relatório de aulas práticas - microbiologia e imunologia

Diversidade vegetal: uma estratgia para o manejo de pragas em sistemas sustentveis de produo agrcola

1 INTRODUO

Bactrias so microrganismos procariticos e unicelulares, em sua maioria. So invisveis a olho nu, sendo medidas em micrmeros. A relao da rea de superfcie pelo volume para as bactrias bastante alta, existindo uma grande superfcie atravs da qual os nutrientes podem entrar em relao a um pequeno volume de substncia celular a ser alimentada. Esta caracterstica, em parte, responsvel pela alta taxa de metabolismo e crescimento da bactria (PELCZAR JUNIOR, 1996).

As clulas bacterianas contm os quatro componentes fundamentais a qualquer clula: membrana plasmtica, citoplasma, ribossomos, para a traduo do RNAm, e DNA, que constitui um nico cromossomo circular. comum existirem plasmdios, molculas de DNA no ligada ao cromossomo bacteriano, espalhados pelo citoplasma. Plasmdios costumam conter genes para vantagens ambientais, como resistncia a antibiticos, por exemplo. Externamente membrana plasmtica existe uma parede, que em bactrias gram-positivas uma espessa camada de peptidoglicano e cido teicico, e em bactrias gram-negativas uma fina camada de peptidoglicano, sobre o qual se encontra uma camada composta por lipoprotenas, fosfolipdios, protenas e lipopolissacarideos (RIBEIRO & SOARES, 2000).

Apresentam-se nas formas esfricas (cocos), cilndricas (bacilos), curvadas (vbrios), ovais (cocobacilos), espirais flexveis (espiroquetas) ou rgidas (espirilo), ou podem mudar de forma, sendo conhecidas como pleomrficas. Ainda, podem se apresentar em arranjos, um agrupamento ntimo entre as clulas, que permanecem juntas aps a diviso. Cocos podem aparecer como diplococos (pares), estreptococos (cadeias), estafilococos (cachos), ttrades ou sarcinas (cubos). Bacilos aparecem como diplobacilos (pares), paliadas (lado a lado) ou estreptobacilos (cadeias).

As aulas prticas de microbiologia tm como objetivo ensinar ao estudante os princpios e os mtodos utilizados em um laboratrio de microbiologia. Por lidar com uma variedade de bactrias, algumas podendo ser patognicas ao Humano, essencial seguir normas de segurana estabelecidas. As principais normas de segurana no laboratrio de microbiologia so (RIBEIRO & SOARES, 2000; SALVATORI et al, 2013):

- O uso do avental de algodo obrigatrio;

- Limpar e desinfetar a superfcie das bancadas antes e depois de cada aula prtica com lcool etlico a 70%;

- Lavar e sanitizar as mos ao iniciar a anlise, ao sair do laboratrio e sempre que for necessrio;

- Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a anlise;

- No colocar materiais contaminados sobre a bancada. Esses materiais devem ser colocados em recipientes apropriados e esterilizados em autoclave;

- No manuseio de compostos qumicos considerados perigosos, evitar o contato cutneo ou a sua inalao, recorrendo ao uso de luvas, mscara ou culos de proteo;

- Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se no h vazamento de gs ou substncias inflamveis por perto;

- Trabalhe sempre prximo ao fogo, onde criado um meio estril. A utilizao do Bico de Bunsen visa a diminuio de microrganismos no campo de trabalho atravs do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possvel selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e no forma fuligem.

Observao: Evite tossir, espirrar e falar prximo s placas e tubos de cultivo para evitar contaminaes.

- Passe as extremidades abertas dos tubos atravs da chama (flambe os tubos) para evitar contaminaes. Os recipientes devem permanecer abertos o mnimo tempo possvel.

- Flambar alas, agulhas e pinas antes e aps o uso, na chama do bico de Bunsen at que a ala fique vermelha. importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas. A zona neutra uma zona fria e, portanto, no deve ser utilizada para flambagem, j as zonas redutora e oxidante so zonas onde j ocorre a combusto e, portanto, j podem ser usadas para a flambagem. Espere alguns segundos para a ala esfriar.

- No caso de derramamento de algum material infeccioso, cobrir imediatamente a rea com um desinfetante adequado e deixar de 15 a 30 minutos antes da limpeza;

Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial dos microrganismos. Estes meios fornecem os princpios nutritivos indispensveis ao seu crescimento, relacionadas a uma fonte de carbono, de nitrognio, de energia e de sais minerais. Outras condies inerentes ao meio de cultura necessrio ao desenvolvimento so as condies de pH, presso osmtica e grau de umidade (RIBEIRO & SOARES, 2000). Quanto consistncia, estes meios de culturas so classificados como (RIBEIRO & SOARES, 2000; PUC Gois):

- Meio Lquido: nutrientes esto dissolvidos em uma soluo aquosa. Utilizado para o crescimento indiscriminado com turvao do meio;

- Meio Slido: possui nutrientes e em torno de 15g de gar/1.000ml de gua destilada. Aplicao no crescimento de colnias isoladas, muito utilizado para culturas puras.

