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Universidad Nacional Intercultural de la Amazonia
EVALUACION DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN LA HOJA DE PEPINO
(Cucumis sativus L.)
TESIS
Para Obtener el Grado de:
INGENIERO AGROINDUSTRIAL
Presenta: Víctor Enrique Lozano Maldonado
DocenteIris O. Ruiz Yance.
Pucallpa, 2013
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………….04
CAPÍTULO 1: DATOS INFORMATIVOS........................................................05
1.1. Institución................................................................................................05
1.2. Carrera profesional.................................................................................05
1.3. Titulo.........................................................................................................05
1.4. Investigador..............................................................................................05
1.5. Asesor......................................................................................................05
1.6. Duración....................................................................................................05
CAPÍTULO 2: PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA......................................06
1.1. Planteamiento del Problema...................................................................06
1.2. Formulación del Problema......................................................................06
1.3. Objetivos..................................................................................................07
1.3.1. Objetivo General............................................................................07
1.3.2. Objetivos Específicos....................................................................07
1.4. Justificación de la Investigación............................................................07
1.5. Limitaciones de la Investigación............................................................07
CAPÍTULO 3: MARCO TEÓRICO...................................................................08
2.1. Antecedentes de la Investigación..........................................................08
2.2. Bases Teóricas.........................................................................................14
2.3. Hipótesis...................................................................................................23
2.4. Sistemas de Variables.............................................................................24
CAPÍTULO 4: METODOLOGÍA.......................................................................26
4.1. Tipo y Nivel de Investigación.................................................................26
2
4.1.1. Tipo de Investigación......................................................................26
4.1.2. Nivel de Investigación.....................................................................26
4.2. Método de la Investigación.....................................................................26
4.3. Diseño de la Investigación......................................................................27
4.4. Población y Muestra................................................................................27
4.4.1. Población..........................................................................................27
4.4.2. Muestra.............................................................................................27
4.5. Técnica de Recolección de Datos..........................................................27
4.6. Tratamiento Estadístico..........................................................................28
CAPÍTULO 5: ASPECTOS ADMINISTRATIVOS............................................29
5.1. Asignación de Recursos.........................................................................29
5.1.1. Recursos Humanos........................................................................29
5.1.1.1. Personal de Apoyo...........................................................29
5.1.1.2. Personal Especializado...................................................29
5.1.2. Recursos Materiales.......................................................................29
5.1.2.1. Equipos...............................................................................29
5.1.2.2. Materiales...........................................................................29
5.1.2.3. Reactivos...........................................................................30
5.1.2.4. Insumo................................................................................30
5.2. Presupuesto.............................................................................................30
5.3. Cronograma..............................................................................................31
CAPÍTULO 6: BIBLIOGRAFÍA........................................................................33
3
INTRODUCCIÓN
La formación de radicales libres mediante procesos naturales conduce a la
oxidación de biomoléculas, dando lugar a diversas enfermedades. Los
organismos fotosintéticos están expuestos a ambientes muy oxidativos, por lo
que poseen un sistema antioxidante muy eficaz. Presentamos en este trabajo
un sencillo método para la extracción y evaluación de la capacidad antioxidante
de los polifenoles DE PEPINO (Cucumis sativus L.). La concentración de
polifenoles se determina siguiendo el método de Folin-Ciocalteu, y la medición
de la actividad antioxidante se realiza por el método del DPPH.
El estudio de plantas medicinales se ha venido realizando desde hace
décadas, por causa de su uso potencial como fuente de sustancias con
propiedades biológicas. Cucumis sativus L. ha presentado algunas aplicaciones
medicinales, por lo que surge la necesidad de indagar su eventual capacidad
antioxidante. 1
Los nuevos conceptos fisiológicos, farmacológicos y clínicos, han devenido en
investigaciones que han demostrado el rol en diferentes patologías, de las
especies reactivas del oxígeno que se generan como producto de nuestro
metabolismo. Como consecuencia, en los últimos años se actualizó el tema de
los antioxidantes biológicos y se ha incrementado la investigación en búsqueda
de nuevos antioxidantes, principalmente de origen natural. Considerando las
perspectivas que, a la par de los nuevos descubrimientos de la acción de las
especies reactivas del oxígeno, se generarán requerimientos de nuevas
fuentes de agentes o sustancias antioxidantes. 2
CAPÍTULO 1: DATOS INFORMATIVOS
1 Pratico D., Delanty N. (2000) Oxidative injury in diseases of the central nervous system: focus on Alzheimer’s disease. Am. J. Med. 109: 577-5852 Silvia Klinar B., Artemio Chang C. y Jorge Chanllio L (2006) Silvia Klinar B., Artemio Chang C. y Jorge Chanllio L. Evaluación de la actividad antioxidante de Lactuca sativa L. (Lechuga).FITOICA, Año 1- Número 1- Enero del 2006
4
1.1. Institución : Universidad Nacional Intercultural de la
Amazonía
1.2. Carrera profesional: Ingeniería agroindustrial
1.3. Titulo : EVALUACION DE LA CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE EN LA HOJA DE PEPINO
(Cucumis sativus L.)
1.4. Investigador : Víctor Enrique Lozano Maldonado
1.5. Asesor : Ing. Iris O. Yance Ruiz.
1.6. Duración : 12 meses
CAPÍTULO 2: PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
5
2.1 Planteamiento del Problema
Las hortalizas conocidas solamente poseen usos ya conocidos, de usos
farmacéuticos o alimenticios. Pero no se han evaluado en su mayoría la
capacidad Antioxidante que poseen estas.
Un gran número de plantas aromáticas y medicinales contienen compuestos
químicos con propiedades antioxidantes. El descubrimiento de estas
propiedades resulta interesante y útil particularmente como nuevas fuentes de
antioxidantes naturales, alimentos funcionales y nutracéuticos.
