Licenciatura em Biotecnologia – 2º ano

Engenharia Genética

Prof. Kiril Bahcevanfziev

Electroforese da proteína GFP

Elaborado por:

20110351 Ana Martins

20110213 Nádia Correia

20120217 Tiago Lima

20110239 Tiago Pinho

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Í ndice

Introdução .......................................................................................................... 3

Procedimento ..................................................................................................... 5

Protocolo 1 ...................................................................................................... 5

Protocolo 2 ...................................................................................................... 7

Resultados e discussão.................................................................................... 13

Protocolo 1 .................................................................................................... 13

Protocolo 2 .................................................................................................... 14

Conclusão ........................................................................................................ 16

Bibliografia ........................................................................................................ 17

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Íntroduçã o

GFP é uma proteína presente em alforrecas fluorescentes. Esta proteína

foi originalmente purificada bioquimicamente da alforreca como parte do

complexo proteico, mas a sua versatilidade e utilidade para escolas e para a

indústria biotecnológica foi determinada na clonagem e na expressão desta

proteína recombinada em E. coli, como já foi feito em experiências anteriores.

Na vertente da electroforese, colónias de bactérias em placas de

controlo (não induzidas) e em placas com colónias induzidas são isoladas e

examinada para determinar a presença ou ausência da proteína GFP.

A proteínas, ao contrário do DNA que é quantificado em termos de

tamanho ou pares de base, são quantificadas em termos do seu peso

molecular relativo a um átomo de hidrogénio, em daltons.

Para as quantificar, a técnica de electroforese em gel de poliacrilamida

contendo dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) é das mais utilizadas. Na SDS-

PAGE, as proteínas em solução são sujeitas à acção da corrente eléctrica,

migrando numa direcção a uma velocidade que reflecte a sua massa molecular

e carga global.

As proteínas são previamente desnaturadas pelo calor na presença de

reagentes desnaturantes, os quais destroem as ligações dissulfeto das

proteínas, e pelo detergente SDS. O SDS, carregado negativamente, rodeia as

cadeias proteicas, desnaturando-as e cobrindo as proteínas com cargas

negativas. Assim, as proteínas carregadas negativamente são separadas,

migrando em direcção ao eléctrodo positivo.

Gel

Proteínas

Electroforese

Direcção da

electroforese

Ilustração 1 Mecanismo da electroforese de proteínas em gel de poliacrilamida. (A) Electroforese. (B) Migração das proteínas através do gel.

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Dependendo do seu tamanho, cada proteína migra de forma

diferenciada ao longo do gel: proteínas de menor tamanho molecular migrarão

mais rapidamente, enquanto as de maior tamanho terão mais dificuldade em se

movimentar pelos poros do gel e, assim, movem-se mais lentamente.

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Procedimento

Protocolo 1 Purificação da Proteína Verde Fluorescente (GFP)

Preparação de Meio LB Líquido

1. Reidratar a ampicilina e a arabinose, adicionando 3 mL de tampão TE a cada um dos frascos.

2. Adicionar 55 mL de água destilada a um Erlenmeyer e deixar ferver no micro-ondas. 3. Adicionar a cápsula de LB ao Erlenmeyer e deixar a embeber durante aproximadamente 20 minutos. 4. Ferver novamente a solução no micro-ondas e agitar. Repetir este passo até

estar completamente dissolvido. 5. Deixar arrefecer o meio até aproximadamente 50ºC.

6. Pipetar 0.5 mL de arabinose e 0.5 mL de ampicilina no meio e agitar.

7. Em 2 tubos de cultura aliquotar em cada, 2 mL do meio LB/Amp/Ara líquido. Os tubos poderão ser guardados a 4ºC.

Inoculação e Crescimento das Culturas Celulares

1. Diferenciar os dois tubos de cultura com meio LB/Amp/Ara liquido com “+” e “-“.

2. Inocular as bactérias transformadas com o plasmídeo pGLO cultivadas em meio LB/Amp (bactérias sem fluorescência/produção da proteína GFP) no tubo “-“ e as bactérias transformadas com o plasmídeo Pglo em meio LB/Amp/Ara (bactérias com fluorescência/produção da proteína GFP) no tubo “+”.

6 3. Fechar os tubos, agitar vigorosamente as culturas bacterianas durante 30 segundos e incubar horizontalmente na estufa a 32ºC durante 48 horas.

