recentes avanços da in-tube spme-lc para bioanálises · recentes avanços da in-tube spme-lc para...

PREPARO DE AMOSTRAS

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):167-179

Instituto Internacional de Cromatografia

DOI: http://dx.doi.org/10.4322/sc.2014.002

ISSN 1984-4433

Recentes avanços da in-tube SPME-LC para bioanálises

Maria Eugênia C. Queiroz*, Lidervan P. Melo

Departamento de Química, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo – USP, Cep 14040-901, Ribeirão Preto, SP, Brasil

e-mail: [email protected]

Resumo

O sistema in-tube SPME-LC realiza extração contínua, concentração e injeção utilizando o injetor automático. Esta técnica é usualmente usada em combinação com a cromatografia líquida de alta eficiência ou com a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas. Esta técnica tem sido aplicada com sucesso na determinação de fármacos em fluidos bilógicos. Neste artigo de revisão, os autores discutem os recentes avanços no desenvolvimento de fases estacionárias para o aumento da sensibilidade de métodos cromatográficos para bioanálises.

Palavras-chave

Microextração em fase sólida; drogas; fluidos biológicos; fases estacionárias seletivas.

Recent advances on in-tube SPME-LC for bioanalysis

Abstract

On-line in-tube SPME-LC performed continuous extraction, concentration, desorption, and injection using an autosampler. This technique is usually used in combination with high performance liquid chromatography and liquid chromatography-mass spectrometry. This technique has successfully been applied to the determination of drugs in biological fluids. In this review, the authors discuss the recent advances in the development of selective stationary phases to increase the sensitive of the chromatography methods for bioanalysis.

Keywords

In-tube solid-phase microextraction; drugs; biological fluids; selective stationary phases.

Queiroz MEC, Melo LP Avanços da in-tube SPME-LC

168 Scientia Chromatographica 2013; 5(3):167-179

1 Introdução

Os fluidos biológicos são amostras com-plexas constituídas por ácidos, bases, sais, pro-teínas, enzimas, assim como outras substâncias orgânicas com estruturas químicas similares aos analitos, como os fármacos de uso conco-mitante. Desta forma, estas amostras biológicas não podem ser introduzidas diretamente, no seu estado in natura, em sistemas cromatográficos. Estes interferentes podem suprimir a ionização dos analitos, durante o processo de ionização nas análises por cromatografia líquida com detector de espectrometria de massas (LC-MS), coeluir com os analitos durante a separação cromatográ-fica (LC-UV), ou adsorver de forma irreversível junto à coluna analítica, modificando a retenção dos analitos e diminuindo o tempo de vida útil da coluna.

Desta forma, a análise de fármacos em fluidos biológicos requer a etapa do preparo da amostra, para a eliminação da maioria dos inter-ferentes e pré-concentração dos fármacos, quase sempre presente em níveis de traços.

Em razão da baixa volatilidade e caráter mais polar da maioria dos fármacos, a cromato-grafia líquida de alta eficiência tem sido a técnica analítica de referência para a análise de fármacos e seus metabólitos em fluidos biológicos.

A química analítica moderna tem sido dire-cionada para a simplificação através da miniaturi-zação dos sistemas analíticos. Este procedimento facilita a hifenação de técnicas, a minimização do consumo de solvente orgânico, do volume da amostra, do tempo da análise, e a utilização de tecnologias ambientalmente corretas, em direção ao cuidado preventivo do meio ambiente.

Neste contexto, destacamos a microextração em fase sólida acoplada à cromatografia líquida, denominada in-tube SPME-LC que permite a extração, dessorção e injeção contínua, utili-zando o injetor automático LC.

1.1 In-tube SPME-LC

A in-tube SPME-LC utiliza uma coluna capi-lar como dispositivo de extração em fase sólida (Figura 1), a qual tem sido acoplada em linha com os sistemas de HPLC, LC-MS ou CE, per-mitindo a automação do processo de extração.