El pepino por su riqueza en agua, vitamina "E" y aceites naturales, constituye
uno de los mejores remedios para el cuidado externo de la piel. Asi pues
resulta muy adecuado para pieles que han sufrido las consecuencias de una
exposición prolongada al sol. 3
2.2. Formulación del Problema
El presente estudio nos mostrará la capacidad antioxidante que se pueda
encontrar en la hoja de pepino “Cucumis sativus”, esto significa que se
obtendrá información relevante sobre los distintos antioxidantes.
Por lo anterior, se está en condiciones de afirmar que esta investigación
aportará datos útiles para prevenir los patógenos radicales libres.
¿Se podrá “Evaluar de la capacidad antioxidante en la hoja de pepino (Cucumis
Sativus L.)”?
2.3. OBJETIVOS
GENERAL:
3 María Serrano Maldonado. 2010. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE PARA EL APROVECHAMIENTO DEL MUÉRDAGO QUE INFESTA LA ZONA CHINAMPERA DE XOCHIMILCO. México, D.F. julio
6
Evaluar la capacidad antioxidante en la hoja de Pepino.
ESPECIFICOS:
1. Evaluar la presencia DE LA VITAMINA C.
2. Evaluar la presencia DE COMPUESTOS FENÓLICOS.
2.4. Justificación de la Investigación
Muchos metabolitos secundarios sintetizados en las plantas, son una fuente de
compuestos con capacidad antioxidante, los cuales contribuyen en la
prevención y tratamiento de enfermedades crónicas. El incremento de los
niveles de antioxidantes en hortalizas es un área de gran interés que
representa una oportunidad y un reto para los investigadores, para el
desarrollo de la región.
En las hojas se mezclan dos potentes antioxidantes tal es el caso de la
vitamina C y la clorofila.
El pepino contiene folato, fósforo, potasio, magnesio, sodio, calcio, hierro, pero
pocas calorías (15kcl) y mucha agua (95ml) y fibras. Por esa razón, son
muy empleados en las dietas para adelgazar.Su contenido de potasio y
magnesio disminuye la presión arterial o hipertensión.Igualmente,
contiene vitamina C y ácido cafeico, ambos de acción antioxidante, que
alivian las irritaciones de la piel y reducen hinchazones del cuerpo.
Posee pequeñas cantidades de provitamina A, vitamina E, vitamina B1, B2 y
B3 que intervienen en la producción de glóbulos rojos y blancos
El pepino es un alimento saludable que tiene diversos usos medicinales y curativos y nos puede ayudar a tener un cuerpo saludable.
2.5. Limitaciones
Las hojas son muy útiles en la alimentación, sobre todo por su contenido
en vitaminas (Vit. A y Vit C) además de otros componentes como la clorofila.
7
En las hojas se mezclan dos potentes antioxidantes tal es el caso de la
vitamina C y la clorofila.
CAPÍTULO 3: MARCO TEÓRICO
3.1. Antecedentes de la Investigación
A continuación referenciamos las investigaciones realizadas en el pasado en
diversos centros de investigación, relativas única y exclusivamente al tema
tratado en esta tesis.
3.1.A. "EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE
Myrciaria dubia (H. B. & K.) McVaugh “Camu-camu”
En ese marco, el presente trabajo corresponde a la evaluación del extracto
acuoso del fruto de Myrciaria dubia (H. B. & K.) McVaugh “Camu-camu”.
La evaluación se realizó por un procedimiento “in vitro” que se fundamenta en
la determinación de la capacidad de inhibir a las enzimas Polifenol Oxidasas
(PPO), cuando actúan sobre el catecol oxidándolo a o-benzoquinona, la cual
absorbe a 420nm.
En la evaluación de la actividad antioxidante se ha comprobado que el extracto
acuoso del fruto de Myrciaria dubia (H. B. & K.) McVaugh “Camu-camu”,
presenta capacidad de inhibición a las enzimas Polifenol Oxidasas. Al realizar
una estimación cuantitativa, por comparación con la capacidad de inhibición
enzimática de un estándar de referencia (Vitamina C), se comprobó que dicho
extracto presenta una actividad antioxidante mayor que la vitamina C.
El extracto acuoso del fruto de Myrciaria dubia (H. B. & K.) McVaugh
“Camucamu”, muestra actividad antioxidante en el método de inhibición de las
enzimas PPO.
8
En la estimación cuantitativa de la actividad antioxidante detectada se observó
que el extracto acuoso del fruto de Myrciaria dubia (H. B. & K.) McVaugh
“Camucamu”, presenta una actividad antioxidante de 416% comparada con la
Vitamina C, es decir una potencia antioxidante 4 veces mayor.
3.1.B. “Evaluación de la capacidad antioxidante de siete plantas
medicinales peruanas”
Se evaluó la capacidad antioxidante de veintinueve extractos de las siguientes
plantas medicinales: Cinnamomum zeylanicum “canela”, Calophyllum
brasiliense “lagarto caspi”, Myrciaria dubia “camu camu”, Minthostachys mollis
“muña”, Alchornea castaneifolia “hiporuro”, Smallanthus sonchifolius “yacón”,
Lepidium peruvianum y Lepidium meyenii “maca”, por el método de la
decoloración del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH).
Los diferentes extractos de las plantas estudiadas, presentaron una buena
actividad antioxidante, siendo el extracto etanólico de canela, el que presentó
una mayor capacidad de captación de radicales libres, seguido por el extracto
metanólico de lagarto caspi, camu camu, extracto acuoso de muña y extracto
metanólico de hiporuro.
Es recomendable seguir realizando estudios adicionales por medio de otros
métodos y otras técnicas de aislamiento e identificación estructural de los
principios activos presentes en estos extractos polares, semipolares y apolares,
estudiados en el presente trabajo, que han presentado una gran capacidad
antioxidante.
