eletroforese 2013 parte1

21
04/03/2013 1 ELETROFORESE Eletroforese Parte1

Upload: endy-bianca

Post on 24-Apr-2015

59 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 2: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

2

1. Características básicas; 2. O fluxo determinante; 3. Fatores envolvidos; 4. O ponto isoelétrico; 5. Tipos de eletroforese: Eletroforese livre, Eletroforese em suporte semi-sólido, Eletroforese em suporte sólido, Eletroforese capilar, Focalização isoelétrica, Eletroforese com SDS, Eletroforese bidimensional, Eletroforese de alta voltagem, Immunobloting, Iontoforese. 6. Revelação; 7. Analise qualitativa e quantitativa; 8. Aplicações e procedimentos experimentais

3

OBJETIVOS:

ELETROFORESE

DEFINIÇÃO: Processo de separação e/ou caracterização dos componentes de um sistema, baseado na carga elétrica livre das partículas, onde ocorre a migração diferencial das mesmas quando submetidas a um campo elétrico. PRINCÍPIO: Para que uma partícula se mova no campo elétrico é necessário que possua carga, isto é, excesso ou deficiência de elétrons, resultando em carga elétrica livre.

4

ELETROFORESE

Page 3: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

3

A eletroforese é especialmente útil como método analítico. Sua vantagem é que as moléculas podem ser separadas e visualizadas, permitindo determinar os componentes presentes em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparação particular de proteínas. A eletroforese permite também a determinação de propriedades cruciais de uma proteína, tais como o seu ponto isoelétrico e sua massa relativa. Técnicas especializadas de eletroforese como Western blotting, eletroforese bi-dimensional e mapeamento peptidico podem ser usadas para detectar produtos gênicos extremamente escassos, encontrar similaridades entre eles e detectar e separar isoenzimas.

5

ELETROFORESE

6

Fracionamento e caracterização Aminoácidos Peptídeos Proteínas (lipo e glico) Nucleotídeos Ácidos carboxílicos Adoçantes Vitaminas Corticoides Pesticidas Outras partículas que apresentem cargas em função do pH do meio.

ELETROFORESE

Page 4: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

4

Componentes que possuem carga elétrica livre migram para pólo de carga oposta a sua. Portanto, partículas carregadas negativamente migram para o pólo positivo (anodo) e partículas carregadas positivamente migram para o pólo negativo (catodo).

Na eletroforese a força elétrica, Fe que move a macromolécula é o potencial elétrico () , vezes a carga líquida da molécula (q). A força que pára a migração da macromolécula é a fricção, Ff, que é proporcional a velocidade da partícula, V, vezes o coeficiente de fricção, ffr: No caso do campo elétrico constante, as duas forças se balanceiam e a molécula migra com a velocidade constante.

7

ELETROFORESE

Eletroforese é o fluxo de partículas carregadas = o fluxo migracional.

A forca que atua sobre as moléculas com cargas elétricas é proporcional ao valor da carga e o potencial elétrico.

O fluxo, J, é proporcional a:

a carga pontual (q),

a concentração da molécula (C),

a área que o fluxo atravessa (A),

a mobilidade da molécula (u)

o potencial elétrico

xqCAuJ

8

ELETROFORESE

Page 5: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

5

A velocidade com que uma partícula se movimenta no campo elétrico depende de vários fatores: densidade de carga elétrica livre: principal fator, diretamente proporcional ao fluxo. potencial elétrico aplicado: diretamente proporcional ao fluxo. A voltagem aplicada deve ser adequada para separar o mais rapidamente possível, antes que a difusão espalhe os componentes. Voltagem muito alta aquece o sistema e prejudica a separação raio da partícula: inversamente proporcional viscosidade do meio: inversamente proporcional.

FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAÇÃO ELETROFORÉTICA:

9

ELETROFORESE

Outros fatores também influenciam na velocidade de migração: pH do meio (tampão);

força iônica do tampão;

interação com a fase fixa;

tipo de suporte;

grau de embebição (adsorção) do suporte;

temperatura;

FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAÇÃO ELETROFORÉTICA:

10

ELETROFORESE

A adsorção é a característica que certos suportes, principalmente o papel, agar e alguns tipos de agarose apresentam interagindo fisico-quimicamente com os anfolitos, como por exemplo, proteínas carregadas positivamente. Para eliminar este problema, devemos trabalhar com soluções-tampão cujo pH seja superior ao pI dos anfólitos, de modo que a carga dos anfolitos seja negativa e repulse a carga negativa presente nestes meios.

Page 6: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

6

PONTO ISOELÉTRICO de uma proteína é o valor do pH no qual as cargas positivas e negativas (da proteína) se equivalem. Não tendo carga elétrica

efetiva, e portando, não migrando na presença do campo elétrico.

Existem aminoácidos que além da carboxila e do grupo amina possuem outros grupos dissociáveis: Histidina (grupo imidazol, pK=8,3), Cisteína (grupo sulfidrila, pK=8,3), Tirosina (grupo hidroxifenol, pK=10,1) e Arginina (grupo guanidil, pK=12,5). As proteínas são poliaminoácidos e, portanto, possuem o comportamento múltiplo dos aminoácidos componentes.

11

ELETROFORESE

Proteínas pI

Pepsina

Ovalbumina

Soroalbumina

Urease

-Lactoglobulina

Hemoglobina

Mioglobina

Quimotripsinogênio

Citocromo C

Lisozima

-1.0

4.6

4.9

5.0

5.2

6.8

7.0

9.5

10.7

11.0

PONTO ISOELÉTRICO

Quase todas as proteínas possuem o ponto isoelétrico exato, por exemplo:

Observe o ponto isoelétrico da pepsina que está apresentado na tabela. Há alguma coisa errada?

12

ELETROFORESE

Page 7: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

7

As imunoglobulinas possuem pontos isoelétricos diferentes. Faça uma pesquisa e descubra o porquê.

DISTRIBUIÇÃO DAS PROTEINAS SÉRICAS PELOS PONTOS

ISOELETRICOS

pI 4,7-5.4 pI 5,4-5,8 pI 6,3-8,3

Albumina

Alfa 1- globulina Beta - globulina Gama-globulina

Alfa 2- globulina Beta - lipoproteína

Alfa – lipoproteína

Observe os pontos isoelétricos das proteínas séricas. Para quais polos elétricos elas vão migrar em pH 9?, pH 4? e pH 6?

O ponto isoelétrico da Gama-globulina está na faixa de 6.3-8.3. Há alguma coisa errada?

13

ELETROFORESE

TIPOS DE SUPORTES ELETROFORÉTICOS:

ELETROFORESE LIVRE:

Nesse sistema as substâncias são separadas em meio totalmente líquido, em tubo em forma de “U”. Para se obter um quadro completo da mistura, escolhe-se um pH onde a maioria das proteínas tenha a mesma carga, porém com densidade de carga e mobilidade diversas. O índice de refração nessa fronteira muda pela passagem das proteínas. Os movimentos de convecção provocados pela dissipação do calor exigem aparelhos e instalações especiais. É um método em desuso.

Diagrama esquemático da célula de Tiselius para medir a mobilidade eletroforética pelo método do movimento de fronteiras. No exemplo é mostrada duas diferentes espécies de proteínas carregadas negativamente, com diferentes mobilidades eletroforéticas, dissolvidas em solução tampão. Neste caso todas as proteínas migram para o ânodo. As mais rápidas assumem as fronteiras (1) tanto ascendente quanto descendente, ultrapassando, as mais lentas (2). Como resultado formam-se duas fronteiras em movimento ascendente e duas fronteiras em movimento descendente.

