universidade federal do triÂngulo mineiro …bdtd.uftm.edu.br/bitstream/tede/525/5/dissert adriana...

ADRIANA COSTA RODRIGUES

ESTUDO QUÍMICO DAS PÉTALAS, FOLHAS, CÁLICES E SEMENTES DE

Hibiscus sabdariffa L.

UBERABA

2017

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO

Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Química de Minas Gerais

ADRIANA COSTA RODRIGUES

ESTUDO QUÍMICO DAS PÉTALAS, FOLHAS, CÁLICES E SEMENTES DE


Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação Multicêntrico em Química

de Minas Gerais na Universidade Federal

do Triângulo Mineiro, como requisito para

a obtenção do título de mestre.

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Amanda Danuello Pivatto

Coorientador: Prof. Dr. Marcos Pivatto

UBERABA

2017

A José Lázaro,

minhas filhas, Júlia e Luiza

que sempre estiveram

presentes, apoiando

para a realização deste

trabalho

AGRADECIMENTOS

A Deus, primeiramente, pela vida, saúde e a alegria de mais um trabalho realizado.

Ao meu marido José Lázaro Rodrigues pelo carinho, compreensão e incentivo

constante.

Às minhas filhas, Júlia e Luiza, pela alegria e incentivo constante.

À Prof.ª Dr.ª Amanda Danuello Pivatto pela orientação e amizade.

Ao Prof. Dr. Marcos Pivatto por sua coorientação.

À Prof.ª Dr.ª Lívia Echternacht Andrade pela identificação e catalogação do material

vegetal.

À Prof.ª Dr.ª Carla Regina Costa pela ajuda e amizade.

Ao Prof. Dr. José Roberto Siqueira Júnior pela ajuda e amizade.

Ao Prof. Dr. Guilherme Vannucchi Portari por suas valiosas contribuições para o

desenvolvimento deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Ricardo Reis Soares pelas análises de espectrometria de massas.

Ao Prof. Dr. Cláudio Vieira da Silva do Instituto de Ciências Biomédicas da

Universidade Federal de Uberlândia - UFU, pelas análises de antiprotozoários.

Ao pós graduando Mário Machado Martins da Universidade Federal de Uberlândia -

UFU, pelos ensaios realizados e amizade.

Aos servidores, João, Luciene e Cintia, do Instituto Federal de Educação, Ciência e

Tecnologia do Triângulo Mineiro - IFTM.

Às amigas de laboratório Alana Kelyene Pereira, Rayla Cristina Gabriel e Kátia

Aparecida pelo convívio fraterno.

À Universidade Federal do Triângulo Mineiro - UFTM.

À Universidade Federal de Uberlândia - UFU.

Ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Triângulo Mineiro –

IFTM.

Ao Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Química de Minas Gerais –

PPGMQ-MG.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais – FAPEMIG.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq.

“Não, não pares.

É graça Divina começar bem.

Graça maior,

é persistir na caminhada certa,

manter o ritmo...

Mas a graça das graças

é não desistir.

Prosseguir firme. Podendo ou não podendo.

Caindo embora aos pedaços...

Chegar até ao fim”.

(D. Hélder Câmara)

RESUMO

Hibiscus sabdariffa L. é uma erva aromática, refrescante e adstringente utilizada na

medicina popular como diurética, digestiva, antilipêmica, anti-hipertensiva e laxativa.

Nas pétalas desta planta é relatada a ocorrência de polifenóis, sendo que vários

estudos relacionaram estes metabólitos ao tratamento de doenças renais,

estomacais, cardíacas e neurodegenerativas. Grande parte dos estudos realizados

com H. sabdariffa é limitada aos extratos etanólicos e aquosos dos cálices, devido

ao amplo consumo na forma de chá. Neste sentido, o presente trabalho teve como

objetivo avaliar o perfil químico dos diferentes órgãos da planta e o potencial

antioxidante, uma vez que esta atividade está relacionada ao tratamento de diversas

patologias, tais como câncer, doenças cardiovasculares, disfunções cerebrais,

doenças degenerativas e processos inflamatórios. Também foi avaliada a atividade

leishmanicida uma vez que dados etnofarmacológicos relataram o uso do chá das

folhas no tratamento da leishmaniose. Inicialmente, foram coletados cálices, pétalas,

folhas e sementes dos quais foram preparados os respectivos extratos etanólicos,

que seguido de extração líquido-líquido com solventes de polaridade crescente. Os

extratos e frações foram submetidos a prospecção fitoquímica utilizando a

cromatografia em camada delgada e diversos reveladores químicos, sendo possível

sugerir a presença de esteroides, terpenoides, saponinas, propilpropanoides,

fenilpropanoides e flavonoides. No ensaio para avaliação da atividade antioxidante

foi possível observar que as frações n-butanol (CE50 64,3 ± 6,2 μg mL–1) e acetato de

etila (CE50 69,3 ± 8,2 μg mL–1) das pétalas apresentaram os melhores resultados, o

que pode ser justificado pela maior quantidade de fenóis totais (61,5 ± 2,8 e 30,7 ±

1,7 mg de EAG/g de amostra, respectivamente). No ensaio para avaliação da

atividade leishmanicida foi observado que as frações n-hexano das folhas (CI50 40 ±

8 μg mL–1), pétalas (CI50 83 ± 16 μg mL–1) e cálices (CI50 67 ± 8 μg mL–1),

apresentaram índices de seletividade de 0,37, 0,66 e 0,16, respectivamente. O

extrato etanólico das sementes foi submetido à análise por cromatografia gasosa

acoplada a espectrometria de massas, sendo possível observar a presença de uma

série de ésteres (hexadecanoato de metila, hexadecanoato de etila, octadeca-9,12-

dienoato de metila, 9-octadecenoato de metila, octadecanoato de metila, octadeca-

9,12-dienoato de etila, 9-octadecenoato de etila e octadecanoato de etila) e ácidos

graxos (ácido hexadecanóico e ácido octadeca-9,12-dienoico) de cadeias longas,

contribuindo assim para o conhecimento do perfil químico desta planta que tem

ampla aplicação na medicina tradicional.

Palavras-chave: Hibiscus sabdariffa, potencial antioxidante, atividade leishmanicida.

ABSTRACT

Hibiscus sabdariffa L. is a refreshing and astringent aromatic herb used in folk

medicine as diuretic, digestive, anti-lipemic, antihypertensive and laxative. In the

petals of this plant is reported the occurrence of polyphenols, and several studies

have related these metabolites to the treatment of kidney, stomach, heart and

neurodegenerative diseases. Much of the studies conducted with H. sabdariffa are

limited to the ethanolic and aqueous extracts of the calyces, due to the large

consumption in the form of tea. In this sense, the present work had as objective to

evaluate the chemical profile of the different organs of the plant and the antioxidant

potential, since this activity is related to the treatment of several pathologies, such as

cancer, cardiovascular diseases, cerebral dysfunctions, degenerative diseases and

processes inflammatory. Additionally, leishmanicidal activity was evaluated because

ethnopharmacological data reported the use of leaves of tea in the treatment of

leishmaniasis. Initially, calyces, leaves, petals and seeds were collected from wich

the respective ethanolic extracts were prepared, followed by liquid-liquid extraction

with solvents of increasing polarity. The extracts and fractions were submitted to

phytochemical prospecting using thin layer chromatography and several chemical

developers, and it was possible to suggest the presence of steroids, terpenoids,

saponins, propylpropanoids, phenylpropanoids and flavonoids. In the assay to

evaluate the antioxidant activity, it was possible to observe that the fractions n-

butanol (EC50 64.3 ± 6.2 μg mL–1) and ethyl acetate (EC50 69.3 ± 8.2 μg mL–1)

showed the best results, which may be justified by the higher amount of total phenols

(61.5 ± 2.8 and 30.7 ± 1.7 mg GAE/g sample, respectively). In the assay for

evaluation of leishmanicidal activity, it was observed that the n-hexane fractions of

the leaves (IC50 40 ± 8 μg mL–1), petals (IC50 83 ± 16 μg mL–1) and calyces (IC50 67 ±

8 μg mL–1) showed selectivity indexes of 0.37, 0.66 and 0.16, respectively. The

ethanolic extract of the seeds was submitted to the analysis by gas chromatography

coupled to mass spectrometry being possible to observe the presence of a series of

esters (methyl hexadecanoate, ethyl hexadecanoate, methyl octadeca-9,12-dienoate,

methyl 9-octadecenoate, methyl octadecanoate, ethyl octadeca-9,12-dienoate, ethyl

9-octadecenoate and ethyl octadecanoate) and fatty acids (hexadecanoic acid and

octadeca-9,12-dienoic acid) of long chains, thus contributing to the knowledge of the

chemical profile of this plant that has wide application in traditional medicine.

Keywords: Hibiscus sabdariffa, antioxidant potential, leishmanicidal activity

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Ácido acetil salicílico e penicilina G ......................................................... 14

Figura 2 – Cálices de Hibiscus sabdariffa L.............................................................. 18

Figura 3 – Flores de Hibiscus sabdariffa L. .............................................................. 19

Figura 4 – Antocianinas: cianidina 3-O-sambubiosídeo, delfinidina 3-O-

sambubiosídeo, cianidina 3-O-glucosídeo e delfinidina 3-O-glucosídeo ................... 20

Figura 5 – Ácido cítrico e pectina ............................................................................. 20

Figura 6 – Ácido hibisco, hibisco glucosídeo, hibisco 6-metil éster, gálico,

protocatecuico glucosídeo, cafeoilquínicos e quínico ................................................ 21

Figura 7 – Quercetina-3-O-rutinosídeo (rutina) ......................................................... 22

Figura 8 – Folhas de Hibiscus sabdariffa L............................................................... 22

Figura 9 – Kaempferol. ............................................................................................. 23

Figura 10 – Sementes de Hibiscus sabdariffa L. ...................................................... 24

Figura 11 – Esteróis: sitosterol, ergosterol e campesterol ........................................ 24

Figura 12 – Ácidos hidroxicítrico e hibisco................................................................ 25

Figura 13 – Cultivo de Hibiscus sabdariffa L. em 14/01/2015 (A), 12/03/2015 (B) ... 32

Figura 14 – Coleta das folhas de Hibiscus sabdariffa L. ........................................... 32

Figura 15 – Secagem das folhas em estufa com circulação de ar a 45 °C .............. 32

Figura 16 – Material vegetal de H. sabdariffa. In natura: pétalas (A), cálices (B) e

sementes (C). Seco: pétalas (A1), cálices (B1) e sementes (C1): Material seco ...... 33

Figura 17 – Moinho de facas: utilizado na trituração das folhas, pétalas, cálices e

sementes ................................................................................................................... 33

Figura 18 – Extração líquido/líquido do EE-Ca de H. sabdariffa ............................... 34

Figura 19 – Extração líquido/líquido do EE-Fo de H. sabdariffa ............................... 35

Figura 20 – Extração líquido/líquido do EE-Pe de H. sabdariffa ............................... 35

Figura 21 – Extração ácido/base do EE-Ca.............................................................. 36

Figura 22 – Extração ácido/base do EE-Fo .............................................................. 37

Figura 23 – CCD das frações hexano, inspeção a 254 nm ...................................... 44

Figura 24 – CCD das frações AcOEt, n-BuOH e hidrometanólica, inspeção a 254

nm ............................................................................................................................. 45

Figura 25 – CCD das frações hexano: Cálices (1), Folhas (2) e Pétalas (3) (FM:

Hex/AcOEt (6:4)) ....................................................................................................... 45

Figura 26 – CCD das frações AcOEt, n-BuOH e hidrometanólica: Cálices (1), Folhas

(2) e Pétalas (3) (FM AcOEt/HOAc/HCO2H/H2O (100:11:11:26)).............................. 45

Figura 27 – Reação do ácido gálico com o íon molibdênio ...................................... 47

Figura 28 – Curva de calibração para o ácido gálico ................................................ 48

Figura 29 – Reação de redução do radical DPPH .................................................... 50

Figura 30 – Consumo do DPPH do Extrato etanólico dos cálices ............................ 51

Figura 31 – Consumo do DPPH do Extrato etanólico das folhas ............................. 51

Figura 32 – Consumo do DPPH do Extrato etanólico das pétalas ........................... 52

Figura 33 – Consumo do DPPH da fração AcOEt dos cálices ................................. 52

Figura 34 – Consumo do DPPH da fração n-BuOH dos cálices ............................... 53

