apostila de microbiologia geral final
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Responsável: Profa. Dra. Danila Soares Caixeta
Colaboradores: Prof. Dr. Eduardo Beraldo de Morais
Profa. Dra. Zoraidy Marques de Lima
Rossean Fernandes Golin
CUIABÁ – MT
2011/2
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE ARQUITETURA, ENGENHARIA E TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA SANITÁRIA E AMBIENTAL
APOSTILA DE MICROBIOLOGIA GERAL:
aulas práticas
Para conduzir as aulas práticas no Laboratório de Microbiologia do
Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental é imprescindível que algumas
normas sejam seguidas para garantir o bom desempenho e segurança nas atividades
laboratoriais
1. Colocar blusas e outros objetos fora da bancada de trabalho. Deixe apenas o
material necessário à prática.
2. O uso de JALECO é obrigatório.
3. Não usar chinelos e sandálias, pois, em caso de acidentes, vidrarias e outros
equipamentos podem causar sérios ferimentos.
4. Lavar bem as mãos antes do início e após o término da aula.
5. Limpar a mesa de trabalho, antes e depois de cada sessão de trabalho, usando
desinfetante. Fechar a água, o gás e desligar o interruptor e tomada do
microscópio.
6. O laboratório deve ser um ambiente calmo. Os alunos devem evitar falar em voz
alta e sair, desnecessariamente de seus lugares.
7. É inadmissível qualquer tipo de brincadeira durante as aulas práticas.
8. Não comer, beber ou fumar dentro do laboratório e nem colocar, caneta, papel
ou dedos na boca.
9. Proteger o cabelo da chama do bico de Bunsen e de contaminação microbiana.
10. Não usar os refrigeradores ou estufas para conservar ou aquecer alimentos.
11. Nunca usar frascos de laboratório para beber água.
12. Ser cuidadoso com materiais que possam causar ferimentos na pele, como
seringas, pipetas de Pasteur, lâminas em geral, dentre outros.
13. Nunca pegue material quente ou substâncias químicas sem luvas adequadas ou
garras especiais.
14. Caso uma cultura seja derramada, cobrir o material com desinfetante eficiente,
lavar bem as mãos com água e sabão e comunicar o fato imediatamente ao
professor.
15. Devem ser registrados os acidentes como o derrame de culturas, ferimentos, etc.
NORMAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO
16. Não pipetar material tóxico ou infeccioso com a boca. O trabalho de pipetagem
deverá ser realizado com o auxílio de ajudantes de pipeta mecânicos.
17. A expulsão rápida e violenta do conteúdo da pipeta pode produzir aerossóis;
geralmente, no trabalho microbiológico é preferível movimentação suave e
tranqüila.
18. As pipetas usadas devem ser colocadas horizontalmente em solução desinfetante
imediatamente após o uso, antes de esterilizar em autoclave.
19. Não cheirar os meios de culturas inoculados.
20. Luvas e máscaras deverão ser utilizadas quando necessário.
21. Todo material contaminado antes de ser lavado, deve passar pelo processo de
esterilização, para que toda a sua flora microbiológica seja completamente
destruída, evitando-se que o mesmo seja uma fonte de contaminação.
22. A autoclave, que é um equipamento usado nas atividades rotineiras do
laboratório, deve ser inspecionado e verificado quanto à eficiência de
esterilização periodicamente.
23. Descartar todo o material contaminado em recipiente apropriado e esterilizar em
autoclave.
24. A alça de platina e agulha utilizadas na manipulação dos micro-organismos
devem ser esterilizadas no bico de Bunsen antes e depois de utilizadas. Colocá-
las sempre em posição vertical no suporte e não sobre a bancada.
24. As lâminas e lamínulas usadas devem ser colocadas em recipiente com
desinfetante.
25. Não manusear objetos no interior da câmera de fluxo laminar com a luz
ultravioleta ligada
26. Não devolva reagentes ao frasco de origem, nunca retire do frasco mais do que
necessário. Descartar espátulas usadas em locais apropriados
OBSERVAÇÕES: Não será permitida a participação de alunos nas aulas práticas,
que não cumprirem as normas acima. Serão dados 5 minutos de tolerância para o
início da atividade prática, não sendo permitido à entrada de alunos retardatários.
INTRODUÇÃO
Os micro-organismos vêm evoluindo a aproximadamente 4 bilhões de anos, e
até 2 bilhões de anos atrás eram as únicas formas de vida na Terra. Estes compreendem
uma definição taxonômica que congrega grupos variados de organismos unicelulares de
dimensões microscópicas, que vivem na natureza como células isoladas ou em
agregados celulares, incluindo os grupos: bactérias, fungos filamentosos e leveduras,
protozoárias e vírus.
O estudo dos micro-organismos está muitas vezes dependente da possibilidade de
cultivar e mantê-los viáveis no laboratório, sob a forma de cultura pura, no entanto,
alguns utensílios, vidrarias e equipamentos são considerados básicos na rotina de um
laboratório. Dentre os diversos equipamentos necessários para as atividades, como
preparo de meio de cultura, soluções, esterilização de material, manipulação de micro-
organismos, dentre outras, citam-se microscópio, incubadoras, estufas esterilizadoras,
autoclaves, geladeiras, balanças, agitadores, destilador de água, centrífuga, banho-
maria, filtros, vidrarias específicas entre outros materiais.
OBJETIVOS
Conhecer materiais, equipamentos e normas do Laboratório de Microbiologia do
Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental-UFMT, para o bom desempenho
das aulas práticas.
MATERIAIS
Equipamentos, Utensílios e Vidrarias
Agitador, autoclave, balança analítica, câmara de fluxo laminar, contador de
colônias, estufa esterilizadora, incubadora ou BOD, microscópio, bico de Bunsen,
geladeira, alça de Drigalsky e platina, balão volumétrico, bastão de vidro, béquer,
estilete, frasco de Erlenmeyer, lâmina, lâmina escavada, lamínula, pinça, pipeta
automática, pipeta de Pasteur, pipetador, placa de Petri, proveta, tubo de cultura, tubo de
Durham, câmara de Neubauer.
PRÁTICA 1
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS DE LABORATÓRIO
PROCEDIMENTO
Esclarecer minuciosamente as regras estabelecidas no laboratório. Exibir os
materiais e utensílios utilizados nas aulas práticas.
ATIVIDADES
1. Descreva a função de cada um dos utensílios abaixo.
Bico de Bunsen
Câmara de fluxo laminar
Placa de Petri
Tubo de Durham
Alça de Drigalsky e platina
Pipeta de Pasteur
2. Qual a importância do uso da autoclave, no processo de esterilização de
materiais?