14

ELETROFORESE

Page 8: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

8

ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO

ELETROFORESE EM SUPORTE: A solução aquosa de proteínas é imobilizada em uma matriz solida ou semi-sólida (material poroso e hidratado que apresenta rigidez mecânica) eliminando a convecção e os distúrbios de vibração. Diminui a difusão das substâncias, o que facilita a sua completa separação. Metodologia mais simples, de maior resolução e que necessita de menores quantidades de amostra em relação a eletroforese livre. ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO: Os suportes sólidos mais usados são papel de filtro (EPF) e acetato de celulose (EAC), por serem materiais relativamente inertes que não interagem com as proteínas migrantes nem ocasionam o seu retardamento. O acetato de celulose tem a vantagem sobre o papel de filtro proporcionando melhor fracionamento, inclusive na separação de beta-globulina e beta-lipoproteína, o que não é possível em papel, e maior rapidez na separação. O processo de eletroforese é mantido até que os componentes tenham sido separados em zonas nítidas. A posição e quantidade das proteínas podem ser avaliadas por um densitômetro.

15

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO

(a) Diagrama do instrumental utilizado. A amostra é aplicada no centro do papel previamente umedecida pela própria solução tampão. As extremidades do papel são mergulhadas na solução tampão, na qual os eletrodos estão imersos e aonde será aplicado o campo elétrico. (b) Representação esquemática do eletroforetograma completo. Veja que os íons positivos (cations) migram em direção ao cátodo e os íons negativos em direção ao ânodo. Moléculas com carga resultante nula, permanecem no ponto de aplicação da amostra.

16

ELETROFORESE

Page 9: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

9

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI-SÓLIDO

Os suportes semi-sólidos mais usados são os géis de agarose e poliacrilamida. É possível maior resolução eletroforética quando o suporte ou material da matriz pode retardar ou excluir moléculas protéicas em função dos seus tamanhos moleculares. ELETROFORESE EM GEL ÁGAR OU AGAROSE (EA): o processo é semelhante ao descrito para eletroforese em acetato de celulose. Uma variação dessa técnica, bastante utilizada é a IMUNOELETROFORESE. IMUNOELETROFORESE: após a separação eletroforética da amostra, faz-se uma reação antígeno-anticorpo (Ag-Ac), lava-se a preparação para retirar as proteínas solúveis, restando os complexos Ag-Ac insolúveis (precipitados no gel), que são visualizados através de coloração específica. A analise imunoeletroforética permite definir ou caracterizar uma substância através de suas propriedades eletroforéticas (mobilidade), diferenças na velocidade de difusão (coeficiente de difusão) e pelas propriedades imunológicas (especificidade).

s17

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI-SÓLIDO

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (EGPA): A eletroforese é realizada em géis feitos de polímeros entrecruzados de poliacrilamida. O gel de poliacrilamida é um suporte que funciona com uma peneira molecular, promovendo a filtração da amostra pela rede do gel, reduzindo a velocidade de migração das proteínas em proporção aproximada à massa de cada uma delas. Nesse caso há associação da separação por carga e por massa relativa. Nesse sistema as proteínas são separadas por suas massas relativas.

s18

ELETROFORESE

Page 10: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

10

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO

Aparelhos e peças para eletroforese vertical

19

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO FORMAÇÃO DO GEL DE POLIACRILAMIDA – polimerização

Gel de poliacrilamida

20

ELETROFORESE

Page 11: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

11

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO Procedimento esquemático

As amostras (misturas das proteínas a ser analisadas estão colocadas com ajuda das micropipetas, nos poços do gel (1-3). O campo elétrico está aplicado (4) e as proteínas migram com velocidades diferente (5, 6) dependendo das cargas elétricas livres e tamanhos.

21

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO EM GEL ÁGAR OU AGAROSE ou POLIACRILAMIDA

Slab-eletroforese – eletroforese em camada fina do gel

Há dois tipos de géis: no topo o gel é com poros grandes e serve para concentrar as amostras; no baixo o gel é com poros menores e serve para separação as proteínas ou outros componentes do analise.

Esquema do gel em camada fina entre duasplacas de vidro. Aplicação das amostras e resolução das proteínas após revelação.

22

ELETROFORESE

Page 12: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

12

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI-SÓLIDO Revelação

A) corante Coomassie blue; B) coloração por prata

23

ELETROFORESE

A) brometo de etídio; B) nitrato de prata; C) marcação radioativa;

D) quimiluminescência; E) Coomasie Blue; F) fast blue BB salt.

