renaturação protéica 2013

7/23/2019 Renaturao Protica 2013

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INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES

Autarquia associada Universidade de So Paulo

ESTUDOSDERENATURAODEPROTENASAGREGADAS

UTILIZANDOALTASPRESSESHIDROSTTICAS

Natlia Malavasi Vallejo

Orientadora: Dra. Ligia Ely Morganti Ferreira Dias

So Paulo

2013


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INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES

Autarquia associada Universidade de So Paulo



Natlia Malavasi Vallejo

Tese apresentada como parte dos

requisitos para obteno do Grau de

Doutor em Cincias na rea de

Tecnologia Nuclear Aplicaes.

Orientadora: Dra. Ligia Ely Morganti Ferreira Dias

So Paulo

2013


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Dedico este trabalho s pessoas mais

importantes da minha vida: meus pais, Paulo e Beth,

que confiaram no meu potencial para esta conquista.No conquistaria nada se no estivessem ao meu lado.

Obrigada, por estarem sempre presentes a todos os

momentos, me dando carinho, apoio, incentivo,

determinao, f, e principalmente pelo Amor de vocs!


4/104

Agradecimentos

Agradeo principalmente Deus, por ter me dado a vida e estar sempre do

meu lado, permitindo que com o passar do tempo eu possa evoluir principalmente

como ser humano.

Aos meus pais, Pauloe Beth, por dedicarem a vida por mim, por fazer de

mim quem sou hoje, e pelo amor incondicional que sempre me fez seguir no

caminho que escolhi.

Ao meu irmo Diego e a minha tia Eliane, mesmo que de longe,

participaram de mais esta conquista e tenho certeza que torceram todos os dias

pelo meu sucesso. Muito Obrigada, Amo vocs!!

Ao Bruno, pelo apoio em tudo que fao, pela dedicao, pacincia e amor

durante todos esses anos.

minha orientadora Ligia Ely Morganti Ferreira Dias, pela oportunidade

de ser sua aluna, pela confiana depositada em mim e por compartilhar comigo

seus conhecimentos e experincias profissionais.

Ao Prof. Dr. Patrick Jack Spencer, por toda a ajuda e conselhos na

realizao deste trabalho e por dividir comigo seus conhecimentos e experincias

no laboratrio durante todos esses anos.

Ao Dr. Carlos Bonaf, pela colaborao permitindo a utilizao do sistema

de presso do Laboratrio Termodinmica de Protrenas da UNICAMP e a

Julianae Joelmapela ajuda na realizao dos experimentos.

Ao Dr. Geraldo Santana Magalhes, pela doao do gene da eGFP.

Ao Dr. Shaker Chuck Farah, a Cristiane Guzzo, ao Maicone ao Raphael

pela doao dos genes das protenas de Xac e pela ajuda na realizao dos

experimentos de purificao e atividade biolgica destas protenas.


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As amigas de trabalho, Laura, Daniella e Rosa, cada uma com o seu

jeitinho aprendi que a convivncia com as pessoas no fcil, porm

impossvel realizar o trabalho sozinha. Sem vocs o trabalho ficaria muito mais

difcil, a cada uma o meu muito obrigada!!!

s amigas que fiz no IPEN, Danielle, Keli, Larissa, Karina e Renata,

pelas conversas, conselhos, saidinhas, almoos e tardes de risadas que tivemos

durante todos esses anos de amizade. Muito Obrigada!

Aos amigos que fiz no IPEN, Alberto (Troxinha), Mariana, Tamara,

Rodrigo, Vincent, Eliza, Bia, Fernanda, Bruno, Ed Carlos, Allison, Daniele e a

tantos outros.

A todos os funcionrios do Centro de Biotecnologia do IPEN, que cada um

em seu setor fez parte da realizao deste trabalho, Rute, Arlete, Z Maria,

Junqueira, Joo, Sr. Longino, Sandra, Beth, Nia, Marisa, Gislaine, sem

vocs no seria possvel.

s amigas, Renata (Fuba), Flavinha (Florzinha)e Claudinha (Japa)pela

amizade, pelo companheirismo, pelo apoio, pela pacincia, pelas risadas e choros

e por todos esses anos inesquecveis que passamos juntas. Muito Obrigada pela

amizade!!

s amigas, Bianca, Giovanna, Thas, Gabie Thalita, que com o passar do

tempo cada uma tomou um caminho diferente e no importa a distncia e o tempo

que passamos sem nos falar ou nos ver, que a amizade, o carinho e o amor

continuam os mesmos, e tenho certeza que torcem pela minha felicidade. Muito

Obrigada!!!

Ao CNPq e a FAPESPpelo apoio financeiro.


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S depois que o passado passou que a gente descobre o quanto ele foi

bom enquanto durou

Eno Teodoro Wanke


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NATLIAMALAVASIVALLEJO

RESUMO

No presente trabalho estudamos a renaturao sob alta presso

hidrosttica de uma forma mutante da protena verde fluorescente (enhanced

GFP, eGFP), a qual somente emite fluorescncia caracterstica quando enovelada

na sua forma nativa. A abordagem do presente estudo foi focada no controle da

bioatividade da protena recombinante, a fluorescncia, como alternativa determinao de solubilidade da protena, fator que no um indicador ideal de

enovelamento proteico adequado. A ao da alta presso na solubilizao dos

corpos de incluso (CI) de eGFP produzidos em bactrias E. colirecombinantes e

no enovelamento da protena foi estudada. A compresso dos CI de eGFP em 2,4

kbar durante 30 minutos promoveu a dissociao dos agregados. No entanto, a

incubao nesta condio no favoreceu o enovelamento da eGFP. O processo

de renaturao foi avaliado em diversas condies de descompresso aps a

dissociao em 2,4 kbar. Durante a descompresso gradual, o aumento da

fluorescncia foi obtido em presses que variaram entre a presso atmosfrica e

1,38kbar. Os nveis mais elevados de fluorescncia de eGFP foram obtidos por

incubao durante vrias horas a nveis de presso entre 0,35 e 0,69 kbar. Esta

condio de presso se mostrou favorvel renaturao de eGFP e possvel

que tambm possa ser utilizada para favorecer o enovelamento de outras

protenas monomricas. Ainda utilizando a eGFP como modelo, verificamos que

os CI desta protena produzidos por bactrias cultivadas em menor temperatura

(37C) possuem maior quantidade de protena recombinante apresentando a

fluorescncia caracterstica em 509 nm, ou seja, na sua forma nativa, do que os

CI expressos em temperaturas mais elevadas (42C e 47C). A anlise realizada

por espectroscopia de infravermelho (FT-IR) tambm demonstrou que os CI

produzidos em temperaturas mais brandas possuem maior grau de estruturas

secundrias semelhantes s da protena na sua forma nativa. Alm disso, os CI


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produzidos a 37C tambm so mais facilmente solubilizados pela ao da alta

presso do que aqueles produzidos em maior temperatura. Conforme esperado, a

renaturao da eGFP a partir de CI produzidos a 37C foi 25 vezes mais eficiente

do que a obtida utilizando CI produzidos a 47C. No presente estudo

demonstramos tambm que a dissociao dos agregados exercida pela ao daalta presso (2,4 kbar) pode ser amplificada quando em associao com a

incubao em baixa temperatura (-9C) e que a combinao destas duas

propriedades fsicas eleva a solubilizao dos agregados em CI, com a

consequente elevao dos rendimentos de renaturao de eGFP. Mostramos

ainda no presente estudo que a cintica de renaturao de eGFP em 0,69 kbar

proporcional temperatura de incubao (entre 10C e 50C). O nvel mais

elevado de fluorescncia foi obtido quando a renaturao de eEGP foi realizada a

20C. A taxa de maturao do cromforo da eGFP mais fortemente afetada pelatemperatura do que a taxa de enovelamento da protena. Em concluso, a

temperatura de produo dos CI, a temperatura de dissociao dos agregados e

a temperatura de enovelamento podem afetar muito o rendimento e a cintica da

renaturao de eGFP em alta presso.

Os resultados do presente estudo podem abrir novas perspectivas para

melhorias no processo de enovelamento de protenas a partir de CI utilizando alta

presso. Tambm neste trabalho descrevemos a renaturao das protenas de

Xac, PilB e os produtos dos genes XAC2810 e XAC3272 nunca antes obtidas na

forma solvel. Os rendimentos de solubilizao destas trs protenas foram muito

altos, entre 75% e 89%. A protena PilB renaturada em alta presso apresentou

atividade ATPasica elevada, o que nunca antes foi demonstrado para a PilB de

Xac.


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RENATURATIONSTUDIESOFAGGREGATEPROTEINSUSING

HIGHHYDROSTATICPRESSURE

NATLIAMALAVASIVALLEJO

ABSTRACT

In the present work we studied the refolding under high hydrostatic pressure

of a mutant form of the green fluorescent protein (eGFP), which only emits the

green characteristic fluorescence when in the native folded state. The approach of

the present study was focused on controlling the bioactivity of the recombinant

protein, the fluorescence, as an alternative for the determination of proteinsolubility, which is not an ideal indicator of proper protein folding. We studied the

action of high pressure in the solubilization of the inclusion bodies (IB) of eGFP

produced in bacteria E. coliand in the folding of this protein. The compression of a

suspension of eGFP IB at 2.4 kbar for 30 minutes promoted dissociation of

aggregates. However, the eGFP folding, monitored by the fluorescence at 509 nm,

does not occur in this pressure level. The process of eGFP refolding was

evaluated under various decompression conditions after dissociation of the IB at

2.4 kbar. During the gradual decompression, the increase in fluorescence was

achieved at pressures ranging between atmospheric pressure and 1.38 kbar. The

higher levels of eGFP fluorescence were obtained by incubation for several hours

at pressure levels between 0.35 and 0.69 kbar. It is possible that the pressure

condition that proved favorable for refolding of eGFP can also be used to favor the

folding of other monomeric proteins. Using eGFP as a model, we also found that

the IB produced by bacteria grown in a relatively low temperature (37C) is more

fluorescent, presenting a higher amount of recombinant protein with the

characteristic fluorescence at 509 nm, i.e., in its native form, than the IB expressed

at higher temperatures (42C and 47C). The analysis by infrared spectroscopy

(FT-IR) also demonstrated that the IB produced at milder temperatures have a

higher degree of secondary structure similar to the protein in its native form.