- Meio Semi-slido: possui na sua composio, alm dos nutrientes, gar (polissacardeo proveniente de algas marinhas), em pequena porcentagem, possibilitando a mobilidade bacteriana.

Quanto funo, so classificados (RIBEIRO & SOARES, 2000; JUNIOR, 2007):

- Meio de Enriquecimento: quando proporcionam nutrientes adequados que estimulam o crescimento de microrganismos exigentes, presentes usualmente em baixos nmeros ou de crescimento lento. Alm das fontes nutritivas usuais, podem possuir sangue, soro ou extratos teciduais.

- Meio Diferencial: quando contm substncias que permitem estabelecer diferenas entre microrganismos muito parecidos, tais como meio de Teague ou Eosina Azul de Metileno (diferencial para coliformes), e gar Baird-Parker para isolamento e diferenciao de cocos Gram-positivos (slidos).

- Meio Seletivo: os que contm substncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos, mas permitem o crescimento de outros. A maioria deles tambm diferencial, permitindo diferenciar as colnias (slidos) dos microrganismos.

- Meio de manuteno: utilizados para conservao de microrganismos no laboratrio. A manuteno adequada para a viabilidade de uma cultura pode exigir um meio diferente daquele recomendado para o seu crescimento timo, pois esse rpido crescimento pode estar associado com uma rpida porte celular.

Alm dos componentes presentes no meio, outros fatores, como a temperatura e tenso de oxignio, interferem no seu desenvolvimento. Aps a inoculao, as bactrias devero ser incubadas em ambiente com tenso de oxignio e temperatura ideal para o seu desenvolvimento (RIBEIRO & SOARES, 2000), que so exigidos de forma diferentes em cada espcie de bactria. As bactrias podem ser, quanto a temperatura: Psicrfilas (temperaturas relativamente baixas para o desenvolvimento, entre 0 e 30C, e temperatura tima de 15 a 20C. Elas geram pouca energia trmica ao trabalhar), Mesfilas (faixa de temperatura de desenvolvimento de 15 a 45 C. A temperatura tima entre 25 e 35 C) ou Termfilas (condies de calor para o desenvolvimento entre 30 e 80C. A faixa de temperatura ideal para seu de 50 a 60C). Quanto a exigncia de oxignio, podem ser (FOX, 2010):

- Bactrias aerbicas obrigatrias requerem a presena de oxignio para poderem crescer; estas no realizam fermentao.

- Bactrias anaerbicas obrigatrias no efetuam a fosforilao oxidativa. Alm disso, elas so mortas pelo oxignio.

- Bactrias anaerbicas aerotolerantes respiram anaerobicamente, mas que podem sobreviver na presena de oxignio.

- Bactrias anaerbicas facultativas podem realizar tanto fermentao quanto respirao. Na presena de oxignio, a respirao anaerbica geralmente desligada e esses microrganismos respiram aerobicamente.

- Bactrias microaerfilas crescem bem em baixas concentraes de oxignio, mas so mortas em altas concentraes.

Na maioria dos casos, o microorganismo a ser isolado faz parte de uma populao mista. O Isolamento de bactrias consiste na obteno de uma cultura pura, para que seja possvel fazer a sua identificao. A simples observao de caracteres morfolgicos no suficiente para a identificao e classificao dos microrganismos, devendo tambm ser analisado caractersticas bioqumicas, sorolgicas, de patogenicidade, etc (CARVALHO, 2012). Uma das maneiras de se obter uma cultura pura consiste no emprego da tcnica de semeadura/inoculao, em que so obtidas colnias isoladas de microrganismos. As colnias so caracterizadas por suas caractersticas morfolgicas e, dependendo do objetivo, so cultivadas separadamente em meios slidos ou lquidos para a posterior identificao. A tcnica de semeadura tambm pode ser aplicada em determinados estudos com o objetivo apenas de cultivo ou para quantificar a populao microbiana (UFMG). O material colocado no meio de cultura chamado de inculo. O processo de inoculao pode ser feito mediante tcnicas (PELCZAR JUNIOR, 1996; RIBEIRO & SOARES, 2000; UFMG; CARVALHO):

- Cultivo em tubos contendo meios de cultura lquidos: Tal procedimento bastante til, pois possibilita a rpida e elevada multiplicao de microrganismos. A inoculao de microrganismos em meios de cultura lquidos pode ser feita com o auxlio de uma ala de platina previamente flambada, caso os microrganismos sejam provenientes de meios slidos ou semi-slidos, ou atravs de uma pipeta, normalmente quando se est fazendo o repique de uma cultura que est armazenada em meio lquido (FIGURA).