3.1.C. “EFECTO ANTIOXIDANTE DE FRUTAS Y HORTALIZAS
DE LA ZONA CENTRAL DE CHILE”
9
Se obtuvieron especies hortofrutícolas de diferentes familias botánicas con el
propósito de obtener extractos utilizando sus órganos comestibles en estado
fresco.
La actividad antioxidante de los extractos se determinó usando la prueba de
decoloración del radical violeta 2,2-difenil-1-picril hidrazilo hidratado (DPPH,
C18H12N5O6) (5,6). La actividad antioxidante se mide en términos de donar
hidrógeno o de la capacidad atrapadora de radicales. La reducción y
estabilización del DPPH por los antioxidantes da lugar a la decoloración de
éste, produciendo una disminución de la absorbancia a 517 nm y se expresa
como porcentaje de decoloración de la solución radicalaria a una concentración
dada.
El rendimiento de los extractos acuosos y metanólicos de las frutas fue de
14,5± 4,5% y 11,2 ± 4,4%, respectivamente; en el caso de las hortalizas fue
7,2±2,8% y 4,7±2,4%, respectivamente.
La actividad antioxidante, expresada como porcentaje de decoloración de la
solución radicalaria de DPPH, por parte de extractos a 1000, 500, 100 y 50
μg/mL de concentración final, se muestra en la tabla 1 para frutas y en la tabla
2 para hortalizas.
Las especies reactivas del oxígeno (ERO) causan daño celular que se puede
expresar como patología, tales como las enfermedades cardiovasculares (ECV)
y otras enfermedades crónicas no transmisibles. El organismo humano cuenta
con sistemas antioxidantes; algunos provienen de la dieta, especialmente de
frutas y hortalizas, otros los genera el mismo organismo de manera endógena.
El objetivo de este estudio fue conocer la capacidad antioxidante in vitro de
algunas frutas y hortalizas que se consumen en la Región del Maule de Chile.
3.1.D. “ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CONTENIDO TOTAL DE FENOLES
DE LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS DE Salvia aratocensis, Salvia
Sochensis, Bidens reptons y Montanoa ovalifolia”
10
Se puede indicar que los extractos etanólicos de Salvia aratocensis, Bidens
reptans y Salvia sochensis al presentar valores de EC50 similares entre sí,
poseen una capacidad análoga de capturar al radical DPPH, y muy superior al
extracto etanólico de Montanoa ovalifolia. A su vez, aunque los extractos de
Salvia aratocensis, Bidens reptans y Salvia sochensis presentaron actividades
antioxidantes diez veces menores en relación con la vitamina E, podrían
convertirse en extractos candidatos para el aislamiento de sustancias activas
como antioxidantes, puesto que este caso la actividad observada equivale al
efecto total (sinérgico o no) de la mezcla.
Los valores hallados del contenido total de fenoles (mg fenoles/100 mg de
planta), de los extractos etanólicos de Salvia aratocensis, Salvia sochensis,
Bidens reptans y Montanoa ovalifolia.
los extractos etanólicos de Salvia aratocensis y Bidens reptans, poseen el
mayor contenido total de fenoles.
Los extractos etanólicos de Salvia aratocensis y Bidens reptans, presentaron la
mayor capacidad de capturar el radical DPPH. A su vez, tuvieron el mayor
contenido total
de fenoles. Mientras que, lo contrario sucede con los extractos de Salvia
sochensis y Montanoa ovalifolia. En general, los resultados obtenidos dan un
indicio sobre la posibilidad de utilizar las especies Salvia aratocensis y Bidens
reptans como plantas promisorias para el aislamiento de sustancias fenólicas
con actividad antioxidante.
3.1.E. “Análisis de polifenoles, actividad antioxidante y genotoxicidad en
especies argentinas de Lippia y Aloysia (Verbenaceae)”
11
Se determinó la capacidad antioxidante y genotoxicidad de las preparaciones
acuosas (infusiones y cocimientos). L. integrifolia fue la especie con mayor
contenido de fenoles totales y A. polystachya la menor. En el análisis de los
hidroxicinámicos, A. polystachya fue la que mayor concentración mostró. En
cuanto a los flavonoides, A. polystachya fue la que poseyó menor
concentración en tanto que A. gratissima var. schultziana fue la más rica en
estos compuestos. A. polystachya es la especie que presenta los menores
valores de actividad antioxidante, seguida por A. gratissima var. gratissima y A.
gratissima var. schulziana, mientras que L. integrifolia es la especie con mayor
actividad antioxidante, en correlación con los valores de polifenoles totales.
Ninguna de las especies analizadas demostró actividad genotóxica en el
ensayo del cometa. La ausencia de genotoxicidad, sumada a una marcada
actividad antioxidante, justificaría el empleo de las infusiones y cocimientos en
el tratamiento de aquellas patologías donde los agentes antioxidantes juegan
un importante rol terapéutico. Estos estudios sugieren el empleo seguro en la
medicina tradicional de los pueblos y comunidades que las incluyen entre sus
plantas medicinales.
En la cuantificación de fenoles totales no se han determinado diferencias
significativas cuando se compara la infusión y el cocimiento de cada especie
(Tabla 1), si bien los cocimientos provenientes de A. gratissima var. gratissima
y A. polystachya presentan menores concentraciones de fenoles respecto de
sus infusiones. Probablemente, debido a la naturaleza de los compuestos
fenólicos presentes, durante el proceso de infusión se extrae la mayoría de los
polifenoles, no obteniéndose concentraciones significativamente mayores
cuando el método empleado involucra condiciones más enérgicas de
extracción (cocimiento).
Las especies correspondientes al género Aloysia presentan los valores más
bajos de fenoles totales. Dentro del género se observa que A. polystachya es la
especie que presenta los valores más bajos, A. gratissima, en sus dos
variedades, es la especie que presenta valores intermedios de fenoles totales,
12
pero existe una diferencia significativa entre ambasvariedades. Por último,
Lippia integrifolia es la especie con mayores niveles de polifenoles.