Furthermore, the IB produced at 37C are also more readily solubilized by the

action of high pressure than those produced at the higher temperatures. As


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expected, the folding of eGFP from IB produced at 37C was 25 times more

efficient than that obtained using IB produced at 47C. In this study we

demonstrated that the dissociation of aggregates exerted by the action of high

pressure (2.4 kbar) can be amplified by combination with incubation at low

temperature (-9C) and the association of these two physical properties can beused to increase the solubilization of the aggregates in IB, with a consequent

increase in the yield of eGFP refolding. In the present study we also showed that

the kinetics of refolding of eGFP is proportional to temperature (10C 50C). The

higher level of fluorescence was obtained when the refolding of eGFP was

performed at 20C. The rate of maturation of the eGFP chromophore is more

strongly affected by temperature than the rate of folding of the protein. In

conclusion, the temperature of production of IB, the temperature of dissociation of

aggregates and the folding temperature can greatly affect the yield and kinetics ofrefolding of eGFP at high pressure.

The results of this study may open new perspectives for improvements in

the process of protein folding from IB using high pressure. In this paper we also

describe the refolding of the proteins ofXac, PilB and the gene products XAC2810

and XAC3272, which have never before been achieved in soluble form. The yields

of solubilization/refolding of these three proteins were very high, between 75% and

89%. The protein PilB refolded at high pressure presented high ATPase activity,

which has never been shown for the PilB ofXac.


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NDICE DE TABELAS

Tabela 1. Exemplos de organismos bioluminescentes (Chalfie 1998). 12

Tabela 2.Antibiticos utilizados para expresso das protenas e genes alvos. 29

Tabela 3.Esquemas de Compresso e Descompresso. 31Tabela 4.Rendimento de renaturao de eGFP em alta presso hidrosttica. 51

Tabela 5.Taxas de aquisio de fluorescncia 62


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NDICE DE FIGURAS

Figura 1.Microscopia eletrnica de varredura (MEV) dos CI do fator estimulador

de colnias granulocitrias humano (G-CSF)......................................................... 2

Figura 2.Etapas para a recuperao de protenas solveis a partir de CI............ 4Figura 3. Efeitos da alta presso hidrosttica ocasionando a dissociao de

protenas oligomricas e a desnaturao das subunidades................................... 8

Figura 4.Aequoria victoria....................................................................................13

Figura 5.Estrutura tridimensional da GFP............................................................15

Figura 6.Mecanismo para a maturao do cromforo. ........................................15

Figura 7.Citros mostrando sintomas de Cancro ctrico........................................19

Figura 8. Vista area da erradicao de rvores de laranja em um raio de 30

metros em relao ao centro do foco da contaminao porXac...........................19

Figura 9.Bomba e vaso de presso.....................................................................31

Figura 10. Espectrofluormetro acoplado a uma clula de presso, gerador de

presso, e banho termostatizado. .........................................................................35

Figura 11.Cubeta de quartzo selada com tampa flexvel de silicone...................35

Figura 12.Efeito da alta presso na dissociao de CI de eGFP (EL e MEV). ....41

Figura 13. Intensidade de Fluorescncia de eGFP renaturada sob diferentes

mtodos de compresso e descompresso..........................................................44

Figura 14. Intensidade de Fluorescncia de eGFP a partir de suspenses de CI

submetidos a 2,4 kbar de presso utilizando diferentes presses intermedirias na

renaturao. ..........................................................................................................45

Figura 15.Renaturao e solubilizao dos CI de eGFP.....................................48

Figura 16.Espectros na regio de amida I das amostras liofilizadas, eGFP nativa

purificada e CI produzidos em diferentes temperaturas. .......................................54

Figura 17.Intensidade de fluorescncia especfica de suspenses de CI de eGFP

produzidos em diferentes temperaturas. ...............................................................55

Figura 18.Dissociao de suspenses de CI de eGFP pela ao de alta presso

e monitorado pelo EL. ...........................................................................................56

Figura 19. Intensidade de fluorescncia da eGFP renaturada a partir de CI

produzidos em diferentes temperaturas. .............................................................. 57


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Figura 20.Efeito de alta presso e baixa temperatura na dissociao dos CI de

eGFP e na renaturao da protena......................................................................59

Figura 21.Cintica de renaturao da eGFP a 0,69 kbar. ...................................62

Figura 22. Cintica de fluorescncia de suspenses de CI e protena nativa,

submetidos a 2,4 kbar, despressurizao para 0,69 kbar e incubao emdiferentes temperaturas. .......................................................................................62

Figura 23.Efeito de diferentes concentraes de Gnd HCl na dissociao dos CI

produzidos em diferentes temperaturas de cultivo. ...............................................64

Figura 24. Rendimentos de solubilizao das suspenses de CI submetidas

renaturao em alta presso. Seleo de proporo de glutationas

reduzida/oxidada...................................................................................................66


renaturao em alta presso. Seleo de proporo das concentraes de GndHCl. .......................................................................................................................67


renaturao em alta presso. Presena de diferentes aditivos.............................69


renaturao em alta presso. Efeito de diferentes mtodos de compresso e

descompresso.....................................................................................................72

Figura 28.Cromatografia em coluna de excluso molecular (Superdex 200) das

protenas solveis deXac. ....................................................................................74


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Lista de Abreviaturas

A Absorbncia

aa Aminocidos

bis-ANS 4,4-dianilino-1,1-binaftil-5,5-sulfonato

BSA Albumina bovina srica

CI Corpos de incluso

D.O. Densidade ptica

Da Daltons

DTT 1,4-ditiotreitol

E. coli Escherichia coli

EDTA cido etilenodiamino tetra-actico

eGFP Enhanced green fluorescent protein

EL Espalhamento de luz

FT-IR Espectroscopia de infravermelho

g Acelerao da gravidade

Gdn HCl Hidrocloreto de guanidina

GFP Green fluoroscence protein

GSH Glutationa reduzia

GSSG Glutationa oxidada

IPTG Isopropil, -D-tiogalactopiranosdeo

L-Arg L-Arginina

MEV Microscopia eletrnica de varredura

NaCl Cloreto de Sdio

PEG Polietilenoglicol

SDS Dodecil sulfato de sdio

SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida

Tris Tris(hidroximetil)aminometanoTween 20 Polioxietileno sorbitol monolaureato

Xac Xanthomonas axonopodispv citri


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SUMRIO

1. INTRODUO ................................................................................................... 1

1.1. Expresso de protenas recombinantes....................................................... 1

1.2. Processos Clssicos de Renaturao ......................................................... 41.2.1. Renaturao de protenas agregadas em CI utilizando altas presses

hidrostticas ...................................................................................................10

1.3. Protena Verde Fluorescente ......................................................................11

1.3.1. Bioluminescncia .................................................................................11

1.3.2.Aequorea victoria .................................................................................12

1.3.3. Protena verde fluorescente selvagem (GFP) e Enhanced GFP

(eGFP) ...........................................................................................................14

1.4. Protenas de Xanthomonas axonopodis pv citri ..........................................17

1.4.1. Papel do cancro ctrico na economia brasileira....................................17

1.4.2.Xanthomonas axonopodispv citri........................................................20

1.4.3. Genmica Funcional e Protemica ......................................................20

2. OBJETIVOS ......................................................................................................24

3. MATERIAIS E MTODOS.................................................................................25

3.1. Materiais .....................................................................................................25

3.1.1. Equipamentos e acessrios principais .................................................25

3.1.2. Reagentes e solues..........................................................................26

3.1.3. Linhagem celular bacteriana ................................................................27

3.1.4. Vetores plasmdicos.............................................................................28

3.2. Mtodos......................................................................................................28

3.2.1. Transformao e expresso.................................................................28

3.2.2. Lavagem dos CI ...................................................................................29

3.2.3. Solubilizao dos CI.............................................................................30

3.2.4. Pressurizao dos CI ...........................................................................30

3.2.5. Agentes de xido-reduo ...................................................................32

3.2.6. Agente solubilizante .............................................................................32

3.2.7. Aditivos.................................................................................................32

3.2.8. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE) ...........................33

3.2.9. Medidas de fluorescncia e de espalhamento de luz (EL) .................. 34


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3.2.10. Dissociao dos CI sob alta presso hidrosttica e temperaturas

negativas........................................................................................................35

3.2.11. Microscopia eletrnica de varredura (MEV) .......................................36

3.2.12. Espectroscopia de infravermelho (FT-IR)...........................................36

3.2.13. Purificao por cromatografia de afinidade por metais imobilizados..373.2.14. Clculo das taxas de constantes de aquisio de fluorescncia........37

3.2.15. Caracterizao das protenas solveis PilB e produtos dos genes

XAC2810 e XAC3272 por cromatografia de excluso molecular ...................38

3.2.16. Anlise de atividade biolgica das protenas renaturadas sob alta

presso hidrosttica.......................................................................................38

4. RESULTADOS E DISCUSSO.........................................................................40

4.1. Protena verde fluorescente (GFP) .............................................................40

4.1.1. Dissociao dos CI utilizando alta presso hidrosttica.......................404.1.2. Renaturao de CI de eGFP sob alta presso hidrosttica .................42

4.1.3. Estados renaturados e no renaturados permanecem solveis aps a

descompresso..............................................................................................46

4.1.4. A presena de Gdn HCl desfavorece a renaturao de eGFP.............50

4.1.5. Influncia da temperatura de expresso na estrutura secundria da

eGFP nos CI ..................................................................................................51

4.1.6. A fluorescncia dos CI depende da temperatura de cultivo das

bactrias.........................................................................................................54

4.1.7. Efeito de presso e temperatura na dissociao dos agregados e na

renaturao de eGFP sob alta presso hidrosttica ......................................57

4.1.8. Cintica de renaturao da eGFP em diferentes temperaturas sob alta

presso ..........................................................................................................59

4.2. Protenas de Xac ........................................................................................63

4.2.1. Seleo da temperatura de cultivo dos CI............................................63

4.2.2. Efeito das diferentes propores de glutationas reduzida/oxidada na

solubilizao das protenas............................................................................65

4.2.3. Efeito de diferentes concentraes de Gdn HCl na solubilizao dos CI

sob presso....................................................................................................66

4.2.4. Efeito de diferentes aditivos na solubilizao dos CI sob presso .......68

4.2.5. Efeito de diferentes mtodos de compresso e descompresso na

solubilizao e renaturao de CI ................................................................. 71


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4.2.6. Caracterizao das protenas deXacpor cromatografia de excluso

molecular........................................................................................................72

4.2.7. Anlise de atividade biolgica das protenas deXacrenaturadas sob

alta presso hidrosttica ................................................................................75

5. CONCLUSES .................................................................................................776. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..................................................................80


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1

1. INTRODUO

1.1. Expresso de protenas recombinantes

A produo de protenas recombinantes tornou-se uma ferramenta muito

valiosa para a pesquisa e a terapia com protenas de interesse, essencial para a

indstria biotecnolgica, oferecendo suporte para a expanso da pesquisa

biolgica moderna, incluindo a genmica estrutural e a protemica (Ventura and

Villaverde 2006; Fahnert 2012). O sistema de expresso de protenas heterlogas

no glicosiladas mais comumente empregado utiliza a bactria Escherichia coli

como hospedeira. Este sistema amplamente difundido devido facilidade e

baixo custo de cultivo das bactrias em condies laboratoriais, pela alta

reprodutibilidade e em muitos casos pela abundncia de produo das protenas

de interesse. No entanto, ao expressar protenas recombinantes em bactrias, um

dos efeitos secundrios mais comuns a formao de corpos de incluso (CI)

(Baneyx and Mujacic 2004; Liovic, Ozir et al. 2012). A agregao das cadeias

polipeptdicas como CI pode se apresentar como um problema para a

biotecnologia, dificultando a produo e a comercializao de muitas protenas de

interesse (Fahnert, Lilie et al. 2004).