- Cultivo em tubos ou placas contendo meios de cultura slidos: Estriamento - Tcnica utilizada para obteno de crescimento bacteriano e/ou para a observao de propriedades bioqumicas da bactria. A semeadura , geralmente, feita da base do meio para a extremidade do mesmo, fazendo estrias na superfcie do gar, utilizando uma ala de platina.

Em Picada - Esta tcnica de semeadura utilizada para qu se possa observar funes metablicas de algumas bactrias que so submetidas a anlise microbiolgica. A inoculao dever ter a profundidade de 2/3 do meio e ser uma nica picada (Figura 1).

Figura 1 - No tubo esquerda, observamos o momento da picada que realizada com o auxlio de uma agulha de semeadura e direita observamos a picada propriamente dita.

- Cultivo em placas contendo meios de cultura slidos: tcnica do esgotamento em placas de gar: consiste em espalhar o material com o auxlio de uma ala bacteriolgica, fazendo estrias sucessivas at o esgotamento do material, de modo a obter-se um perfeito isolamento das bactrias existentes na amostra, que aps a incubao, formaro as colnias isoladas sobre a superfcie do gar. Primeiramente, deve-se flambar a ala e introduzi-la no meio contendo as bactrias. Fazer ento o estriamento na superfcie do gar em dois ou trs setores, sem recarregar a ala, de maneira a obter quantidades progressivamente menores do material.Esta tcnica usada fundamentalmente para se obter (isolar) culturas puras de amostras que contenham microbiota mista, sendo igualmente til para o estudo da morfologia colonial. O sucesso da semeadura est em fazer um grande numero de estrias, no perfurar o meio e pegar pequena quantidade de material para semear, caso contrrio, pode haver a justaposio das colnias e por isso no se pode isol-las.

Figura 2 Tcnica de esgotamento em placa.

Uma vez que as bactrias tenham sido isoladas em culturas puras, necessrio manter as culturas vivas por um perodo de tempo com o objetivo de estud-las. Se a cultura mantida por somente um curto perodo (dias a meses), ela pode ser armazenada temperatura de refrigeradores (4 a 10C). Para armazenar por um longo perodo, as culturas so mantidas em nitrognio liquido a -196C ou em freezer a -70 a -120C, ou so congeladas e ento desidratadas e fechadas a vcuo (liofilizao), mantendo a viabilidade das culturas por muitos anos (PELCZAR JUNIOR, 1996). Nesses casos o microrganismo fica apenas inibido, e no destrudo.

A bacterioscopia um mtodo utilizado para a visualizao microscopia das bactrias, a partir de diferentes meios. Consiste na preparao de esfregaos de materiais em lmina, seguida de uma colorao especfica e aps visualizao ao microscpio (RIBEIRO & SOARES, 2000).

- Preparo do esfregao a partir de meio slido: com uma lmina limpa, secar e flambar rapidamente ela na chama do bico de Bunsen; colocar na lmina uma gota de soluo salina fisiolgica ou gua destilada; flambar a ala bacteriolgica, deixar esfriar prximo a chama, abrir a placa com a cultura teste e tocar a colnia escolhida para retirada da amostra. Esfrega-se o material com movimentos de rotao da ala bacteriolgica, para se obter um esfregao de forma oval, bem fino e uniforme; deixar secar nas proximidades da chama; e fixar o esfregao passando a lmina (lado oposto ao esfregao) 5 vezes na chama do bico de Bunsen (rapidamente).

- Preparo do esfregao a partir de meio lquido: Usando ala estril, colocar duas a trs alquotas de cultura bacteriana preparada em meio lquido sobre superfcie da lmina de microscopia. Deixar secar nas proximidades da chama e realizar a fixao como descrito no item anterior.

O mecanismo da colorao de Gram se refere composio da parede celular, sendo que as Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e cido teicico, e as Gram-negativas, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoprotenas, fosfolipdeos, protenas e lipopolissacardeos. Durante o processo de colorao, o tratamento com lcool-acetona extrai os lipdeos, da resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactrias Gram-negativas. Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CVI) pode ser retirado e as bactrias Gram-negativas so descoradas. A parede celular das bactrias gram-positivas, em virtude de sua composio diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com lcool-acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade reduzida e o complexo CVI no pode ser extrado (RIBEIRO & SOARES, 2000).