A técnica in-tube SPME-LC, geralmente, utiliza um capilar de sílica fundida aberto reves-tido internamente com fase estacionária qui-micamente ligada (Figura 1A), como as colu-nas capilares de cromatografia em fase gasosa. Capilares de poli-éter-éter cetona (PEEK) reche-ados com tubos de sílica fundida com revesti-mento interno ou externo (Figura 1B), capila-res de PEEK recheados com partículas sólidas adsorventes (Figura 1C), ou ainda capilares de sílica fundida com fase monolítica (Figura 1D) também têm sido utilizados.

Uma das vantagens desta técnica é a dis-ponibilidade de várias colunas capilares de GC (diferentes seletividades), as quais podem ser utilizadas como dispositivo extrator, ampliando assim o leque das aplicações.

Geralmente, o sistema in-tube SPME-LC é montado fixando-se a coluna capilar de sílica fundida aberta, revestida internamente com a fase extratora (como por exemplo, um pedaço de coluna capilar GC, 60-70 cm), entre a alça de amostragem e a agulha do injetor automático do LC. Para o processo de extração (válvula do injetor LC na posição carregar), uma alíquota da amostra, presente no frasco do injetor automá-tico LC, é aspirada, transportada para a coluna capilar e dispensada novamente no frasco, à vazão constante, Figura 2a. Estas etapas são denominadas como ciclos aspirar/dispensar, as quais são executadas repetitivamente, segundo programa do injetor automático.

Avanços da in-tube SPME-LC Queiroz MEC, Melo LP

Scientia Chromatographica 2013; 5(3):167-179 169

Quando atingido o equilíbrio de sorção, os analitos pré-concentrados no capilar são rapida-mente dessorvidos da fase estacionária através da percolação da fase móvel, após posicionar a vál-

vula do injetor LC na posição injetar (Figura 2b). Os analitos dessorvidos são transportados para a coluna analítica (LC) para separação cromatográ-fica e posterior detecção. Diferentes detectores, tais como UV, arranjo de diodos, fluorescência e de espectrometria de massas têm sido utilizados em linha com o sistema in-tube SPME-LC.

Outra forma de montar o sistema in-tube SPME-LC é conectar a coluna capilar junto à válvula de seis pórticos do LC. Com a válvula do injetor LC na posição carregar, a amostra é injetada no capilar e após limpeza do sorvente com solvente fraco para a remoção dos compos-tos endógenos da matriz, a válvula é colocada na posição injetar e a fase móvel é percolada pelo capilar para dessorção dos analitos e transporte para a coluna analítica (Figura 3).

As condições experimentais in-tube SPME (fase estacionária, dimensões do capilar, volume de amostra, pH e força iônica da amostra, vazão da amostra, número de ciclos aspirar/dispensar e modo de dessorção) têm sido otimizadas para aumentar a eficiência da extração e diminuir o tempo da análise. Ensaios realizados em condi-ções experimentais que representam o equilíbrio de sorção do analito com a fase extratora apre-sentam maior precisão analítica.

Figura 1 Configurações dos dispositivos de extração in-tube SPME (A) coluna capilar de sílica fundida com revestimento polimérico, (B) capilar PEEK recheado com tubos de sílica fundida com revestimento interno ou externo, (C) capilar de PEEK recheado com sólidos adsorventes e (D) capilar recheado com fase monolítica. Adaptado de Kataoka et al.[1] (2009).

Figura 2 Esquema do processo in-tube SPME. (a) extração e (b) dessorção. Adaptado de Kataoka et al.[2] (1999).



2 Fases estacionárias

Dentre as fases estacionárias disponíveis no comércio, a Omegawax 250 (polietilenogli-col) (Tabela 1)[4], Sulpel Q-PLOT (polímeros porosos derivados de estireno-divinilbenzeno) (Tabela 1)[5-8] e OV1701 (14% cianopropilfenil metilpolisiloxano) (Tabela 1)[9], têm sido as mais utilizadas para análises de fármacos em fluidos biológicos. Com o objetivo de aumentar a sele-tividade dos métodos cromatográficos, algumas fases estacionárias, tais como, poli(pirrol), mate-rial de acesso restrito, imunossorvente, políme-ros impressos molecularmente e monolítica têm sido desenvolvidos (Labmade) para análises de fármacos em fluidos biológicos.