Vrios sistemas de expresso e condies de cultivo foram aprimoradoscom o objetivo de evitar a formao de CI. Contudo, a formao destes

agregados proteicos ainda muito comum e muitas vezes inevitvel (Hartley and

Kane 1988). Apesar da produo dos CI ser considerada, de modo geral,

indesejada, sua formao pode ser vantajosa. Os principais benefcios

associados aos CI so: produo de elevados nveis de protenas, baixo custo,

homogeneidade da protena alvo, resistncia protelise e como resultado,

baixos nveis de degradao da protena expressa e fcil isolamento e

purificao. No caso da protena de interesse ser txica para as clulashospedeiras, a produo em CI se torna praticamente a nica opo vivel de

expresso (Clark 2001; Singh and Panda 2005).

A formao de CI um processo complexo e depende das condies de

cultivo e do tipo de expresso das protenas. Alguns fatores envolvidos no

processo de agregao incluem: alta concentrao local de protena sintetizada;


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2

acmulo de protenas com a conformao completa ou parcialmente incorreta;

processo de renaturao proteica incorreto; ausncia de modificaes ps-

traducionais necessrias para obter a solubilidade de algumas protenas

eucariticas e inibio da formao de pontes dissulfeto nativas no ambiente

redutor da bactria (Fahnert, Lilie et al. 2004; Upadhyay, Murmu et al. 2012). OsCI citoplasmticos (figura 1) so estruturas ovides ou cilndricas com dimetros

que variam de 0,5 a 1,3 m e maior densidade (~1,3 mg/ml) do que muitos

componentes celulares. O fato de os CI serem insolveis facilita a sua separao

dos outros componentes celulares por centrifugao e lavagens aps o

rompimento celular. Estas estruturas so altamente hidratadas, possuem uma

arquitetura porosa e em geral so relativamente puras (Carrio, Cubarsi et al.

2000; Singh and Panda 2005). O tamanho dos agregados bem como as suas

outras propriedades fsicas e estruturais depende das condies de cultura e deinduo da expresso nas bactrias hospedeiras (Margreiter, Messner et al. 2008;

Margreiter, Schwanninger et al. 2008).

Figura 1. Microscopia eletrnica de varredura (MEV) dos CI do fator estimulador de colniasgranulocitrias humano (G-CSF). Retirado de(Peternel, Grdadolnik et al. 2008.)

At recentemente as protenas dos CI eram consideradas como totalmenteinativas. No entanto, o conhecimento atual sobre CI evoluiu e hoje em dia se

reconhece que protenas agregadas em CI no so necessariamente inativas (de

Groot and Ventura 2006). Por meio de espectroscopia de infravermelho (FT-IR) se

demonstrou que as protenas nos CI possuem estruturas secundrias

semelhantes quelas das protenas em seu estado nativo (Ami, Natalello et al.


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3

2006). Alm disso, dados recentes indicam a presena de certa porcentagem de

protenas apresentando estruturas tercirias com conformao nativa em CI, fato

de grande importncia para a produo de protenas recombinantes, pois sugere

que as protenas podem ser liberadas dos CI em um estado funcional, desde que

se utilizem condies que desarranjem a rede de contatos intermoleculares semdesnaturarem as estruturas nativas que esto embebidas nestes agregados (de

Groot and Ventura 2006).

O fato de a atividade biolgica das protenas nos CI poder chegar a quase

100% possibilitou inclusive a utilizao dessas protenas estruturadas e

biologicamente ativas como uma fonte adequada de enzimas para o uso direto

em biocatlise (Tokatlidis, Dhurjati et al. 1991; Nahalka and Patoprsty 2009).

A estratgia geral para recuperar protenas nativas a partir de CI envolve

trs etapas: isolamento e lavagem dos CI, solubilizao dos agregados proteicose enovelamento das protenas solubilizadas (figura 2). As clulas contendo os CI

so geralmente rompidas atravs de uma combinao de mtodos qumicos,

mecnicos e enzimticos. A suspenso restante ento centrifugada para o

isolamento das protenas solveis da frao insolvel e alguns passos de

lavagens so realizados para a remoo de protenas de membrana e outros

contaminantes dos CI. Uma variedade de mtodos pode ser utilizada para a

solubilizao e renaturao dos CI, contudo no h um mtodo universal para a

renaturao de todas as protenas. A renaturao de protenas a partir de CI

frequentemente requer um extensivo processo de tentativa e erro (Clark 2001).


21/104

4

Figura 2. Etapas para a recuperao de protenas solveis a partir de CI. Modificado de(Clark2001.)

1.2. Processos Clssicos de Renaturao

O processo de renaturao de protenas a partir de CI requer a

solubilizao das protenas e sua posterior renaturao para a obteno de

conformao e atividade biolgica nativas. Os processos clssicos de renaturao

de protenas a partir de agregados em CI requerem o uso de agentes

desnaturantes qumicos fortes em altas concentraes. Comumente, agregados

de protenas so solubilizados em agentes caotrpicos fortes como, por exemplo,

6 M de hidrocloreto de guanidina (Gdn HCl) ou 8 M de uria (Clark 2001; St John,

Carpenter et al. 2002). Estes agentes solubilizam as protenas nos CI

promovendo sua desnaturao atravs de uma combinao de aes. A estrutura

da gua perturbada e desta forma as molculas hidrofbicas se tornam mais

solveis neste solvente. Os agentes desnaturantes ligam-se aos grupos polares

das protenas, rompendo as interaes eletrostticas e pontes de hidrognio que


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5

mantm a estrutura proteica, resultando na desnaturao das molculas de

protena (Caballero-Herrera, Nordstrand et al. 2005).

Uma vez solveis e desnaturadas, as protenas so primeiramente diludas

e ento enoveladas pela remoo do agente caotrpico por dilise, diluio

adicional ou mtodos de fase slida. Contudo, estes mtodos convencionais derenaturao, frequentemente geram novos agregados de protenas durante o

processo de remoo do agente caotrpico, o que resulta na necessidade de

utilizao de concentraes proticas muito baixas (10 a 50 g/mL) a fim de evitar

a reagregao (Clark 2001). Com a finalidade de minimizar a reagregao

proteica durante a renaturao, certos aditivos qumicos podem ser utilizados. Os

surfactantes ligam-se nas regies hidrofbicas expostas, protegendo a protena

da agregao, enquanto alguns acares e sais auxiliam na estabilizao dos

estados de conformao intermediria (Cowan, Davies et al. 2008).Nos casos de protenas que possuem pontes dissulfeto o processo de

renaturao em geral realizado na presena de agentes redutores que auxiliam

na quebra de pontes dissulfeto no nativas e solubilizao dos agregados e de

agentes oxidantes que auxiliam na formao de pontes dissulfeto nativas. A

oxidao da protena pode ser realizada atravs da adio de uma mistura em

propores e concentrao adequados de reagentes oxidantes e redutores, como

as glutationas, cistenas e cistaminas. A renaturao utilizando glutationas

envolve a quebra das pontes no nativas e formao de pontes dissulfeto entre a

glutationa e a protena, seguida de renaturao na presena de uma quantidade

de glutationa reduzida. A utilizao destes reagentes aumenta a solubilidade da

protena durante a renaturao, desfavorecendo a formao de pontes dissulfeto

no nativas (Clark 2001; Singh and Panda 2005).

Portanto, o passo de renaturao nos mtodos clssicos difcil e depende

fortemente das condies de renaturao. Por exemplo, condies de redox, pH,

taxas de dilise e concentrao proteica devem ser empiricamente otimizados

para cada protena. Encontrar as condies que levem a rendimentos aceitveis

de renaturao, quando possvel, geralmente requer a seleo de um grande

nmero de condies de renaturao (Clark 1998; Vincentelli, Canaan et al.

2004). Frequentemente, aps pesquisa extensiva, os rendimentos de renaturao

continuam muito baixos. Alm disso, baixas concentraes de protena

necessrias para rendimentos de renaturao aceitveis, levam a grandes


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6

volumes de processamento e requerem grandes quantidades de agentes

caotrpicos corrosivos e txicos (Fischer, Sumner et al. 1993).

A presso um parmetro fsico que modula as interaes protena-

solvente atravs da mudana de volume do sistema (Silva and Weber 1993; Kim,

Randolph et al. 2006). Os efeitos da presso na interao entre segmentos desubunidades de uma protena ou entre ligaes intramoleculares so ditados por

reaes similares, que produzem essencialmente o desvio do equilbrio em favor

dos reagentes que ocupam o menor volume (princpio de Le Chatelier). A

perturbao na estrutura terciria de protenas mediada por alta presso, ocorre

devido s mudanas de volume associadas com a alterao de acessibilidade do

solvente nos diferentes estados conformacionais de uma protena, ou seja,

quando em solues aquosas e em altas presses, as protenas so infiltradas

por gua. As conformaes parcialmente enoveladas de protenas sob ao dealta presso ligam uma quantidade substancial de gua (Silva and Weber 1993).