2 METODOLOGIA

2.1 Coleta Ambiental

Os tubos e placas que seriam utilizados para inoculao foram identificados com um cdigo exclusivo do grupo, para que ficassem caracterizados. Foram escolhidos os locais para coletar amostras de bactrias, tendo cuidado para retirar o swab apenas no momento da coleta. O material, primeiramente, foi inoculado em tubo de ensaio com o meio lquido, e depois em placas com meio slido de Agar BHI, e ento ficaram 24h em estufa 35C (Quadro 1).

CD. DO GRUPO/COLETA

LOCAL DE COLETA

DATA DE

COLETA

MEIO DE CULTURA

FORMA DE

INCUBAO

#A

Bolsa

24/09

BHI

Estufa, 35C

#B

Mq. de caf

24/09

BHI

Estufa, 35C

#C

Balco Sto. Gro

24/09

BHI

Estufa, 35C

#D

Unhas

24/09

BHI

Estufa, 35C

Quadro 1 Planilha apresentando os dados da coleta ambiental de bactrias.

Descrio completa da composio do AGAR BHI e para que utilizado.

Na aula seguinte, as placas com cultivo mistos foram utilizadas para transferir uma alquota de cada colnia selecionada (Figura 3) para placas de Agar BHI, atravs do mtodo de esgotamento por estrias e incubar em estufa por 24hs/ 35oC.

#C1 = colnia alaranjada

#C2 = colnia alaranjada

#C3 = colnia branca, mucide

#D1 = colnia branca, mucide

Figura 3 colnias da placa #C (balco da lancheria Santo Gro do Unilasalle) selecionadas para isolamento.

2.1.1 Colorao de GRAM

Consiste no tratamento sucessivo de um esfregao bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina bsica. Essa tcnica permite a separao de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinao da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. A tcnica tem importncia clnica uma vez que muitas das bactrias associadas a infeces so prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaos de pus ou de fluidos orgnicos. Essa informao permite ao clnico monitorar a infeco at que dados de cultura estejam disponveis. possvel a anlise de vrios esfregaos por lmina, o que facilita a comparao de espcimes clnicos. As lminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentao. Quando examinadas ao microscpio tico, usando objetiva de imerso, as bactrias gram-negativas aparecem coradas de rosa e as gram-positivas de roxo (violeta azulado).

O mtodo consiste em cobrir o esfregao com cristal violeta, aguardar 1 minuto e desprezar o corante na pia; Cobrir o esfregao com lugol, aguardar 1 minuto e 30 segundos e desprezar o corante na pia; Inclinar a lmina e gotejar lcool/acetona (3:1) at que no haja mais desprendimento de corante (trs a cinco gotas so suficientes). Lavar a lmina rapidamente com gua corrente com intensidade fraca; Cobrir o esfregao com fucsina, aguardar 30 segundos, lavar a lmina com gua corrente e secar com papel filtro (de forma suave e sem esfregar). Pingar uma gota de leo de imerso e observar com a objetiva de imerso.

Solues em ordem de aplicao

Reao do aspecto das bactriasGram-positivas

Reao do aspecto das bactriasGram-negativas

Cristal violeta

Coradas em violeta

Coradas em violeta

Soluo de Iugol

Formao do complexo CV-I no interior da clula, que permanece violeta

Formao do complexo CV-I no interior da clula, que permanece violeta

lcool-acetona

Desidratao da parede

celular, diminuio da

porosidade e da

permeabilidade; ocomplexo CV-I no pode sair da clula, quepermanece violeta

Extrao dos lipdeos da parede celular, aumento da porosidade; o complexo CV-I removido da clula

Fucsina ou safranina

A clula no afetada, permanece violeta

A clula adquire o corante, tornando-se rosa

Quadro 2 Resumo dos acontecimento da tcnica de colorao gram.

2.1.2 Formao de estoque com Agar Inclinado

Cada colnia isolada foi inoculada em tubos contendo Agar inclinado TSA (Figura 4), com uma estria a partir do fundo do tubo at a extremidade superior do Agar. E ento, incubou-se por 24hs em estufa a 35o C, depositando no refrigerador aps, para estoque.

Falar sobre o TSA.

Figura 4 Tubos com Agar inclinado.

Figura 5 Procedimento de inoculao em tubos com Agar inclinado.

2.1.3 Semeadura por estrias em Agar MacConkey

As amostras de cada isolado foram inoculadas por estrias em placas de Agar MacConkey, e deixados em estufa a 35C por 24hs.

