol. I Sol. II
Ácido Pirúvico (sais de Na) 0,011 g 0,04 g H2O (sigma ou milli Q) 5,0 mL 5,0 mL - Aliquotar em Eppendorf: Sol. I = 57,5 e 100µl e Sol. II = 70 e 100 µl; armazenar no freezer. •••• Solução Lactato – di sulfito:
Produto Quantidade Ácido Lático (sais de Na) (60%) 0,0252 mL Di Sulfito de Na 0,01 g H2O (sigma ou milli Q) 10,0 mL - Ajustar o pH = 4,0.
•••• Solução PHE:
Produto Quantidade Sol. Lactato – di sulfito 9,6 mL Epinefrina / H2O (0,0092g/5mL) 0,24 mL Penicillamina / H2O (0,01209g/10mL) 6,0 mL Hypotaurina / H2O (0,011g/2,5mL) 0,6 mL - Aliquotar em Eppendorf = 100 µl; armazenar no freezer, protegido da luz. •••• Heparina:
Produto Quantidade Heparina 0,003 g H2O (sigma ou milli Q) 5,0 mL - Filtrar e aliquotar em Eppendorf = 80 µl; armazenar no freezer. •••• Solução de Penicilina/Estreptomicina:
Produto Quantidade Estreptomicina sulfato 0,05 g Penicilina G Potássica 0,065 g H2O (sigma ou milli Q) 1,0 mL - Filtrar e aliquotar em Eppendorf = 100 µl; armazenar no freezer. •••• Solução de Gentamicina:
Produto Quantidade Gentamicina 0,05 g H2O (sigma ou milli Q) 1,0 mL - Filtrar e aliquotar em Eppendorf = 100 µl; armazenar no freezer. →→→→ MEIOS BASE: •••• Meio 199 sais de Earle concentrado (10x):
Produto Quantidade Meio 199 (com L-glutamina e sem bicarbonato) qsp 1l H2O 100 mL •••• Meio 199 estoque:
Produto Quantidade Meio 199 concentrado (10x) 10 mL H2O (sigma ou milli Q) 90 mL
•••• TCM Hepes:
Produto Quantidade 50 mL 100 mL
Meio 199 estoque (ou concentrado + H2O sigma)
50 mL (5 + qsp) 100 mL (10 + qsp)
NaHCO3 0,0084 g 0,0168 g Ácido Pirúvico (sais de Na) 0,011 g 0,022 g Hepes (sais de Na) H 7006 0,325 g 0,65 g Sol. Penicilina / Estreptomicina 50,0 µl 100,0 µl - pH = em média: inicial = 8,0 → 3,0 mL HCl 0,5 N = pH 7,25 (ajustar pH entre 7,2 e
7,4). - Osmolaridade = em média: inicial = 296 → 4,0 mL a 6,0 mL H2O milli Q = 283 mOsm
(ajustar entre 275 e 285 mOsm). - Filtrar e armazenar em geladeira por até 30 dias. •••• Solução de Trealose (1,0 M):
Quantidade Produto 5 mL
Trealose 1,892 g TCM Hepes 3,85 mL •••• Solução de Sacarose (1,0 M):
Quantidade Produto 5 mL
Sacarose 1,712 g TCM Hepes 4,175 mL •••• TCM Bicarbonato:
Produto Quantidade 50 mL 10 mL
Meio 199 estoque (ou concentrado + H2O sigma) 50 mL (5 + qsp)
100 mL (10 + qsp)
NaHCO3 0,110 g 0,220 g Hepes H 6147 0,2978 g 0,5957 g Sol. Penicilina/Estreptomicina 50,0 µl 100,0 µl * Ácido Pirúvico (sais de Na) 0,011 g 0,022 g - Adicionar no meio de maturação = alíquota de 57,5 µl Sol. I / 5 mL de meio. - pH = estabilizar na estufa, se necessário, ajustar (pH = 7,2 – 7,4). - Osmolaridade = em média: inicial = 296 → 9,0 mL H2O milli Q = 283 mOsm (ajustar
entre 275 e 285 mOsm). - Filtrar e armazenar em geladeira por até 90 dias.