De acuerdo con los valores obtenidos de los ácidos hidroxicinámicos totales
(Tabla 2), A. polystachya es la especie con menor concentración; L. integrifolia
presenta valores inferiores a los detectados para las dos variedades de A.
gratissima.
El análisis del contenido de flavonoides totales (Tabla 3), muestra que A.
polystachya es la especiecon menor concentración de dichos compuestos y es
duplicada en el contenido de flavonoides por las otras especies del género
Aloysia. Para L. integrifolia se obtuvieron valores intermedios entre ambas
variedades de A. gratissima.
La ausencia de genotoxicidad, sumada a una marcada actividad antioxidante,
estaría avalando el empleo de las infusiones y los cocimientos en la medicina
tradicional de los pueblos y comunidades que incluyen a las especies aquí
analizadas entre sus plantas medicinales.
3.1.F. “Capacidad antioxidante in vitro de fracciones de hojas de Piper
peltatum L.”
La composición fitoquímica del extracto crudo demostró que estos extractos
son ricos en compuestos fenólicos, con una menor presencia de compuestos
terpenoides.
En el potencial antioxidante de las fracciones fue considerablemente más alto
que el extracto crudo. Por otro lado, la EC50 estuvo en el intervalo de 4,7 a 87,1
mg extracto/µmol DPPH. Lo anterior sugiere que la fracción 1 puede contener
los compuestos con mayor capacidad antioxidante.
La actividad de las muestras de las hojas de P. peltatum sobre el reactivo de
FRAP. Se observa que la absorbancia para las fracciones 1, 2 y 3 aumentó por
causa de la formación del complejo Fe2+-TPTZ con el incremento de la
concentración de los extractos. De la misma manera como sucedió con el
13
ensayo de DPPH, la fracción 1 presentó la actividad reductora más promisoria.
El estado estacionario de la reacción entre el DPPH y las diferentes fracciones,
el cual fue en todos los casos menores que 5 min. En este estudio preliminar
tanto el extracto crudo como las fracciones presentaron buena actividad
antirradical.
3.2. Bases Teóricas
3.2.1. HISTORIA NATURAL DE LA ESPECIE
CENTRO DE ORIGEN
Asia y en particular la India es considerado el centro de origen del pepino,
debido a la frecuente ocurrencia de especies silvestres de Cucumis con
número cromosómico n=7, además de la existencia de vestigios del cultivo de
hace 3000-4000 años, y aunque algunos autores señalan que el centro de
origen es África tropical, la mayoría de los trabajos señalan un origen
totalmente asiático. 4
CENTRO DE DIVERSIFICACIÓN DE LA ESPECIE
El centro de diversificación primario de la especie es la zona sur y este del
Himalaya en la India y de ahí fue trasladado para Grecia e Italia y después a
China considerado como el segundo centro de diversificación. Posteriormente
4 Bisognin, 2002, p.718; Krístková et al., 2003, p.14-15; InfoAgro: Pepino; AgroNet; Report of the cucurbit working group.
14
esta especie fue introducida a Francia en el siglo IX, a Inglaterra en el siglo XIV
y a Norte América a mediados del siglo XVI.5
Cucumis sativus
INFORMACIÓN TAXONÓMICA
REINO : Plantae
DIVISIÓN : Magnoliophyta
CLASE : Magnoliopsida
ORDEN : Violales
FAMILIA : Cucurbitaceae
GÉNERO : Cucumis L., 1753
ESPECIE : sativus L., 1753
SINÓNIMOS
Cucumis esculentus Salisb., 1796
Cucumis muricatus Willd., 1805
Cucumis sativus chiar Forssk., 1775
CARACTERÍSTICAS ECOGEOGRÁFICAS
INTERVALO ALTITUDINAL
Esta especie se cultiva primordialmente en zonas con climas cálidos, desde el
nivel del mar a 1500 (-2000) msnm6.
HÁBITAT
Se encuentra en cultivares, agrosistemas y en huertos familiares, generalmente
abarcando climas cálidos7.
VEGETACIÓN
Cuando es escapada al cultivo, forma parte de vegetación secundaria y ruderal,
derivados de bosques tropicales, aunque también se encuentra en matorrales,
5 Bisognin, 2002, p.718; Krístková et al., 2003, p.14-15; InfoAgro: Pepino; AgroNet.6 Nee, 1993, p.29. 7 Nee, 1993, p.29; Plants for a future: Cucumis sativus.
15
vegetación de dunas costeras, bosques de galería, pastizales y bosques de
encino8.
SUELO
El pepino puede cultivarse en cualquier tipo de suelo de estructura suelta, bien
drenado y con suficiente materia orgánica. Es una planta medianamente
tolerante a la salinidad (algo menos que el melón), de forma que si la
concentración de sales en el suelo es demasiado elevada las plantas absorben
con dificultad el agua de riego, el crecimiento es más lento, el tallo se debilita,
las hojas son más pequeñas y de color oscuro y los frutos obtenidos serán
torcidos. Si la concentración de sales es demasiado baja el resultado se
invertirá, dando plantas más frondosas, que presentan mayor sensibilidad a
diversas enfermedades. El pH óptimo oscila entre 5,5 y 7. 9
CARACTERÍSTICAS DE LA ESPECIE
DESCRIPCIÓN DE LA ESPECIE
Hierbas anuales, postradas. Tallos angulosos, híspidos. Zarcillos simples,
densa o esparcidamente hispídulos. Hojas pecioladas, pecíolos 4.0-7.0 cm
largo, híspidos; láminas 8.0-12.0 cm largo, 6.0-11.0 cm ancho, cordado-
triangulares, angulosamente 3-5-lobadas, el lóbulo Terminal triangular,
acuminado, ambas superficies híspidas10.