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Fase de Purificação – Concentração Bacteriana e Lise

1. Retirar as culturas da estufa e com uma luz UV verificar se existem diferenças entre elas. 2. Etiquetar um eppendorf com “+” e pipetar para o mesmo 2 mL da cultura que incubou no tubo “+”. Centrifugar o eppendorf durante 5 minutos à velocidade

máxima e descartar o sobrenadante.

3. Ressuspender o pellet em 250 μL de solução TE. 4. Adicionar 1 gota de lisozima à solução bacteriana para iniciar a digestão

enzimática da parede celular das bactérias. Misturar o conteúdo invertendo o eppendorf. 5. Guardar o eppendorf a -20ºC durante a noite, o que irá causar a ruptura total das bactérias.

Fase de Purificação – LiseBacteriana

1. Retirar o eppendorf do congelador e deixar descongelar. 2. Centrifugar 10 minutos à velocidade máxima, reservar o sobrenadante e

descartar o pellet (constituído por detritos celulares insolúveis).

3. Aquando da centrifugação, preparar a coluna de cromatografia removendo a tampa, retirar a parte inferior e deixar o tampão drenar.

7 4. Adicionar 2 mL, no total, de Equilibration Buffer desde o topo da coluna de cromatografia, aliquotando 1 mL de cada vez. Drenar o tampão até 1 mL de volume. Fechar a coluna de cromatografia pelo topo e pela parte inferior e guardar à temperatura ambiente. 5. Finda a centrifugação, transferir 250 μL do sobrenadante para um novo eppendorf também etiquetado como “+”. 6. Adicionar 250 μL de tampão de ligação ao sobrenadante “+” e guardar a solução a 4ºC.

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Fase de Purificação – Cromatografia de Proteínas

1. Etiquetar 3 tubos colectores de 1 a 3 e colocá-los no suporte de esponja. 2. Remover a tampa e a parte inferior da coluna de cromatografia e inseri-la no

tubo colector 1, deixar o Equilibration Bufffer escorrer até à superfície da matriz HIC. 3. Pipetar cuidadosamente 250 μL do sobrenadante “+” para a coluna de cromatografia, encostando a ponta à parede do tubo, acima da matriz HIC. 4. Após a drenagem transferir a coluna de cromatografia para o tubo colector 2. Adicionar 250 μL de Wash Buffer e deixar escorrer através da coluna de cromatografia.

5. Transferir a coluna de cromatografia para o tubo colector 3. Adicionar 750 μL de tampão TE e deixar o volume escoar através da coluna. 6. Examinar os 3 tubos colectores e anotar as diferenças. Selar os tubos com parafilme e guardá-los a 4ºC.

Protocolo 2 Electroforese das GFP

1. Laemmli sample buffer: adcionar 0.3 g de DTT a 30 ml de tampão Laemmli. Ressuspender. A concentração final do DTT será de 50 mM. A solução restante deverá ser armazenada a -20ºC. Antes de cada utilização, aquecer a solução à temperatura ambiente para dissolver o precipitado de SDS que se forma aquando da congelação.

2. Precision Plus Protein Kaleidoscope standards: Antes de cada utilização, aquecer a solução à temperatura ambiente para dissolver o precipitado de SDS que se forma aquando da congelação. 3. TGS Running Buffer: Misturar 100 ml de 10x Tris-glycine-SDS running buffer

com 900 ml de água destilada. 1x TGS pode ser armazenado por 6 meses.

Preparação

1. Marcar 4 eppendorffs

• Branco, (-) calor • Verde, (-) calor • Branco, (+) calor • Verde, (+) calor

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2. Adicionar 300 μl de Laemmli sample buffer aos dois tubos (-) calor.

3. Usando uma ansa de inoculação, recolher colónias saudáveis (20–100) de uma placa LB/amp (colónias brancas) e transferir para o tubo Branco, (-) calor. Misture bem, invertendo o tubo entre o polegar e o indicador. Certifique-se de que não há nenhum aglomerado de colónias visível no tubo. Se necessário, os aglomerados podem ser dispersos com a ajuda de uma micropipeta de 100 μl. 4. Repetir o processo isolando e misturando bem colónias saudáveis (20–100) de uma placa LB/amp/ara (colónias verdes) e transferir para o tubo verde, (-) calor.