Figura 35 – Consumo do DPPH da fração AcOEt das folhas ................................... 53

Figura 36 – Consumo do DPPH da fração n-BuOH das folhas ................................ 54

Figura 37 – Consumo do DPPH da fração AcOEt das pétalas ................................. 54

Figura 38 – Consumo do DPPH da fração n-BuOH das pétalas .............................. 55

Figura 39 – Cromatograma de íons totais do EE-Se de H. sabdariffa ...................... 57

Figura 40 – EM-IE do composto referente ao tR 44,5 min ......................................... 59

Figura 41 – Proposta de fragmentação para o composto referente ao tR 44,5 min .. 60









Figura 50 – Proposta de fragmentação para o composto referente ao tR 45,9 min .. 64

Figura 51 – EM-IE do composto referente ao tR 51,4 min ........................................ 65

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Rendimento da coleta do material vegetal (Hibiscus sabdariffa L.)......... 42

Tabela 2 – Rendimento dos extratos etanólicos das folhas, cálices, pétalas e

sementes de Hibiscus sabdariffa L. ........................................................................... 42

Tabela 3 – Extração líquido/líquido de Hibiscus sabdariffa L. ................................... 43

Tabela 4 – Prospecção química ................................................................................ 46

Tabela 5 – Fenóis totais dos extratos e frações de H. sabdariffa ............................. 48

Tabela 6 – Potencial antioxidante dos extratos e frações de H. sabdariffa ............... 55

Tabela 7 – Substâncias propostas a partir da análise por CG-EM do EE-Se de H.

sabdariffa................................................................................................................... 58

Tabela 8 – Ensaios da atividade leishmanicida com L. amazonensis ....................... 67

LISTA DE ABREVIATURAS

AA – atividade antioxidante

AAS – ácido acetil salicílico

AcOEt – acetato de etila

BHI – Brain-Heart Infusion

CCD – cromatografia em camada delgada

CC50 – concentração citotóxica média

CE50 – concentração efetiva média

CI50 – concentração inibitória média

CG-EM – cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

DMEM – Dulbecco’s modified Eagle’s médium

DMSO – dimetilsulfóxido

DPPH – 2,2-difenil-picrilhidrazila

EAG – Equivalentes de ácido gálico

EE-Ca – extrato etanólico dos cálices

EE-Pe – extrato etanólico das pétalas

EE-Fo – extrato etanólico das folhas

EE-Se – extrato etanólico das sementes

EM – Espectrometria de massas

FE – Fase estacionária

FM – Fase móvel

FT – Fenóis totais

Hex – hexano

HOAc – ácido acético

IA – índice aritmético

Iodocloroplatinato – IClPt

IS – índice de seletividade

MeOH – metanol

n-BuOH – n-butanol

OMS – Organização Mundial da Saúde

PBS – Phosphate Buffered Saline

RMN – Ressonância magnética nuclear

tR – tempo de retenção

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 14

1.1 PRODUTOS NATURAIS – ASPECTOS GERAIS ............................................... 14

1.2 CARACTERÍSTICAS DO Hibiscus sabdariffa L. ................................................. 17

1.2.1 Cálice e flores de Hibiscus sabdariffa .......................................................... 18

1.2.2 Folhas de Hibiscus sabdariffa ....................................................................... 22

1.2.3 Sementes de Hibiscus sabdariffa ................................................................. 23

1.3 ATIVIDADE BIOLÓGICA CONTRA Leishmania amazonensis ........................... 25

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 27

3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 28

3.1 INSTRUMENTAÇÃO ........................................................................................... 28

3.2 MATERIAIS UTILIZADOS ................................................................................... 28

3.2.1 Reagentes e solventes ................................................................................... 28

3.2.2 Cromatografia ................................................................................................. 29

3.3 REVELADORES UTILIZADOS ........................................................................... 29

3.3.1 Revelador ácido fosfomolíbdico ................................................................... 29

3.3.2 Revelador anisaldeído ................................................................................... 29

3.3.3 Revelador Dragendorff ................................................................................... 30

3.3.4 Revelador iodocloroplatinato ........................................................................ 30

3.3.5 Revelador Liebermann-Burchard .................................................................. 30

3.3.6 Revelador NP/PEG.......................................................................................... 30

3.3.7 Revelador vanilina sulfúrica .......................................................................... 31

3.4 COLETA E PREPARO DO MATERIAL VEGETAL ............................................. 31

3.5 PREPARO DOS EXTRATOS DE Hibiscus sabdariffa L. .................................... 34

3.6 EXTRAÇÃO LÍQUIDO/LÍQUIDO DO ETRATO ETANÓLICO DOS CÁLICES,

FOLHAS E PÉTALAS DE Hibiscus sabdariffa L. .................................................... 34

3.7 EXTRAÇÃO ÁCIDO/BASE DOS EXTRATOS EE-Ca e EE-Fo ........................... 36

3.8 DETERMINAÇÃO DE FENÓIS TOTAIS (FT) PELO MÉTODO DE FOLIN-

CIOCALTEAU ........................................................................................................... 37

3.9 AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ........................ 38

3.10 ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA GASOSA-ESPECTROMETRIA DE

MASSAS (CG-EM) PARA AS SEMENTES ............................................................... 39

3.11 ENSAIO LEISHMANICIDA ................................................................................ 39

3.12 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE ....................................................................... 40

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 42

4.1 RENDIMENTO DA COLETA DO MATERIAL VEGETAL (H. sabdariffa L.) ........ 42

4.2 RENDIMENTO DOS EXTRATOS ETANÓLICOS ............................................... 42

4.3 EXTRAÇÃO LÍQUIDO/LÍQUIDO DOS EXTRATOS ETANÓLICOS DE Hibiscus

sabdariffa L. ............................................................................................................... 43

4.4 AVALIAÇÃO ALCALOÍDICA DOS EXTRATOS ETANÓLICOS DOS CÁLICES E

FOLHAS .................................................................................................................... 44

4.5 DETERMINAÇÃO DO PERFIL CROMATOGRÁFICO DOS EXTRATOS

ETANÓLICOS DOS CÁLICES, FOLHAS E PÉTALAS POR CCD ............................ 44

4.6 DETERMINAÇÃO DE FENÓIS TOTAIS PELO MÉTODO DE FOLIN-

CIOCALTEAU ........................................................................................................... 47

4.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELO MÉTODO DO

RADICAL DPPH ........................................................................................................ 49

4.8 ANÁLISE POR CG-EM DO EXTRATO ETANÓLICO DAS SEMENTES DE H.

sabdariffa................................................................................................................... 56

4.9 ENSAIOS LEISHMANICIDA E DE CITOTOXICIDADE ....................................... 65

5 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 68

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 69

14

1 INTRODUÇÃO

1.1 PRODUTOS NATURAIS – ASPECTOS GERAIS

Os produtos naturais são utilizados há milhares de anos para tratamento de

ferimentos, alívio das dores (BOLZANI; VIEGAS; BARREIRO, 2006) e como corantes,

além dos bálsamos que eram utilizados como repelentes e odorizadores (PINTO,

1995). No Brasil, os colonizadores exploraram o pau-brasil até o século XIX que era

utilizado exclusivamente como corante para tingimento de roupas e tinta para a escrita

(PINTO, 1995).

O conhecimento popular contribui para a pesquisa dos produtos naturais ao

longo do tempo, tanto para o conhecimento das estruturas químicas quanto para as

propriedades biológicas, como por exemplo, o ácido acetil salicílico (AAS) e a penicilina

(Figura 1), ambos com grande impacto na indústria farmacêutica. (BOLZANI; VIEGAS;

BARREIRO, 2006).

Figura 1 – Ácido acetil salicílico e penicilina G.

HN

O

penicilina G

O OH

O CH3

O

ácido acetil salicílico

N

S

O

HOO

Fonte: Autora, 2017.

No Brasil, as plantas são consideradas a principal fonte de novos fármacos

devido às condições favoráveis de coleta do material, à biodiversidade do país e à

possibilidade de encontrar novos princípios ativos (BRAZ-FILHO, 2010). Diversas

plantas tropicais têm sido utilizadas popularmente e encontram-se documentadas por

dados etnobotânicos (BRAZ-FILHO, 2010). Os métodos cromatográficos e

espectrométricos, principalmente a espectrometria de massas (EM) e a ressonância

magnética nuclear (RMN), são práticas amplamente utilizadas nas investigações

metabolômicas (BRAZ-FILHO, 2010).

Os metabólitos são moléculas orgânicas oriundas de reações biossintéticas que

15

ocorrem em organismos como animais, vegetais e micro-organismos. Esses

metabólitos podem ser primários ou secundários, os primários são responsáveis pelas

reações essenciais do organismo como a respiração, fotossíntese e transporte de

solutos. Os metabólitos secundários consistem na interação química entre os

organismos e o ambiente ao seu redor (EMERY; SANTOS; BIANCHI, 2010; GOBBO-

NETO; LOPES, 2007).

Vale destacar que os metabólitos secundários das plantas podem apresentar

diversas bioatividades, como a proteção e prevenção contra doenças degenerativas,

atuando, por exemplo, como antioxidantes (OBOUAYEBA et al., 2014), que bloqueiam

o efeito danoso dos radicais livres (FYNLAYS TEA SOLUTIONS, 2009).

O isolamento e a identificação de compostos orgânicos produzidos pelo

metabolismo secundário são de grande importância para a química de produtos

naturais e para o avanço de outras atividades científicas e tecnológicas. As substâncias

extraídas da flora brasileira têm contribuído para o desenvolvimento social, econômico,

científico e tecnológico no país (BRAZ-FILHO, 1994) como, por exemplo, o Hipérico

(Hypericum perforatum), indicado para tratamento de problemas de depressão oriundo

da erva de São João (CORDEIRO et al., 2005) e Fitoscar (Stryphnodendron

adstringens) indicado como cicatrizante em vários tipos de lesões de pele, oriundo do

barbatimão (MENDONÇA, 2011).

As plantas superiores compõem uma das fontes importantes para a descoberta

de novas substâncias que além de atuarem como agentes medicinais contribuem com

a química orgânica sintética fornecendo modelos estruturais, além de permitir a

modificação destas buscando a otimização das propriedades farmacológicas e

bioquímicas (BRAZ-FILHO, 2010).

Na busca de novos fármacos, a síntese e avaliação biológica passaram a ter um

custo muito elevado, pois poucos compostos venciam as etapas pré-clínicas e clínicas

para tornar-se um medicamento. Neste sentido, os produtos naturais recuperaram

espaço na indústria farmacêutica como fitoterápicos e como fonte inspiradora de novos

padrões moleculares (BOLZANI, VIEGAS, BARREIRO, 2006).

A utilização de medicamentos naturais é uma tendência mundial, tanto que nos

últimos dez anos a aplicação de plantas para tratamento de diversas patologias

aumentou consideravelmente (OBOUAYEBA et al., 2014).

Por outro lado, Harvey, Edrada-Ebel e Quinn (2015) descreveram que a

utilização de produtos naturais para descoberta de novos fármacos diminuiu nas

16

últimas duas décadas. Em parte, isto ocorreu devido a barreiras técnicas para efetuar

as triagens biológicas automatizadas em alta escala (HTS, do inglês high-throughput

screening) dos produtos naturais em diversos alvos biomoleculares (RISHTON, 2008

apud HARVEY; EDRADA-EBEL; QUINN, 2015).

Mesmo considerando este panorama, a pesquisa nesta área ainda é relevante,

já que os produtos naturais apresentam uma vasta variedade de grupos farmacofóricos

e, muitas vezes, compostos com estereoespecificidade o que possibilita a descoberta

de novos candidatos a fármacos. Além disto, estudos revelaram que tais compostos,

em muitos casos, não são somente biologicamente ativos como apresentam bons

perfis de biodisponibilidade, o que é essencial no desenvolvimento de um medicamento

(DREWRY; MACARRON, 2010 apud HARVEY; EDRADA-EBEL; QUINN, 2015).

Estudos fitoquímicos mostram que alcaloides, por exemplo, são amplamente

utilizados como agentes quimioterapêuticos do câncer (OCHO-ANIN et al., 2010), as

saponinas apresentam propriedades depressoras de hipertensos e cardíacos, além de

oferecer estratégia de prevenção do risco de câncer (HALLIWELL, GUTTERIDGE,

CROSS,1992 apud OBOUAYEBA et al., 2014).