Por esta razo a desnaturao por altas presses no ocorre na ausncia de

gua (Mozhaev, Heremans et al. 1996).

Os volumes especficos nas protenas agregadas e em protenas com

estrutura quaternria so maiores do que nos estados nativos devido presena

de cavidades intermoleculares no expostas gua. Em solues aquosas de

protenas sob altas presses hidrostticas, o decrscimo no volume especfico de

protenas quando do desenovelamento parcial ou total causado por uma

combinao de vrios efeitos: 1) rompimento de pontes salinas, seguido por

hidratao e decrscimo de volume correspondente devido eletroestrio; 2)

hidratao de resduos polares e no polares recm-expostos; 3) perda de

volume livre que aparece de defeitos no empacotamento de cavidades livres de

gua. A magnitude da diminuio do volume pequena, 0,5 a 1% do volume total

especfico da protena e as mudanas de volume para a populao de estados

intermedirios tendem a ser ainda menores. Desta forma, a aplicao de alta

presso favorece estados proteicos contendo cavidades mnimas, estados com

maior exposio de grupos hidrofbicos e estados mais altamente ionizados

(Silva and Weber 1993; Mozhaev, Heremans et al. 1996; Randolph, Seefeldt et al.

2002; Seefeldt, Ouyang et al. 2004). O esquema mostrado na figura 3 demonstra

o fenmeno de dissociao de uma protena dimrica promovida pela alta

presso (Boonyaratanakornkit, Park et al. 2002).


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7

A alta presso hidrosttica tambm tem sido utilizada como uma

ferramenta importante para o estudo do enovelamento de protenas e da dinmica

e estrutura de estados intermedirios do caminho de enovelamento, pois

possibilita sua estabilizao, tornando possvel a caracterizao da estrutura e

dinmica destes estados. O estudo da ao de altas presses sobre as protenastem possibilitado o melhor entendimento de como os polipeptdeos se enovelam

em conformaes altamente estruturadas (Silva, Foguel et al. 2001).


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8

subunidade subunidade

cavidade

1 bar

Presena de cavidadesdentro da protena

subunidade

subunidade

1~3 kbar

Dissociao de CI

Eletroestrio Formao de clatratos ao

redor dos resduos

hidrofbicos

subunidade

~5 kbar

subunidade

Flutuaes

conformacionais

fornecem vias para a

penetrao da gua nas

cavidades

Inchao do ncleo

hidrofbico

5~10 kbar

Ruptura da estrutura

terciria

Perda de cavidades

dentro da protena

Figura 3. Efeitos da alta presso hidrosttica ocasionando a dissociao de protenasoligomricas e a desnaturao das subunidades. Modificado de(Boonyaratanakornkit, Park et al.2002.)


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Estudos tm demostrado que altas presses hidrostticas so uma

alternativa atrativa s tcnicas tradicionais de desnaturao e diluio para a

renaturao de protenas em termos de concentrao proteica, simplicidade no

processo, custo e potencial para aumentar rendimentos de protenas com

conformao nativa e atividade biolgica a partir de agregados (Seefeldt, Ouyanget al. 2004).

Altas presses hidrostticas foram descritas como capazes de solubilizar

os agregados e possibilitar a renaturao de protenas (Foguel, Robinson et al.

1999; St John, Carpenter et al. 1999; Randolph, Seefeldt et al. 2002). Como

exemplo citamos os estudos que utilizaram agregados do hormnio de

crescimento recombinante, da lisozima e da -lactamase, nos quais o processo

de renaturao em alta presso hidrosttica levou a altos rendimentos (> 90%) de

protenas nativas, mesmo na presena de altas concentraes proteicas (St John,Carpenter et al. 1999; St John, Carpenter et al. 2001; St John, Carpenter et al.

2002).

Sob altas presses ocorre a entrada de gua nas estruturas proteicas.

Presses da ordem de 1 a 3 kbar desfavorecem interaes intermoleculares

hidrofbicas e eletrostticas, levando dissociao de agregados. Os mesmos

tipos de interao so tambm responsveis pelas estruturas proteicas nos

estados nativos. No entanto, normalmente as protenas no so desnaturadas at

presses de 5 kbar em temperatura ambiente. Ento, a dissociao de complexos

macromoleculares pela aplicao de presso de at 2 a 3 kbar no

acompanhada de perda de estruturas secundrias e tercirias existentes nos

estados dissociados (Silva and Weber 1993; Silva, Foguel et al. 2001). Em

contraste, as pontes de hidrognio no so sensveis alta presso hidrosttica

devido desprezvel mudana de volume associada quebra dessas pontes

(Randolph, Seefeldt et al. 2002). Alteraes de temperatura e/ou baixas

concentraes (no desnaturantes) de agentes desnaturantes como Gdn HCl e

uria, foram descritas como teis para facilitar a quebra das pontes de hidrognio

entre protenas nos agregados promovida pela alta presso (St John, Carpenter et

al. 2002).

A alta presso tambm no quebra pontes dissulfeto que fazem ligaes

cruzadas covalentes entre agregados de protenas. Nos casos de polipeptdeos

contendo pontes dissulfeto, um par xido-redutor pode ser includo nas solues


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10

durante a compresso de modo a facilitar a quebra das pontes dissulfeto

intermoleculares e formao de pontes dissulfeto nativas (St John, Carpenter et

al. 2002; Chura-Chambi, Genova et al. 2008). Aps a desagregao induzida por

presso, a quebra de ligaes no nativas e formao de pontes dissulfeto

nativas so necessrias para permitir a formao de molculas nativas, as quaisapresentam as menores energias livres (St John, Carpenter et al. 2002).

Estas propriedades claramente diferenciam a alta presso hidrosttica dos

mtodos tradicionais que utilizam altas concentraes de agentes caotrpicos. As

principais vantagens associadas utilizao da alta presso para dissociao de

CI e renaturao de protenas recombinantes so: a solubilizao das protenas

agregadas e sua renaturao ocorrem nas mesmas condies de tampo, o uso

de altas concentraes de agentes caotrpicos no necessrio, o que pode

possibilitar a manuteno da estrutura secundria e terciria semelhantes nativaexistentes, e a desagregao dos CI ocorre rapidamente. Deste modo, a alta

presso uma ferramenta til para dissociao de agregados proticos em

protenas nativas e sua renaturao, facilitando a preparao de protenas para

estudos estruturais e funcionais e tambm para aplicaes em indstria

biotecnolgica (Kim, Randolph et al. 2006).

1.2.1. Renaturao de protenas agregadas em CI utilizando altas

presses hidrostticas

Os primeiros dois artigos sobre a renaturao de protenas utilizando altas

presses foram publicados no mesmo ano, 1999 (Foguel, Robinson et al. 1999; St

John, Carpenter et al. 1999). Alguns artigos foram publicados aps essa data

descrevendo a otimizao do processo de renaturao para diferentes protenas

utilizando altas presses. A literatura ainda pouco representativa, porm os

trabalhos publicados mostram sua eficincia, sugerindo que o processo pode ter

alta aplicabilidade. Algumas publicaes j descreveram o desenvolvimento de

processo de renaturao de protenas a partir de CI: a enzima flavina redutase

(Okai, Ohtsuka et al. 2012), o fator de crescimento vascular endotelial humano

(VEGF) (Cothran, St John et al. 2011), o hormnio de crescimento murino


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(Fradkin, Boand et al. 2010), as protenas de Drosophila melanogaster Gram-

negative bacteria binding proteins (GNBP 1, GNBP 2 e GNBP 3), duas fosfatases

humanas (PTPRS e DUSP7) (Lee, Carpenter et al. 2006), membros da famlia de

receptores nucleares (Schoner, Bramlett et al. 2005) e a -lactamase (St John,

Carpenter et al. 1999). O mais recente trabalho descreve a renaturao daprotena quimiotaxina leucocitria 2 (LECT2), com a obteno de um alto

rendimento de renaturao (10 mg/L) (Okai, Ohtsuka et al. 2012; Zheng,

Miyakawa et al. 2013). Dentre estas publicaes esto algumas do nosso grupo

em que foram obtidas a renaturao da protena antiangiognica endostatina

(Chura-Chambi, Genova et al. 2008), da bothropstoxina 1 de Bothrops

jararacussu (Balduino, Spencer et al. 2011) e da protena OmpA de Leptospira

interrogans(Fraga, Chura-Chambi et al. 2010).

No entanto, pelo que de nosso conhecimento, no haviam sidopublicados artigos com o objetivo de estudar a ao da alta presso sobre

dissociao dos CI ou sobre as estruturas proteicas com a finalidade de aprimorar

este processo utilizando como modelo uma protena fluorescente.

No presente trabalho foram utilizadas quatro protenas: uma monomrica

(GFP de Aequorea Victoria) e trs oligomricas (PilB e produtos dos genes

XAC2810 e XAC3272 deXanthomonas axonopodispv citri -Xac) para os estudos

de renaturao de protenas agregadas em CI utilizando altas presses

hidrostticas.

1.3. Protena Verde Fluorescente

1.3.1. Bioluminescncia

A bioluminescncia um fenmeno natural observado em diversas

espcies de organismos marinhos e terrestres (tabela 1). No ambiente terrestre o

vagalume o representante mais conhecido. Os animais marinhos utilizam-se da

bioluminescncia para afastar predadores, para camuflagem mimetizando outras

espcies, para atrair suas presas e seus parceiros no perodo reprodutivo e como

fonte alternativa de energia (Barnes 1991). O mecanismo qumico de produo de


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luz por organismos marinhos difere para cada espcie. A maioria apresenta

somente quimioluminescncia ou bioluminescncia resultante de reao qumica

mediada por fotoprotenas. O exemplo mais bem elucidado a reao de

oxidao da luciferina a oxiluciferina catalisada pela enzima luciferase, produzindo

luz. Outros mecanismos de luminescncia so independentes de substrato eapresentam sistemas prprios. A fluorescncia ocorre quando um eltron excitado

deslocado para uma rbita de maior energia e ao retornar para o estado de

menor energia, emite um fton.

Tabela 1. Exemplos de organismos bioluminescentes. Retirado de(Chalfie 1998.)