•••• TALP Sperm (TALP = Tyrode′′′′s Albumin-Lactate-Pyruvate Media): Quantidade Produto
Sais Soluções H2O 100 mL NaCl 0,5752 g KCl 0,0231 g NaHCO3 0,210 g Hepes H 7006 (sais de sódio) ou H 6147 0,2603 / 0,238g Vermelho fenol 0,0005 g 1 mL (0,01g/10 mL Lactato de Sódio xarope 60% 370µl Mg Cl2 6 H2O 0,0223 g 223µl (1g/10mL) Ca Cl2 2H2O * 0,0294 g 294µl (1g/10mL) Na H2 PO4 ** 0,004 g 1 mL (0,04g/10 mL) Sol. Pecicilina / Estreptomicina 100 µl Ácido Pirúvico (sais de Na) * - Podem ser substituídos: * Ca Cl2 anidro (0,029g) ** Na H2 PO4 H2O (0,0046g) - Osmolaridade: em média: inicial = 297→ 3,0 a 6,0 mL H2O milli Q = 280 mOsm
(ajustar entre 275-285 mOsm). - pH: entre 7,2 – 7,4 (corrigir no momento da preparação do meio de migração). - * Adicionar alíquota no momento do uso = 70 µl Sol. I / 5 mL. - Armazenar em geladeira por até 60 dias. •••• TALP Fert:
Quantidade Produto Sais Soluções
H2O qsp 100 mL NaCl 0,665 g KCl 0,0236 g 236 µl NaHCO3 0,2103 g Vermelho fenol 0,0005 g 500 µl Lactato de Sódio xarope 60% 190 µl Mg Cl2 6H2O 0,010 g 100 µl (1g/10mL) Ca Cl2 2H2O 0,0294 g 294 µl (1g/10mL) Na H2 PO4 * 0,004 g 1 mL (0,04g/10mL) Sol. Pecicilina / Estreptomicina 100 µl Ácido Pirúvico (sais de Na) * - Pode ser substituído: * Na H2 PO4 H2O (0,0046 g). - Osmolaridade: em 275-285 mOsm (correção = 296mOsm + 3 mL de H2O = 285
mOsm). - * Adicionar o piruvato no momento do uso (Sol. I). - Armazenar em geladeira por até 60 dias.
•••• SOFFaa: Quantidade Produto
Sais Soluções H2O qsp 90,9 mL (100-9,1 mL) NaCl 0.629 g - KCl 0,0534g 534 µl (0,01/10mL) NaHCO3 0,2106g - Vermelho fenol 0,013g 150 µl (0,01g/10 mL) Lactato de Sódio xarope 60% 47,06µl 60 µl Mg Cl2 6H2O 0,0966g - Ca Cl2 2H2O 0,0248g 262 µl (1,0g/10 mL) K H2 PO4 0,0162g 1 mL (0,162g/10mL) Ácido Pirúvico (sais de Na)* 0,0368g - aa essenciais BME 50x 4,0 mL 3,0 mL aa não essenciais MEM 100x 1,0 mL 1,0 mL Glutamina 0,0146g 1 mL (0,0292/10mL) - * Adicionar na hora do uso na forma de solução (Sol. II). - Estabilizar na estufa por no mínimo duas horas, ajustar o pH em 7,2-7,3. - Osmolaridade em 275-285 mOsm. - Filtrar e armazenar em geladeira. •••• PBS →→→→ QSP 4000 mL:
KCl 0,8 g NaCl 32 g Na2HPO4 4,6 g KH2PO4 0,8 g H2O 4000 mL Penicilina 0,26 g Estreptomicina 0,2 g
•••• PBS MODIFICADO (Dulbbecos):
Componente 1000 mL 500 mL
MgSO4. 7H2O 0,121 g 0,061 g CaCl2 . 2H2O 0,132 g 0,066 g NaCl 8,0 g 4,0 g KCl 0,2 g 0,1 g Na2HPO4 1,15 g 0,575 g KH2PO4 0,2 g 0,1 g Glicose 1,0 g 0,5 g Piruvato Na 0,036 g 0,018 g Penicilina G 100.00 UI 50.000 UI Estreptomicina 0,05 g 0,025 g
- Não misturar MgSO4 e CACl2 com os demais componentes, antes de sua completa dissolução. - pH 7,2 a 7,6. - penicilina G: 0,065 g contém 100.000 UI.