Este um meio amplamente empregado para isolar e identificar, seletivamente, enterobactrias em amostras biolgicas, guas de esgotos e alimentos. O meio formulado com gar bacteriolgico, cloreto de sdio, cristal violeta, lactose, peptona de carne, peptona de casena, peptona de gelatina, sais biliares n 3 e vermelho neutro. O aspecto do meio preparado rosa e apresenta pH final de 7,1 +/- 0,2 a 25 C. Devem-se incubar as placas a 35 +/- 2C, de 18 a 24 horas. A ao seletiva deste meio atribuda aos sais biliares e ao cristal violeta que inibem a maioria das espcies gram-positivas. Bactrias gram-negativas geralmente se desenvolvem bem neste meio e se diferenciam por sua habilidade em fermentar lactose. Linhagens fermentadoras de lactose crescem como colnias vermelhas ou rosadas e podem ser circundadas por uma rea de precipitao cida de bile. A cor vermelha devida produo de cido pela degradao da lactose, absoro do vermelho neutro e uma subsequente mudana na colorao quando o pH do meio cai abaixo de 6,8. Linhagens no fermentadoras de lactose, como Shigella e Salmonella, so incolores, transparentes e tipicamente no alteram a aparncia do meio. Outros Gram-negativos no-Enterobacteriaceae, como Pseudomonas e Aeromonas, tambm crescem neste meio. Em nmero reduzido, Enterococcus faecalis pode desenvolver-se como colnias puntiformes vermelhas e alguns estafilococos foram colnias pequenas, opacas e rosa-plido.

2.1.4 Semeadura por estrias em Agar EMB

As amostras de cada isolado foram inoculadas por estrias em placas de Agar EMB, e deixados em estufa a 35C por 24hs.

O gar Eosina Azul de Metileno (EMB) uma modificao da frmula de Holt-Harris e Teague usada para o isolamento e diferenciao de enterobactrias (bacilos Gram-negativos). O meio formulado com gar bacteriolgico, azul de metileno, eosina Y, fosfato bibsico de potssio, lactose, peptona de gelatina e sacarose. O aspecto do meio preparado vinho e seu pH final de 7,2 +/- 0,2 a 25 C. Neste meio, a combinao de eosina e azul de metileno como um indicador promove uma diferenciao distinta entre as colnias de organismos fermentadores da lactose e os que no fermentam a lactose. A sacarose foi includa no meio para detectar os membros do grupo coliforme que fermentam este carboidrato mais rpido do que a lactose. As colnias lactose-positivas ou so negras ou possuem centros negros com periferia transparente, ao passo que as lactose ou sacarose negativas so incolores. O meio ligeiramente inibidor para organismos Gram-positivos.

2.1.5 Inoculao em placas de Agar DNAse

Semeou-se numa nica estria, de aproximadamente 2 cm de comprimento, um inoculo de cada amostra de isolado em placa de gar DNAse, incobado por 24h em estufa a 35C.

O teste de DNAse usado para detectar a degradao do cido Desoxirribonucleico (DNA), contido no meio de cultura, por bactrias que possuem uma enzima extracelular, a desoxirribonuclease, responsvel pela reao. A enzima quebra o DNA em subunidades compostas de nucleotdeos. Ao utilizar o meio de DNAse Test Agar, deve-se acrescentar uma quantidade de HCl a 1N para revelar a atividade enzimtica. Uma zona clara em volta da colnia indica reao positiva. Caso no haja atividade dessa enzima o HCl reagir com o cido nuclico intacto, formando um precipitado.

2.1.6 Inoculao em tubos inclinados de Agar TSI

As amostras de cada isolado fora, Inoculadas tanto por estrias na superfcie, quanto por puno com profundidade at o fundo do tubo contendo Agar TSI. O material foi inoculado a 35C por 24hs.

O gar Ferro Trplice Acar (TSI) um meio diferencial recomendado para a identificao de bacilos entricos, baseado na fermentao da glicose, lactose e sacarose e na produo de sulfeto de hidrognio. Esse meio recomendado pela APHA (Associao de Sade Pblica Americana) para anlise de carne e produtos alimentcios, anlise de leite e laticnios, testes de limites microbiais para identificar a presena de Salmonella e na identificao de bacilos gram-negativos.O meio formulado com gar bacteriolgico, cloreto de sdio, dextrose, lactose, peptona de carne, peptona de casena, sacarose, sulfato ferro III e amnio, tiossulfato de sdio e vermelho de fenol. O aspecto do meio preparado laranja avermelhado. Organismos que fermentam glicose produzem uma variedade de cidos, mudando a cor do meio de vermelho para amarelo.