3.2.2. Antioxidante
8 Nee, 1993, p.29; Plants for a future: Cucumis sativus. 9 Plants for a future: Cucumis sativus; AgroNet. 10 Nee, 1993, p.28-29; Krístková et al., 2003, p.16-19.
16
Los radicales libres son protagonistas de numerosas enfermedades que
provocan reacciones en cadena, estas reacciones solo son eliminadas por la
acción de otras moléculas en estos procesos tóxicos en el organismo, los
llamados sistemas antioxidantes defensivos. Se ha demostrado que el
organismo posee un numero de mecanismos a través de los cuales produce y
a la vez limita la producción de especies reactivas de oxígeno. Un exceso de
radicales libres suele iniciar el daño de la pared vascular y en este proceso se
encuentra implicado el colesterol LDL; se ha demostrado en la incidencia de
enfermedades cardiovasculares con suplementos individuales de antioxidantes.
Un antioxidante es una molécula capaz de retardar o prevenir la oxidación de
otras moléculas. El sistema de defensa antioxidante está constituido por
compuestos de naturaleza enzimática como: superóxido dismutasa, catalasa,
glutation peroxidasa, y compuestos de naturaleza no enzimática como:
vitamina E, beta-caroteno, vitamina C, glutation reducido, albúmina, flavonoides
y metales de transición como Se, Cu, Zn, entre otros.
El estrés oxidativo ha sido asociado a la patogénesis de muchas enfermedades
humanas, es por ello que el uso de antioxidantes en farmacología es estudiado
de forma intensiva, particularmente como tratamiento para accidentes
cerebrovasculares y enfermedades neurodegenerativas.
Actualmente existen diversos métodos para determinar la actividad
antioxidante, los cuales se basan en su capacidad para captar radicales libres.
Entre ellos se pueden mencionar el uso del 2,2-difenil-1-picril hidrailo (DPPH),
ácido 2,2´, azino-bis (3-etilbenzotiazolin)-6- sulfónico (ABTS), la reacción con el
óxido nitroso (test NO), dicloridrato de N,N-Dimetilp-fenilendiamina (DMPD),
generación de radicales peroxilo, superóxido e hidroxilo, y otros Los alimentos,
al igual que las células del organismo humano, también pueden generar
radicales libres; sin embargo también pueden contener sustancias
17
antioxidantes y ejercer una actividad antioxidante, al igual que las plantas
medicinales11.
Sistemas de defensa antioxidante
El sistema de defensa antioxidante está constituido por un grupo de sustancias
que al estar presente en concentraciones bajas con respecto al sustrato
oxidable, retrasan o previenen significativamente la oxidación de este. Como
sustrato oxidable se pueden considerar casi todas las moléculas orgánicas o
inorgánicas que se encuentran en las células vivas, como proteínas, lípidos,
hidratos de carbono y las moléculas de ADN.29 Los antioxidantes impiden que
otras moléculas se unan al oxígeno, al reaccionar-interactuar más rápido con
los radicales libres del oxígeno y las especies reactivas del oxígeno que con el
resto de las moléculas presentes, en un determinado microambiente
-membrana plasmática, citosol, núcleo o líquido extracelular (tabla 1). La acción
del antioxidante es de sacrificio de su propia integridad molecular para evitar
alteraciones de moléculas -lípidos, proteínas, ADN, etc.- funcionalmente vitales
o más importantes.30 Su acción la realizan tanto en medios hidrofílicos como
hidrofóbicos.31 Actúan como eliminadoras (Scavengers), con el objetivo de
mantener el equilibrio prooxidante/antioxidante a favor de estos últimos (tabla
2). Los antioxidantes exógenos actúan como moléculas suicidas, ya que se
oxidan al neutralizar al radical libre, por lo que la reposición de ellos debe ser
continua, mediante la ingestión de los nutrientes que los contienen.
Tabla 1. Clasificación de los antioxidantes según el sitio donde ejercen su
acción
Intracelular Membrana Extracelular
Superóxido dismutasa Vitamina E Ceruloplasmina
Catalasa Betacarotenos Transferinas
Peroxidasa Ubiquinol-10 Lactoferinas
11 Centro de Investigación de Medicina Tradicional, Instituto de Investigación, Facultad de Medicina Humana, Universidad San Martín de Porres.
18
DT-deafarasa Albúminas
GSH Haptoglobinas
Proteínas que ligan metales Vitamina C
Sistemas proteolíticos Ácido úrico
Vitamina C Vitamina E
Tabla 2. Clasificación de los antioxidantes, según origen
Origen Acción
1. Exógenos
Vitamina E - Neutraliza el oxígeno singlete
- Captura radicales libres hidroxilo
- Captura O2
- Neutraliza peróxidos
Vitamina C - Neutraliza el oxígeno singlete
- Captura radicales libres de hidroxilo
- Captura O2
- Regenera la forma oxidada de la
vitamina E
Betacarotenos Neutraliza el oxígeno singlete
Flavonoides,
Licopenos
2. Endógenos
Enzimáticos Cofactor
Superóxido
dismutasa (SOD)Cobre, sodio, manganese
Catalasa (CAT) Hierro
Glutatión
peroxidasa (GPx)Selenio
3. No enzimáticos
Glutatión
Barreras fisiológicas que enfrenta el
oxígeno a su paso desde el aire hasta
las células
Coenzima Q
Ácido Tioctico Transportadores de metales
19
(transferrina y ceruloplasmina)
12.
3.2.3. Actividad antioxidante
Por definición la actividad antioxidante es la capacidad de un compuesto de
inhibir la degradación oxidativa (Roginsky y Lissi, 2005). Una de las estrategias
más aplicadas en las medidas in vitro de la capacidad antioxidante total de un
compuesto, mezcla o alimento, consiste en determinar la actividad del
antioxidante frente a sustancias cromógenas de naturaleza radical; la pérdida
de color ocurre de forma proporcional con la concentración. No obstante, las
determinaciones de la capacidad antioxidante realizadas in vitro muestran tan
solo una idea aproximada de lo que ocurre en situaciones complejas in vivo.