3. Explique o efeito da radiação sobre as células microbianas
INTRODUÇÃO
Todos os organismos vivos necessitam de uma variedade de elementos químicos
como nutrientes, que participam diretamente nas reações catabólicas e anabólicas,
podendo ser divididos em dois grandes grupos: micronutrientes e macronutrientes.
A partir dos conhecimentos dos requerimentos nutricionais, podem ser
confeccionados meios que permitem o crescimento in vitro. Algumas bactérias podem
crescer normalmente em qualquer meio de cultura, outras necessitam de meios especiais
e existem aquelas que não são capazes de crescer em nenhum meio de cultura já
desenvolvido. Os micro-organismos que crescem e se multiplicam nos meio de cultura
são denominados cultura.
Para o crescimento de micro-organismos no laboratório há uma grande
variedade de meios de cultura, podendo ser classificados de acordo com a consistência
em sólido, semi-sólido e líquido e quanto à composição em quimicamente definido e
complexo.
O meio de cultura deverá ser inicialmente estéril, para que ocorre o crescimento
somente de micro-organismos adicionados. Finalmente, a cultura deverá ser incubada a
temperatura adequada para o seu crescimento.
OBJETIVOS
Preparar os meios de cultura ágar sabouraud e ágar nutriente. Executar a
esterilização em autoclave (calor úmido) dos meios de cultura
MATERIAIS
Provetas, Erlenmeyers, balança, tubos de ensaio, pHmetro, autoclave, micro-
ondas, meio de cultivo, espátula, bastão de vidro.
PROCEDIMENTO
Para preparar os meios de cultura pesar os ingredientes indicados em papel
alumínio e colocar em um frasco de erlenmeyer de 1 litro.
PRÁTICA 2
PREPARO DE MEIO DE CULTURA
Ágar Nutriente
Extrato de carne ............................... 3g
Peptona .............................................5g
Agar...................................................15 g
Água destilada ..................................1000 mL
1. Dissolver os ingredientes.
2. Ajustar o pH para 6,8±0,2.
3. Esterilizar a 121°C/15 min.
Ágar Sabouraud
Peptona ............................................ 10g
Dextrose ........................................... 40g
Ágar ................................................. 15g
Água destilada ................................. 1000 mL
1. Dissolver os ingredientes em micro-ondas.
2. Ajustar o pH para 5,6±0,2.
3. Esterilizar a 121°C/15 min.
Obs. Existem alguns equivalentes comerciais nos quais estes meios estão prontos para
serem utilizados. Neste caso seguir as especificações do rótulo.
ATIVIDADES
1. Para quais fins utiliza-se o meio de cultura sólido, semi-sólido e líquido?
2. Por que, algumas vezes, a esterilização de meios de cultura por calor sob
pressão, em autoclave, não é adequada? Qual seria a alternativa sugerida nesses
casos?
3. Cite os cuidados necessários para que o material não seja contaminado após os
procedimentos de esterilização.
INTRODUÇÃO
Os micro-organismos podem ser encontrados nos mais variados ambientes,
desde que condições favoráveis como água, nutriente e superfície, sejam
disponibilizadas para o crescimento. São transportados por correntes aéreas desde a
superfície da Terra até as camadas superiores da atmosfera.
Os micro-organismos desempenham um papel importante na natureza e em
processos tecnológicos. Dependendo da área, podem ser indesejáveis ou benéficos.
Na natureza, os micro-organismos apresentam um papel crucial na ciclagem de
nutrientes aquáticos e terrestres, na biodegradação de poluentes ambientais, no processo
de biorremediação, na recuperação de óleo, extração de metais, agricultura e no
processo de nodulação de leguminosas, em contrapartida, eles podem ser indesejáveis
na indústria em âmbito global, causando sérios problemas de higiene e perdas
econômicas, devido a danos em alimentos e equipamentos. Os micro-organismos têm
sido relatados ser responsáveis por causar doenças em humanas e animais.
Os microbiologistas devem estimular e otimizar o desenvolvimento de micro-
organismos benéficos e inibir aqueles que causam doenças ou deterioram os alimentos e
o ambiente.
OBJETIVOS
Isolar micro-organismos de diferentes ambientes.
MATERIAIS
Meios de cultivo
Ágar nutriente, Ágar Sabouraud e água peptonada.
Equipamentos e utensílios
Agitador, câmara de fluxo laminar, bico de Bunsen, incubadora, alça de
Drigalsky, swab, pipeta, placa de Petri.
PROCEDIMENTO
PRÁTICA 3
ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS DO AMBIENTE
Para averiguar a presença de micro-organismos no ambiente, utilize placas de
Petri com meio de cultivo estéril e swab. Exponha à placa a condição de inoculação em
qualquer ambiente por 15 minutos, ou faça um esfregaço com auxílio de um swab,
sobre uma superfície desejável.
Identificar as placas, anotando na tampa tipo de exposição a que foram
submetidas e o número do grupo. Incubar as placas na posição invertida a 37 °C por 24-
48 horas. Realizar as contagens das colônias diariamente avaliando sua abundância e
diversidade.
ATIVIDADES
1. Qual a utilidade do bico de Bunsen no laboratório de microbiologia?
INTRODUÇÃO
Todas as células vivas podem ser classificadas como procariotas, das palavras
gregas pro (antes) e Karyon (núcleo), ou eucarióticas, de eu (verdadeiro) e Karyon
(núcleo). Todos os organismos procariontes são unicelulares, como exemplificado pelas
bactérias, enquanto os eucariontes incluem os vegetais, animais, fungos e protistas.
De acordo com o grupo a que pertencem, os micro-organismos apresentam
dimensões reduzidas e bastante variáveis. Os procariotos estão entre os menores
organismos, a maioria deles medem de 0,5 e 2,0 µm de diâmetro e mais de 100 µm de
comprimento, enquanto que os eucariontes possuem diâmetro maior que 10 µm e
muitos são bem maiores.
Em relação às formas, as maiorias das bactérias estudadas seguem um padrão
menos variável, embora existam vários tipos morfológicos distintos. De maneira geral,
as bactérias podem ser agrupadas em três tipos morfológicos gerais: esférica, bastão e
espiral.
As leveduras são normalmente ovais, mas algumas vezes são alongadas ou
esféricas. Diferentemente das leveduras unicelulares, os fungos filamentosos são
organismos multicelulares que aparecem com filamentos. O corpo, ou talo de um fungo
filamentoso, consiste em um micélio e nos esporos latentes. Cada micélio é uma massa
de filamentos chamada hifa, podendo ser classificadas em cenocítica ou como septadas.