Os polifenóis, por exemplo, flavonoides, cumarinas, ácido clorogênio e taninos,

são especialmente utilizados como anti-inflamatórios, antivirais e citotóxicas, têm

propriedades antioxidantes relevantes (ZHANG, 2011 apud OBOUAYEBA et al., 2014),

podem atuar na cura e prevenção de problemas renais e do estômago, doenças

neurodegenerativas e outros processos patológicos tais como envelhecimento,

doenças coronárias, Alzheimer e cataratas (CHEN et al., 2003 apud OBOUAYEBA et

al., 2014).

Os flavonoides são bem conhecidos pela sua atividade antiviral, anti-

inflamatória, antioxidante, citotóxica e são também utilizados no tratamento da

hipertensão, diabetes e febre reumática (AKANBI et al., 2009).

Os taninos diminuem a proliferação bacteriana, bloqueando enzimas chave no

metabolismo microbiano, são antioxidantes (TOM et al., 2013 apud OBOUAYEBA et

al., 2014), adstringentes, e utilizados para tratar desordens intestinais, tais como

diarreia e disenteria (DHARMANANDA, 2003 apud OBOUAYEBA et al., 2014). E as

antocianinas são cardioprotetoras, antioxidantes e hepatoprotetoras (WANG et al.,

2000 apud OBOUAYEBA et al., 2014 ).

17

1.2 CARACTERÍSTICAS DO Hibiscus sabdariffa L.

O gênero Hibiscus pertence à família Malvaceae e compreendem mais de 300

espécies de ervas anuais ou perenes, arbustos ou árvores. A espécie Hibiscus

sabdariffa Linnaeus é uma herbácea anual, podendo atingir 2,4 m de altura, de fácil

cultivo sendo encontrada em regiões tropicais e subtropicais, especialmente na Índia,

Arábia Saudita, China, Malásia, Indonésia, Filipinas, Vietnã, Sudão, Egito, Nigéria e

México. É utilizada nas indústrias farmacêutica e alimentícia e sua fibra pode ser

utilizada em confecções de vestuários, redes de pesca e cordas (BORRÁS-LINARES et

al., 2015).

A planta pode ser cultivada tanto em solo rico, quanto pobre de drenagem,

possui um período de 4 a 8 meses de crescimento e, durante o cultivo, é ideal ter uma

temperatura noturna em torno de 20 ºC e 13 horas de sol diárias. H. sabdariffa L. é

sensível ao frio (MOHAMED et al., 2007) e muita chuva ou alta umidade pode

comprometer a qualidade e rendimento da planta (DA-COSTA-ROCHA et al., 2014).

H. sabdariffa L. é conhecida como rosélia, bissap, oseille de guinée, karkadeh,

azedinha, caruru-azedo, pampolha, papoula-de-duas-cores, quiabo-azedo, quiabo-roxo

e vinagreira (RAMOS et al., 2011), já seu chá é conhecido como chá de hibisco, zobo,

roselle, azeda vermelha, chá de leite, água de Jamaica e karkade (ZHEN et al., 2016;

SINDI; MARSHALL; MORGAN, 2014).

Essa planta é conhecida como uma erva aromática, refrescante, adstringente,

diurética, antiescorbútica, antisséptica, afrodisíaca, emoliente, digestiva e laxativa.

Popularmente, é usada no tratamento de abscessos, câncer, tosse, fraqueza, febre,

ressaca e doenças cardíacas (VILASINEE et al., 2005 apud OBOUAYEBA et al., 2014).

H. sabdariffa L. contém proteínas, gorduras, carboidratos, ácidos, sais minerais,

vitaminas e diversos tipos de compostos fenólicos (BORRÁS-LINARES et al., 2015).

No entanto, o perfil químico da planta é afetado pela variabilidade genética, tipo de solo

e solvente de extração (WANG et al.,2015; OBOUAYEBA et al., 2014). Neste sentido, é

difícil comparar os dados disponíveis na literatura devido às diferentes condições de

cultivo, armazenamento e extração (SINDI; MARSHALL; MORGAN, 2014; RAMIREZ-

RODRIGUES et al., 2011).

18

1.2.1 Cálice e flores de Hibiscus sabdariffa

O cálice (Figura 2), anel externo envolto do fruto, é comumente utilizado em

muitos lugares do mundo na forma de bebidas e alimentos como chás, compotas e

geleias (LEPENGUE et al., 2009).

Figura 2 – Cálices de Hibiscus sabdariffa L.


As flores de H. sabdariffa L. (Figura 3) são amarelas com um círculo interno

(“olho”) rosa ou marrom, se tornam rosa durante a maturação (ESEZOBOR et al., 2016;

MOHAMED et al., 2007) e murcham no final do dia (MOHAMED et al., 2007). São

consumidas cruas ou cozidas em saladas, para tempero de molhos, sopas e como

aromatizante em bolos (OBOUAYEBA et al., 2014). Além disto, os cálices podem ser

utilizados no preparo de bebidas à base de ervas, vinhos, bebidas fermentadas,

chocolate, sorvete corantes, aromatizante e como ingrediente de rum (IMAIL, IKRAM,

NAZRI, 2008 apud DA-COSTA-ROCHA et al., 2014). No Egito elas são usadas para

fazer uma bebida refrescante ácida conhecida como Karkade (MOHAMED et al., 2007).

19

Figura 3 – Flores de Hibiscus sabdariffa L.


Os componentes químicos das flores secas de H. sabdariffa descritos na

literatura são: polissacarídeos (mucilagem, pectina e carboidratos), arabinose,

galactose, glucose, ramnose e, em menores quantidades, o ácido galacturônico, ácido

glucurônico, manose e xilose. Elas são ricas em antocianinas (Figura 4), que

compreendem o maior grupo de pigmentos naturais solúveis em água e são

responsáveis pela cor vermelha (ESEZOBOR et al., 2016; DA-COSTA-ROCHA et al.,

2014), além de possuírem ácido cítrico e pectina (Figura 5) (SINDI; MARSHALL;

MORGAN, 2014; LEPENGUE et al., 2009), por isso é útil na preparação de doces e

geleias (LEPENGUE et al., 2014).

20

Figura 4 – Antocianinas: cianidina 3-O-sambubiosídeo, delfinidina 3-O-sambubiosídeo, cianidina 3-O-glucosídeo e delfinidina 3-O-glucosídeo

OHO

OH

OH

OH

O Glc

Xyl

cianidina 3-O-sambubiosídeo

OHO

OH

OH

OH

OH

O Glc

Xyl

delfinidina 3-O-sambubiosídeo

O

OH

OH

O Glc

OH

HO

cianidina 3-O-glucosídeo

OHO

OH

OH

OH

O Glc

OH

delfinidina 3-O-glucosídeo

Glc: Glicose; Xyl: xilose


Figura 5 - Ácido cítrico e pectina

OHHO

OOO OH

OH

COOH

OH

OH

O

OH

COOCH3

OH

O

COOH

OH

OH

O

OH

COOCH3

OH

Ácido cítrico Pectina


Nas pétalas são encontrados os polifenóis, que têm sido alvo de muitas

pesquisas pelos seus benefícios à saúde. Vários estudos demonstram atividades

biológicas destes metabólitos no tratamento de problemas renais, hipertensão e

leucemia, além de ser excelente antioxidante, anti-inflamatória, cardioprotetora, e

antibacteriana (OBOUAYEBA et al., 2014).

Ramirez-Rodrigues e seus colaboradores (2011) realizaram um estudo da

extração de metabólitos dos cálices frescos e secos utilizando água em duas

temperaturas (25 °C e 90 °C) e não observaram alterações nos teores de antocianinas,

enquanto que os fenóis foram mais extraídos em água quente do que em água fria. Em

21

ambos os extratos foi observado o ácido hibisco e dois derivados (ácido hibisco

glucosideo e ácido hibisco 6-metil éster), o ácido gálico, o ácido protocatecuico

glucosideo e os ácidos cafeoilquínicos e quínico (Figura 6) (RAMIREZ-RODRIGUES et

al., 2011).

Figura 6 – Ácido hibisco, hibisco glucosídeo, hibisco 6-metil éster, gálico, protocatecuico glucosídeo, cafeoilquínicos e quínico.


As flores têm sido utilizadas no tratamento contra a leucemia devido ao seu alto

teor em polifenóis, particularmente o ácido protocatecuico (MOHAMED et al., 2007).

Estudos em ratos e coelhos revelaram que o extrato das flores inibiu a ação da

lipoproteína (LDL) e diminuiu os níveis de colesterol nestes animais. Posteriormente,

pesquisadores em Taiwan realizaram um estudo em humanos com o chá de

H. sabdariffa e comprovaram a redução dos níveis de colesterol (LIN et al., 2007).

Experiências com aves domésticas mostraram que o extrato dos cálices de

H. sabdariffa foi capaz de reduzir a intoxicação resultante do consumo de álcool pela

queda na sua taxa de absorção pelo organismo (MORTON, 1987 apud ALAGA et al.,

2014).

22

As propriedades antibacterianas do extrato aquoso e etanólico foram avaliadas,

sendo que as maiores concentrações de substâncias bioativas foram obtidas no extrato

etanólico, enquanto que as saponinas foram extraídas tanto por água quanto por

etanol. Os metabólitos encontrados em ordem quantitativa foram: os flavonoides, como

a quercetina (Figura 7), e saponinas (ALAGA et al., 2014).

Figura 7 – Quercetina-3-O-rutinosídeo (rutina)

O

OH O

HO

O

OH

OH

RamGlc

Ram: Raminosídeo; Glc: Glicose


1.2.2 Folhas de Hibiscus sabdariffa

As folhas (Figura 8) são verdes com veias avermelhadas e pecíolos longos ou

curtos de margens dentadas e podem atingir de 7,5 a 12,5 cm de comprimento

(MOHAMED et al., 2007). São consumidas cruas ou cozidas em saladas e como

tempero em vários países (OBOUAYEBA et al., 2014; ZHEN et al., 2016).

Figura 8 – Folhas de Hibiscus sabdariffa L.


Grande parte dos estudos de H. sabdariffa é realizada com os cálices e, apesar

23

do volume crescente de investigação, são poucos os estudos fitoquímicos das folhas

(ZHEN et al., 2014).

Algumas atividades biológicas são atribuídas a extratos deste órgão da planta,

tais como: atividade antioxidante moderada, anti-hiperlipidêmica, antiaterosclerótica,

antiproliferativa (ZHEN et al.,2016), antisséptico, digestiva, diurética, refrigerante,

sedativa e tônico (OLALEYE, 2007).

Os principais constituintes químicos presentes na folha de H. sabdariffa são os

ácidos fenólicos e os flavonoides (RODRÍGUEZ-MEDINA, et al., 2009), sendo três

diferentes ácidos isômeros, ácido 3-cafeoilquínico (ácido clorogênico), ácido 4-

cafeoilquínico (ácido criptoclorogênico) e ácido 5-cafeoilquínico (ácido neoclorogênico)

(Figura 6) e os flavonoides, quercetina (Figura 7) e kaempferol (Figura 9) que possuem

atividade anti-inflamatória (RODRÍGUEZ-MEDINA, et al., 2009).

Figura 9 - Kaempferol

O

OH

OH

HO

OOH


1.2.3 Sementes de Hibiscus sabdariffa

As sementes (Figura 10), na África, são moídas e consumidas como farinha

devido ao seu alto teor de proteínas e também são torradas para utilizar como

substituto para o café (MORTON, 1987 apud MOHD-ESA et al., 2010). No norte da

Nigéria as sementes são fermentadas na presença de algumas especiarias para

preparar um alimento conhecido como Mungza Ntusa (MOHAMED et al., 2007).

24

Figura 10 – Sementes de Hibiscus sabdariffa L.


Nas sementes de H. sabdariffa é encontrado uma quantidade de óleo que se

assemelha ao encontrado na semente de algodão (MOHAMED et al., 2007). Possuem

um grupo de compostos menos polares como os esteróis sitosterol, ergosterol e

campesterol (Figura 11) (DA-COSTA-ROCHA et al., 2014; BORRÁS-LINARES, et al.,

2015).