La medición de la actividad antioxidante en un ensayo individual, refleja solo la
reactividad química bajo ciertas condiciones de la prueba, por lo que es
inapropiado generalizar los datos de un método de medición en particular,
como indicador de actividad antioxidante total
Métodos de cuantificación de la capacidad antioxidante
1.5.1 Métodos in vitro
Los métodos para determinar la capacidad antioxidante se pueden dividir en
dos grandes categorías, los basados en la reacción de transferencia de átomo
hidrógeno (HAT) y los basados en las reacciones de transferencia de un solo
electrón (ET). Los últimos involucran una reacción redox con el oxidante como
un indicador del final de la reacción, mientras que losmétodos HAT,
generalmente usan un compuesto generador de radicales libres, un indicador
molecular oxidable y un antioxidante
12 Instituto Superior de Medicina Militar “Dr. Luis Díaz Soto” Daño oxidativo, radicales libres y antioxidantes
20
- Método de inhibición de consumo de oxígeno (IOU).
Este método usa como sustrato estireno y como radical iniciador
azoisobutironitrilo. Se mide el consumo de oxígeno en presencia o ausencia de
tocoferoles en clorobenceno usando un sistema transductor de presión bajo
una atmósfera de presión de oxígeno. Este método no tiene una aplicación
amplia debido a que las condiciones de trabajo de presión de oxígeno son
irreales y las muestras de alimentos tienen baja concentración de antioxidantes
por lo que la sensibilidad del método no es suficiente (Huang et al., 2005).
- Inhibición de autoxidación lipídica.
Este método induce artificialmente la autoxidación de ácido linoleico por Cu (II)
o un iniciador azo. El progreso de la autoxidación es monitoreado por
absorbencia UV a 234 nm, para detectar peróxidos conjugados de dieno. Este
método es más sensible que el método de inhibición de consumo de oxígeno,
sin embargo, muchos compuestos orgánicos de alimentos absorben a 234 nm
por lo que no es una medición exacta (Huang et al., 2005).
- Capacidad de absorbencia del radical oxígeno (ORAC).
Originalmente, la primera versión del ORAC usaba la proteína fluorescente B-
Ficoeritrina (B-PE) como prueba. Su fluorescencia decaía como indicador del
daño producido por la reacción con radical peroxilo. Sin embargo, se encontró
que la B-PE representaba grandes desventajas para la medición de capacidad
antioxidante, ya que tiene gran variabilidad, es fotosensible e interacciona con
polifenoles de manera inespecífica perdiendo fluorescencia aun sin agregar el
radical generador. Para resolver este problema, se reemplazó la B-PE con
fluoresceína que es sintética y cubre las limitaciones de B-PE. La prueba
ORAC provee una medición directa de la capacidad antioxidante hidrofílica y
lipofílica contra radicales peroxilo
21
- Método de blanqueamiento de Crocina.
Este método mide la capacidad de protección de los antioxidantes frente a un
generador de radicales libres en el blanqueamiento de crocina que es un
derivado carotenoide. El progreso de la reacción es monitoreado por
espectrofotómetro UV-vis a una longitud de onda de 443 nm, durante 10 min. El
método de blanqueamiento de crocina tiene limitaciones en alimentos ya que
varían las constantes de reacción entre ROO● y fitoquímicos, muchos
pigmentos de alimentos absorben a la misma longitud de onda y la crocina al
ser una mezcla natural de pigmentos extraídos del azafrán tiene mucha
variabilidad (Huang et al., 2005).
- Parámetro total del atrapamiento de radicales por antioxidantes.
Este parámetro usa R-ficoeritrina como muestra fluorescente. El progreso de la
reacción con iniciador azo es monitoreado fluorométricamente (λcx = 495 nm y
λcm = 575 nm). La capacidad antioxidante es expresada en equivalentes
Trolox (Huang et al., 2005).
- Fenoles totales por reactivo Folin-Ciocalteu.
Mide la capacidad de reducción de una muestra. El reactivo de Folin-Ciocalteu
es color amarillo, la contaminación con reductores le da un color verde,
mientras que los oxidantes le regresan su color amarillo. El reactivo no es
específico a compuestos fenólicos, por lo que puede ser reducido por
compuestos no fenólicos. Los compuestos fenólicos reaccionan con el reactivo
solo bajo condiciones alcalinas. La disociación de protones fenólicos genera un
anión fenolato que es capaz de reducir al reactivo.
Métodos in vivo
22
Las técnicas ex vivo están tomando importancia como alternativas a las
pruebas de toxicidad animal, ya que disminuye el uso de animales
experimentales y el costo, además tienen gran especificidad y rapidez (Asensio
et al., 2007).
- Evaluación de efecto citotóxico.
Los ensayos de citotoxicidad miden las alteraciones inducidas por drogas en
rutas metabólicas o integridad estructural, la cual puede o no ser relacionada
directamente a la muerte celular, sin embargo, los ensayos de supervivencia
miden el final de los resultados de tales perturbaciones metabólicas los cuales
pueden ser tanto recuperación celular o muerte celular. Teóricamente el único
índice de supervivencia en la proliferación celular es la demostración de la
integridad reproductiva (Freshney, 1992).
- Absorción de rojo neutro (NRU).
Este método es utilizado para probar nuevos productos terapéuticos para
padecimientos agudos y para evaluación de toxicidad crónica (Ndhlala, 2010).