Por serem os micro-organismos muito pequenos, estes devem ser observados
através de microscópios, podendo ser utilizados microscópios ópticos, eletrônicos,
epifluorescência, contraste de fase, força atômica e outros. No entanto, para que os
microscópios sejam úteis, os espécimes a serem observados devem ser preparados
corretamente.
OBJETIVOS
Reconhecer e descrever características de colônias e estruturas de micro-
organismos.
Identificar o grupo ao qual o micro-organismo pertence com base nas
características macro e micromorfológicas.
PRÁTICA 4
OBSERVAÇÃO MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA DOS MICRO-
ORGANISMOS
Preparar lâminas a fresco
MATERIAIS
Micro-organismos
Micro-organismos (fungos filamentosos, leveduras e bactérias) crescidos em
meio sólido, isolados de diferentes ambientes (Prática 3).
Soluções
Azul de metileno
Equipamentos e utensílios
Microscópio ótico, lâminas, lamínulas, alça de platina, bico de Bunsen, água
destilada, pipeta de Pauster.
PROCEDIMENTOS
1. A partir das placas da aula anterior selecionar 3 colônias diferentes (escolher
colônias que apresentam aspecto filamentoso, cor brilhante e opaca.
2. Com o auxílio de uma alça ou agulha de inoculação, assepticamente, transferir
uma pequena porção da cultura para uma lâmina de vidro com uma gota de
água.
3. Fixar pelo calor, passando a lâmina pela chama do bico de Bunsen por 3 vezes.
Adicionar uma gota de azul de metileno sobre o esfregaço e cobrir com a
lamínula.
4. Examinar ao microscópio ótico nas objetivas de 10X, 40X e 100X (colocar olho
de imersão), observando forma das células/hifas, tamanho relativo, modo e
estruturas de reprodução.
OBSERVAÇÕES: Não levante a platina do microscópio (movimentando o
macrométrico) com a objetiva de maior aumento encaixada.
Procure o campo onde os organismos estão, utilizando os parafusos de
“charrior”.
Terminada a observação, desligue a luz; gire o revolver para encaixa a objetiva
de menor aumento, passando pela objetiva de 10x; abaixe a platina e retire a lâmina.
Após a observação, descarte a lâmina e a lamínula em locais apropriados com
detergente e desinfetante.
ATIVIDADES
1. Examinar macroscopicamente as culturas descrevendo cor, textura, borda,
forma, tamanho e brilho da colônia. Esquematizar cada uma delas.
Levedura Fungo filamentoso
Bactérias
2. Quais são as vantagens e as desvantagens da observação de lâminas em
preparações a fresco?
3. No laboratório, examinando culturas de micro-organismos, como podemos
definir se trata de bactéria, fungo filamentoso ou levedura?
ANEXO
Figura 1 Microscópio óptico
Figura 2 Morfologia celular de bactérias
Figura 3 Característica das colônias bacterianas (Harley e Prescott; 2002)
Figura 4 Características morfológicas de fungos filamentosos evidenciando suas
estruturas microscópicas.
Figura 5 Padrão morfológico do gênero Aspergillus (A) e Penicillium(B)
Figura 6 Padrão morfológico de levedura
B A
INTRODUÇÃO
Em ambiente naturais, os micro-organismos se encontram, em comunidades
microbianas. Assim sendo, para que seja possível estudar as características das espécies
que compõem essas comunidades microbianas, é necessário fazer o isolamento e cultivo
em cultura pura.
Uma cultura pura consiste em micro-organismos geneticamente idênticos,
originados a partir de uma única célula. Para a obtenção de culturas puras o método
mais comumente utilizado é o método de semeadura por esgotamento.
A metodologia de semeadura por esgotamento pode se aplicada com sucesso
para o isolamento de organismos presentes em grandes números relativos à população
microbiana.
OBJETIVOS
Obter cultura pura pelo método de semeadura por esgotamento, produzindo
estrias simples e compostas.
MATERIAIS
Placa Petri contendo meio de cultura sólido (Ágar Nutriente), alça de platina,
cultura de micro-organismos, bico de Bunsen.
PROCEDIMENTOS
1. Escolher entre os micro-organismos isolados, uma colônia de bactéria.
2. Realizar o trabalho próximo ao bico de Bunsen, adotando procedimentos que
evitem a contaminação.
3. Esterilizar a alça de platina na chama e esfriá-la.
4. Com a alça carregada, realizar estrias (simples e composta) na placa contendo
Ágar Nutriente.
5. Flambe a alça novamente, deixe-a esfriar
6. Incubar as placas em posição invertida a 37 °C por 24-48 horas. Observe o
isolamento de colônias isoladas.
PRÁTICA 5
ISOLAMENTO DE BACTÉRIA EM CULTURA PURA: técnica de semeadura
por esgotamento
ATIVIDADES
1. Qual a diferença entre culturas mistas, puras e axênicas?
2. Por que os meios sólidos são preferidos para o isolamento dos micro-
organismos?
3. Esquematize os métodos de esgotamento por estrias simples e composta.
ANEXO
1. Segure a alça de inoculação como na figura
2. Esterilize a alça de repicagem, deixe-a esfriar
3. Transfira a suspensão bacteriana contida na alça de repicagem para a superfície do
meio de cultura, espalhando conforme uma das técnicas: estria simples e estria
composta.
4.
4. Espalhar o inóculo na área A e estriar em direção a B. Repetir o processo de B para
C.
INTRODUÇÃO
Em microbiologia, são utilizados dois tipos principais de coloração: coloração
simples e coloração diferencial. Na coloração simples utiliza um único corante e revela
os formatos básicos das células e seus arranjos. Por outro lado, a coloração diferencial
utiliza dois ou mais corantes e diferencia dois tipos de organismos ou partes diferentes
de um mesmo organismo.
A coloração de Gram, provavelmente a coloração diferencial que mais tem sido
utilizada, foi desenvolvida pelo médico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884.
Durante a coloração de Gram, as células são tratadas com cristal violeta (corante
primário) e em seguida com uma solução de iodo (mordente), resultando na formação
de um complexo cristal violeta-iodo (CVI) dentro da célula. Quando uma bactéria
Gram-negativa é tratada com etanol, o lipídeo na membrana é dissolvido e removido.
Isso rompe a membrana externa e aumenta sua permeabilidade. Assim, o CVI pode ser
removido, descorando a célula que pode então ser tingida com o corante safranina.
Em bactérias Gram-positiva, o etanol faz com que os poros no peptideoglicano
se contraiam, e o CVI permanece no interior da célula.
OBJETIVOS
Realizar a técnica de coloração de Gram para o exame microscópico, diferindo
as bactérias de acordo com sua resposta a coloração de Gram.