Tipo deorganismo

Gnerorepresentativo

Mecanismos / Componentesde emisso de fluorescncia

Caracterstica /Funo

Bactria PhotobacteriumFlavina reduzida e aldedo da

cadeia longa de luciferaseEmisso constante

Dinoflagelados NoctilucaCintilao atravs de

organelas celulares (=470nm)

Brilho em flashesrpidos para afugentar

predadores

CnidriosMedusasHidrides

Aequorea victoria

Ca2+, coelenterazina /aequorina ncleos

imidazlicos-piraznicos(=470 - 509nm), emisso:

GFP


predadores.

Ctenforos BeroeCa2+, coelenterazina

(=460nm )


predadores

Crustceos Cypridina ncleos imidazolcos-iraznicos (=465nm) Liberar enzimas emsubstratos

Insetos, vaga-lume

Photinus, Photurisncleo benzotiazlico, ATP,

Mg2+(=550-580nm)

Flashes, afastarpredadores,

acasalamento

1.3.2.Aequorea victoria

A Aequorea victoria um cnidrio de corpo totalmente transparente em

forma de guarda-chuva, com dimetro entre 7 e 10 cm que apresenta grnulosbioluminescentes ao redor de seu corpo, formando um crculo (figura 4).


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Figura 4.Aequoria Victoria. Restirado de(http://cienciaemdia.folha.blog.uol.com.br/arch2008-10-05_2008-10-11.html.)

A produo da luminescncia ocorre por meio de uma reao qumica

altamente exotrmica em que a oxidao de uma molcula orgnica,

genericamente chamada de luciferina, libera energia preferencialmente na forma

de luz visvel. Essa reao catalisada por enzimas chamadas de luciferases. A

natureza qumica das luciferinas, cofatores e a seqncia e estrutura destas

protenas variam de um grupo taxonmico a outro, levando a concluso que a

bioluminescncia se originou vrias vezes e independentemente durante a

evoluo (de Farias 2009).

No caso das guas-vivas do gnero Aequorea, a bioluminescncia em

geral verde. Curiosamente, os primeiros estudos bioqumicos, que tentavam

caracterizar o sistema bioluminescente dessas guas-vivas, mostraram que a

ruptura da estrutura celular dos grnulos presentes nas medusas resultava no

isolamento de uma luciferase e luciferina que produziam luz azul, em vez deverde, como observado no animal vivo. Havia um terceiro componente que

produzia luminescncia verde (Shimomura, Johnson et al. 1962). Foi essa

observao que levou Osamu Shimomura a isolar a protena verde fluorescente

em 1962 e como consequncia deste importante achado, receber o prmio Nobel

de Qumica em 2008. Essa protena, embora no seja luminescente por si s, ao


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ser irradiada com luz visvel na faixa azul do espectro, produz uma luminescncia

verde intensa, devido fluorescncia. O grupo de Shimomura verificou que, no

sistema bioluminescente intacto das medusas, quem transfere a energia para a

GFP a prpria reao bioluminescente da luciferase e luciferina. Quando o

complexo luciferase-luciferina e a GFP esto suficientemente prximos, a energiade excitao do complexo luciferase-oxiluciferina eficientemente transferida

para a GFP, que fluoresce na regio do verde. Essa modalidade de transferncia

de energia chamada de transferncia por ressonncia e depende da

proximidade e sobreposio dos espectros de emisso do doador de energia (o

complexo luciferase-oxiluciferina excitada) e de absoro do aceptor de energia (a

GFP) (Shimomura, Johnson et al. 1962; de Farias 2009).

1.3.3. Protena verde fluorescente selvagem (GFP) e Enhanced GFP

(eGFP)

O mesmo grupo de Shimomura publicou o espectro de emisso da GFP,

com o pico de excitao em 395 - 397 nm e de emisso em 504 nm (Tsien 1998).

A GFP uma protena monomrica com 238 resduos, cadeia nica de

polipeptdeos com massa molecular de 27 kDa. A protena GFP consiste de 11

folhas em forma de barril com uma -hlice contendo o fluorforo ao centro

(figura 5) (Ormo, Cubitt et al. 1996).

O cromforo uma p-hidroxibenzilideno imidazolinona formada pelos

resduos 65 - 67 (Ser-Tyr-Gly) na protena nativa. Para a formao do cromforo,

a GFP se enovela numa conformao quase nativa e ento a imidazolinona

formada pelo ataque nucleoflico da amida da Gly67na carbonila do resduo Ser65,

seguido de oxidao (figura 6). Finalmente, ocorre a etapa de desidratao que

envolve a perda de um dos hidrognios do C do resduo Tyr66. Somente neste

estgio que o cromforo adquire absorbncia e fluorescncia visvel (Heim,

Prasher et al. 1994; Cubitt, Heim et al. 1995; Reid and Flynn 1997). A formao

do cromforo na forma madura da GFP autocataltica e oxignio fundamental

para o desenvolvimento da fluorescncia.


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Figura 5.Estrutura tridimensional da GFP. A estrutura em barril se enovela com o cromforo aocentro, mostrado como esferas. tomos de carbono so mostrados em cinza, nitrognio em azul e

oxignio em vermelho. Retirado de(de Farias 2009.)

Figura 6. Mecanismo para a maturao do cromforo. Aps o enovelamento da GFP, ocorre aciclizao que formada pelo ataque nucleoflico do nitrognio da amida da Gly67no carbono dacarbonila da Ser65, formando o anel imidazolona. A molcula intermediria oxidada esubsequentemente ocorre a desidratao gerando o cromforo maduro. Modificado de(Craggs2009.)


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A GFP se mostra estvel mesmo em altas temperaturas. Esta estabilidade

parece ser conseqncia da sua estrutura tridimensional nica. As onze folhas

rodeiam e protegem o cromforo que posicionado perto do centro geomtrico da

estrutura em barril. Regies de pequenas dobras e -hlices distorcidas tampam

ambas as extremidades do barril. A proteo to completa que agentesclssicos que extinguem a fluorescncia no possuem quase efeito sobre a

fluorescncia da GFP (Yang, Moss et al. 1996).

A desnaturao da GFP por cidos, bases ou Gdn HCl resulta em perda de

fluorescncia, no entanto, a GFP desnaturada recupera a fluorescncia aps o

retorno a um pH neutro ou diluio da Gdn HCl (Bokman and Ward 1981; Ward

and Bokman 1982).

O comportamento de uma forma mutante de GFP (red-shifted GFP, rsGFP)

sob altssimas presses foi descrito, tendo sido demonstrado que este mutantesofre alterao de estrutura em presses da ordem de 4 kbar, presso na qual

ocorrem pequenas mudanas na regio do cromforo, que so acompanhadas

pela penetrao de gua na estrutura de -barril, com decrscimo de emisso de

fluorescncia. A desnaturao da rsGFP ocorre por colapso da estrutura de -

barril em presses bem mais altas, da ordem de 9 kbar (Herberhold, Marchal et al.

2003). A GFP selvagem e alguns mutantes (entre eles a enhanced GFP, eGFP)

se mostraram mais estveis do que a rsGFP sob altas presses hidrostticas.

Sob presses de at 600 MPa (6 kbar) no houve decrscimo de fluorescncia

dos mutantes testados, com exceo da rsGFP (Ehrmann, Scheyhing et al. 2001).

Foi demonstrado que as estruturas secundrias da GFP e tambm da eGFP,

monitoradas por meio de estudos de espectroscopia de infravermelho (FT-IR),

so mantidas em presses de at 13 - 14 kbar (Scheyhing, Meersman et al.

2002), confirmando que as GFPs so altamente resistentes desnaturao pela

aplicao de presso.

A necessidade da estrutura nativa da protena para a emisso de

fluorescncia foi demonstrada pelas informaes que foram obtidas com a

estrutura cristalogrfica das GFPs (Ormo, Cubitt et al. 1996; Yang, Moss et al.

1996), na qual se demonstrou que o fluorforo interage com vrios resduos

distantes na sequncia primria. Conseqentemente a GFP possui uma grande

vantagem para o estudo de enovelamento de protena, que a facilidade de

monitoramento do enovelamento em tempo real, sob altas presses e utilizando a


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fluorescncia como marcador de recuperao da estrutura nativa. De fato, a

renaturao da GFP j foi bem descrita (Weissman, Rye et al. 1996; Makino,

Amada et al. 1997; Fukuda, Arai et al. 2000; Wielgus-Kutrowska, Narczyk et al.

2007), mas a sua renaturao utilizando altas presses ainda no. O fato de que

a estrutura nativa deve estar presente para a emisso de sua fluorescnciacaracterstica (Ormo, Cubitt et al. 1996) e a simplicidade de monitoramento da

bioatividade da GFP tornam esta protena um excelente sistema modelo para

estudos de renaturao sob presso. Ns consideramos que o estudo das

condies de desagregao e renaturao de eGFP agregada em CI sob altas

presses seria muito til como modelo de renaturao de outras protenas nessas

condies.

No presente estudo utilizamos a enhanced GFP (eGFP), um mutante com

as mutaes F64L e S65T, que apresenta fluorescncia mais elevada do que aforma selvagem, excitao em 488 nm e pico de fluorescncia entre 507 - 509 nm

(Tsien 1998).

1.4. Protenas deXanthomonas axonopodispv citri

1.4.1. Papel do cancro ctrico na economia brasileira

Na dcada de 80 o Brasil se tornou o maior produtor mundial de laranja,

sendo destinada a produo de suco concentrado (Hasse 1987; Bevan 2000). O

Brasil tem mais de 1 milho de hectares de terra com cutlivo de plantas ctricas e

produz, aproximadamente, um tero dos frutos ctricos mundiais, respondendo por

80% de suco de laranja concentrado negociado mundialmente, os quais

absorveram mais de US$ 1,2 bilho para o Brasil, fato este, explica a relevncia

da cadeia agroindustrial citrcola na economia brasileira, no agronegcio e na

balana comercial do pas (Hasse 1987; Bevan 2000).

O Estado de So Paulo o principal polo produtor brasileiro,

correspondendo a 87,7% da produo anual nacional e 30% da mundial. O

volume de recursos movimentados pelo agronegcio citrcola supera R$ 5 bilhes

por ano, gerando cerca de 400 mil empregos diretos com 3 mil frentes de trabalho


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na colheita e cerca de 3 milhes de empregos indiretos, somente no Estado de

So Paulo (Pruvost, Boher et al. 2002; Moreira, Almeida et al. 2010).