Quantidades maiores de cido so liberadas no fundo (fermentao) comparadas com a produo na rea inclinada (rampa; respirao). O crescimento bacteriano tambm forma produtos alcalinos da descarboxilao oxidativa da peptona que neutralizam o cido presente no fundo. Portanto, a formao de uma rea alcalina na inclinao rampa (vermelha) e de uma rea cida (amarela) no fundo do tubo aps a incubao, indica que o microrganismo fermentador de glicose, mas no capaz de fermentar lactose e/ou sacarose. Bactrias que fermentam lactose e/ou sacarose, na adio de glicose, produzem grandes quantidades de cido, causando a no reverso do pH naquela regio e portanto os tubos exibem a colorao amarela tanto na inclinao (rampa) quanto no fundo devido ao pH cido. A produo de gs (CO2) detectada pela presena de bolhas, quando o gs acumulado escapa. O pH final do meio de 7,3 +/- 0,2 a 25 C. Por conter trs acares, o meio permite o reconhecimento e identificao de Proteus, Hafnia e Providencia, que no fermentam a lactose ou o fazem muito lentamente, porm fermentam a sacarose rapidamente, o que permite diferenciar esse grupo de Salmonella e Shigella.

2.1.7 Inoculao em tubos inclinados de Agar Citrato

As amostras de cada isolado fora, Inoculadas tanto por estrias na superfcie, quanto por puno com profundidade at o fundo do tubo contendo Agar Citrato. O material foi inoculado a 35C por 4 dias.

O gar Citrato Simmons usado para diferenciar e identificar enterobactrias, baseando-se na utilizao do citrato como nica fonte de carbono. Recomendado para a diferenciao de coliformes isolados de guas. O meio formulado com gar bacteriolgico, azul de bromotimol, citrato de sdio, cloreto de sdio, fosfato bibsico de potssio, fosfato monobsico de amnio e sulfato de magnsio. O aspecto do meio verde e seu pH final de 6,9 +/- 0,2 a 25 C. O metabolismo desses sais faz com que o meio se torne alcalino, indicado pela alterao da cor do indicador de pH azul de bromotimol do verde para o azul. O azul de bromotimol o indicador de pH. O meio dever ser preparado na hora porque em ambientes secos, a alteraes de cor pode ocorrer mesmo antes da inoculao, especialmente no fundo de tubos inclinados. Se no forem obtidos resultados precisos, fato que pode ocorrer com linhagens de Providencia, necessrio fazer novas provas, incubando-se temperatura ambiente por 7 dias. Somente os microrganismos que utilizam o citrato como nica fonte de carbono crescem neste meio. O aparecimento de um crescimento visvel geralmente acompanhado de uma mudana do indicador para azul.

2.1.8 Inoculao em placa de Agar Verde Brilhante

Semeou-se por esgotamento em estrias, um inoculo de cada isolado de estoque em placa de gar verde brilhante, por 24hs a 35C.

O Agar Verde Brilhante recomendado para a enumerao de bactrias coliformes em gua e gua residuais. Originalmente formulado para enumerao de bactrias coliformes de materiais de importncia sanitria. O meio contm uma combinao de verde brilhante e bile de boi, o qual altamente seletivo para coliformes, inibindo a maioria das bactrias gram-positivas incluindo as Clostridias fermentadoras de lactose e algumas bactrias gram-negativas. A erioglaucina e a fucsina bsica juntas formam o sistema indicador do meio. Quando o pH neutro, a colorao do meio azul, enquanto a produo cida da lactose torna o meio rosa e as colnias variam do rosa ao vermelho escuro dependendo da mudana do pH. Colnias de bactrias coliformes so vermelhas escuras rodeadas por um halo cor de rosa, contrrio ao fundo azul do meio. O gar verde brilhante um meio sensvel luz, particularmente luz direta do sol. A exposio direta pode diminuir a produtividade do meio e tambm a colorao do meio pode mudar do azul escuro para o roxo ou vermelho.

2.1.9 Inoculao em placa de Vermelho Violeta

Semeou-se por esgotamento em estrias, um inoculo de cada isolado de estoque em placa de gar Vermelho violeta, por 24hs a 35C.