MATERIAIS
Micro-organismos
Cultura de bactérias em meio líquido ou sólido crescidas por 24 horas.
Meios e soluções
Água destilada, cristal violeta, lugol, álcool, fucsina ou safranina, óleo de
imersão.
Equipamentos e utensílios
Microscópio ótico, lâminas, alça de repicagem, bico de Bunsen, bandejas e
suporte para lâminas.
PRÁTICA 6
COLORAÇÃO DIFERENCIAL: Gram
PROCEDIMENTO
Limpe bem uma lâmina com papel, flambe-a com o bico de Bunsen e deixe-a
esfriar a temperatura ambiente.
Esterilize a alça de repicagem, aquecendo-a ao rubro no bico de Bunsen.
Transfira assepticamente com a alça de repicagem uma gota da cultura de
bactéria do meio líquido ou sólido, para o centro da lâmina. Se a cultura estiver
em meio sólido, coloque uma gota de água destilada sobre a lâmina e colete o
material, e adicione na gota pré existente.
Prepare o esfregaço, espalhando a suspensão com a alça de repicagem;
Fixe o esfregaço por três vezes.
Deixe a lâmina esfriar.
Inicie a coloração de Gram, sempre respeitando o tempo indicado para cada
reagente.
Cubra o esfregaço com cristal violeta (1 minuto), em seguida, lave com água
destilada (evite jato de água muito forte sobre o esfregaço, para não desprendê-
lo).
Cubra com solução de lugol (1 minuto). Lave com água destilada.
Lave a lâmina com etanol 95%, rapidamente, até que não desprenda mais
corante da preparação.
Lave o excesso de água com álcool.
Cubra o esfregaço com solução safranina ou fucsina (30 segundos)
Lave a lâmina com água e deixe-a secar ao ar.
Manuseie corretamente o microscópio ótico. Focalize o material corado,
sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X, 40 X.
Trave o microscópio, adicione uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e
visualize com a objetiva de 100X, usando o micrométrico.
Terminada a observação, desligue a luz, gire o revolver para encaixar a objetiva
de menor aumento, passando pela objetiva de 10X, abaixe a platina e retire a
lâmina.
Após a observação, descarte a lâmina e a lamínula em locais apropriados.
OBSERVAÇÃO: Limpar as lentes das objetivas com éter.
ATIVIDADES
1. Desenhe os campos observados, fazendo distinção entre a forma, arranjo das
bactérias e cor predominante.
Bactéria 1 Bactéria 2
2. Por que a coloração de Gram é importante em microbiologia?
3. Dê exemplos de outras técnicas de coloração diferencial, além da coloração de
Gram.
INTRODUÇÃO
Os micro-organismos normalmente crescem em complexas populações, as quais
são encontrados em solo, águas, ar, alimentos, serragem e na superfície de qualquer
lugar.
Os fungos terrestres são as espécies mais conhecidas entre os fungos. Ente grupo
inclui leveduras e fungos filamentosos. Todos caracterizam pela nutrição através da
absorção e com exceção das leveduras (geralmente unicelulares), a maioria produz um
micélio bem desenvolvido constituído de hifas septadas ou cenocíticas.
Como saprófitos, degradam a matéria orgânica transformando-a em formas
químicas simples que retornam ao solo. Por outro lado, podem causar a deterioração de
alimentos, tecidos vegetais e ambientes. Como parasitas, causam doenças em vegetais e
animais, inclusive no homem. Os fungos podem atuar ainda em associações simbióticas
de grande importância, como as associações com outros organismos, tais como as algas,
formando os líquens, ou com raízes de plantas, formando as micorrizas.
Para o estudo de uma determinada espécie é necessário separá-la da população
mista. Os métodos usados para o isolamento de fungos e seu cultivo dependem muito do
seu habitat natural. Geralmente, empregam-se meios sólidos acidificados, com pH em
torno de 4 a 5, com o objetivo de inibir o crescimento de bactérias.
Nos últimos anos, o desenvolvimento de novos meios de cultura e novas técnicas
de isolamento, detecção e enumeração de fungos têm-se aperfeiçoado muito no âmbito
internacional, sendo, entretanto, muito pouco explorados no Brasil, até o momento.
OBJETIVOS
Isolar fungos de diferentes ambientes e preparar lâminas a partir de cultura pura.
PROCEDIMENTO
Amostras
Frutas e vegetais em decomposição, cogumelos, material vegetal contaminado
com fungos fitopatogênicos.
Meios e soluções
Ágar Sabouraud, azul de metileno e óleo de imersão.
PRÁTICA 7
ISOLAMENTO DE FUNGOS FILAMENTOSOS
Equipamentos e utensílios
Incubadora, pinça, placas de Petri com ágar sabouraud, alça de platina e/ou
agulha de inoculação, estilete, papel absorvente.
PROCEDIMENTO
Isolamento de fungos filamentosos saprófitas a partir de material vegetal em
decomposição:
Recolher com alça de platina e/ou agulha de inoculação esporos ou micélio de
fungos contaminando alimentos ou outros materiais em decomposição.
Fazer três pontos no centro da placa de ágar Sabouraud.
Identificar as placas colocando o nome da amostra e grupo.
Incubar a 25 ºC por 7 dias ou até a formação visível de colônias.
Isolamento de fungo saprófita a partir do corpo de frutificação (cogumelo)
Lavar bem o cogumelo em água corrente e deixar escorrer o excesso de água em
papel absorvente limpo.
Molhar a pinça no álcool, passar pela chama e esperar até que todo o álcool se
queime.
Abrir o cogumelo e, do interior, retirar uma pequena porção do pseudotecido
com auxílio de uma pinça.
Transferir o fragmento do cogumelo para uma placa com ágar Sabouraud
(colocar em cada placa 4 fragmentos bem separados uns dos outros).
Incubar a 25 ºC por 7 dias ou até a formação visível de colônias.
Preparo de lâminas e visualização em microscópio ótico
Retirar o bloco de ágar com o fungo desenvolvido.
Transferir para a lâmina e adicionar o azul de metileno.
Cobrir com lamínula e esmagar o bloco
Observar no microscópio. Manuseie corretamente o microscópio ótico. Focalize
o material corado, sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X, 40 X.
Trave o microscópio, adicione uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e
visualize com a objetiva de 100X, usando o micrométrico.
Terminada a observação, desligue a luz, gire o revolver para encaixar a objetiva
de menor aumento, passando pela objetiva de 10X, abaixe a platina e retire a
lâmina.
Após a observação, descarte a lâmina e a lamínula em locais apropriados.
OBSERVAÇÃO: Limpar as lentes das objetivas com éter.