Figura 11 – Esteróis: sitosterol, ergosterol e campesterol

HO

H

H

H

H

sitosterol

H H

HO

H

ergosterol

H

HO

H H

H

campesterol


É possível identificar a presença de componentes voláteis no óleo das

25

sementes, constituídos principalmente por hidrocarbonetos insaturados, álcoois e

aldeídos com número de carbonos entre 8 e 13. Em estudos posteriores, foi

comprovada a presença de 37 compostos voláteis em cinco diferentes variedades de

Hibiscus sabdariffa que podem ser classificados em álcoois, aldeídos, cetonas,

terpenos e ácidos, como o ácido hidroxicítrico e hibisco (Figura 12) (DA-COSTA-

ROCHA et al., 2014).

Figura 12 – Ácidos hidroxicítrico e hibisco.


Grande parte dos estudos realizados com Hibiscus sabdariffa L. são limitados

aos extratos etanólicos e aquosos dos cálices, devido ao amplo consumo desta planta

na forma de chá. Entretanto, considerando suas propriedades medicinais, é relevante

avaliar o perfil químico dos diferentes órgãos da planta, assim como avaliar o potencial

antioxidante, uma vez que esta atividade está relacionada ao tratamento de diversas

patologias, tais como câncer, doenças cardiovasculares, cataratas, disfunções

cerebrais, doenças degenerativas e processos inflamatórios (RAMOS et al., 2011).

Além disto, dados etnofarmacológicos descritos por Odonne e colaboradores

(2011) revelaram que as folhas e caules de H. sabdariffa são utilizados na forma de

suco como forma alternativa para a profilaxia da leishmaniose cutânea (ODONNE et

al., 2011). Nesse sentido, é interessante avaliar o potencial leishmanicida dos

diferentes órgãos da planta.

1.3 ATIVIDADE BIOLÓGICA CONTRA Leishmania amazonensis

A leishmaniose é uma doença causada por diferentes protozoários do gênero

Leishmania. Os parasitas são transmitidos através da picada do mosquito (mosquito-

26

palha) infectado. É uma das doenças mais negligenciadas no mundo; dois milhões de

novos casos ocorrem anualmente (WHO, 2010).

A manifestação pode ser cutânea ou visceral, podendo atingir crianças, idosos e

pessoas com outras doenças crônicas. Em 2010, os especialistas da OMS

recomendaram, para o tratamento da leishmaniose, o uso de testes rápidos de

diagnóstico, controle dos detalhes das infecções com outras doenças crônicas, além de

fatores sociais e mudanças climáticas como fatores de risco (WHO, 2010).

Estima-se que mais de 90% dos casos de leishmania visceral está concentrada

em Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Nepal e Sudão; e até 90% dos casos de

leishmania cutânea ocorrem no Afeganistão, Argélia, República Islâmica do Irã, Arábia

Saudita, Síria, Bolívia, Colômbia, Nicarágua, Peru e Brasil. Na Índia, estudos realizados

sugeriu que cerca de 20% dos pacientes com leishmaniose visceral, pobres e

mulheres, morreram antes do seu reconhecimento (WHO, 2010).

Na última década, foi dada uma atenção considerável às plantas na busca por

novos compostos leishmanicidas, já que os produtos naturais são uma fonte preciosa

de novas arquiteturas moleculares (RIBEIRO et al., 2014).

Existem poucos fármacos disponíveis no mercado para o tratamento dessa

patologia, sendo que todos são tóxicos. Além disto, a resistência parasitária vem

aumentando de maneira alarmante nos últimos anos. Considerando esse panorama, a

busca de novas alternativas terapêuticas para o tratamento da leishmaniose é um tema

relevante (RIBEIRO et al., 2014).

27

2 OBJETIVOS

1) Estudo químico das pétalas, folhas, cálices e sementes de Hibiscus

sabdariffa L.

2) Comparar o perfil químico destes órgãos.

3) Avaliar o potencial antioxidante e leishmanicida dos diferentes órgãos da

planta.

4) Avaliar a citotoxicidade dos extratos e frações dos diferentes órgãos da

planta.

28

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 INSTRUMENTAÇÃO

Balança analítica – Shimadzu (modelo AY220)

Estufa (modelo DeLeo), com circulação de ar;

Moinho de facas (modelo Willye Star FT50 – Fortinox);

Rotaevaporador da marca Tecnal (modelo TE-2005), com banho a 45 °C e

refrigeração a 8 °C;

Espectrofotômetro (UV-VIS Spectrophotometer) da marca Thermo (modelo

GENESYS 10S);

Cromatógrafo gasoso acoplada a espectro de massas – Shimadzu (modelo

GC2010/QP5010).

3.2 MATERIAIS UTILIZADOS

3.2.1 Reagentes e solventes

Acetato de etila (C4H8O2): CRO – Cromato Produtos Químicos PA

Ácido acético glacial (H3CCO2H): Quemis PA ACS

Ácido clorídrico (HCl): Vetec PA

Ácido fórmico (HCO2H): Real Química

Ácido fosfomolibdico (H3PMo12O40): INLAB

Ácido gálico (C7H6O5): Vetec PA

Ácido sulfúrico (H2SO4): Quemis PA ACS

Carbonato de sódio (Na2CO3): Reagen PA

Clorofórmio (CHCl3): Proquímios

Diclorometano (CH2Cl2): Vetec PA

Etanol (C2H5OH): Cromoline PA

Hidróxido de amônio (NH4OH): Vetec PA

Hexano (C6H14): Proquímios PA

Metanol (CH3OH): Sigma Aldrich HPLC

n-Butanol (C4H9OH): Êxodo científica PA ACS

p-anisaldeído (C8H8O2): Sigma Aldrich

29

Reagente de Folin-Ciocalteau (H3PMo12O40 e H3PW12O40): Cromoline PA

Vanilina (C8H8O3): Isofor PA

2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH) (C18H12N5O6): Sigma Aldrich PA

3.2.2 Cromatografia

Para a cromatografia em camada delgada (CCD) foi utilizada como fase

estacionária sílica gel 60 com indicador de fluorescência (UV254) 0,20 mm de

espessura (Macherey-Nagel).

3.3 REVELADORES UTILIZADOS

As visualizações em placas cromatográficas utilizaram os seguintes reveladores

3.3.1 Revelador ácido fosfomolíbdico

Solução de ácido fosfomolíbdico em etanol 20% (m/v) (WAGNER; BLADT,

1996).

Detecta: substâncias redutoras (antioxidantes, ácido ascórbico, vitamina E,

esteroides, ácidos biliares, lipídeos, fosfolipídeos, ácidos graxos ou seus ésteres

metílicos, triglicerídeos, prostaglandinas, fenóis e terpenos) (JORK, et al, 1990).

3.3.2 Revelador anisaldeído

Um volume de 0,5 mL de anisaldeído é misturado com 10 mL de ácido acético

glacial, 85 mL de metanol e 5 mL de ácido sulfúrico concentrado, nesta ordem

(WAGNER; BLADT, 1996).

Detecta: antioxidantes, esteroides, prostaglandinas, carboidratos, fenóis,

glicosídeos, saponinas, terpenos, antibióticos (macrolídeos e tetraciclinas) e

micotoxinas (JORK, et al, 1990).

30

3.3.3 Revelador Dragendorff

Solução A: 0,85 g de nitrato de bismuto em solução de 10 mL de ácido acético

glacial e 40 mL de água.

Solução B: 8,0 g de iodeto de potássio (KI) em 30 mL de água.

Solução estoque: misturar A + B na proporção 1:1

Solução spray: 1 mL da solução estoque + 2 mL de ácido acético + 10 mL de

água.

Detecta: alcaloides (WAGNER; BLADT, 1996).

3.3.4 Revelador iodocloroplatinato

Solução A: Solução aquosa a 5% (m/m) de ácido hexacloroplatínico IV.

Solução B: Solução aquosa a 10% (m/m) de iodeto de potássio.

Solução spray: 1 mL da solução A + 9 mL da solução B + 10 mL de água

(WAGNER; BLADT, 1996).

Detecta: compostos nitrogenados, compostos de amônio quaternário, tióis,

tioéteres, sulfóxidos, cetosteroides e vitaminas (JORK, et al, 1990).

3.3.5 Revelador Liebermann-Burchard

Solução: 5 mL de anidrido acético e 5 mL de ácido sulfúrico concentrado são

adicionados cuidadosamente em 50 mL de etanol sob banho de gelo.

Detecta: Triterpenos (WAGNER; BLADT, 1996).

3.3.6 Revelador NP/PEG

Solução A: ácido β-etilaminodifenilbórico éster 1% em metanol

Solução B: polietilenoglicol-4000 5% em etanol.

Solução spray: 10 mL da solução A + 8 mL da solução B.

Detecta: Flavonoides (WAGNER; BLADT, 1996).

.

31

3.3.7 Revelador vanilina sulfúrica

Solução A: Vanilina em etanol 1% (m/v).

Solução B: Ácido sulfúrico 10% em etanol (v/v).

Solução spray: Borrifar A e imediatamente B (WAGNER; BLADT, 1996).

Detecta: esteroides, esteróis, triterpenos, prostaglandinas e saponinas (JORK, et

al, 1990).

3.4 COLETA E PREPARO DO MATERIAL VEGETAL

As pétalas, folhas, cálices e sementes de Hibiscus sabdariffa L. foram obtidos a

partir do material vegetal coletado no Instituto Federal do Triângulo Mineiro –

Uberaba/MG, cuja exsicata foi enviada para a profa. Dra. Livia Echternacht Andrade,

curadora do herbário da Universidade Federal de Uberlândia (Herbarium Uberlandense

- HUFU). A determinação taxonômica foi feita pelo especialista Aluisio Fernandes

Júnior, sendo que a exsicata está depositada no HUFU sob o nº 68457.

As folhas foram coletadas em 13 de abril de 2015 (coordenadas S: 19° 39’

42,45”; O: 47° 57’ 45,86” e altitude 781,1m) (Figuras 13 e 14). O material coletado foi

colocado em sacos de papel, levados para o laboratório e secos em estufa com

circulação de ar a 45 ºC por cinco dias (Figura 15).

As pétalas foram coletadas nos dias 21, 22, 28 de maio, e 03 e 09 de junho de

2015 (início do período de floração). O material coletado foi armazenado em caixas de

papel, transportado para o laboratório e seco em estufa. Os cálices e sementes foram

coletados no dia 17 de junho de 2015 (final do período de floração), transportados para

o laboratório e secos em estufa com circulação de ar a 45° C (Figura 16). As coletas

foram realizadas no período da manhã com tempo limpo e temperatura em média de

24 °C.

Folhas, pétalas, sementes e cálices depois de secos foram triturados em

moinho de facas (Figura 17) obtendo-se assim o material seco, triturado e pesado, os

quais foram submetidos à extração com etanol.

32

Figura 13 – Cultivo de Hibiscus sabdariffa L. em 14/01/2015 (A), 12/03/2015 (B).


Figura 14 – Coleta das folhas de Hibiscus sabdariffa L.


Figura 15 – Secagem das folhas em estufa com circulação de ar.


A B

33

Figura 16 – Material vegetal de H. sabdariffa. In natura: pétalas (A), cálices (B) e sementes (C); Seco: pétalas (A1), cálices (B1) e sementes (C1); Material seco.


Figura 17 – Moinho de facas: utilizado na trituração das folhas, pétalas, cálices e sementes.


A B C

A1 B1

B1

B1

B1

B1

B1

B1

B1

B1

B1 B

B

C1

A

A1

34

3.5 PREPARO DOS EXTRATOS DE Hibiscus sabdariffa L.

Os cálices, folhas, pétalas e sementes foram submetidos à extração com etanol,

com intervalo de quatro dias entre uma extração e outra, sendo este processo repetido

até a exaustão assim, foi realizado três vezes para as pétalas, cinco vezes para as

folhas e quatro vezes para os cálices e sementes. O material vegetal com etanol foi

mantido à temperatura ambiente sem exposição à luz durante os intervalos de cada

extração. Em seguida o etanol foi filtrado e o solvente evaporado em evaporador

rotativo (ALAGA et al., 2014; SOUSA et al., 2007).

3.6 EXTRAÇÃO LÍQUIDO/LÍQUIDO DO EXTRATO ETANÓLICO DOS CÁLICES,

FOLHAS E PÉTALAS DE Hibiscus sabdariffa L.

Os extratos etanólicos dos cálices (EE-Ca) (74,6 g), das folhas (EE-Fo) (10,0 g)

e das pétalas (EE-Pe) (10,0 g), foram solubilizados em metanol/água (9:1) e em

seguida submetidos a extração líquído-líquido com hexano, AcOEt e n-BuOH (Figuras

18–20). O extrato etanólico das sementes não foi submetido à extração líquido/líquido

por apresentar característica oleosa.