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO Revelação

Page 13: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

13

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO Revelação

Com Luz UV Com corantes fluorescentes

Visualização dos ácidos nucléicos

25

ELETROFORESE

ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO Revelação

26

ELETROFORESE

Page 14: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

14

Eletroforese ácidos nucléicos

27

ELETROFORESE

Eletroforese na presença do SDS

Um método eletroforético comumente utilizado para a determinação da pureza e da massa relativa de proteínas faz uso de detergente dodecilsulfato de sódio (SDS). O SDS liga-se à maioria das proteínas, provavelmente por interações hidrofóbicas em quantidades grosseiramente proporcionais ao peso molecular de cada proteína e, em geral, na proporção de uma molécula de SDS para cada dois resíduos de aminoácidos. O SDS ligado adiciona uma grande carga negativa à molécula de proteína, tornando insignificantes as cargas intrínsecas da mesma.

[CH3-(CH2)n-CH2-O-SO3-] Na+

Dodecilsulfato de sódio (SDS) A conformação nativa das proteínas é alterada quando o SDS liga-se a elas e a maioria adquire, então, uma mesma forma geométrica, isto as tornam muito semelhantes entre si e, por esta razão, passam a ter uma mesma relação entre a carga elétrica e a massa. Assim, a eletroforese na presença de SDS separa as proteínas quase exclusivamente com base na sua massa, com os polipeptídios menores migrando mais rapidamente. Proteínas tratadas com SDS, perdem a carga intrínseca e adquirem carga negativa constante em relação a massa relativa. Sendo negativas, são atraídas para o ânodo e a separação ocorre segundo a massa relativa. As proteínas menores migram na frente, o inverso da cromatografica por gel-filtração.

28

ELETROFORESE

Page 15: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

15

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA NA PRESENÇA DE DODECIL SULFATO DE SODIO (EGPA-SDS).

Exemplo do gráfico padrão para determinação da massa relativa

Eletroforetograma

Etapas: 1. medida das distancias percorridas (todas as proteínas e corante Lider); 2. Calculo de Rf (migração relativa = Dp/DL); 3. construção do gráfico Padrão, onde eixo Y – migração relativa e eixo X – Logaritmo da massa relativa das proteínas padrão; 4. Utilizando valor do Rf da proteína desconhecida, determine o Logaritmo da massa molecular .

Descubra a massa relativa da proteína desconhecida, no Eletroforetograma ao lado.

29

Log

da

Mas

sa R

ela

tiva

Migração Relativa

ELETROFORESE

FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA OU ELETROFOCALIZAÇÃO

A focalização isoelétrica é um procedimento usado para determinar o ponto isoelétrico (pI) de uma proteína. Talvez seja o método mais eficiente de eletroforese.

Nesse método, inicialmente, os anfólitos (uma mistura de ácidos e bases orgânicos, de pequena massa) são aplicados no suporte (um gel), após aplicarmos um campo elétrico num tempo curto (pré-corrida) para distribuir os anfólitos ao longo do gel e estabelecer um gradiente linear de pH no gel de poliacrilamida ou agarose.

Uma mistura de moléculas com pontos isoelétricos diferentes é aplicada (1). As moléculas migram (2) até cada uma delas chegar ao local com o valor do pH igual ao seu pI (3).

1 2 3

3

Separação das moléculas em acordo com pontos isoelétricos

30

ELETROFORESE

Page 16: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

16

FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA OU ELETROFOCALIZAÇÃO Resultado

Quando uma mistura protéica é colocada no gel de poliacrilamida ou agarose cada proteína migra para o cátodo ou anodo até atingir o pH, que corresponde ao seu pI (ponto isoelétrico), formado uma área estacionária. Assim, proteínas com diferentes pontos isoelétricos distribuem-se de forma diferente ao longo do gel, formado uma área estacionária. O processo da revelação é similar ao processo utilizado na nossa aula pratica com papel da celulose como suporte sólido: corante revelador e solução descorante.

A separação das moléculas de acordo com seus pontos isoelétricos.