5 5. Transferir 150 μl da mistura do tubo branco (-) calor para o tubo branco (+) calor. Transferir 150 μl da mistura do tubo verde (-) calor para o tubo verde (+) calor.

6. Aquecer os tubos marcados (+) calor, a 95°C por 5 min, num banho-maria. Arrefecer até à temperatura ambiente.

Electroforese

1. Preparar o gel (4–20%).

2. Carregar o gel de acordo com a ordem da tabela 1 para que metade do gel seja posteriormente corada com Coomassie (para se ver a complexidade das

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proteínas da E. coli e a expressão da GFP) e a outra metade não (para se ver a fluorescência verde).

Nota: as amostras não aquecidas são muito mais viscosas do que as sujeitas a

aquecimento pelo que pode ser mais moroso conseguir depositá-las nos poços do gel. Uma vez que as amostras não atingem a ebulição, o ADN genómico não desnatura a amostra fica com um aspecto mais “espesso”. As amostras devem ser carregadas lentamente e a ponta da micropipeta puxada rapidamente para cima e para fora do poço; as amostras devem ficar no fundo do poço.

3. Deixar correr por 30 min a 200 V em tampão 1X TGS. Usando a lâmpada de UV, examinar o gel durante a electroforese e observar as pistas que mostram fluorescência. Após 5 min, a banda correspondente à GFP terá migrado suficientemente para ser visível.

4. Após o tempo de corrida, remover o gel e cortá-lo em duas partes iguais, após a linha 5 (siga o marcador de peso molecular para guiar a linha de corte).

5. Lavar as duas partes do gel em água: 3 x 5 min por lavagem (15 min total) e proceda conforme a tabela 2:

6. Examinar as duas peças do gel com luz UV e registe as observações. Mantenha a primeira peça (linhas 1–5) em água durante a noite e core a 2ª peça (linhas 6–10) com Coomassie.

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Coloração do Gel

1. Deite fora a água da 2ª peça de gel (linhas 6–10) e adicione 50 ml de Bio-Safe Coomassie stain.

2. Deixar corar durante 1 hora ou durante a noite, mas tape o recipiente para evitar a evaporação do líquido. 3. Após a coloração, substitua o corante por água (bastante). Mude a água 2–3 x, seguida de uma incubação durante a noite. 4. Seque os dois pedaços de gel, conforme descrito abaixo.

5. Visualize as bandas GFP. O que se espera observar é mostrado na figura 2.

Secagem do gel

1. Colocar duas folhas de papel celofane em água por 15–20 seg.

2. Centrar um das folhas de celofane sobre um quadrado de secagem de plástico.

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8 3. Cuidadosamente, coloque o gel sobre o celofane. Se houver bolhas entre o gel e o celofane, empurre-as suavemente para fora com o dedo. 4. Cobrir o gel com água e colocar a segunda folha de papel celofane por cima. Se houver bolhas, empurre-as delicadamente para fora com o dedo. 5. Cobrir com um quadrado de secagem de plástico. Prenda a sanduíche assim formada com 8 molas distribuídas uniformemente pela sanduíche. Deixar por 12–36 horas numa área bem ventilada.

Determinação do Peso Molecular das diferentes

conformações da GFP

1. Medir e anotar as distâncias percorridas pelas 10 bandas do Precision Plus

Kaleidoscope standard. Um exemplo é mostrado na tabela abaixo.

2. Medir e anotar as distâncias percorridas pelas duas conformações da GFP observadas na linha 8 da figura 7.

3. Com recurso ao software Excel traçar um gráfico do log PM (eixo do y) pela distância percorrida (eixo do x). 4. Obter a recta (linha de tendência) que melhor se ajusta aos pontos obtidos.

5. Determinar o peso molecular (PM) das duas conformações da GFP. Um gráfico com os resultados esperados é mostrado na figura 3.

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Resultãdos e discussã o

Protocolo 1

Tubo 1: Não se verificou fluorescência

Tubo 2: Não se verificou fluorescência

Tubo 3: Verificou-se fluorescência

Ilustração 2 Tubos de ensaio sem fluorescência (1 e 2) e com colónias fluorescentes (3)

As propriedades hidrofóbicas da proteína GFP permitem que ela possa

ser separada com sucesso das outras proteínas menos hidrofóbicas.