O poli(pirrol) (PPY), em razão de sua per-meabilidade (estrutura porosa) e propriedades multifuncionais, que resultam em interações intermoleculares ácido-base, dipolo-dipolo, hidrofóbica, π−π e ligação de hidrogênio com os analitos foi avaliado como fase extratora para in--tube SPME para análise de enantiosseletiva de fluoxetina e seu principal metabólito (norfluoxe-tina) em amostras de plasma para fins de moni-torização terapêutica[10]. Um capilar de sílica fundida (60 cm × 0,25 mm d.i.), após silanização

com solução etanóica de aminopropiltrietoxisi-lano (APTES) foi revestido com polipirrol por polimerização química através da percolação das soluções do monômero e da solução oxidante [Fe (ClO4)3] sob fluxo de N2, (Figura 4). Este capilar mostrou-se estável nas condições de análise, per-mitindo a reutilização em centenas de extrações.

O método PPY in-tube SPME-LC apresen-tou limites de quantificação de 10 a 15 ng mL–1, os quais permitiram análise enantiosseletiva de fluoxetina e seu principal metabólito em níveis plasmáticos que contemplam o intervalo tera-pêutico, Figura 5.

O desenvolvimento de fases sorbentes com material de acesso restrito (RAM – restricted acess media), tem permitido a introdução direta de fluidos biológicos em sistemas cromatográfi-cos, reduzindo o tempo da análise. As fases de acesso restrito possuem uma superfície hidrofí-lica biocompatível na parte externa e hidrofóbica (suportes de sílica, C8 ou C18) no interior dos poros da partícula do sorbente. As macromolé-culas são excluídas por uma barreira física ou de difusão química. Já as moléculas pequenas (fár-macos) penetram nos poros (hidrofóbicos) e são sorvidos, através do processo de partição. Mullett and Pawliszyn[11] desenvolveram um capilar de

Figura 3 Sistema in-tube SPME-LC com a fase RAM (partículas hidrofóbicas revestidas com albumina sérica bovina) para análise de interferon em amostras de plasma. Adaptado de Chaves et al.[3] (2011).



PEEK recheado com fase a RAM, ou seja, super-fície hidrofílica (diol, ADS) na parte externa e hidrofóbica (octadecilsilano, C18) no interior dos poros da partícula do sorvente para análises de benzodiazepínicos em amostras de soro.

Os interferons, biofármacos, são um grupo de glicoproteínas que atuam nas imunidades inata e adaptativa, e possuem diversas proprieda-des, como antiviral/antibacteriana, antitumoral, antiproliferativa e imunomoduladora. A Figura 3 ilustra o sistema in-tube SPME-LC montado para análise de interferon em amostra de plasma com a fase biocompativel composta por partícu-las C18 revestidas com albumina sérica bovina

(BSA)[3]. O material biocompatível (C18-BSA) permitiu análise direta das amostras de plasma diluídas em solução tampão, sem remoção pré-via das proteínas.

As fases imunossorventes, onde o meca-nismo de sorção é baseado no reconhecimento molecular, têm sido desenvolvidas através da imobilização (ligações covalentes) de anticorpos (específicos do analito) na superfície interna do capilar de sílica fundida[12]. Chaves and Queiroz[13]

(Tabela 1) comprovaram a especificidade das interações antígeno-anticorpo (monoclonais) através das análises in-tube SPME/LC de inter-feron em amostras de plasma para fins de moni-torização terapêutica. O tubo capilar de sílica fundida foi primeiramente ativado com APTES e glutaraldeído, liberando o grupo amina primá-rio sobre a superfície. Após extensa lavagem com água nanopura, a superfície de glutaraldeído ati-vada foi reagida com uma solução de anticorpo monoclonal em solução salina tamponada com fosfato. Os grupos aldeídos remanescentes na superfície, foram desativados com uma solução de etanolamina. A linearidade do método desen-volvido in-tube SPME-LC imunossorvente para

Figura 4 Desenvolvimento do capilar de PPY por polimerização química.