O Agar vermelho violeta um meio seletivo usado para isolamento, deteco e contagem de bactrias coli-aergenas em amostras de gua, leite e outros produtos lcteos. O grupo bacteriano de coliformes composto por vrios gneros da famlia Enterobacteriaceae. Todos os membros do grupo so aerbios ou anaerbios facultativos, Gram-negativos, no formadores de esporo, possuem forma de bastonete e fermentam a lactose produzindo gs e cido em 48 horas a 35C. Organismos que fermentam a lactose rapidamente formam colnias roxas rodeadas por halos tambm roxos. No fermentadores ou fermentadores tardios da lactose formam colnias plidas com zonas esverdeadas. A digesto pptica de tecido animal e o extrato de levedura so as fontes de carbono, nitrognio, vitaminas e outros nutrientes essenciais ao crescimento. A lactose o carboidrato fermentvel, a qual, quando fermentada, leva a produo de cidos. O vermelho neutro o indicador de pH que detecta a formao do pH cido. O cristal violeta e a mistura de sais biliares favorecem a inibio do crescimento das bactrias Gram-positivas associadas e da flora no relacionada. O cloreto de sdio mantm o equilbrio osmtico. Sua aparncia roxa avermelhada e seu pH final de 7,4 +/- 0,2.

2.1.10 Inoculao em tubos de Agar SIM

Semeou-se por puno, um inoculo de cada isolado de estoque em tubo de gar SIM, que foram incubados em estufa a 35o C por 24 - 48hs.

Figura 6: Tubos contendo Agar SIM

O Indol revelado pingando-se algumas gotas (4 5) de reativo de Kovacs sobre a superfcie do gar. Aparecendo um anel avermelhado na superfcie (em cerca de 10 a 30 segundos), considera-se o resultado positivo.

Aps a incubao, observo-se a motilidade (crescimento difuso fora da linda de inoculao ou turvao ao longo do meio) e produo de H2S (enegrecimento do meio).

Figura 7: Teste do Indol

Meio SIM recomendado para a determinao da produo de sulfeto de hidrognio (cido sulfdrico), formao de Indol e motilidade de bacilos entricos. Seu pH final de 7,3 +/- 0,2 e sua aparncia mbar, levemente opalescente em tubos. O meio SIM permite a determinao de trs caractersticas pelas quais as bactrias entricas podem ser diferenciadas. O ferro peptonizado e o tiossulfato de sdio so os indicadores de produo de H2S. O H2S reage com o ferro peptonizado formando um precipitado de cor preta de sulfureto ferroso. Organismos com motilidade intensificam a reao de H2S. Organismos com motilidade crescem longe da linha de inoculao mostrando um crescimento difuso, enquanto organismos sem motilidade crescem ao longo da linha de inoculao. A deteco da motilidade possvel devido natureza semi-slida do meio. O crescimento radiando-se fora da linha central de inoculao indica que o organismo analisado mvel.

2.2 Coleta de Alimento

Utilizou-se o iogurte Batavo Natural. 5 tubos, contendo gua peptonada, foram identificados de acordo com a sua diluio futura. Utilizando-se ???? com ????? descartveis, foram transferidas as amostras de um tubo para outro, sempre realizando o procedimento na rea estril criada pelo calor do bico de Bunsen, aumentando gradualmente a diluio do iogurte.

2.2.1 Diluio Seriada da amostra em lquido

Adicionar 1mL da amostra de lquido em um tubo com 9mL de gua peptonada (0,1%), esta ser sua diluio 10-1.

Transferir 1mL da diluio 10-1 em um tubo com 9mL de gua peptonada (0,1%), esta ser sua diluio 10-2.




Figura 8 Iogurte Batavo Natural em diferentes diluies

Composio e para que utilizada a GUA PEPTONADA

2.2.2 Semeadura em Drop Plate

Semeadura de gota em superfcie (Contagem de Bactrias Heterotrficas) Falar mais sobre essa tcnica de semeadura, utilizada quando?

Para a inoculao em meio PCA, dividiu-se as placas em 3 ou 4 quadrantes, onde foi transferido 1 gota de 10L de cada diluio (10-3 10-5) em cada quadrante. Os tubos devem ser agitados bem antes de coletar as alquotas. As placas devem ser tampadas e deixadas descansar por alguns minutos antes de ser invertida e incubada em estufa a 35C por 24hs.

Descrio completa da composio do AGAR PCA e para que utilizado.

2.2.3 Cultivo em substrato enzimtico - ColilertR

Utilizando-se ???? com ????? descartveis, foi aplicado 1mL de cada diluio do iogurte em cada srie de 5 tubos contendo ColilertR.

Qual a composio co Colilert? Para que utilizado?

3 RESULTADOS



Identificao

Microorganismo

#C5

Staphylococcus sp. ou Enterococcus faecalis

#C6

Serratia sp.

#D1

Staphylococcus sp. ou Enterococcus faecalis

Morfologia das colnias:

Staphylococcus sp - Inibidas

Enterococcus faecalis - Inibidas

Serratia sp. - Vermelhas ou rosadas. No so mucides.


Identificao

Microorganismo

#C5

Enterobacter aerogenes ou Klebsiella sp.