Figura 18 – Extração líquido/líquido do EE-Ca de H. sabdariffa.

EE-Ca 74,6 g

1. MeOH/H2O (9:1) (300 mL)

2. Filtração

Resíduo insolúvel4,2 g (5,6%)

Solução Hidrometanólica

F. Hexano1,0 g (1,3%)

Hexano (4 200 mL)


AcOEt (4 200mL)

F. AcOEt22,4 g (30,0%)


n-BuOH (4 200mL)

F. n-BuOH27,0 g (36,2%)

Solução Hidrometanólica26,6 g (35,7 %)


35

Figura 19 – Extração líquido/líquido do EE-Fo de H. sabdariffa.

EE-Fo 10,0 g

1. MeOH/H2O (9:1) (50 mL)

2. Filtração



F. Hexano0,6 g (6,0%)

Hexano (4 30 mL)


AcOEt (4 30mL)

F. AcOEt0,5 g (5,0%)


n-BuOH (4 30mL)

F. n-BuOH1,9 g (19,0%)

Solução Hidrometanólica1,3 g (13,0%)


Figura 20 – Extração líquido/líquido do EE-Pe de H. sabdariffa.

EE-Pe 10,0 g

1. MeOH/H2O (9:1) (50 mL)

2. Filtração



F. Hexano0,6 g (6,0%)

Hexano (4 30 mL)


AcOEt (4 30mL)

F. AcOEt1,2 g (12,0%)


n-BuOH (4 30mL)

F. n-BuOH2,1 g (21,0%)

Solução Hidrometanólica3,3 g (33,0%)


36

3.7 EXTRAÇÃO ÁCIDO/BASE DOS EXTRATOS EE-Ca e EE-Fo

Os extratos EE-Ca e EE-Fo foram submetidos à extração ácido/base (Figuras

21 e 22). Inicialmente 1,0 g de cada um dos extratos foi solubilizado em 30 mL de

HCl (5%), filtrado e submetido a extração líquido-líquido com diclorometano (3 × 15

mL). Em seguida foi adicionado NH4OH (30%) até pH 10 e a solução aquosa

submetida novamente a extração líquido-líquido com diclorometano (3 × 15 mL). O

solvente da fração orgânica foi evaporado e em seguida esta fração foi submetida à

CCD utilizando sílica gel como fase estacionária (FE) e CHCl3/MeOH/NH4OH

(9:1:0,25) como fase móvel (FM). Depois de desenvolvidas, as placas foram

reveladas sob luz UV 254 ou 365 nm ou aspergidas com os reveladores

iodocloroplatinato (IClPt) e Dragendorff, específicos para identificação de alcaloides

(FRANCISCO et al, 2012; AZEVEDO et al, 2014).

Figura 21 – Extração ácido/base do EE-Ca

EE-Ca 1,0 g

1. Solução aquosa de HCl 5% (30 mL)2. Filtração

Resíduo insolúvel Solução ácida

CH2Cl2 (3 15 mL)

Fração CH2Cl2 Solução ácida

1. NH4OH até pH 9-11

2. CH2Cl2 (3 15 mL)

Fração aquosa Fração CH2Cl2

0,0811 g (8,11%)

0,6780 g (67,8%) 0,0039 g (0,39%)


37

Figura 22 – Extração ácido/base do EE-Fo

EE-Fo 1,0 g

1. Solução aquosa de HCl 5% (30 mL)

2. Filtração

Resíduo insolúvel Solução ácida

CH2Cl2 (3 15 mL)

Fração CH2Cl2 Solução ácida

1. NH4OH até pH 9-11

2. CH2Cl2 (3 15 mL)

Fração aquosa Fração CH2Cl2

0,0065 g (0,65%)

0,2662 g (26,62%) 0,0009 g (0,09%)


3.8 DETERMINAÇÃO DE FENÓIS TOTAIS (FT) PELO MÉTODO DE FOLIN-

CIOCALTEAU

Para determinar os FT foi preparada uma solução de 2000 μg mL–1 em metanol

dos extratos etanólicos dos cálices, folhas, pétalas e sementes (EE-Se), e das frações

AcOEt, n-BuOH, hexânica e hidrometanólica dos cálices, folhas e pétalas. De cada

solução, retirou-se uma alíquota de 0,5 mL que foi adicionada em um tubo de ensaio e

foram misturados 2,5 mL do reagente Folin-Ciocalteau a 10% e 2,0 mL de carbonato de

sódio a 7,5%. A mistura foi homogeneizada e incubada por cinco minutos em banho a

50 °C, resfriada e, em seguida, mediu-se a absorbância no comprimento de onda de

760 nm, contra um branco. O teor de FT foi determinado por interpolação da

absorbância da amostra com uma curva de calibração construída com padrões de

ácido gálico (0,781, 1,562, 3,125, 6,250 e 12,50 mg mL–1) e os resultados, em

triplicatas, expressos em miligramas de equivalentes de ácido gálico (EAG) por grama

de extrato (SOUSA et al, 2007; CARVALHO et al, 2012).

38

3.9 AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

A atividade antioxidante foi determinada utilizando o radical livre DPPH. Foram

preparadas soluções em metanol de 200 µg mL–1 para as frações AcOEt e n-BuOH das

pétalas, 500 µg mL–1 para o extrato etanólico das pétalas, 750 µg mL–1 para a fração n-

BuOH das folhas, 1500 µg mL–1 para os extratos etanólicos dos cálices e folhas e

frações AcOEt e n-BuOH dos cálices e 5000 µg mL–1 para o extrato etanólico das

sementes e as frações hexânica e hidrometanólica dos cálices, folhas e pétalas.

A partir das soluções preparadas foram realizadas diluições de 100, 83, 66, 49,

32 e 15%. Para cada uma das soluções diluídas, tomou-se uma alíquota de 0,30 mL da

amostra a ser analisada e adicionou 2,7 mL de solução de radical DPPH de

concentração 35 µg mL–1. Além disso, foi feito um branco da amostra nas mesmas

condições, porém sem o radical DPPH. Após a adição de radical DPPH, as soluções

foram deixadas em repouso durante uma hora e suas absorbâncias registradas, em

triplicata, no comprimento de onda de 516 nm. A porcentagem de DPPH sequestrado,

que determina a atividade antioxidante, foi determinada pela equação 1.

DPPHsequestrado

(%) (equação 1)

Onde:

AbvC1 corresponde à absorbância do controle 1 (0,30 mL de metanol + 2,7 mL de

DPPH);

AbvA corresponde à absorbância da amostra ao final de 60 minutos (0,30 mL da

amostra + 2,7 mL de DPPH);

AbvC2 corresponde à absorbância do controle 2 (0,30 mL da amostra + 2,7 mL de

metanol).

A concentração efetiva média (CE50), que representa a concentração de amostra

necessária para sequestrar 50% dos radicais de DPPH foi determinada plotando-se a

porcentagem de radical DPPH sequestrado versus as concentrações das amostras de

cada extrato e frações (ARGOLO et al, 2004).

39

3.10 ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA GASOSA-ESPECTROMETRIA DE MASSAS

(CG-EM) PARA AS SEMENTES

As análises de CG-EM foram realizadas na Universidade Federal de Uberlândia,

no laboratório de Produtos Naturais do Instituto de Química.

A separação e identificação dos constituintes foram feitas utilizando a

cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) usando uma

coluna polar DB-5, capilar de 30 m × 0,25 mm de diâmetro interno e de 0,25 µm de

espessura. Para a análise cromatográfica foi utilizada uma rampa de aquecimento de

60–246 °C (3 °C min-1), injetor no modo splitless a 220 °C; hélio como gás de arraste a

fluxo constante de 1,7 mL min-1. No espectrômetro de massas foi utilizada 70 eV como

energia de ionização, sendo registrados os fragmentos de m/z 40 a 400 u; interface a

240 °C; temperatura da fonte de íons a 240 °C; volume injetado 1,0 μL. A identificação

dos compostos foi realizada por comparação com bibliotecas de espectros de massas

(similaridade 90%) da Wiley (7, 139 e 229), NIST (8, 27 e 147), SHIM2205 e por índices

Kovats (índices calculado e teórico). Uma mistura dos padrões de alcanos C10–C40 foi

submetida às mesmas condições cromatográficas, de onde foram obtidos os

respectivos tempos de retenção, necessários para a determinação do índice aritmético,

o qual foi calculado a partir da equação 2 (ADAMS, 2007).

AI (x) = 100 PZ +100 [(RT (x) – RT (Pz)) / (RT (Pz+1) – RT (Pz))] (equação 2)

Onde:

AI (x) corresponde ao índice aritmético;

Pz corresponde ao número de carbono do alcano de tempo de retenção anterior ao

analisado;

RT (x) corresponde ao tempo de retenção do composto analisado;

RT (Pz) corresponde ao tempo de retenção do alcano anterior;

RT (Pz+1) corresponde ao tempo de retenção do alcano posterior;

3.11 ENSAIO LEISHMANICIDA

O ensaio leishmanicida foi realizado sob supervisão do Prof. Dr. Cláudio Vieira

da Silva do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal de Uberlândia.

40

As amostras foram solubilizadas em DMSO (dimetilsulfóxido) e diluídas com caldo BHI

(Brian-Heart Infusion), para obtenção de uma solução estoque de 640 μg mL–1. O teste

de viabilidade celular foi realizado utilizando a fase promastigota de

Leishmania amazonensis (cepa PH8). A análise foi realizada pelo método de

microdiluição em placas de 96 poços, sendo testadas as concentrações de 512, 256,

128, 64, 32, 16, 8 e 4 μg mL–1, preparadas a partir da solução estoque, sendo que a

concentração de DMSO não excedeu 1%. O volume final em cada poço foi de 100 μL,

sendo 20 μL do inóculo (1 × 108 parasitas em 2 mL) e 80 μL de amostra. Controles de

crescimento, positivo, solvente e da amostra foram preparados em cada placa. A placa

foi incubada durante 48 horas a 25 °C, em sequência foram adicionados 2 μL de uma

solução de resazurina 3 mM em PBS (Phophate Buffered Saline) a cada poço e

incubados novamente durante 24 horas a 25 °C. No final deste período, foi utilizado um

espectrofotômetro de microplaca para determinar a absorbância de cada poço da placa

em 595 nm (ROLÓN et al., 2006). A partir dos resultados das absorbâncias, a

viabilidade celular foi calculada em função do controle de crescimento. Para a

determinação da concentração necessária para inibir 50% dos parasitas (CI50) foi

construído um gráfico de dose resposta utilizando o método de regressão não linear.

Todos os testes foram realizados em triplicata (PILLAY et al., 2007).

3.12 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE

O ensaio de citotoxicidade foi realizado sob supervisão do Prof. Dr. Cláudio

Vieira da Silva do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal de

Uberlândia. As amostras foram solubilizadas em DMSO e diluídas com DMEM

(Dulbecco's modified Eagle’s médium) (suplementado com 10% de soro fetal bovino),

para obtenção de solução estoque na concentração de 640 μg mL–1. A análise foi

realizada utilizando o método de microdiluição em placa de 96 poços. Foram

adicionados 100 μL de solução com as células (1 × 106 células em 10 mL) em cada

poço do teste e incubado por 6 horas em estufa à 37 ºC, com 5% CO2 e atmosfera

úmida, para que as células aderissem ao fundo do poço. Em seguida foi retirado todo o

meio de cultura e adicionado a amostra nas concentrações de 512, 256, 128, 64, 32,

16, 8 e 4 μg mL–1, a partir da solução estoque, sendo que a concentração de DMSO

não excedeu 1%. Os controles de crescimento, negativo (100% células lisadas) e

solvente também foram preparados. Posteriormente, a placa foi incubada durante 48

41

horas à 37 ºC, com 5% CO2 em atmosfera úmida. Em sequência foram adicionados 10

μL de uma solução de resazurina 3 mM em PBS a cada poço e incubados novamente

durante 24 horas nas mesmas condições (ROLÓN et al., 2006). No final deste período,

foi utilizado um espectrofotômetro de microplaca para determinar a absorbância de

cada poço da placa em 595 nm. A partir dos resultados das absorbâncias, a viabilidade

celular foi calculada em função do controle crescimento. Para a determinação da

concentração citotóxica de 50% (CC50) foi construído um gráfico de dose resposta

utilizando o método de regressão não linear. Todos os testes foram realizados em

triplicata (PILLAY et al., 2007).