31

ELETROFORESE

Combinação de dois métodos eletroforéticos :

1. focalização isoelétrica (IEF) e

2. eletroforese na presença de SDS

Em géis bidimensionais consegue-se a resolução de misturas mais complexas de proteínas. Este método composto é mais sensível do que a focalização isoelétrica ou a eletroforese em SDS sozinhos. A eletroforese bidimensional separa as proteínas de massa relativa idênticas, que diferem em ponto isoelétrico, ou proteínas com pI similar, porém massas relativas diferentes.

Eletroforese bidimensional

32

ELETROFORESE

Page 17: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

17

Combinando os dois métodos:

1. focalização isoelétrica (IEF) e

2. eletroforese na presença de SDS

A eletroforese bidimensional separa as proteínas de mesma massa relativa que diferem em pontos isoelétricos, ou proteínas com pI similares, porém massas diferentes.

Revelado com o corante Coomassie.

Eletroforese bidimensional

33

ELETROFORESE

Coloração por prata Corantes fluorescentes

Eletroforese bidimensional - Revelação

Cada pontinho representa um proteína diferente. A intensidade da coloração indica a quantidade da proteína.

34

ELETROFORESE

Page 18: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

18

ELETROFORESE DE ALTA VOLTAGEM

Aplica-se alta voltagem (ate 10 mil volts) ao sistema para separação de pequenas moléculas com rapidez, antes que elas possam se difundir. Utilizada para aminoácidos e pequenos polipeptídios.

Fonte externo para eletroforese 35

ELETROFORESE

“ IMMUNOBLOTING” é um poderoso método de diagnostico.

36

ELETROFORESE

Page 19: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

19

“ IMMUNOBLOTING” é um poderoso método do diagnostico.

37

ELETROFORESE

Analise dos eletroforetogramas. Densitometros são fotocolorímetros específicos.

38

ELETROFORESE

Page 20: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

20

Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas. Densitogramas = curvas de absorbância

39

ELETROFORESE

Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas. Densitogramas = curvas de absorbância

40

ELETROFORESE

Page 21: Eletroforese 2013 Parte1

04/03/2013

21

Determinação as quantidades relativas de cada proteína nas analises eletroforéticas

Como podemos calcular as quantidades relativas de cada proteína na amostra analisada, baseados apenas nos densitogramas? Isto pode ser resolvido de duas formas: 1. Baseado na área do gráfico. Primeiro traçamos uma linha na base do gráfico ligando os pontos iniciais e finais. Depois, podemos utilizar o conceito de integral e derivação de funções, mas podemos utilizar um artifício geométrico para resolver nosso problema: basta traçarmos retas paralelas aos eixos x e y, cobrindo todo o gráfico (formando uma malha). Feito isto, passaremos a trabalhar como se usássemos um papel milimetrado (quanto mais próximas essas linhas umas das outras, mais exata será a medida obtida). Para descobrir as áreas aproximadas das curvas do gráfico, devemos então contar o número de quadrados contidos no gráfico. Quando o quadrado estiver apenas parcialmente contido no gráfico, a ele será atribuído valor 0,5. Quando o quadrado estiver totalmente contido no gráfico, a ele será atribuído valor 1. Após a contagem, soma-se os valores, obtendo as áreas relativas das curvas. 2. Com uma balança analítica. Primeiro traçamos uma linha na base do gráfico e com uma tesoura podemos simplesmente recortar o gráfico e obter um pedaço de papel na forma dele. Em seguida pesa-se esse recorte e anota-se a o peso obtido (PG =peso total), referente a todo gráfico. Depois, recorta-se cada Gaussiana (picos) do gráfico e pesa-se separadamente. Para se saber a quantidade relativa das proteínas, basta estabelecer relações matemáticas entre os pesos anotados e o peso total, PG. Usar essa noção para analisar a fração relativa das proteínas séricas a partir dos densitogramas de eletroforese apresentados na pagina anterior.

41

ELETROFORESE

Uma imunoeletroforese cruzada bidimensional.

42

ELETROFORESE