El método de absorción de rojo neutro evalúa células viables o sobrevivientes
basadas en la capacidad que tienen para incorporar o unir rojo neutro, una tinta
supravital. El rojo neutro es una tinta catiónica débil que penetra la membrana
celular por difusión y se acumula intracelularmente en los lisosomas. Las
alteraciones en las membranas lisosomales provocan fragilidad y otros daños
irreversibles. Estos daños reducen la absorción de rojo neutro, es por esto que
es posible distinguir entre células viables, dañadas o muertas (Repetto et al.,
2008).
- Evaluación de oxidación de lípidos in vivo.
Las especies reactivas del oxígeno son mediadores importantes del daño
celular alterando membranas o actividad enzimática. Los ácidos grasos
poliinsaturados son particularmente susceptibles al ataque de radicales libres,
formándose hidroperóxidos lipídicos, hidróxidos y aldehídos como productos de
la degradación (El Haffidi y Baños, 1997).
23
El Fe(III) y Fe(II) catalizan reacciones de peroxidación lipídica por la generación
de especies reactivas del oxígeno, por lo que en este análisis, se induce
peroxidación lipídica por inyección intraperitoneal de hierro-dextan in vivo a
ratas. La peroxidación se evalúa por el método de sustancias reactivas del
ácido tiobarbitúrico en suero sanguíneo (El Haffidi y Baños, 1997).
3.4. Hipótesis
3.4.1. Hipótesis General
“Las hojas poseen componentes orgánicos como la vitamina C, que a su vez
esta vitamina posee actividad antioxidante. Por lo tanto es posible que permita
la evaluación de la capacidad antioxidante en la hoja de pepino “Cucumis
sativus L.”.
3.4.2. Hipótesis Nula
“No se podrá evaluar la capacidad antioxidante mediante el método
espectofométrico de la hoja de Pepino (cucumis sativus L.)”.
3.5. Sistemas de Variables
3.5.1. Variables dependientes
a. Solventes (etanol, metanol, agua destilada)
b. Tiempo de extracción (30, 60 y 90 minutos)
c. Temperatura de extracción (25, 50 y 75ºC)
Definición Conceptual:
24
Solventes: Son compuestos orgánicos basados en el elemento químico
Carbono. Ellos producen efectos similares a los del alcohol o los anestésicos.
Estos efectos se producen a través de la inhalación de sus vapores.
Algunos de ellos tienen aplicaciones industriales como los pegamentos,
pinturas, barnices y fluidos de limpieza. Otros son utilizados como gases en
aerosoles, extinguidores de fuego o encendedores para cigarrillos.
Extracción: es un procedimiento de separación de una sustancia que puede
disolverse en dos disolventes no miscibles entre sí, con distinto grado de
solubilidad y que están en contacto a través de una interfase. La relación de las
concentraciones de dicha sustancia en cada uno de los disolventes, a una
temperatura determinada, es constante.
3.5.2. Variables independientes
a. Concentración (Vit. A, Vit. C, polifenoles y antioxidantes)
Definición Conceptual:
a. Concentración La concentración de aceite se refiere a la cantidad (volumen)
que se obtiene, producto de la aplicación de un método de extracción.
3.5.3Variables constantes
a. Temperatura ambiental
b. Humedad relativa
c. Presión atmosférico 540 mm.Hg
Definición Conceptual:
a. Temperatura ambiental: es la temperatura que se puede medir con un
termómetro y que se toma del ambiente actual, por lo que, si se toma de varios
puntos en un área a un mismo tiempo puede variar.
Esto es debido a que una temperatura tomada en un ambiente tan frío como lo
es el Polo Norte, donde la temperatura sería bajo cero (si se mide en grados
25
Fahrenheit o en Centígrados), no será igual a una tomada en un lugar tan
cálido como un desierto donde la temperatura estaría muy por encima del cero.
b. Humedad relativa: La humedad relativa es la humedad que contiene una
masa de aire, en relación con la máxima humedad absoluta que podría admitir
sin producirse condensación, conservando las mismas condiciones de
temperatura y presión atmosférica.
c. Presión atmosférica: La presión atmosférica es la presión ejercida por el
aire atmosférico en cualquier punto de la atmósfera. Normalmente se refiere a
la presión atmosférica terrestre, pero el término es generalizable a la atmósfera
de cualquier planeta o satélite.
La presión atmosférica en un punto representa el peso de una columna de aire
de área de sección recta unitaria que se extiende desde ese punto hasta el
límite superior de la atmósfera. Como la densidad del aire disminuye cuando
nos elevamos, no podemos calcular ese peso a menos que seamos capaces
de expresar la densidad del aire ρ en función de la altitud z o de la presión p.
Por ello, no resulta fácil hacer un cálculo exacto de la presión atmosférica sobre
la superficie terrestre; por el contrario, es muy fácil medirla.
CAPÍTULO 4: METODOLOGÍA
4.1. Tipo y Nivel de Investigación
4.1.1. Tipo de Investigación
La presente es una investigación de tipo descriptiva explicativa, la cual se
encarga de cuantificar la capacidad antioxidante extraído de la hoja de pepino
(Cucumis sativus L.).
26
4.1.2. Nivel de Investigación
El presente proyecto de tesis, de acuerdo a la naturaleza del estudio de la
investigación, reúne por sus características una investigación descriptiva
explicativa.
4.2. Método de la Investigación
4.2.1. Cuantificación de la Vitamina C:
Se determinará cuantitativamente por el método espetofométrico, basado en la
reducción del colorante 2-6 diclorofenolindofenol por medio de una solución de
ácido ascórbico a una longitud de onda de 515 nm, (AOAC 1995)
4.2.2. Cuantificación de Compuestos Fenólicos
Se determinará con el reactivo Folin- Cicoalteu, usado como estándar el ácido
clorogénico, desarrollado por el método de Brand Williams.
4.2.3. Cuantificación de la Capacidad Antioxidante (AOA)
Método espectofotométrico basado en una reacción con el 2,2- Diphenil-1-
picrilhidracil (DPPH), a una longitud de onda de 515 nm.