#C6

Staphylococcus Coagulase-positivo

#C7


#D1


Morfologia das colnias:

Enterobacter aerogenes e Klebsiella sp. - Colnias grandes (4 a 6 mm de dimetro), elevadas e mucides com tendncia a unirem-se. Usualmente no apresentam brilho metlico. luz transmitida mostram um centro marrom-acinzentado e bordas claras.

Staphylococcus Coagulase-positivo - Muito pequenas, puntiformes, incolores e bastantes inibidas.



Identificao

Microorganismo

Colorao Gram

#C1

Pseudomonas aeruginosa

Positivo

#C4

Serratia sp.

Negativo

#D1

Serratia sp.

Positivo


Identificao

Microorganismo

Colorao Gram

#C1

Escherichia coli ou Salmonella typhi ou Salmonella paratyphi A ou Shigella sp.

Positivo

#C4

Enterobacter sp. ou Klebsiella pneumoniae ou Salmonella enteritidis ou Salmonella paratyphi B ou Salmionella typhimurium ou Serratia sp.

Negativo

#D1

Escherichia coli ou Salmonella typhi ou Salmonella paratyphi A ou Shigella sp.

Positivo

#C1 - DIZ ESTAFILOCOCUS POREM TODAS OS MICROORGANISMOS DE GREM - SO BACILOS!!!

POSITIVO = CITROBACTER SP/SALMONELLA ARIZONAE = ESTAFILOCOCUS - NO ACHEI MUITAS IMAGENS PRA CONFIRMAR SE SO MESMO, CONFIRMEM PRA M,IM!

NOSSA #C4 BACILO







4 CONCLUSO

O grupo deve descrever de que maneira a interpretao dos resultados direcionou a determinao (mesmo que aproximada) dos gneros sugeridos para cada isolado.

- Devem ser colocados como itens separados os resultados das coletas ambientais e do alimento/gua (quando for efetuado). No caso de alimento/gua, comentar sobre o nmero de UFCs e se h ou no evidncia da presena de bactrias do grupo coliforme (tecendo um comentrio fundamentado, sobre se o grupo considera o alimento/gua saudvel ou no ).

OBS: os resultados e a concluso devem conferidos com pesquisa bibliogrfica, para que no sejam cometidos erros primrios (como indicar que um isolado pertena a um gnero com forma, arranjo ou classificao de Gram diferente do que realmente o grupo apresente).

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

FOX, Alvin. Traduo: Dr. Paulo E. Moretti. Bacteriologia - Nutrio, Crescimento e Metabolismo energtico. Disponvel em:

Acesso em 26 out 2014.

JUNIOR, Lauri Raitz. Pesquisa de microrganismos presentes em estetoscpios como fator determinante para infeco hospitalar em um Hospital de Brusque-SC. Universidade Regional de Blumenau, Centro de Cincias da Sade. Blumenau, 2007.

RIBEIRO, Mariangela Cagnoni; SOARES, Maria Magali S. R.. Microbiologia prtica: roteiro e manual: bactrias e fungos. So Paulo: Atheneu, 2000. 112 p. (Biblioteca biomdica) ISBN 8573792442

PELCZAR JUNIOR, Joseph Michael et al. Microbiologia: conceitos e aplicaes. 2. ed. So Paulo: Makron Books, 1996. 2 v. ISBN 8534601968 (v. 1).

PONTIFCIA UNIVERSIDADE CATLICA DE GOIS. Departamento de Biologia,

Microbiologia aplicada. Meios de Cultura. Disponvel em: Acesso em 26 out 2014.

SALVATORI, Rosngela Uhrig; WOLF, Greice Aline Kaisecamp; DRESCH, Fabola; STROHSCHOEN, Andreia Aparecida Guimares. Laboratrio de Microbiologia: normas gerais, instrues de trabalho e Procedimentos Operacionais Padres. Editora UNIVATES, 1 edio. Lajeado, 2013.

http://www.icb.ufmg.br/mic/index.php?secao=material&material=42

http://www.uff.br/bacteriologia/aulaspraticas/tecnicasdesemeadura.htm

SUMRIO

11 INTRODUO

72 METODOLOGIA


82.1.1 Colorao de GRAM

92.1.2 Formao de estoque com Agar Inclinado










152.2.1 Diluio Seriada da amostra em lquido



173 RESULTADOS













204 CONCLUSO

21REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

GABY

MAYARA

MICHELE EIDT

MICHELLE VISCARDI

SABRINA

RELATRIO DE AULAS PRTICAS DE BACTERIOLOGIA

CANOAS, 2014.

PAGE

9

_1477507879.bin

relatório de aulas práticas - microbiologia e imunologia

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