ATIVIDADES
1. Avalie o crescimento de fungos nos meios utilizados e esquematize as colônias
fúngicas encontradas.
Saprófita Cogumelo
2. Esquematize as estruturas dos fungos
INTRODUÇÃO
O método de contagem em placa é a técnica mais utilizada na determinação do
tamanho de uma população bacteriana. A grande vantagem deste método é que as
células viáveis são qualificadas. Em contra partida, a desvantagem pode ser o tempo, em
geral 24 horas, para o aparecimento visível de colônias na placa.
Na realização do método de contagem em placa é essencial que somente um
número limitado de colônias cresça em cada placa. Normalmente, somente serão
analisadas para contagem, as placas que contem entre 30 e 300 colônias.
Quando essa técnica é utilizada, deve-se utilizar o método de diluição seriada
para garantir que o número de colônias na placa permaneça na faixa desejada. Na
diluição seriada o inóculo é diluído em uma série de tubos de diluição, onde cada tubo
subseqüente conterá um décimo do número de bactérias presentes na anterior.
Posteriormente, as amostras destes tubos serão transferidas para placas de Petri
contendo meio de cultura onde ocorrerá o crescimento das colônias e a contagem.
Existem duas metodologias para se realizar a contagem de bactérias em placa:
método de espalhamento em superfície (spread plate) ou método de espalhamento em
profundidade (pour plate).
No método de espalhamento em superfície, 0,1 mL da diluição bacteriana é
adicionado a superfície do meio contendo ágar já solidificado. O inóculo é então,
espalhado uniformemente na superfície por meio de um bastão de vidro especial (alça
de Drigalsky).
Nesse método, as colônias crescem somente na superfície do meio e não entram
em contato com o ágar fundido, permitindo identificar e observar características da
colônia.
OBJETIVOS
Identificar micro-organismos presentes em amostras de leite utilizando como
metodologia a técnica de plaqueamento em superfície.
AMOSTRA
Amostra de leite obtida no mercado de Cuiabá.
PRÁTICA 8
CONTAGEM PADRÃO EM PLACA: Spread plate
EQUIPAMENTOS E UTENSÍLIOS
Placas de Petri com meios de cultivo (Ágar nutriente), tubos de diluição (Água
peptonada), bico de Bunsen, pipetas, pipetadores, alça de Drigalski.
PROCEDIMENTO
Marque os tubos de diluição presentes na estante com os valores da diluição (10-
1, 10
-2, 10
-3, etc. As diluições que serão utilizadas dependerão da natureza da
amostra).
Faça o mesmo com as placas de Petri. Faça duplicata de cada placa.
Agite bem o material recebido (amostra), retire 1,0 mL com pipeta esterilizada e
transfira para o tubo marcado 10-1
. Agite-o.
A partir do tubo 10-1
transfira 1,0 mL utilizando pipeta esterilizada para o tubo
marca 10-2
. Agite. Repita este procedimento até atingir a diluição necessária.
Coloque cuidadosamente 0,1 mL da suspensão do tubo marcado 10-2
, após agitá-
lo, no centro das placas marcadas com esta diluição (Anexo).
Espalhe bem o material presente em ambas as placas, utilizando a alça de
Drigalski. Para tanto, a alça (que deve permanecer mergulhada em álcool) deve
ser flambada e depois esfriada antes de entrar em contato com o material a ser
espalhado.
Repita o procedimento para os demais tubos de diluição (10-3
e 10-4
).
As placas deverão ser incubadas a 37 ºC por 48 horas.
Conte as colônias nas placas cujo número esteja entre 30-300. Calcule a média
das duplicatas e registre como UFC (unidades formadoras de colônias)/mL.
Cálculo e expressão dos resultados
ATIVIDADES
1. Cite as vantagens de utilizar a técnica de espalhamento em superfície.
UFC/mL = nº colônias x inverso da diluição = UFC/mL
Inóculo
2. Esquematize o processo de diluição e plaqueamento em superfície
3. Expresse os valores encontrados nas placas selecionadas (30 a 300 colônias)
ANEXO
Figura 1 Plaqueamento em superfície (Harley e Prescott, 2002)
INTRODUÇÃO
No método de plaqueamento em profundidade (pour plate), 1,0 mL da diluição
bacteriana é inoculado diretamente na placa de Petri. O meio de cultivo, mantido em
banho-maria a 50 ºC é vertido sobre a amostra, que será misturada, agitando-se
suavemente a placa. Após a solidificação do ágar a placa é incubada na temperatura de
crescimento das bactérias.
Esta metodologia permite o crescimento das colônias dentro e na superfície da
placa de ágar.
Bactérias sensíveis ao calor são destruídas durante a solidificação do ágar, não
formando colônias; essa metodologia tem ainda a desvantagem de não ser aplicável em
métodos diagnósticos, ou seja, quando é necessário identificar uma colônia
característica na superfície do meio.
OBJETIVOS
Analisar a qualidade da água obtidas de diferentes residências na cidade de
Cuiabá-MT, aplicando a técnica de espalhamento em profundidade (pour plate).
MATERIAIS E UTENSÍLIOS
Placas de Petri, ágar nutriente, tubos de diluição (Água peptonada), bico de
Bunsen, pipetas, pipetadores, alça de Drigalski, frascos de coleta de água, tiossulfato de
sódio 10%, banho-maria a 50ºC.
PROCEDIMENTOS
Recolher a água seguindo os procedimentos de coleta (Anexo).
Adicioná-la ao frasco contendo 0,1 mL de tiossulfato de sódio 10%.
Marque os tubos de diluição presentes na estante com os valores da diluição (10-
1, 10
-2, 10
-3, etc. As diluições que serão utilizadas dependerão da natureza da
amostra).
Faça o mesmo com as placas de Petri. Faça duplicata de cada placa.
PRÁTICA 9
CONTAGEM PADRÃO EM PLACA: Pour plate
Agite bem o material recebido (amostra), retire 1,0 mL com pipeta esterilizada e
transfira para o tubo marcado 10-1
. Agite-o.
A partir do tubo 10-1
transfira 1,0 mL utilizando pipeta esterilizada para o tubo
marca 10-2
. Agite. Repita este procedimento até atingir a diluição necessária.
Porções de 1,0 mL de cada diluição preparadas como na aula anterior dever ser
assepticamente colocadas no interior (centro) das mesmas e imediatamente o
meio fundido deve ser adicionado. Mover a placa cuidadosamente num
movimento em forma de 8, várias vezes para homogeneizar.
Após a solidificação do meio na placa, levar à estufa e incubar na posição
invertida.
Contar (calcular a média) e expressar em UFC/mL.