Apesar do grande potencial da citricultura Brasileira, o pas vem perdendo

um espao significatico no comrcio internacional, devido a problemas

fitossanitrios. A citricultura brasileira alvo de uma grande variedade dedoenas, entre elas o cancro ctrico, causando grandes prejuzos s lavouras de

citros no pas, pondo em risco benefcios econmicos e sociais gerados pela

agricultura. O cancro ctrico foi constatado pela primeira vez no Brasil em 1957,

encontrado inicialmente em pomares na regio de Presidente Prudente em So

Paulo, trazida em mudas importadas por imigrantes japoneses. A doena foi

posteriormente detectada em regies dos Estados de So Paulo, Mato Grosso do

Sul, Paran, Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Bitancourt 1957; Namekata

1996). A doena se alastrou rapidamente pela regio produtora e, atualmente, citada como um dos principais fatores responsveis pela retrao na

produtividade de citros do pas e tambm sendo a causadora de prejuzos da

ordem de centenas de milhes de Reais por ano em nosso pas.

Segundo Leite (1990) e Rossetti (2001) so conhecidos cinco tipos de

cancro ctrico, os quais podem ser distinguidos de acordo com a diferena em

patogenicidade e sintomas apresentados, em funo de espcies de Citrus e

outros gneros afins infectados. Os genes das protenas utilizados no presente

trabalho foram isolados da bactriaXac (Leite JR 1990; Rossetti 2001).

Xanthomonas um gnero de fitopatgeno bacteriano responsvel por

doenas em algumas variedades de hospedeiros, incluindo citros, arroz, uva,

feijo e algodo (Swings 1993). O grande problema do cancro ctrico a sua

difcil erradicao e a sua fcil e rpida disseminao, podendo ocorrer atravs do

vento, da chuva e do prprio homem. A Xac, invade seu hospedeiro (Citrus spp)

atravs dos estmatos e lenticelas (Gottwald 2009). Desse modo, todos os

tecidos areos como ramos, folhas e frutos so susceptveis ao ataque (figura 7)

(Schubert 2003). Os primeiros sintomas do cancro ctrico se manifestam nas

folhas, como leses necrticas arredondadas, salientes e de colorao

amarronzada ao centro e amarelada ao redor, nos dois lados das folhas.

Posteriormente estas leses aparecem nas frutas e nos ramos diminuindo a

quantidade e a qualidade das frutas e, portanto inviabilizando comercialmente a

planta (http://www.fundecitrus.com.br; Brunings and Gabriel 2003; Gottwald 2009).


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Figura 7. Citros mostrando sintomas de Cancro ctrico. Folhas e frutos infectados em estadoavanado da doena. Retirado de(http://www.caripestnetwork.org.)

Embora o cancro ctrico seja responsvel por grandes perdas econmicasna produo das frutas ctricas, no foi descoberta nenhuma forma eficaz para

sua erradicao e o procedimento adotado para evitar uma possvel epidemia em

toda lavoura a deteco precoce da doena e a erradicao de plantas

contaminadas a um raio de 30 metros do foco de contaminao (figura 8) (Timmer

2006; Lowe 2009).

Figura 8. Vista area da erradicao de rvores de laranja em um raio de 30 metros em relaoao centro do foco da contaminao por Xac. Retirado de(http://www.redetec.org.br/inventabrasil/xanto.htm.)


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1.4.2.Xanthomonas axonopodispv citri

A agricultura brasileira e mundial bastante afetada por vrias doenas

ocasionadas por espcies do gnero Xanthomonas, provocando assim, perdas

substanciais em vrias culturas de grande importncia econmica. Esse gnerocontm uma ampla variedade de espcies, linhagens, e hospedeiros (124

monocotiledneas e 286 dicotiledneas) (Leyns 1984) e representa o maior grupo

de bactrias fitopatognicas, o qual apresenta uma extraordinria diversidade

patognica e importncia econmica (http://www.fundecitrus.com.br; Chan and

Goodwin 1999; Vauterin 2000; Vicente 2001; Brunings and Gabriel 2003; Buttner

and Bonas 2009; Gottwald 2009). Alm disso, a Xac, agente etiolgico do cancro

ctrico, est entre as Xanthomonas que causam maior impacto na agricultura

mundial (Schubert 2003).

Bactrias do gnero Xanthomonas so cosmopolitas, com duas

caractersticas morfolgicas comumentes presentes: 1) produo de goma

xantana (exopolissacardeo que auxilia na disperso e sobrevivncia do

patgeno, alm de ser uma importante matria prima nas indstrias de alimentos),

que leva as suas colnias a possuirem um aspecto mucide e 2) possuem cor

amarela devido produo de pigmentos, principalmente xantomonadina, quando

cultivadas em meio Nutriente gar, aps 2 ou 3 dias de incubao a 28C

(Bebendo 1995; Vauterin 1996). AXacse adapta bem em temperatura de 20C -

30C, condio que adicionada ao elevado teor de umidade excelente para o

crescimento e desenvolvimento da infeco (Peltier 1920; Bebendo 1995).

1.4.3. Genmica Funcional e Protemica

A protemica, entendida como a anlise em larga escala da expresso

proteica, atualmente considerada uma das reas centrais da genmica

funcional. De fato, os avanos tcnicos que permitem resolver e identificar

centenas ou milhares de protenas a partir de extratos proteicos complexos,

atravs de tecnologia protemica envolvendo separao eletrofortica ou

cromatografia aliada espectrometria de massas, possibilita a aquisio em larga


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escala de informaes sobre o repertrio de protenas envolvidas diretamente

com diferentes situaes metablicas e fisiolgicas de um dado organismo, e

ainda detectar modificaes ps-traducionais (Anderson 1997). Alm disso, o

grande nmero de sequncias disponibilizadas pelos projetos de sequenciamento

de genomas tem favorecido o interesse em anlises de proteomas, visto que,atravs de informaes do sequenciamento de um organismo pode-se deduzir

protenas codificadas num genoma, o que de fundamental auxlio no processo

de identificao das protenas detectadas pela anlise protemica, bem como da

regulao da expresso destas (Jungblut 1995). Utilizar a alta presso como

ferramenta para a obteno de protenas solveis e biologicamente ativas a partir

de CI particularmente interessante para possibilitar a continuidade de projetos

como o do genoma daXac,ao qual se seguiu o projeto de genoma estrutural. Isto

se deve ao fato de que a estrutura e atividade biolgica de muitas das protenasque foram expressas como CI em E. coli no foram estudadas devido s

dificuldades encontradas para sua renaturao. A produo de protenas

envolvidas com a motilidade e virulncia bacterianas apresentando a

conformao nativa e biologicamente ativas pode ser um passo inicial para a

compreenso dos processos relacionados patogenicidade de bactrias

economicamente importantes como aXac.

O sequenciamento completo e anotao do genoma da bactria Xac (Da

Silva 2002), revelaram um cromossomo circular com 5.175.554 pares de bases

(pb) e dois plasmdeos o pXAC64 (64.920 pb) e o pXAC33 (33.699 pb). Essa

constituio gentica responsvel por codificar 4.428 protenas, sendo que,

deste total 2.770 (62,6%) protenas tiveram suas respectivas funes associadas

s protenas com funes conhecidas descritas na literatura, e 1.653 (37,4%)

correspondem s protenas hipotticas sem funo descrita at ento (Da Silva

2002). As protenas utilizadas no presente trabalho so: PilB codificada pelo gene

XAC3239, e produtos dos genes XAC2810 e XAC3272.

A protena PilB de Xac possui 578 aminocidos, 62 kDa e possui alta

identidade de sequncia primria (92%) com outras protenas PilB de outros

organismos. Est envolvida na biognese do pilus tipo IV (T4P), um filamento fino

encontrado na superfcie de clulas bacterianas que est envolvido na

patogenicidade bacteriana, incluindo, por exemplo, movimento involuntrio,

adeso em superfcies, transformao natural, formao de biofilme, secreo de


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protenas e quimiotaxia (Mattick 2002; Craig, Pique et al. 2004; Han, Kennan et al.

2007; Craig and Li 2008). A biognese do T4P um processo complexo que

envolve uma grande quantidade de protenas, no qual PilB, via consumo de ATP,

forma uma estrutura hexamrica na face citoslica da membrana interna

bacteriana que compem o funcionamento geral do T4P em vrios processosbiolgicos, como por exemplo, no processo de autotransformao e no processo

de adeso superfcie. As protenas PilB possuem atividade ATPsica, porm

somente havia sido determinada a atividade da protena PilB de Myxococcus

xanthuse de Pseudomonas aeruginosa. No entanto, sua estrutura ainda no foi

descrita (Chiang, Sampaleanu et al. 2008; Jakovljevic, Leonardy et al. 2008).

As protenas produtos dos genes XAC2810 e XAC3272, possuem 356 e

307 aa e massa molecular de 42,2 e 34,5 kDa, respectivamente. Pelo fato de

possurem alta identidade de sequncia primria com outras protenas de outrosorganismos, possuindo em suas sequncias os domnios GAF e GGDEF

conservados, forte a possibilidade de que sejam enzimas diguanilato ciclases,

envolvidas na sntese do segundo mensageiro diguanilato cclico, bis-(3, 5)-di-

guanosina monofosfato cclico (c-di-GMP). A estrutura secundria e a atividade

biolgica das protenas ainda no foram descritas, mas por homologia acredita-se

que seus domnios GGDEF poderiam possuir atividade de diguanilatos ciclase, a

qual convertem 2 molculas de GTP e liberam fosfato inorgnico e somente

sejam ativas na forma de dmeros (Drenkard and Ausubel 2002; Chiang,

Sampaleanu et al. 2008; Jakovljevic, Leonardy et al. 2008).

O c-di-GMP uma molcula de sinalizao intracelular universalmente

encontrada em bactrias. Trabalhos recentes em diferentes organismos mostram

que altos nveis de c-di-GMP promovem o estado sssil das clulas, associado ao

aumento da produo de componentes extracelulares de adeso como

polissacardeos e fimbrias. Inversamente, baixos nveis de c-di-GMP promovem a

motilidade celular e virulncia (Simm, Morr et al. 2004).As protenas codificadas

pelos genes XAC2810 e XAC3272 so constitudas por dois domnios, um

domnio GAF no N-terminal e um domnio GGDEF no C-terminal. O domnio

GGDEF de XAC2810 possui o motivo conservado GGEEF o que sugere ser um

domnio ativo, j o domnio GGDEF do gene XAC3272 possui um motivo

degenerado (AEGEF) e provavelmente no seja capaz de sintetizar c-di-GMP,

mas talvez seja capaz de ligar ao c-di-GMP.