42

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 RENDIMENTO DA COLETA DO MATERIAL VEGETAL (H. sabdariffa L.)

Os rendimentos das coletas das folhas, pétalas, cálices e sementes de H.

sabdariffa foram obtidos depois de secos, triturados e pesados (Tabela 1).

Tabela 1 - Rendimento da coleta do material vegetal (Hibiscus sabdariffa L.)

aMV Massa in natura (Kg) Massa seca (Kg) Umidade (%)

Folhas

Cálices

Pétalas

Sementes

5,0

4,4

5,5

1,7

0,7

0,6

0,3

0,4

86,1

86,4

94,8

78,1 aMV: Material vegetal.

4.2 RENDIMENTO DOS EXTRATOS ETANÓLICOS

Após a extração dos materiais vegetais com etanol e evaporação do solvente,

os rendimentos foram calculados (Tabela 2). Foi observado maior rendimento para o

extrato etanólico dos cálices de Hibiscus sabdariffa L., indicando grande quantidade de

metabólitos.

Tabela 2 – Rendimento dos extratos etanólicos das folhas, cálices, pétalas e sementes de Hibiscus sabdariffa L.

aMV Extração (g) Rendimento

1ª 2ª 3ª 4ª 5ª (g) (%)

Folhas

Cálices

Pétalas

Sementes

25,6

80,7

8,8

13,9

43,4

85,8

7,6

9,6

23,4

30,6

4,5

5,5

12,5

11,7

-

3,0

12,0

-

-

-

116,9

208,7

21,0

31,9

16,8

34,7

7,2

8,6 aMV: Material vegetal.

43

4.3 EXTRAÇÃO LÍQUIDO/LÍQUIDO DOS EXTRATOS ETANÓLICOS DE


Os extratos etanólicos (EEs) das folhas, cálices e pétalas foram submetidos à

extração líquido/líquido com hexano, AcOEt e n-butanol e os rendimentos das frações

em relação aos EEs foram calculados (Tabela 3).

Tabela 3 – Extração líquido/líquido de Hibiscus sabdariffa L.

aMV

Fração

Hexano

(g/%)

AcOEt

(g/%)

n-BuOH

(g/%)

Hidrometanólica

(g/%)

Material

insolúvel

(g/%)

bfolhas

0,6/6,0

0,5/5,0

1,9/19,0

1,3/13,0

4,1/41,0

bpétalas

0,6/6,0

1,2/12,0

2,1/21,0

3,3/33,0

2,6/26,0

bcálices

1,0/1,3

22,4/30,0

27,0/36,2

26,6/35,7

4,2/5,6

aMV: Material vegetal.

bExtrato etanólico

Os melhores resultados de rendimentos das frações podem ser observados na

fração n-BuOH de todos os órgãos submetidos à extração líquido/líquido. Neste

sentido, é possível sugerir que nessa fração n-BuOH, presença de compostos de

maior polaridade, pode apresentar maior potencial antioxidante. As frações das folhas

apresentaram os menores rendimentos, devido à quantidade de material insolúvel

obtida na extração líquido/líquido.

44

4.4 AVALIAÇÃO ALCALOÍDICA DOS EXTRATOS ETANÓLICOS DOS CÁLICES E

FOLHAS

Após a extração ácido/base, a fração diclorometano foi submetida à análise por

CCD, utilizando sílica gel como fase estacionária e CHCl3/MeOH/NH4OH (9:1:0,25)

como fase móvel. Foram utilizados os reveladores IClPt e Dragendorff. Segundo a

análise por CCD não foi possível observar a presença de alcaloides. Esse fato, aliado

ao baixo rendimento das frações (0,39% para os cálices e 0,09% para as folhas)

sugere que não foi encontrado a presença de alcaloides nos órgãos avaliados da

planta.

A extração ácido/base não foi realizada para as pétalas e sementes devido à

pequena quantidade de massa de extrato etanólico obtido.

4.5 DETERMINAÇÃO DO PERFIL CROMATOGRÁFICO DOS EXTRATOS

ETANÓLICOS DOS CÁLICES, FOLHAS E PÉTALAS POR CCD

As análises cromatográficas foram realizadas com as frações dos extratos

etanólicos dos cálices, folhas e pétalas. Devido a diversidade metabólica presente nas

frações foi necessário utilizar dois sistemas de solventes para o desenvolvimento das

placas cromatográficas. Para o desenvolvimento das CCD das frações hexano foi

utilizado um sistema de solventes que consistiu de Hex/AcOEt (6:4) (Figura 23). Para

o desenvolvimento das CCD das frações AcOEt, n-BuOH e hidrometanólica foi

utilizado AcOEt/HOAc/HCO2H/H2O (100:11:11:26), como sistema de solvente (Figura

24).

Figura 23 – CCD das frações hexano, inspeção a 254 nm.


45

Figura 24 – CCD das frações AcOEt, n-BuOH e hidrometanólica, inspeção a 254 nm.


As placas foram reveladas utilizando os reveladores Liebermann-Burchard,

NP/PEG, anisaldeído, ácido fosfomolibdico e vanilina sulfúrica (Tabela 4). Além disso,

foram observadas sob luz UV a 254 e 365 nm (Figuras 25 e 26) (Tabela 4).

Figura 25 – CCD das frações hexano: Cálices (1), Folhas (2) e Pétalas (3) (FM: Hex/AcOEt (6:4))


Figura 26 – CCD das frações AcOEt, n-BuOH e hidrometanólica: Cálices (1), Folhas (2) e Pétalas (3) (FM: AcOEt/HOAc/HCO2H/H2O (100:11:11:26))


46

Tabela 4 – Prospecção química.

aMV

Fração

bRevelador

A B C D E

Cálices

Hexano

AcOEt

n-BuOH

hidrometanólica

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

0

0

0

0

+

+

+

Folhas

Hexano

AcOEt

n-BuOH

hidrometanólica

+

+

+

+

+

0

0

0

+

+

+

+

0

0

0

0

0

-

+

+

Pétalas

Hexano

AcOEt

n-BuOH

hidrometanólica

+

+

+

-

+

0

0

0

+

+

+

-

0

0

0

0

0

+

+

-

aMV: Material vegetal.

bReveladores: anisaldeído (A); ácido fosfomolibdico (B); vanilina sulfúrica (C);

Liebermann-Buchard (D); NP/PEG (E). (0): não foi revelada com o revelador; (+): positivo para o revelador; (-): negativo para o revelador

Na prospecção química foi observado o aparecimento de manchas de

colorações azul e vermelho na cromatoplaca da fração hexano dos cálices, quando

reveladas com o reagente Liebermann-Burchard e submetidas a inspeção em luz UV

365 nm, indicando a presença de terpenos. As cromatoplacas das frações AcOEt e n-

BuOH dos cálices, folhas e pétalas apresentaram manchas de coloração azul, amarelo

e vermelho pela reação do revelador NP/PEG com compostos fenólicos presentes nas

frações. As manchas nestas colorações indicam a presença de flavonoides (AZEVEDO

et al., 2014).

Alguns compostos presentes nas frações hexano, AcOEt e n-BuOH dos cálices,

folhas e pétalas reagiram com a vanilina sulfúrica levando a manchas com coloração

amarelo/alaranjado e, utlizando o ácido fosfomolíbdico foi possível observar manchas

com coloração azul/esverdeado. Além disso, para as frações hexano dos cálices,

folhas e pétalas foi observado o aparecimento de manchas de coloração azul e

vermelho e para as frações AcOEt e n-BuOH foi observado o aparecimento de

manchas de coloração alaranjado nas cromatoplacas quando reveladas com

47

anisaldeído. De acordo com a prospecção química, é possível sugerir a presença de

esteroides, terpenoides, saponinas, propilpropanoides, fenilpropanoides e flavonoides.

4.6 DETERMINAÇÃO DE FENÓIS TOTAIS PELO MÉTODO DE FOLIN-CIOCALTEAU

A determinação de fenóis totais (FT) foi realizada pelo método

espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, que consiste da mistura dos ácidos

fosfomolibídico e fosfotungstico, onde o molibdênio, que se encontra no estado de

oxidação (VI) (de coloração amarela Na2MoO4.2H2O), reduz na presença de

compostos fenólicos, levando a formação do complexo molibdênio e tungstênio azul

[(PMoW11O4)4-] cuja coloração permite a determinação da concentração das

substâncias redutoras (Figura 27) (SINGLETON,ORTHOFER, LAMUELA-RAVENTÓS,

1999 apud OLIVEIRA et al, 2009).

Figura 27 – Reação do ácido gálico com o íon molibdênio

COOH

HO

OH

OH

Na2CO3

COO-

HO

O-

OH

+ 2 Mo+62e, H+

COO-

O

O

HO

2 Mo+5+

Ácido gálico Anion fenolato

Fonte: Oliveira, 2008.

Para o cálculo de FT foi construído uma curva de calibração do ácido gálico, a

partir de concentrações conhecidas, em função da absorbância (Figura 28). A partir da

curva de calibração construída, foi calculado o teor de FT, em triplicata, através da

interpolação da absorbância dos extratos com as respectivas concentrações. Os

resultados foram expressos em miligrama de equivalentes de ácido gálico (EAG) por

grama de amostra (Tabela 5) (SOUSA et al., 2007; CARVALHO et al., 2012).

48

Figura 28 – Curva de calibração para o ácido gálico

y = 0,1414x + 0,0875R² = 0,9998

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 2 4 6 8 10 12 14

Ab

sorb

ânci

a

Concentração (mg / mL)


Tabela 5 – Fenóis totais dos extratos e frações de H. sabdariffa

Material vegetal Extrato e frações mg de EAG / g de amostra (n=3)

Cálices

Extrato etanólico

AcOEt

n-BuOH

Hex

Hidrometanólica

6,8 ± 0,4

7,7 ± 0,1

5,6 ± 0,6

3,1 ± 0,1

2,1 ± 0,1

Folhas

Extrato etanólico

AcOEt

n-BuOH

Hex

Hidrometanólica

10,1 ± 0,3

14,0 ± 1,4

23,8 ± 1,4

4,1 ± 0,3

7,7 ± 0,6

Pétalas

Extrato etanólico

AcOEt

n-BuOH

Hex

Hidrometanólica

8,1 ±0,3

30,7 ±1,7

61,5 ± 2,8

4,7 ± 0,2

3,1 ± 0,2

Sementes Extrato etanólico 10,4 ±1,3

Na Tabela 5 é possível observar que a fração n-BuOH das pétalas apresentou

maior quantidade de fenóis, (61,5 ± 2,8 mg EAG/g), seguida da fração AcOEt (30,7 ±

1,7 mg EAG/g). Depois das pétalas, o órgão que apresentou maior teor de fenóis foi as

folhas sendo a fração n-BuOH (23,8 ± 1,4 mg EAG/g) a de maior quantidade de fenóis,

49

seguida da fração AcOEt (14,0 ± 1,4 mg EAG/g), enquanto que a fração

hidrometanólica dos cálices apresentou o menor teor de fenóis (2,1 ± 0,1 mg EAG/g).

A fração hidrometanólica das folhas (7,7 ± 0,6 mg EAG/g), AcOEt (7,7 ± 0,1 mg

EAG/g), o extrato etanólico (6,8 ± 0,4 mg EAG/g), e a fração n-BuOH (5,6 ± 0,6 mg

EAG/g) dos cálices foram os que tiveram menores quantidades de fenóis, seguidos

das frações hexânicas das pétalas (4,7 ± 0,2 mg EAG/g), das folhas (4,1 ± 0,3 mg

EAG/g), dos cálices (3,1 ± 0,1 mg EAG/g) e as frações hidrometanólicas das pétalas

(3,1 ± 0,2 mg EAG/g) e dos cálices (2,1 ± 0,1 mg EAG/g).