4.3. Diseño de la Investigación
El presente proyecto de tesis corresponde a un diseño tranversal, esto implica
que se realizan la toma de datos en un momento único en el tiempo midiendo
variables de manera individual y se reportan estas mediciones entre variables,
son correlacionales y si establecen procesos de causalidad entre variables son
correlacionales/causales.
4.4. Población y Muestra
27
4.4.1. Población
La población de la hoja de pepino (Cucumis sativus L.) a estudiar por el
presente proyecto de tesis, es la que se encuentra de manera silvestre en los
campos agrícolas de la región.
4.4.2. Muestra
La muestra seleccionada será al 100% de la muestra total recolectada en un
solo día de faena.
4.5. Técnica de Recolección de Datos
La principal técnica que se utiliza en este proyecto de tesis, es el análisis de
contenido apoyándose en la observación del investigador y el análisis
documental, ya que el la técnica más usada, recopilando datos de la fuente
secundaria como libros, informes, y otros documentos que son indispensables
como fuente de datos de toda investigación actual.
4.6. Tratamiento Estadístico
4.6. Diseño Experimental
Unidad experimental (hoja de pepino)
28
LEYENDA:
S1, S2, S3 : Solvente 1, 2, 3
Θ1, Θ2, Θ3 : Tiempo 1, 2, 3
T1, T2, T3 : Temperatura 1, 2, 3
4.6. Tratamiento Estadístico
Diseño completamente al azar (DCA) con arreglo factorial de 3x3x3.
Ajuste de tukey (α =0.1)
SAS
Interpretación de resultados
CAPÍTULO 5: ASPECTOS ADMINISTRATIVOS
5.1. Asignación de Recursos
5.1.1. Recursos Humanos
5.1.1.1. Personal de Apoyo
29
- Tabuladores
- Programador de estadísticas
5.1.1.2. Personal Especializado
- Asesores
- consultorías
5.1.2. Recursos Materiales
5.1.2.1. Equipos
- Espectrofotómetro Smart Spectro
- Balanza Analítica
- Estufa
- Computadora
- Empacadora
5.1.2.2. Materiales
- Tamiz
- Matraces
- Fiolas
- Micropipetas
- Bolsas de polipropileno
- Vasos de precipitación
5.1.2.3. Reactivos
- Etanol
- Metanol
- Colorante 2-6 diclorofenolindofenol
- Folin- Cicoalteu
30
- 2,2- Diphenil-1-picrilhidracil (DPPH)
5.1.2.4. Insumo
Hoja de pepino (Cucumis sativus L.).
5.2. Presupuesto
ITEM Unidades
de Medida
Cantidad Precio
Unitario s/.
Monto
Total1) Elaboración del Proyecto
de tesis
- Papel bond A4
- Cuadernillo de Apunte
- Internet
- Lapiz
- Lapiceros
2) Adquisición de equipos y
materiales
*Equipos
- Espectrofotómetro
- Balanza Analítica
- Estufa
- Computadora
- Empacadora
*Materiales
- Tamiz
- Matraces
- Fiolas
- Micropipetas
- Bolsas de polipropileno
- Vasos de precipitación
31
* Reactivos
- Etanol
- Metanol
- Colorante 2-6
diclorofenolindofenol
- Folin- Cicoalteu
- 2,2- Diphenil-1-
picrilhidracil (DPPH)
3) Elaboración del Informe
final
- Papel bond A4
- Impresiones
- AnilladoTotal
5.3. Cronograma
Meses y Semanas
Actividades
Octubre Noviembre Diciembre Enero
Elaboración del Proyecto de
32
TesisRecopilación de Datos
Fuentes primariosRecopilación de Datos
Fuentes secundariosPresentación del Proyecto de
TesisSustentación del Proyecto de
TesisRecepción de Materia Prima
Recepción de Insumos y
ReactivosProceso de Cuantificación de
actividad antioxidante, Vitamina
C y Compuestos FenólicosRecopilación de Datos
Procesamiento de DatosAnálisis de Datos
Elaboración de Informe FinalSustentación de Informe Final
CAPÍTULO 6: BIBLIOGRAFÍA
1. Pratico D., Delanty N. (2000) Oxidative injury in diseases of the central nervous system: focus on Alzheimer’s disease. Am. J. Med. 109: 577-585
2. Silvia Klinar B., Artemio Chang C. y Jorge Chanllio L (2006) Silvia Klinar B., Artemio Chang C. y Jorge Chanllio L. Evaluación de la actividad antioxidante de Lactuca sativa L. (Lechuga).
3. FITOICA, Año 1- Número 1- Enero del 2006
4. María Serrano Maldonado. 2010. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE PARA EL APROVECHAMIENTO DEL MUÉRDAGO QUE INFESTA LA ZONA CHINAMPERA DE XOCHIMILCO. México, D.F. julio
5. Bisognin, 2002, p.718; Krístková et al., 2003, p.14-15; InfoAgro: Pepino; AgroNet; Report of the cucurbit working group.
33
6. Bisognin, 2002, p.718; Krístková et al., 2003, p.14-15; InfoAgro: Pepino; AgroNet.
7. Nee, 1993, p.29.
8. Nee, 1993, p.29; Plants for a future: Cucumis sativus.
9. Nee, 1993, p.29; Plants for a future: Cucumis sativus.
10.Plants for a future: Cucumis sativus; AgroNet.
11.Nee, 1993, p.28-29; Krístková et al., 2003, p.16-19.
12.Centro de Investigación de Medicina Tradicional, Instituto de Investigación, Facultad de Medicina Humana, Universidad San Martín de Porres.
13. Instituto Superior de Medicina Militar “Dr. Luis Díaz Soto” Daño oxidativo, radicales libres y antioxidantes
34