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Utilizar a alta presso como ferramenta para a obteno de protenas

solveis e biologicamente ativas a partir de CI particularmente interessante para

possibilitar a continuidade de projetos como o do genoma daXac. Isto se deve ao

fato de que a estrutura e atividade biolgica de muitas das protenas que foram

expressas como CI em E. coli no foram estudadas devido s dificuldadesencontradas para a obteno de protenas solveis ou renaturadas. A produo

de protenas envolvidas com a patogenicidade bacterianas apresentando a

conformao nativa e biologicamente ativas pode ser um passo inicial para a

compreenso dos processos relacionados infeco porXac.


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2. OBJETIVOS

Utilizando como modelo a protena eGFP, estudar e otimizar o processo de

solubilizao dos CIs e renaturao desta protena utilizando alta presso

hidrosttica. Com base na otimizao da metodologia utilizada, produzir as

protenas de Xac solveis e com atividade biolgica a partir de agregados

expressos em Escherichia coli.


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3. MATERIAIS E MTODOS

3.1. Materiais

3.1.1. Equipamentos e acessrios principais

Agitador, modelo Ts-2000, Vertex.

Aparelho Mili-Q Plus, purificador de gua, Milipore.

Autoclave, modelo 12 LI/LA, Kavo.

Autoclave, modelo 415, Fanem.

Balana analtica, modelo AW 220, Shimadzu. Balana de preciso, modelo P1200, Mettler.

Banho-maria, modelo 100, Fanem.

Banho-maria, modelo Type 16500 Dry-Bath, Thermolyne.

Banho-maria, modelo Cool Tech 320, Thermo Scientific.

Bomba peristltica, modelo P1TM, GE Healthcare.

Cmera fotogrfica, modelo DMC-FX100, Lumix Panasonic.

Centrfuga refrigeradora automtica, modelo 5810R, Eppendorf.

Centrfuga refrigeradora automtica, modelo RC2-B, Sorvall Speed.

Coluna de afinidade, modelo His Trap HP, GE Healthcare.

Coluna de excluso molecular, modelo Superdex 75 10/30 GL, GE

Healthcare.

Coluna de excluso molecular, modelo Superdex 200 10/300 GL, GE

Healthcare.

Eletroporador, modelo II, Invitrogen.

Espectrofluormetro, modelo Cary Eclipse, Varian.

Espectrofotmetro, modelo Genesys 6, Thermo Scientific.

Espectrometro de infravermelho, Nicolet 6700, Thermo Corp., USA

Estufa para cultura bacteriana, modelo Q-316B, Quimis.

Forno de microondas, LG.

Freezer -20 C, Bosch.


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Freezer -80 C, modelo AL880 E, American Lab.

Incubadora refrigerada com agitao, modelo TE421, Tecnal.

Kit de Ensaio de Fosfato EnzChek, Molecular Probes, Invitrogen.

Leitor de D.O., modelo Ultrospec 10, Amersham Bioscience.

Microscpio eletrnico de varredura, modelo XL200, Phillips.

Seladora a vcuo, modelo TM 150, TecMaq.

Sistema de Eletroforese vertical, modelo Tetra System, Bio-Rad.

Sonicador, modelo 3000, Biologics.

Transiluminador, modelo Mocrouve, Hoefer.

Vaso de alta presso, modelo R4-6-40 e bomba, modelo P40, High

Pressure Equipment.

3.1.2. Reagentes e solues

cido Actico Glacial, Merck.

cido Clordrico, Merck.

Acrilamida, Reagen.

gar, Difco.

Agarose, BioAgency. Ampicilina, Bayer.

Bis-acrilamida, BioAgency.

Bis-ANS, Sigma-Aldrich.

BSA, Sigma-Aldrich.

Casaminocidos, BD.

Cloreto de clcio, Sigma-Aldrich.

Cloreto de sdio, Synth.

Comassie brilliant Blue G-250, Sigma-Aldrich.

Deoxicolato de sdio, Sigma-Aldrich.

Ditiotreitol, Sigma-Aldrich.

Dodecil Sulfato de Sdio, xodo Cientfica.

Extrato de levedura, BD.


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Glicerol, Serva.

Glicina, Sigma-Aldrich.

Glicose, Casa Americana.

Glutationas reduzida e oxidada, Sigma-Aldrich.

Hidrocloreto de Guanidina, Sigma-Aldrich.

Imidazol, Sigma-Aldrich.

Isopropil, -D-tiogalactopiranosde, Fermentas.

Kanamicina, Invitrogen.

L-Arginina, Sigma-Aldrich.

Lisozima, Sigma-Aldrich.

Membrana de dilise, Sigma-Aldrich.

Padro de Massa molecular, GE Healthcare.

PEG 600, Sigma-Aldrich.

Persulfato de amnio, BioAgency.

Sacarose, In Lab.

Soroalbumina bovina, Sigma-Aldrich.

Sulfato de Magnsio, Synth.

Sulfato de Nquel, GE Healthcare.

Sulfato de Potssio, Synth.

Triptona, Difco. Tris base, Vetec.

Triton X-100, Sigma-Aldrich.

Tween-20, Merck.

Uria, Poliscience.

Verde Malaquita, Synth.

3.1.3. Linhagem celular bacteriana

A cepa de E. coliutilizada para a expresso das protenas eGFP, PilB e os

produtos dos genes XAC2810 e XAC3272 foi a BL-21 (DE3) pLysS: [F -, ampT,

hsdSb (rB-mB

-), gal, dcm (DE3)] (Novagen EMD Biosciences, Inc.).


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3.1.4. Vetores plasmdicos

- pAE: vetor de expresso que contm clonado o gene codificador da protena

eGFP, doado pelo Dr. Geraldo Santana Magalhes do Laboratrio de

Imunopatologia do Instituto Butantan. A protena expressa a enhanced greenfluorescent protein (eGFP), que apresenta fluorescncia aumentada em relao

cepa selvagem, devido s mutaes F64L e S65T (Tsien 1998).

- pET28a: vetor de expresso que contm clonado o gene XAC3239 (codificador

da protena PilB), e o gene XAC3272, ambos doados pelo Dr. Shaker Chuck

Farah do Instituto de Qumica da Universidade de So Paulo.

- pProExHTb: vetor de expresso que contm clonado o gene XAC2810, doado

pelo Dr. Shaker Chuck Farah do Instituto de Qumica da Universidade de So

Paulo.

3.2. Mtodos

3.2.1. Transformao e expresso

As cepas BL21(DE3) de E. coli foram transformadas por eletroporao,

seguindo protocolo descrito pelo fabricante do eletroporador (Invitrogen) e em

seguida plaqueadas em meio gar LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de

levedura, 10 g/L de NaCl e 15 g/L de gar), contendo o antibitico adequado

(Tabela 2). As culturas foram mantidas em estufa por 16 horas a 37C. As

colnias transformantes foram escolhidas aleatoriamente e repicadas em 15 mL

de meio rico 2HKII (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de triptona, 4 g/L decasamincidos, 0,8 g/L de sulfato de magnsio, 0,08 g/L de cloreto de clcio, 3,1

g/L de sulfato de potssio e 320 l/L de soluo trao de metais) (Jensen and

Carlsen 1990) na presena do antibitico especfico e mantidas em incubadora a

37C com agitao de 200 rpm. Este volume foi ento diludo em 250 mL do

mesmo meio de cultura, em erlenmeyer de 1000 mL, contendo o antibitico


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especfico e mantidas a 200 rpm a 37C at atingirem a densidade ptica (D.O. 600

nm) de 3,0. As culturas foram ento induzidas expresso pela adio de

isopropil--D-tiogalactopiranosideo (IPTG) em concentrao final de 0,5 mM e

incubadas s temperaturas de 37C, 42C e 47C para a protena eGFP e 20C,

25C, 30C e 37C para as protenas PilB e produto do gene XAC2810 eXAC3272 e foram mantidas a 200 rpm por mais 16 horas.

Tabela 2. Antibiticos utilizados para expresso das protenas e genes alvos.

Protenas e Genes Antibiticos

eGFP Ampicilina (100 g/mL)

PilB Kanamicina (30 g/mL)

Gene XAC2810 Ampicilina (100 g/mL)Gene XAC3272 Kanamicina (30 g/mL)

3.2.2. Lavagem dos CI

As suspenses contendo as bactrias foram centrifugadas a 10.000 g por

10 minutos a 4C e o sobrenadante foi descartado. Os botes celular foram

ressuspendidos em tampo A (Tris HCl 0,1 M, pH 7,5 e 5 mM EDTA) e 50 g/mL

de lisozima foi adicionada s solues. As suspenses foram ento incubadas em

temperatura ambiente por 15 minutos e em seguida foram sonicadas na presena

de 0,1% de deoxicolato de sdio por 30 segundos com intervalos de 30 segundos

a 60 Hz em banho de gelo. As suspenses foram novamente centrifugadas a

10.000 g por 10 minutos a 4C, os sobrenadantes foram descartados e os

precipitados insolveis foram ressuspendidos em tampo B (Tris HCl 0,1 M, pH

7,5, 5 mM de EDTA e 0,1% de deoxicolato de sdio). As suspenses foram

novamente sonicadas e centrifugadas nas mesmas condies descritas

anteriormente. O procedimento de lavagem dos CI foi repetido mais uma vez.

Aps a lavagem, os CI foram ressuspedidos em tampo de renaturao (Tris HCl

50 mM, pH 7,5 e 1 mM EDTA). A suspenso foi sonicada e centrifugada. Este

procedimento foi repetido por mais duas vezes, os CI foram ressuspedidos em 10

mL de tampo de renaturao e armazenados a -20C.


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3.2.3. Solubilizao dos CI

As suspenses dos CI das protenas estudadas, produzidas em diferentes

temperaturas (eGFP: 37C, 42C e 47C; PilB, gene XAC2810 e gene XAC3272:

20C, 25C, 30C e 37C), foram ajustadas para uma D.O. de 0,5 (A 350nm) ediludas em tampo de renaturao contendo concentraes de Gdn HCl de 0 a 6

M. As reaes foram mantidas sob agitao constante durante 72 horas em

temperatura ambiente. O efeito do agente desnaturante na solubilizao dos CI foi

monitorado pelas mudanas de absorbncia a 350 nm (turbidez) em um

espectrofotmetro.