Figura 5 Cromatogramas referentes às análises por in-tube SPME-LC com a fase de PPY (a) Amostra de plasma (branco de referência), (b) amostra de branco de referência enriquecida com fluoxetina e norfluoxetina na concentração de 300 ng/mL, (c) amostra de plasma de paciente em terapia com fluoxetina. Adaptado de Silva et al.[10] (2009).



análises de α-interferon em amostras de plasma resultou em concentrações que variam de 0,006 (limite de quantificação) a 3,0 MIU mL–1. O capi-lar in-tube SPME imunosorvente foi reutilizado 10 vezes sem perda significativa da eficiência de extração.

Já os polímeros de impressão molecular (MIP) são materiais sintéticos com proprieda-des de reconhecimento molecular baseados em sistemas biomiméticos, semelhante aos sistemas específicos enzimas-substratos ou antígeno--anticorpo. De acordo com a literatura, a maioria dos polímeros de impressão molecular é baseada em polímeros acrílicos ou acrilatos orgânicos, os quais são sintetizados através da polimeriza-ção radicalar. A síntese dos MIP consiste, basi-camente, em três etapas: (a) Formação de um complexo pré-polímero através de interações covalentes ou não covalentes entre a molécula molde (soluto) e o monômero funcional; (b) Etapa de polimerização em torno do complexo molde-monômero, gerando uma cadeia polimé-rica tridimensional altamente entrecruzada; (c) Remoção da molécula molde das cavidades do polímero. Após a etapa de remoção da molécula molde, cavidades seletivas ao molde são esta-belecidas, tanto em tamanho e forma, quanto à presença de grupos funcionais. Estas cavidades constituem os sítios específicos de ligação que atuam no reconhecimento do molde e/ou com-postos com estrutura química semelhante ao soluto [14].

Mullett et al.[15] desenvolveram um capilar de PEEK recheado com a fase MIP (processo radicalar) para análises in-tube SPME/LC-UV de propranolol em fluidos biológicos. O capilar foi reutilizado mais de 500 vezes com boa pre-cisão analítica (RSD < 5,0%) na faixa linear de 0,5-100 µg/mL para análises de propanolol em

soro. Zhang et al.[16] sintetizaram a fase MIP em capilar de sílica fundida para a in-tube SPME off--line para análises LC-UV de 8-hidroxi-2`-deoxi-guanosina em amostras de urina. O sistema in--tube SPME (off-line) foi montado com o auxílio de uma bomba seringa.

Yuling Hu et al.[17] desenvolveram o método fiber-in-tube SPME-LC utilizando um capilar PEEK recheado com fibras (capilares de sílica fundida) revestidas externamente com polímeros de impressão molecular de diferen-tes tipos, ou seja, desenvolvidos com diferentes templates (moléculas molde), ofloxacin (fibra OFL-MIP) e sulfametazina (fibra SM-MIP). O sistema fiber-in-tube SPME-LC foi conectado aos detectores UV e fluorescência em sequên-cia. O método fiber-in-tube SPME com o capi-lar PEEK recheado com fibras híbridas resul-tou em alta seletividade (fase MIP) e excelente dinâmica fluídica, o qual permitiu a determi-nação de antibióticos (ofloxacin, norfloxacin, cifloxacin, sulfadiazina, sulfamerazina, sulfa-metazina e sulfamato) em amostras de alimen-tos de origem animal com baixos limites de detecção (0,016 e 0,11 µg. L–1).

Recentemente, os pesquisadores têm sinte-tizados sorventes seletivos MIP através do pro-cesso sol-gel como fase extratora para in-tube SPME-LC. O polímero impresso sintetizado pelo método sol-gel apresenta alta afinidade, seletivi-dade e rápida taxa de transferência de massa[18].

As fases monolíticas também têm sido avaliadas nas análises in-tube SPME-LC, pois possuem estrutura sólida e altamente porosa, de pequenos domínios e canais relativamente grandes, que resultam em alta permeabilidade e eficiente extração[19]. Estas fases apresentam algumas vantagens, tais como, não necessitam de filtros nas extremidades, bom controle da



porosidade, facilidade de incorporação de dife-rentes grupos (moléculas hidrofóbicas, molécu-las carregadas, moléculas para interações espe-cíficas, etc.) durante seu preparo e capacidade de sorção superior às colunas capilares de tubos abertos.