Cálculo e expressão dos resultados
ATIVIDADES
1. Cite as vantagens de utilizar a técnica de espalhamento em profundidade.
2. Esquematize o processo de diluição e plaqueamento em profundidade.
3. Expresse os valores encontrados nas placas selecionadas (30 a 300
colônias).
UFC/mL = nº colônias x inverso da diluição = UFC/mL
Inóculo
ANEXO
Figura 1 Plaqueamento em profundidade (Harley e Prescott, 2002)
INTRODUÇÃO
O método do número mais provável (MNP), também chamada de técnica dos
tubos múltiplos, é outra técnica utilizada para estimar a contagem de alguns tipos de
micro-organismos, como coliformes totais, coliformes termotolerantes, Escherichia coli
e Staphylococcus aureus.
Esse método foi introduzido por volta de 1915, mas muito utilizado até hoje. No
entanto, o método do NMP fornece somente uma estimativa de 95% de probabilidade
de a população bacteriana conter um número de bactérias e que o NMP da tabela é
estatisticamente o número mais provável.
Esta técnica estatística tem como princípio: quanto maior o número de bactérias
em uma amostra maior será o número de diluições necessárias para eliminar totalmente
o crescimento em tubos contendo meios de cultura.
Na técnica do NMP, a amostra a ser analisada, após homogeneização, é
submetida à pelo menos três diluições decimais seriadas. De cada uma dessas diluições,
alíquotas iguais são transferidas para três ou para cinco tubos contendo o meio de
cultura escolhido e um tubo coletor de gás (tubo de Durhan). Todos os tubos são
incubados, e, em seguida, os positivos são identificados. Para E. coli, positividade
significa turvação do meio com produção de gás.
OBJETIVOS
Determinar coliformes totais, coliformes termotolerantes e E. coli em amostra de
água obtida de locais diversos.
MATERIAIS E UTENSÍLIOS
Amostra de água bruta, Tubos de ensaio contendo meio Caldo Lactosado com
Púrpura de Bromocresol, Caldo Lactosado Verde Brilhante Bile a 2%, Caldo EC-MUG
(suplementado com 4-metilumbeliferil-β-Dglicuronídeo), tubos de Durhan, alça de
platina, pipetas 5 e 10 mL, pipetadores, luz ultravioleta .
PROCEDIMENTOS
PRÁTICA 10
TÉCNICA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL: Tubos múltiplos
DETERMINAÇÃO DE COLIFORMES TOTAIS
Teste presuntivo
Identificar 15 tubos, contendo caldo lactosado com púrpura de bromocresol (CL-
PBC), com o volume e/ou diluição da amostra a ser inoculada e dispô-los em
uma estante, em fileiras de 5 tubos.
Homogeneizar a amostra.
Com uma pipeta de 10 mL, transferir 10 mL da amostra para um frasco contendo
90 mL de água de diluição tamponada, antecipadamente identificado. Prepara-se
assim a primeira diluição decimal (10-1
), sendo que 1 mL da mesma corresponde
a 0,1 mL da amostra;
Desprezar a pipeta de 10 mL e, com uma pipeta de 5 mL, inocular 1 mL da
amostra em cada um dos 5 tubos correspondentes a essa quantidade de inóculo;
Homogeneizar a amostra com a primeira diluição (10-1
) agitando vigorosamente
o frasco e, com uma nova pipeta, transferir 10 mL para um frasco contendo 90
mL de água de diluição tamponada, conseguindo-se assim, a segunda diluição
decimal (10-2
), sendo que 1 mL da mesma corresponde a 0,01 mL da amostra;
Proceder dessa maneira na seqüência de diluições desejadas;
Após a inoculação de todos os volumes da amostra e/ou diluições requeridas,
colocar a estante contendo os tubos inoculados em incubadora a 37ºC, durante
24 horas;
Após esse período de incubação, efetuar a primeira leitura de resultados (24
horas). Retirar os tubos com resultado positivo (produção de gás) e anotar os
resultados;
Retornar os tubos com resultado negativo à incubadora, por um período
adicional de 24 horas.
Na segunda leitura (48 horas), os tubos com resultado positivo serão separados e
os negativos, desprezados.
Teste confirmativo
Para a realização do ensaio confirmativo, todos os tubos com resultado positivo
em caldo lactosado com púrpura de bromocresol (CL-PBC) nas leituras de 24 e 48
horas serão submetidos à confirmação imediatamente após as respectivas leituras.
Identificar os tubos contendo caldo lactosado verde brilhante e bile a 2%
(CLVBB) correspondentes a cada tubo de CL-PBC com resultado presuntivo
positivo;
Agitar cada tubo de CL-PBC e com uma alça de platina, inocular o tubo de
CLVBB correspondente, evitando a película superficial que pode se formar no
CL-PBC presuntivo positivo;
Incubar os tubos por 48 horas, a 37ºC;
Proceder à leitura, considerando como teste confirmativo positivo todos os tubos
que apresentarem formação de gás e turvação do meio;
Anotar resultados e calcular o NMP a partir dos dados obtidos.
Determinação de Escherichia coli
Realizada a partir dos tubos positivos de CL-PBC.
Efetuar a marcação de tubos contendo meio EC-MUG (previamente mantidos
em banho-maria a 44,5 ± 0,2ºC durante um mínimo de 30 minutos) com os
números correspondentes a cada tubo CL-PBC positivo;
Agitar bem cada tubo e com uma alça de semeadura, inocular o tubo EC-MUG
correspondente, evitando a película superficial que pode se formar na cultura
presuntiva positiva;
Incubar os tubos EC-MUG inoculados, no máximo até 30 minutos após a
inoculação, em banho-maria 44,5 ± 0,2ºC por 24 horas;
Proceder à leitura, considerando como resultado positivo, todos os tubos que
apresentaram fluorescência azul sob luz ultravioleta (lâmpada 3 a 6w, ondas
longas 365nm).
Cálculo e expressão de resultados
A Tabela 1 apresenta o NMP para várias combinações de resultados positivos e
negativos, quando são inoculados 5 porções de 10 mL, 5 porções de 1 mL e 5 porções
de 0,1 mL da amostra. Para a sua utilização, procuram-se os códigos formados por três
algarismos correspondentes ao número de tubos com resultado positivo em três séries
consecutivas inoculadas. Para a obtenção do NMP de coliformes totais, o código é
composto com resultado positivo no meio Caldo VBB.
Quando são inoculadas 3 séries de 5 tubos, sendo utilizados os volumes
indicados na tabela (10 mL, 1,0 mL e 0,1 mL), o NMP é obtido diretamente na tabela.