3.2.4. Pressurizao dos CI

Suspenses de CI de eGFP foram ressuspendidos em tampo de

renaturao, ajustando-se as densidades pticas em espectrofotmetro em

comprimento de onda de 350 nm para uma D.O. = 0,5. A amostra foi colocada em

bulbos de pipetas Pasteur de 5 mL, para garantir que um volume fixo de ar (2 mL)

estivesse presente nas amostras da suspenso dos CI, para promover a

oxigenao, importante para a formao do cromforo responsvel pela emisso

da luz fluorescente. Os bulbos foram selados a quente e colocados em um nico

saco plstico, que foi selado vcuo.

CI de PilB e de produtos dos genes XAC2810 e XAC3272 foram

resuspendidos em tampo de renaturao com uma D.O.350 nm= 2,0. As amostras

foram colocadas em saquinhos plsticos que foram selados. Os saquinhos foram

introduzidos em um nico saco plstico maior, o qual foi selado a vcuo. Os sacos

plsticos foram ento colocados no vaso de presso (Figura 9) e submersos em

uma mistura de gua e leo. O vaso foi fechado e pressurizado a 2,4 kbar

utilizando um compressor de ar ligado a uma bomba capaz de injetar leo sob alta

presso no vaso de presso. As amostras foram submetidas a diversas condies

de compresso/descompresso (Tabela 3). Aps a descompresso, as amostras

foram retiradas dos recipientes plsticos e centrifugadas a 12.000 g por 15

minutos para a remoo de agregados insolveis. Os sobrenadantes foram


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dialisados contra tampo Tris HCl 50 mM, pH7,5 e centrifugados novamente para

a remoo de agregados. As fraes solveis foram estocadas a -20C para

posterior anlise.

Figura 9. Bomba e vaso de presso.

Tabela 3. Esquemas de Compresso e Descompresso.

Condio Esquema de Presso/Descompresso

A 2,4 kbar por 1,5 horas, descompresso direta eincubao em presso atmosfrica por 16 horas

B 2,4 kbar por 16 horas e descompresso direta

C2,4 kbar por 1,5 horas, descompresso em degraus e

incubao em presso atmosfrica por 16 horas

D2,4 kbar por 1,5 horas, descompresso para 0,8 kbar por

16 horas e descompresso direta

E2,4 kbar por 1,5 horas, descompresso para 0,4 kbar por

16 horas e descompresso direta

F2,4 kbar por 1,5 horas, descompresso para 0,2 kbar por

16 horas e descompresso direta.


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3.2.5. Agentes de xido-reduo

O agente redutor Ditiotreitol (DTT) foi adicionado s suspenses de CI de

eGFP (1 mM). Em suspenses de CI das protenas PilB e produto dos genes

XAC2810 e XAC3272 foi adicionado um par xido-redutor no tampo derenaturao. Os reagentes glutationas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) em uma

concentrao total de 10 mM foram utilizados como par xido-redutor e as

propores de cada uma das glutationas foram variadas e na presena de 1,5 M

de Gdn HCl. As propores de GSH e GSSG testadas foram respectivamente:

1:9; 1:4; 1:2; 2:3; 1:1; 3:2; 2:1; 4:1 e 9:1. Como controles utilizaram-se

suspenses na ausncia das glutationas e Gdn HCl, amostra na ausncia de

glutationas e amostra com os agentes de xido-reduo e Gdn HCl na qual no

foi aplicada alta presso. Os sobrenadantes das amostras pressurizadas na

presena de glutationas e Gdn HCl foram dialisados contra tampo Tris HCl 50

mM, pH 7,5 e 50 mM de NaCl, para a remoo destes reagentes, centrifugados e

congelados para posterior anlise.

3.2.6. Agente solubilizante

Com a prvia seleo dos agentes de xido-reduo, suspenses de CI

das protenas PilB e produto dos genes XAC2810 e XAC3272 foram submetidas

alta presso na presena de concentraes diferentes de Gdn HCl (0, 0,5, 1,0 e

1,5 M) e a amostra controle na qual no foi aplicada alta presso tambm foi

utilizada. Os sobrenadantes das amostras foram submetidos dilise contra

tampo Tris HCl 50 mM, pH 7,5 e 50 mM de NaCl, novamente centrifugados e

congelados para posterior anlise.

3.2.7. Aditivos

A utilidade da presena de aditivos para elevar o rendimento de

renaturao das protenas PilB e produto dos genes XAC2810 e XAC3272 foi


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testada, submetendo amostras de CI alta presso hidrosttica na presena de

diferentes aditivos. Os aditivos testados foram os que so descritos como teis

para elevar os rendimentos de renaturao em presso atmosfrica (Jensen and

Carlsen 1990; Tsien 1998): NaCl (0,15 M), L-Arginina (0,5 M), L-Arginina com

GdnHCl (1,5 M), Glicose (1 M), Sacarose (1 M), PEG-6000 (0,1%), Glicerol (2,5M), Tween 20 (1 mM), Tritron X-100 (0,5 mM) e Bis-ANS (10 vezes a

concentrao molar de cada protena). Como controle foi utilizada a suspenso de

CI na ausncia destes aditivos e tambm uma amostra na qual no foi aplicada

alta presso hidrosttica. Os sobrenadantes das amostras foram dialisados contra

tampo Tris HCl 50 mM, pH 7,5 e 50 mM de NaCl, centrifugados e congelados

para posterior anlise.

3.2.8. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)

As anlises das amostras solubilizadas pelo tratamento sob presso e

suspenses de CI foram realizadas utilizando eletroforese em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE) em condies redutoras. As corridas eletroforticas

foram realizadas seguindo o protocolo de Laemmli (1970), utilizando gis de

eletroforese de 12% de concentrao. Nas amostras foram adicionados o tampo

de amostra e DTT na concentrao de 0,1 M, as amostras ento foram aquecidas

a 75C durante 5 minutos, e aplicadas no gel de eletroforese. A corrida foi

realizada no tampo de corrida 1 X (14,4 g de Glicina, 3 g de Tris e 1 g de SDS e

gua destilada at o volume de 1000 mL) e fixando-se a voltagem em 90 V, com a

corrente livre.

Finalizada a corrida, os gis foram corados com Comassie Blue G-250 e as

bandas puderam ser visualizadas e fotografadas. A anlise das bandas nas

fotografias dos gis de eletroforese foi realizada utilizando-se o programa Image

J. A quantificao das protenas de interesse foi realizada pela comparao com

uma curva padro de soroalbumina bovina pura. A determinao da porcentagem

de solubilizao de cada amostra foi realizada pela comparao da banda obtida

com a banda referente suspenso de CI.


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3.2.9. Medidas de fluorescncia e de espalhamento de luz (EL)

As medidas de EL e de fluorescncia foram realizadas em um

espectrofotmetro Cary Eclipse (Varian). A determinao da fluorescncia

caracterstica de eGFP foi realizada com um comprimento de excitao de 470nm e leituras em 509 nm. O comprimento de onda utilizado para a anlise da

fluorescncia dos CI foi menor (440 nm) de maneira a diminuir a alta interferncia

exercida pelos CI no espectro devido ao alto grau de espalhamento da luz de

excitao. O espectro de emisso foi coletado entre 450 e 600 nm em um ngulo

de 90 relativo luz incidente, utilizando um tempo de resposta de 1s e uma

velocidade de leitura de 240 nm/minuto. Para o EL, as amostras foram excitadas

em 320 nm e as leituras foram de 315 a 325 nm em um ngulo de 90 relativo

luz incidente.

Os dados em presso atmosfrica foram coletados utilizando uma cubeta

com 1 cm de caminho ptico. Para o monitoramento sob presso, uma clula de

alta presso equipada com janelas de safira (ISS) foi conectada por tubo de ao

resistente presso a um gerador de presso (High Pressure Equipment) e

etanol foi utilizado como lquido para a transmisso de presso (figura 10). Neste

caso, cubetas redondas preenchidas com as amostras e seladas com tampas

flexveis de polietileno (figura 11) foram colocadas na clula de alta presso e

submetidas presso.


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Figura 10. Espectrofluormetro acoplado a uma clula de presso, gerador de presso, e banhotermostatizado.

Figura 11. Cubeta de quartzo selada com tampa flexvel de silicone.

3.2.10. Dissociao dos CI sob alta presso hidrosttica e

temperaturas negativas

A dissociao dos CI sob alta presso hidrosttica associada aplicao

de baixas temperaturas foi avaliada pela queda nos valores de EL. Estas medidas

foram obtidas em espectrofluormetro acoplado a um gerador de presso e a uma

clula de presso acoplada a um banho-maria termostatizado (Figura 10). As

suspenses de CI foram submetidas a 2,4 kbar de presso com intervalos de 0,4

kbar a 20C, sendo que em cada intervalo de presso as amostras foram

mantidas durante 15 minutos (tempo suficiente para que a leitura de EL estivesse

estabilizada). Aps a chegada a 2,4 kbar de presso, a temperatura foi

gradualmente diminuda de 20C at -9C tambm sendo mantidas nas


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temperaturas selecionadas durante 15 minutos, e por fim a temperatura foi

elevada a 20C e foi realizada a descompresso at a presso atmosfrica. As

leituras de EL foram realizadas em cada intervalo tanto de presso, quanto de

temperatura.

3.2.11. Microscopia eletrnica de varredura (MEV)

A magnitude de desagregao e possveis mudanas no tamanho e

morfologia dos CI ao da presso (2,4 kbar) foram visualizadas por MEV. Para tal

anlise, suspenses de CI no submetidas alta presso e tambm as fraes

insolveis de amostras j submetidas alta presso foram lavados com gua

destilada para a retirada do Tris HCl da soluo tampo. Aps a lavagem, os

precipitados foram aplicados em porta-amostras e secos em dessecador durante 16

horas. As amostras receberam um banho de ouro a 38 mA por 120 segundos e

foram visualizadas e fotografadas em microscpio eletrnico de varredura Philips

XL-200 operando a 15 kV. Os tamanhos dos CI foram analisados utilizando o

software Image Tools.

3.2.12. Espectroscopia de infravermelho (FT-IR)

Espectros de infravermelho com transformada de Fourier (Fourier

Transform Infrared Spectroscopy, FT-IR), com reflectncia total atenuada (ATR)

foram obtidos de amostras secas depo

renaturação protéica 2013

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