As fases monolíticas com polímeros orgâ-nicos[20,21] ou à base de sílica [22-24] têm sido utili-zadas para análises in-tube SPME. Os polímeros monolíticos orgânicos apresentam boa estabili-dade em ampla faixa de pH, no entanto, o intu-mescimento desses polímeros na presença de solventes orgânicos pode levar à diminuição da estabilidade mecânica. Já os monolitos à base de sílica apresentam altas permeabilidade e estabi-lidade mecânica e não apresentam intumesci-mento na presença de solventes orgânicos, mas o preparo convencional é moroso e de baixa reprodutibilidade. Uma alternativa promissora tem sido os monolitos híbridos organo-silica para as análises in-tube SPME[25-27]. Estes apre-sentam uma ligação covalente entre a parte orgâ-nica (trialcoxisilano organo-funcionalizado) e a parte inorgânica (tetrametoxisilano, TMOS ou tetraetoxisilano, TEOS). Os grupos alcóxidos sob reações de hidrólises e policondensação, processo sol-gel, resultam na matriz de sílica híbrida com grupos orgânicos covalentemente incorporados. O meio ácido favorece as reações de hidrólise, enquanto que o meio alcalino favo-rece as reações de condensação. Geralmente, os monolitos híbridos são sintetizados via reações sol-gel, em duas etapas. Inicialmente, os silanos são hidrolisados em altas temperaturas em solu-ção água/metanol (co-solvente), na presença de um catalisador ácido (ácido clorídrico, ácido acético). Em uma segunda etapa, dodecilamina é adicionada à solução como um catalizador secundário, aumentando o pH e acelerando as

reações de condensação e reduzindo tempo de gelatização. A dodecilamina também atua como supramolecular template para formar poros na matriz monolítica. Este procedimento foi ado-tado para a síntese de monolitos com grupos cianoetil e octil incorporados, os quais foram utilizados, respectivamente, para análises in--tube SPME/LC de antidepressivos[27] em amos-tras de plasma e de PAHs[26].

A coluna capilar monolítica híbrida inor-gânica-orgânica molecularmente impressa (MIP monolítico híbrido) foi sintetizada pelo processo sol-gel e radicalar “one-pot” (num só reator), e empregada para a extração seletiva de lisozima (proteína) em amostras biológicas complexas[28]. Para a síntese das colunas mono-líticas híbridas tetrametilsiloxano e 3-meta-criloxipropiltrimetoxisilano foram utilizados como co-precursores inorgânicos, acrilamida e N, N’-metilenobisacrilamida como monôme-ros orgânicos funcionalizados, e lisozima como molde. A reprodutibilidade da síntese das colu-nas monolítica hibridas impressas foi demons-trada (n=5) e o desvio padrão relativo foi inferior a 3,87%.

A Tabela 1 ilustra as aplicações recentes da técnica in-tube SPME-LC para análise de fárma-cos em fluidos biológicos.

3 Conclusão

O desenvolvimento de sorventes seletivos aumenta a eficiência e seletividade da in-tube SPME-LC, permitindo a utilização desta técnica na quantificação de fármacos em níveis de traços (mesmo com detectores convencionais, como por exemplo, o UV) em amostras complexas, como os fluidos biológicos.



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A robustez do sorvente PPY (mais de 100 extrações sem perda da eficiência) e as intera-ções iônicas com os fármacos fluoxetina e nor-fluoxetina permitiu as análises (in-tube SPME/LC) enantiosseletivas em níveis plasmáticos sub--terapêuticos.

O sorvente biocompatível (RAM-BSA) per-mitiu injeções diretas e múltiplas de amostras de plasma sem nenhum tratamento prévio da amostra biológica, exceto a diluição com solução tampão, simplificando e reduzindo o processo in-tube SPME/LC.

O método in-tube SPME-LC com a fase imu-nossorvente, em razão das interações específicas (antígeno-anticorpo), apresentou baixos limites de quantificação. Já os polímeros de impressão molecular, os quais apresentam propriedades de reconhecimento molecular específicas para as moléculas moldes, são uma alternativa de baixo custo e versátil aos imussorventes

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