Isto acontece porque ao adicionar um tampão com uma concentração

salina elevada ao lisado que está colocado na coluna, as proteínas hidrofóbicas

vão ligar-se às esferas enquanto que todas as outras proteínas escoam pela

coluna. Posteriormente, ao adicionar a esse lisado um tampão com uma

concentração salina mais baixa, as proteínas hidrofóbicas vão desligar-se das

esferas às quais se tinham ligado quando expostas a uma concentração salina

elevada. Ao desligarem-se das esferas, as proteínas hidrofóbicas conseguem

eluir pela coluna já em estado purificado.

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Assim, sendo a GFP uma proteína hidrofóbica, quando foi adicionado

um tampão com uma concentração salina elevada, ela ligou-se às esferas,

enquanto que as outras proteínas, sem interesse para a realização deste

protocolo, escoaram pela coluna, separando-as assim das GFP. Por este

motivo, não se verificou fluorescência no tubo 1, bem como no tubo 2, uma vez

que o filtrado apenas continha as proteínas não hidrofóbicas.

No tubo 3, ao adicionar ao lisado um tampão com uma concentração

salina baixa, as proteínas hidrofóbicas (GFP) voltaram a desligar-se das

esferas, eluindo pela coluna. Uma vez que a coluna já não continha outras

proteínas para além das GFP, pelos motivos acima referidos, o filtrado apenas

continha as GFP (proteínas fluorescentes), na forma purificada. Por este

motivo, apenas o tubo 3 apresenta fluorescência, como era esperado.

Resultados esperados

Protocolo 2

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Resultados Obtidos:

Ao visualizar a fotografia que a Professora Sandra Gamboa tirou logo

após o término da electroforese, verificou-se que os resultados obtidos eram os

esperados, sendo possível visualizar as bandas assinaladas na figura acima.

No entanto, ao visualizar o gel após o processo de coloração com Bio-

Safe Coomassie stain e de incubação durante a noite, não foi possível verificar

a existência de bandas.

A explicação mais provável ao desaparecimento das bandas é o facto do

gel utilizado entrar em fusão a temperatura ambiente e, como ficou a incubar

durante a noite nessas condições, é provável que a camada mais superficial se

tenha fundido, sendo eliminada na lavagem do gel com água, arrastando

consigo as proteínas que nela se encontravam fixadas.

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Conclusã o

O cromossoma para GFP, reside na estrutura terciária da proteína e é

responsável pelas propriedades fluorescentes. Como o cromossoma consiste

em três aminoácidos adjacentes (estrutura tridimensional) as propriedades

fluorescentes continuam presentes, mesmo sob condições desnaturantes

adversas.

Quando neste procedimento, o sal é removido, a estrutura tridimensional

da proteína é novamente rearranjada para que as regiões hidrofóbicas da

proteína sejam movidas para o interior onde estão mais protegidas e as regiões

hidrofílicas mais expostas no exterior, e assim verifica-se fluorescência (tubo

3), enquanto que nos outros tubos não houve essa protecção das propriedades

fluorescentes e não houve fluorescência.

A sequência de cDNA permite que se estime o peso molecular da

proteína. Para GFP, os 239 aminoácidos codificam uma proteína de 26870

dalton. O método de electroforese quando realizado com sucesso permite

confirmar o peso molecular previsto da proteína, pois a composição e a posição

dos aminoácidos podem afectar a migração no gel de poliacrilamida.

Como o gel, por ter ficado exposto à temperatura ambiente ficou com

poros mais dilatados o que durante a lavagem do gel poderá ter lavado à

remoção das proteínas, ou seja não se obtiveram bandas de proteínas, como

referido na discussão de resultados, e assim, não foi possível proceder à

determinação do peso molecular das diferentes conformações da GFP.

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Bibliogrãfiã

Biotechnology Explorer Protein Electrophoresis of GFP: pGLO™ Bacterial

Transformation Kit Extension. Application note. Bio-Rad Laboratories, Inc.

GAMBOA, Sandra; QUARESMA, Andreia; BAHCEVANDZIEV, Kiril. Biotechnology

Explorer – Protein Electrophoresis of GFP: A pGLO Bacterial Transformation Kit

Extension.