Mohd-Esa e colaboradores (2010) encontraram maior quantidade de fenóis

totais nas sementes em extrato metanólico (4,87 ± 0,14 mg EAG/g) quando

comparado com extrato destilado com água (2,97 ± 0,17mg EAG/g). Nos cálices,

encontraram no extrato metanólico (2,91 ± 0,07mg EAG/g) e em extrato destilado com

água (1,85 ± 0,11 mg EAG/g). E, para os extratos metanólico e destilado com água

(2,20 ± 0,02 mg EAG/g) e (1,71 ± 0,04 mg EAG/g), respectivamente (MOHD-ESA et

al., 2010). No presente estudo, os extratos etanólicos também apresentaram maior

teor de fenóis em sementes (10,4 ± 1,3 mg EAG/g) porém, seguido das folhas (10,1 ±

0,3 mg EAG/g) e dos cálices (6,8 ± 0,4 mg EAG/g), contudo os resultados foram

maiores em extrações com etanol.

Carvalho et al, 2012 também encontrou maior teor fenólicos no extrato etanólico

das folhas (108,39 µg EAG/mL) quando comparado com o extrato etanólico dos

cálices (19,24 µg EAG/mL) (CARVALHO et al., 2012).

Estudos anteriores demonstraram que o estágio de desenvolvimento da planta

pode interferir nas vias biosintéticas de compostos fenólicos. Além disso, o teor de

fenóis pode variar em diferentes solventes de extração (MOHD-ESA et al., 2010).

4.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELO MÉTODO DO RADICAL

DPPH

O potencial antioxidante de uma substância está relacionado com a capacidade

deste composto em ceder um hidrogênio através de uma reação radicalar para o

radical livre 2,2-difenil-picrilhidrazila (DPPH) (violeta) que absorve luz UV a 516 nm.

Depois que o radical DPPH for reduzido, o produto desta reação 2,2-difenil-

picrilhidrazina (amarelo), deixa de absorver luz a 516 nm, consequentemente há um

50

decréscimo da absorbância (Figura 29) (BERSET; CUVELIER; BRAND-WILLIAMS,

1995).

Figura 29 – Reação de redução do radical DPPH

N

N

O2N NO2

NO2

516 nm

N

NH

O2N NO2

NO2

DPPH(violeta)

(DPPH)H(amarelo)

ROH

substância compotencial antioxidante

RO


A concentração efetiva média (CE50), que representa a concentração de

amostra necessária para consumir 50% do radical DPPH, foi calculada plotando-se a

porcentagem de radical DPPH consumido versus as concentrações dos extratos de

cada amostra expresso em µg mL–1 (Figuras 30–38) (Tabela 6). Um valor de CE50

baixo indica que a amostra apresenta maior atividade antioxidante, sendo que o CE50

inferior a 50 μg mL–1 é considerado muito ativo; entre 50 e 100 μg mL–1 é moderado;

entre 100 e 200 μg mL–1 é pouco ativo, e acima de 200 μg mL–1 é inativo

(REYNERTSON; BASILE; KENNELLY, 2005).

51

Figura 30 – Consumo do DPPH do Extrato etanólico dos cálices

y = 38,909x - 570,12R² = 0,999

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Co

nce

ntr

ação

(µ

g /

mL)

DPPH (%)


Figura 31 – Consumo do DPPH do Extrato etanólico das folhas

y = 26,374x - 507,29R² = 0,9932

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

20 30 40 50 60 70 80

Co

nce

ntr

ação

(µ

g /

mL)

DPPH (%)


52

Figura 32 – Consumo do DPPH do Extrato etanólico das pétalas

y = 8,5945x - 242,27R² = 0,9886

0

100

200

300

400

500

600

30 40 50 60 70 80 90

Co

nce

ntr

ação

(µ

g /

mL)

DPPH (%)


Figura 33 – Consumo do DPPH da fração AcOEt dos cálices

y = 29,119x - 420,4R² = 0,9474

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75

Co

nce

ntr

ação

(µ

g /

mL)

DPPH (%)


53

Figura 34 – Consumo do DPPH da fração n-BuOH dos cálices

y = 21,22x - 70,056R² = 0,9835

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Co

nce

ntr

ação

(µ

g /

mL)

DPPH (%)


Figura 35 – Consumo do DPPH da fração AcOEt das folhas

y = 23,999x - 826,15R² = 0,9531

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

30 40 50 60 70 80 90 100

Co

nce

ntr

ação

(µ

g /

mL)

DPPH (%)


54

Figura 36 – Consumo do DPPH da fração n-BuOH das folhas

y = 14,002x - 613R² = 0,9399

0

100

200

300

400

500

600

700

800

40 50 60 70 80 90 100

Co

nce

ntr

ação

(µ

g /

mL)

DPPH (%)


Figura 37 – Consumo do DPPH da fração AcOEt das pétalas

y = 2,884x - 74,861R² = 0,9519

0

50

100

150

200

250

30 40 50 60 70 80 90 100

Co

nce

ntr

ação

(µ

g /

mL)

DPPH (%)


55

Figura 38 – Consumo do DPPH da fração n-BuOH das pétalas

y = 2,948x - 83,07R² = 0,9843

0

50

100

150

200

250

30 40 50 60 70 80 90 100

Co

nce

ntr

ação

(µ

g /

mL)

DPPH (%)


Tabela 6 – Potencial antioxidante dos extratos e frações de H. sabdariffa

Material vegetal

Extrato e frações CE50 (µg mL–1) (n=3)

Cálices

Extrato etanólico

AcOEt

n-BuOH

Hex

Hidrometanólica

1375,3 ± 72,2

1035,6 ± 66,2

990,9 ± 21,1

˃ 5000

˃ 5000

Folhas

Extrato etanólico

AcOEt

n-BuOH

Hex

Hidrometanólica

811,4 ± 13,0

373,8 ± 34,4

87,1 ± 15,6

˃ 5000

˃ 5000

Pétalas

Extrato etanólico

AcOEt

n-BuOH

Hex

Hidrometanólica

187,5 ± 11,5

69,3 ± 8,2

64,3 ± 6,2

˃ 5000

˃ 5000

Sementes Extrato etanólico ˃ 5000

As frações mais ativas foram n-butanol e acetato de etila das pétalas e n-

butanol das folhas (64,3 ± 6,2, 69,3 ± 8,2 e 87,1 ± 15,6 µg mL–1, respectivamente).

Estes valores são considerados moderados para extratos e frações (REYNERTSON;

56

BASILE; KENNELLY, 2005), no entanto, o foco desse trabalho foi os extratos e frações

que possuem diversos metabólitos, sendo que nem todos foram ativos. Como

esperado, as frações que apresentaram menores valores de fenóis totais não

apresentaram atividade antioxidante (frações hexânicas e hidrometanólicas dos

cálices, folhas e pétalas; e do extrato etanólico das sementes).

Os valores de fenóis totais corroboram estes resultados, pois as amostras com

maior potencial antioxidante foram aquelas com maior teor fenólico. Esta relação se

aplica porque os compostos fenólicos quando formam um radical, podem deslocalizar

o elétron desemparelhado por ressonância conferindo estabilidade a esta espécie

química.

Em estudos com extratos aquoso das folhas e cálices, com leitura feita após 30

minutos da introdução da amostra, foi encontrado maior potencial antioxidante nas

folhas (90,42 %) seguido dos cálices (65,95 %) (CARVALHO, et al., 2012). Assim

como encontrado, no presente estudo, com os extratos etanólicos das folhas e cálices.

4.8 ANÁLISE POR CG-EM DO EXTRATO ETANÓLICO DAS SEMENTES DE

H. sabdariffa.

O extrato etanólico das sementes foi obtido como um óleo de cor amarelo-

esverdeado (MOHAMED et al., 2007). Por apresentar este aspecto oleoso foi

submetido à análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas,

onde foi possível observar a presença de 15 sinais (Figura 39).

A partir da análise dos espectros de massas comparados com aqueles das

bibliotecas (NIST e Adams) e índice aritmético, foram propostas estruturas para as

substâncias presentes nesta matriz. Na análise dos espectros de massas foram

identificados 11 compostos sendo dois com similaridade abaixo de 90% (Tabela 7). Na

Tabela 7 estão descritos os tempos de retenção (tR), índices aritméticos (AI)

(experimental e teórico), porcentagem de similaridade e estruturas propostas.

57

Figura 39 – Cromotograma de íons totais do EE-Se de H. sabdariffa.

10 20 30 40 50 60 70 80 90

500e3

750e3

1000e3

1250e3

TIC

44.5

14

45.9

23

46.7

41

49.9

44

50.1

22

50.9

25

51.3

95

51.5

23

51.9

86

52.1

50

52.9

43

53.4

60

60.8

85

61.8

07

67.3

95


49 50 51 52 53 54 55

500e3

750e3

1000e3

1250e3

TIC

44.5

14

45.9

23

46.7

41

49.9

44

50.1

22

50.9

25

51.3

95

51.5

23

51.9

86

52.1

50

52.9

43

53.4

60

60.8

85

61.8

07

67.3

95

58

Tabela 7 – Substâncias propostas a partir da análise por CG-EM do EE-Se de H. sabdariffa.

tR(min) Substâncias propostas AI calculado AI teórico Similaridade/EM

(%)

44,5 hexadecanoato de metila 1927 1921 90

45,9 ácido hexadecanóico

(ácido palmítico) 1934 1959 92

46,7 hexadecanoato de etila 1946 1992 91

49,9 octadeca-9,12-dienoato de metila (linoleato de metila)

2047 2095 94

50,1 9-octadecenoato de metila

(elaidato de metila) 2050 ni 91

50,9 octadecanoato de metila

(estearato de metila) 2124 2124 84

51,4 ácido octadeca-9,12-

dienoico (ácido linoleico) 2140 2132 91

51,5 ácido octadeca-9,12-

dienoico (ácido linoleico) 2143 2132 91

52,0 octadeca-9,12-dienoato de

etila (linoleato de etila) 2159 2177 92

52,2 9-octadecenoato de etila

(oleato de etila) 2164 2180 90

52,9 octadecanoato de etila

(estearato de etila) 2191 2196 80

53,5 Ni - - -

60,9 Ni - - -

61,8 Ni - - -

67,4 Ni - - -

ni - não identificado;

No extrato etanólico das sementes foram identificados ésteres e ácidos

carboxílicos de cadeia longa. Foi possível observar que o sinal referente ao íon

molecular dos ésteres de metila de ácidos alifáticos lineares foi quase sempre

59

observado. Em geral, os sinais dos íons moleculares dos ésteres de metila são pouco

intensos para massas de m/z 130 a 200 u. São mais intensos à medida que o tamanho

da cadeia aumenta (maiores que m/z 200 u). Dentre os fragmentos mais intensos e

frequentes está o sinal de m/z 74, que pode ser atribuído ao rearranjo do tipo

McLafferty, através da clivagem da ligação entre o carbono β e a carbonila. Também

são frequentes os sinais referentes aos íons moleculares (M•+), íon acílio (RCO+) e

uma série de sinais com diferenças de 280 u, que pode ser correlacionado a

eliminações de grupos C2H4 (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2010).

A partir das análises dos dados de AI teórico e experimental, aliados aos dados

dos EM dos compostos identificados nas análises por CG-EM, foi possível atribuir uma

série de ácidos graxos de cadeias extensas saturadas e insaturadas (Figuras 40–51).

Para o composto referente ao tR 44,5 min (Figura 40), o EM apresentou um sinal

referente ao íon molecular de m/z 270, que foi atribuído ao hexadecanoato de metila. A

proposta de fragmentação (Figura 41) apresenta como pico base o sinal de m/z 74,

que foi atribuído ao rearranjo do tipo McLafferty. Na sequência a eliminação da

metoxila leva a formação do íon acílio de m/z 43. Também foram observados

fragmentos referentes a eliminações de grupos alquilas, como o sinal de m/z 227,

atribuído à eliminação de um grupo propila (43 u) e, na sequência, sinais referentes a

eliminações consecutivas de etenos (28 u) até m/z 87, característicos de compostos

alifáticos de cadeias longas não ramificadas (PAVIA et al.,2010).

Figura 40 – EM-IE do composto referente ao tR 44,5 min.

50 75 100 125 150 175 200 225 250 2750e3

10e3

20e3

30e3

40e3

50e3

60e3

70e3 74

87

43

55

143

22712997 171 185 199 270

60

Figura 41 – Proposta de fragmentação para o composto referente ao tR 44,5 min.

OH

O

m/ z 74

O

OMcLafferty

O

O

m/z 270

H

7

C3H7

O

O

H

7

C2H4

m/ z 227

m/z 199 até 87

Eliminaçãode etenos

OCH3

H3C C O

m/ z 43

Na análise do EM do composto referente ao tR 46,7 min (Figura 42), foi

observado o sinal referente ao íon molecular em m/z 284, que foi atribuído ao

hexadecanoato de etila. Este composto apresenta sinal (m/z 88) referente ao rearranjo

do tipo McLafferty, similar aquele discutido para o composto de tR 44,5 min (Figura 41),

porém com uma diferença de 14 u atribuída a presença da etila no final da cadeial.