Quando são inoculadas 3 séries de 5 tubos, sendo utilizados volumes decimais
diferentes aos indicados na tabela, procura-se o código formado pelo número de tubos
com resultados positivos obtido nas três séries consecutivas inoculadas, verificando-se o
valor de NMP correspondente a ele. O NMP/100 mL será dado através da seguinte
fórmula:
ATIVIDADES
1. Expresse os resultados obtidos nas análises
NMP correspondente ao código × _______10__________
Maior volume inoculado
ANEXO
Tabela 1 Cálculo do número mais provável (NMP)
Índice de N.M.P. e Limites de Confiança de 95% para várias combinações de
resultados positivos e negativos, quando são utilizadas 5 porções de 10 mL, 5 porções
de 1mL, 5 porções de 0,1 mL
Nº de tubos que apresentam
reação positiva quando são
utilizados
Índice de
N.N.P.
Limites de confiança 95 %
5 tubos
de 10 mL
5 tubos
de 1 mL
5 tubos de
0,1 mL
por 100 mL
Inferior
Superior
0 0 0 <2 - -
0 0 1 2 <1 10
0 1 0 2 <1 10
0 2 0 4 <1 13
1 0 0 2 <1 11
1 0 1 4 1 15
1 1 0 4 1 15
1 1 1 6 2 18
1 2 0 6 2 18
2 0 0 4 1 17
2 0 1 7 2 20
2 1 0 7 2 21
2 1 1 9 3 24
2 2 0 9 3 25
2 3 0 12 5 29
3 0 0 8 3 24
3 0 1 11 4 29
3 1 0 11 4 29
3 1 1 14 6 35
3 2 0 14 6 35
3 2 1 17 7 40
4 0 0 13 5 36
4 0 1 17 7 45
4 1 0 17 7 46
4 1 1 21 9 55
4 1 2 26 12 63
4 2 0 22 9 56
4 2 1 26 12 65
4 3 0 27 12 67
4 3 1 33 15 77
4 4 0 34 16 80
5 0 0 23 9 86
5 0 1 30 10 110
5 0 2 40 20 140
5 1 0 30 10 120
5 1 1 50 20 150
5 1 2 60 30 160
5 2 0 50 20 170
5 2 1 70 30 210
5 2 2 90 40 250
5 3 0 60 30 250
5 3 1 110 40 300
5 3 2 140 60 360
5 3 3 170 80 410
5 4 0 130 50 390
5 4 1 170 70 480
5 4 2 220 100 560
5 4 3 260 120 690
5 4 4 350 160 820
5 5 0 240 100 940
5 5 1 300 100 1300
5 5 2 500 200 2000
5 5 3 900 300 2900
5 5 4 1600 600 5300
5 5 5 >1600 - -
INTRODUÇÃO
A técnica de membrana filtrante (MF) é um método rápido e preciso para
isolamento e identificação de colônias de bactérias. Esta técnica é recomendada pelo
Standard of Methods for the Examination of Water and Wasterwater, referência
internacional em análises em águas.
Na técnica de MF, volumes conhecidos da amostra são filtrados através de
membranas com uma porosidade 0,45µm, onde as bactérias ficam retidas. Essas
membranas são dispostas sobre meios de cultura sólidos preparados em placas de Petri e
incubadas; assim, as bactérias crescerão na superfície das membranas formando
colônias discretas.
A seletividade do meio de cultura propiciará a identificação de colônias típicas
da bactéria procurada, por características morfológicas e de cor. A densidade de
bactérias é obtida pela contagem das colônias típicas, e os resultados são expressos em
unidades formadoras de colônias (UFC)/100 mL.
O volume da amostra a ser filtrada depende da qualidade presumível da água.
Para águas de boa qualidade, por exemplo, águas tratadas, devem-se filtrar 100 mL da
amostra; em contrapartida, amostras de águas de pior qualidade exigirão diluições, caso
contrário, o número de colônias será tão elevado que dificultará a contagem ou
prejudicará o crescimento das bactérias em colônias discretas.
Em geral, recomenda-se que a contagem seja feita em membranas com 20-80
colônias, nunca com mais de 200. Portanto, na análise de água de qualidade
desconhecida deve-se filtrar diferentes diluições da amostra, sempre em réplicas.
OB JETIVO
Realizar análises bacteriológicas em amostras ambientais através da técnica de
membrana filtrante para determinar os principais indicadores utilizados no controle de
qualidade de águas.
MATERIAIS E UTENSÍLIOS
Amostra de água bruta, porta-filtro adaptados ao frasco de filtração, Kitassato de
segurança, placas de Petri contendo meio Ágar M-Endo Les (coliformes totais), Ágar
PRÁTICA 11
TÉCNICA DE MEMBRANA FILTRANTE
m-FC (coliformes termotolerantes) e Ágar Chromocult (coliformes totais e Escherichia
coli), pinças, provetas, membranas filtrantes, água de diluição tamponada estéril
(Tampão Fosfato com Cloreto de Magnésio).
PROCEDIMENTO
1a Etapa – Identificação da amostra, definir os volumes a serem filtrados em
função de sua procedência
Tabela 1 Seleção de volumes recomendados para filtração de acordo com a procedência
da amostra.
Fonte: American Public Health Association (APHA)
Identificar as placas de Petri com o número da amostra, volume da amostra a ser
filtrado, identificação do grupo e data.
2a Etapa – Filtração da amostra
Homogeneizar a amostra;
Distribuir os volumes requeridos da amostra em provetas estéreis ou diretamente
nos porta-filtro graduados para efetuar a filtração;
Retirar a parte superior do porta-filtro e, com as extremidades de uma pinça
flambada e resfriada, colocar a membrana filtrante estéril, com a face
quadriculada voltada para cima, centralizando-a sobre a parte inferior do porta-
filtro;
Acoplar a parte superior do porta-filtro à parte inferior, tomando cuidado para
não danificar a membrana;
Verter cuidadosamente o volume da amostra a ser examinada no porta-filtro,
evitando que a água respingue sobre as bordas superiores do mesmo;
Ligar a bomba de vácuo e proceder à filtração;
Volumes a serem filtrados Procedência da amostra 100 50 10 1 0,1
Águas tratadas Águas de piscinas Águas de poços, fontes, nascentes Águas de lagos, reservatórios Mananciais que abastecem ETA’s
X X X X
X X
X X X
X
X
Após a filtração, enxaguar o porta-filtro duas vezes, com porções de
aproximadamente 20 a 30 mL de água de diluição tamponada estéril, para evitar
a retenção de alguma bactéria nas paredes internas do mesmo;
Desligar a fonte de vácuo ao finalizar a operação;
Separar a parte superior do porta-filtro e, com uma pinça cujas extremidades
foram flambadas e resfriadas, retirar, com cuidado, a membrana. Acoplar
novamente a parte superior do porta-filtro à parte inferior;
Obedecendo aos cuidados de assepsia, colocar cuidadosamente a membrana,
com a superfície quadriculada voltada para cima, na superfície do meio de
cultura contido na placa de Petri.