O composto de tR 50,9 min (Figura 43), cujo sinal referente ao íon molecular foi

observado em m/z 298, foi correlacionado ao octadecanoato de metila que também é

um éster saturado e difere do composto de tR 44,5 min por duas unidade metileno (CH2)

na extensão da cadeia linear. No EM também foi observado um sinal (m/z 74) referente

a clivagem do tipo MacLafferty, similar àquela discutida para o composto de tR 44,5 min

(Figura 41).


observado em m/z 312, foi correlacionado ao octadecanoato de etila, que assim como

o composto de tR 46,7 min, apresenta um sinal em m/z 88, atribuído ao rearranjo do

tipo MacLafferty. Além deste sinal, é possível observar similaridade no perfil dos EM

destes compostos.

61


50 75 100 125 150 175 200 225 250 2750e3

10e3

20e3

30e3

40e3

50e3

60e388

101

43

5570

157

241115 143 213199185129 284

Figura 43 – EM-IE do composto referente ao tR 50,9 min

50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 3000

2500

5000

7500

10000

12500

15000

44

74

4087

57 143

199 255101 129213 298185157 267241115 171


50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 3000

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500

44

88

40

101

5773

157115 213129 269143 171 199 227185 312241 255


observado em m/z 294, foi correlacionado ao octadeca-9,12-dienoato de metila, que é

um éster insaturado. É possível observar no EM que o sinal de m/z 74, característico

OCH3

O

12

H3C

62

do rearranjo de MacLafferty, tem baixa intensidade, sendo o sinal de m/z 67 o pico

base. Este fato deve estar associado à presença da instauração na cadeia lateral,

modificando o perfil de fragmentação.

Características semelhantes às do composto de tR 49,9 min (Figura 45), são

observadas para o composto de tR 50,1 min (Figura 46), que também apresenta

insaturação, sendo observado o sinal de m/z 55 como pico base. De acordo com a

similaridade das bibliotecas NIST e Adamns este composto seria o 9-octadecenoato de

metila.


50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 3000e3

10e3

20e3

30e3

40e3

50e3

60e3

70e367

81

55

9541

109

123 135 150164 262178 294


50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 3000

5000

10000

15000

20000

25000

55

6941

8397

98

123264

137 222152 180166207 235193 246 296266

Características semelhantes às dos compostos de tR 49,9 min (Figura 45) e

tR 50,1 min (Figura 46), são observadas para os compostos de tR 52,0 min (Figura 47) e

tR 52,2 min (Figura 48), respectivamente, que também apresentam insaturações, sendo

observados os sinais de m/z 67 e 55 como picos base, respectivamente. De acordo

com a similaridade das bibliotecas NIST e Adamns estes compostos seriam o

octadeca-9,12-dienoato de etila e 9-octadecenoato de etila

H3C

O

O

5

CH3

H3C

O

7

CH3

7

O

63


50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 3000

25000

50000

75000

67

81

5595

41

109

121 135149 262164 178

220 308


50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 3000

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

4000055

69

41

83

97

98

123264137 222180152

207185 235 266 284 310

Os espectros de massas e as estruturas dos ácidos carboxílicos com

identificação proposta por CG-EM da amostra e suas respectivas estruturas são

apresentados nas Figuras 49–51.

O EM do composto referente ao tR 45,9 min (Figura 49), apresentou um sinal

referente ao íon molecular em m/z 256, que foi atribuído ao ácido hexadecanóico

(ácido palmítico). A proposta de fragmentação (Figura 50) apresenta um sinal de

m/z 60, que foi atribuído ao rearranjo do tipo McLafferty. Na sequência a eliminação da

hidroxila leva a formação do íon acílio de m/z 43. Também foram observados

fragmentos referentes a eliminações de grupos alquilas, como o sinal de m/z 227,

atribuído à eliminação de um grupo etila (29 u) e, na sequência, eliminações

consecutivas de etenos (28 u) até a formação do pico base em m/z 87. Este padrão é

característico de compostos alifáticos de cadeias extensas não ramificadas (PAVIA et

al., 2010; SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2010).

H3C O

O

7

CH3

4

O

O

CH3

77

H3C

64


50 75 100 125 150 175 200 225 2500

5000

10000

15000

20000

2500073

43 60

129

83

97213115 157

171 185 256143

199 227

Figura 50 – Proposta de fragmentação para o composto referente ao tR 45,9 min.

OH

HO

m/ z 60

O

HOMcLafferty

O

HO

m/ z 256

H

7

C2H5

O

HO

H

7

C2H4

m/z 227

m/ z 199 até 87

Eliminaçãode etenos

OHH3C C O

m/z 43

O EM do composto de tR 51,4 min (Figura 51) apresentou características

semelhantes às dos compostos de tR 49,9 min (Figura 45) e tR 52,0 min (Figura 47),

que são ésteres insaturados. De acordo com a similaridade das bibliotecas NIST e

Adamns este composto seria o ácido octadeca-9,12-dienoico (ácido linoleico), o que

corrobora com estudos anteriores que descrevem a presença deste ácido no óleo de

H. sabdariffa, como sendo o composto mais abundante, seguido pelo ácido palmítico

(ácido hexadecanoico).

O ácido graxo linoleico-oleico é importante nas indústrias alimentícias como na

produção de manteigas através de processos de hidrogenação (MOHAMED et al.,

2007).

65


50 75 100 125 150 175 200 225 250 2750e3

10e3

20e3

30e3

40e3

50e3

60e367

81

55

4195

109

123135 150 280

O composto de tR 51,5 min apresentou o mesmo índice aritmético e mesma

similaridade do octadeca-9,12-dienoico (Figura 51), portanto o mesmo espectro. De

acordo com estes dados sugerimos que este composto seja um estereoisômeros do

tipo E e Z do composto de tR 51,4 min.

Os sinais de tempo de retenção 53,5; 60,9; 61,8 e 67,4 min não foram

identificados, sugerindo assim que podem ser novos compostos.

4.9 ENSAIOS LEISHMANICIDA E DE CITOTOXICIDADE

Em 2011, foram divulgados dados etnofarmacológicos relacionados à utilização

de plantas para tratamento da leishmaniose cutânea na Guiana Francesa, onde há

uma alta incidência dessa patologia. Relatos indicam que as folhas e caules de H.

sabdariffa são utilizados na forma de suco como forma alternativa para a profilaxia da

doença (ODONNE et al., 2011). Neste sentido, os extratos etanólicos e frações dos

cálices, pétalas e folhas de H. sabdariffa foram avaliados no ensaio leishmanicida e de

citotoxicidade.

A partir da análise dos resultados dos extratos etanólicos (EE) e das frações no

ensaio de atividade leishmanicida (Tabela 8), foi possível observar que as frações n-

hexano de todos os órgãos, foram as que apresentaram melhores resultados, com

valores de CI50 de 83 ± 16 (pétalas), 40 ± 8 (folhas) e 67 ± 8 (cálices), pois os menores

valores de CI50 são os que apresentam maior atividade.

Para extratos e frações um valor de CI50 menor que 10 µg mL-1 é considerado

altamente ativo; valores entre 10 e 50 µg mL-1 é ativo; entre 50 e 100 µg mL-1 é

HO

O

5

CH3

3

66

moderadamente ativo, e CI50 maiores que 100 µg mL-1 é considerado não ativo

(OZORIO et al., 2007).

No presente trabalho a fração n-hexano das folhas teve a melhor resposta

contra o parasita (40 ± 8 µg mL-1 ) e apresentou uma atividade considerada ativa. Além

disso, as frações n-hexano, AcOEt das pétalas e cálices e n-BuOH das folhas

apresentaram uma atividade moderadamente ativa. Enquanto que os extratos

etanólicos, a fração AcOEt das folhas, n-BuOH dos cálices e pétalas; e as frações

hidrometanólicas não apresentaram atividade.

A partir dos ensaios in vitro e resultados da concentração citotóxica das células

e da capacidade de inibição de 50% dos parasitas foi possível calcular o índice de

seletividade (IS).

Case et al (2006), descrevem como calcular o IS como sendo o logaritmo da

razão entre a citotoxicidade das células analisadas pela concentração inibitória dos

parasitas. O valor obtido está associado à seletividade da amostra contra o organismo

em relação às células Vero.

Valores de CC50 menores que 10 µg mL-1 é considerado altamente tóxico,

valores entre 10 e 100 µg mL-1 é tóxico, entre 100 e 1000 é moderadamente tóxico e

valores de CC50 acima de 1000 µg mL-1 é considerado não tóxico (OZORIO et al.,

2007).

No presente trabalho o fato da fração mais ativa ser das folhas está de acordo

com os dados etnofarmacológicos descritos para a planta, citado pela comunidade de

Wayãpi no uso das folhas como remédios tópicos no tratamento da leishmaniose

(ODONNE et al., 2011).

67

Tabela 8 - Ensaios de atividade leishmanicida com L. amazonensis.

Órgão Amostra CI50a (μg mL–1) L. amazonenses CC50

b (μg mL–1) Células Vero ISc

Pétalas

EE-Pe 358 ± 6 > 512 –

F. n-hexano 83 ± 16 384 ± 15 0,66

F. AcOEt 93 ± 6 187 ± 14 0,30

F. n-BuOH > 512 > 512 –

F. hidro-MeOH > 512 > 512 –

Folhas

EE-Fo 209 ± 8 389 ± 9 0,27

F. n-hexano 40 ± 8 94 ± 4 0,37

F. AcOEt 120 ± 19 197 ± 12 0,21

F. n-BuOH 92 ± 7 > 512 –

F. hidro-MeOH > 512 > 512 –

Cálices

EE-Ca > 512 > 512 –

F. n-hexano 67 ± 8 96 ± 9 0,16

F. AcOEt 88 ± 9 270 ± 19 0,49

F. n-BuOH > 512 > 512 –

F. hidro-MeOH > 512 > 512 –

Controle positivo Anfotericina B 0,29 ± 0,01 – –

aCI50 concentração da amostra que causa 50% da inibição do parasita.

bCC50 concentração da amostra na qual 50% das células são viáveis.

cIS = log[CC50

(células Vero)/CI50 (L. amazonensis)] (CASE et al., 2006).

68

5 CONCLUSÕES

1) O acompanhamento do crescimento da planta permitiu a autenticação e coleta

dos diferentes órgãos da espécime.

2) A extração líquido-líquido dos extratos etanólicos, a extração ácido/base e os

perfis cromatográficos obtidos por CCD forneceram os primeiros resultados para a

comparação química da espécime.

3) No teste realizado por cromatografia em camada delgada com

iodocloroplatinato e dragendorff não foi possível identificar a presença de alcaloides

nas folhas e cálices.

4) Pelas análises por cromatografia em camada delgada das diferentes frações

dos cálices, folhas e pétalas utilizando diversos reveladores químicos foi possível

sugerir a presença de esteroides, terpenoides, saponinas, propilpropanoides,

fenilpropanoides e flavonoides.

5) As frações dos órgãos da planta que apresentaram melhor potencial

antioxidante foram a fração n-BuOH das pétalas (64,3 ± 6,2 µg mL-1), AcOEt das

pétalas (69,3 ± 8,2 µg mL-1), e a n-BuOH das folhas (87,1 ± 15,6 µg mL-1), potencial

moderado e também maior quantidade de fenóis (61,5 ± 2,8; 30,7 ± 1,7 e 23,8 ± 1,4

mg EAG/g, respectivamente); enquanto que as frações hexânicas, hidrometanólicas

dos cálices, folhas e pétalas e, o extrato etanólico das sementes não apresentaram

atividade antioxidante.

6) O cromatograma do Extrato etanólico das sementes de H. sabdariffa apresentou

15 sinais, sendo que 11 foram identificados através da comparação com bibliotecas de

espectros de massas e por índice aritmético e de similaridade.

7) As frações n-hexano de todos os órgãos, foram as que apresentaram melhores

resultados para ensaio leishmanicida, com valores de CI50 de 83 ± 16 (pétalas), 40 ± 8

(folhas) e 67 ± 8 (cálices) µg mL-1.

69

REFERÊNCIAS

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