Seguir as seguintes condições de incubação:
Contagem Meio de cultura Condições de incubação
Coliformes totais Ágar M-Endo Les 35ºC / 24 horas
Coliformes termotolerantes Ágar m-FC 44,5ºC / 24 horas
Coliformes totais e
Escherichia coli
Ágar Chromocult 35ºC / 24 horas
Após o período de incubação, efetuar a contagem de colônias típicas nos
diversos meios:
Meio de cultura Contagem Características das colônias
Ágar M-Endo Les Coliformes totais Róseas a vermelho escuras, com
brilho verde metálico ou brilho
dourado
Ágar m-FC Coliformes
termotolerantes
Azuis
Ágar Chromocult Coliformes totais Rosadas
Ágar Chromocult Escherichia coli Azuis escuras ou violeta
3a Etapa – Leitura
Os limites aceitáveis para a contagem de colônias típicas de coliformes totais em
M-Endo Ágar Les ou Ágar M-Endo se situam entre 20 a 80, sendo que a
contagem total (colônias típicas e atípicas) deve ser inferior a 200;
No caso de terem sido filtrados volumes diferentes de 100 mL, selecionar para
leitura apenas aquele (s) que tiver (em) fornecido contagem de colônias dentro
dos limites aceitáveis;
Se a contagem em todos os volumes filtrados for inferior a 20 colônias típicas,
não considerar o limite mínimo e efetuar a leitura em todas as placas
correspondentes aos volumes filtrados da amostra
Nos casos em que todos os volumes filtrados fornecerem contagem superiores a
80, mas for possível a contagem, efetuar a contagem no menor desses volumes;
Quando todos os volumes filtrados não apresentarem crescimento bacteriano,
expressar o resultado como: ausência de coliformes ou, <1 coliformes por 100
mL;
Quando a estimativa visual do total de colônias (típicas e atípicas) for superior a
200, ou quando houver crescimento em toda a área de filtração da membrana,
sem colônias bem definidas (crescimento confluente), a contagem não é
efetuada, sendo requerido o procedimento de confirmação da presença de
coliformes;
Ocasionalmente, as bactérias do grupo coliforme podem produzir colônias
atípicas. Nos casos em que ocorrem apenas colônias atípicas em grande número,
é recomendável efetuar a contagem e posterior confirmação.
Cálculo e expressão de resultados
Calcular a densidade de coliformes totais a partir da contagem de colônias
típicas em M-Endo Ágar Les ou m-Endo em 100 ml da amostra filtrada, através da
aplicação da seguinte fórmula:
Nº de colônias de coliformes totais/ 100 mL = nº de colônias típicas × 100
Volume filtrado da amostra (mL)
Se as contagens obtidas forem inferiores aos limites ideais, considerar as
contagens efetuadas em todas as placas (incluindo as que forem igual a zero)
correspondentes aos volumes filtrados e calcular a densidade em 100 mL através da
seguinte fórmula:
ATIVIDADES
1. Expresse os valores encontrados
Nº de colônias de coliformes totais/ 100 mL = Soma das colônias típicas × 100
Soma dos volumes correspondentes às contagens (mL)
INTRODUÇÃO
Mais recentemente desenvolveram-se métodos baseados nas atividades
enzimáticas específicas dos coliformes (ß-galactosidade) e de E. coli (ß-glucoronidase).
Os meios de cultura contêm nutrientes indicadores (substrato cromogênico) que,
hidrolisados pelas enzimas específicas dos coliformes e/ou E. coli, provocam uma
mudança de cor no meio, no caso de coliformes, ou produzem fluorescência quando a
amostra é exposta à luz ultravioleta, no caso de E. coli. Estes substratos cromogênicos,
quando hidrolisados pelas enzimas dos coliformes e de E. coli, liberam,
respectivamente, O-nitrofenol (de cor amarela) e 4-metil-unberliferona (fuorescente).
O método pode ser aplicado tanto em análises qualitativas, como quantitativas.
Além da maior precisão, outra grande vantagem é o tempo de resposta, já que a
determinação simultânea de coliformes (totais) e de E. coli é efetuada após incubação
das amostras a 37 ºC por 24 horas, não havendo necessidade de ensaios confirmativos.
OBJETIVOS
Determinar coliformes totais e Escherichia coli em amostra de água bruta,
através da técnica do substrato cromogênico e fluorogênico pela técnica de tubos
múltiplos e pelo método de presença-ausência.
MATERIAIS E UTENSÍLIOS
Amostra de água bruta, Substrato cromogênico/fluorogênico adquirido
comercialmente (Colilert), cartelas Quanti-Tray®, Frascos contendo água de diluição
tamponada, seladora.
PROCEDIMENTOS
Método quantitativo
Selecionar a diluição adequada para o teste.
Abrir, assepticamente, um envelope contendo a quantidade pré-pesada do
substrato (envelope adquirido comercialmente), requerida para o teste.
Adicionar o conteúdo do mesmo a 100 mL da amostra de água, contida em
frasco estéril.
PRÁTICA 12
MÉTODO DO SUBSTRATO CROMOGÊNICO/FLUOROGÊNICO
Fechar o recipiente e homogeneizar bem para sua completa dissolução.
Coloque a amostra na cartela Quality-Tray e sele-a
Incubar por 24 horas a 37 ºC.
Método de presença-ausência (qualitativo)
Abrir, assepticamente, um envelope contendo a quantidade pré-pesada do
substrato (envelope adquirido comercialmente), requerida para o teste.
Adicionar o conteúdo do mesmo a 100 mL da amostra de água, contida em
frasco estéril.
Fechar o recipiente e homogeneizar bem para sua completa dissolução.
Incubar por 24 horas a 37 ºC.
Leitura dos resultados
Coliformes Totais: Considerar resultado positivo a coloração amarela nos frascos e na
cartela.
Escherichia coli: Após a leitura dos resultados para coliforme totais, efetuar a
exposição do frasco e da cartela à luz ultravioleta, a uma distância de 6 a 8 cm. Se E.
coli estiver presente, uma fluorescência azul brilhante é observada.
Cálculo e expressão dos resultados
Método quantitativo
Relatar o resultado com NMP/100 mL de coliformes totais e NMP/100 mL de E.
coli. Utilizar as tabelas de NMP específicas.
Método de presença-ausência (qualitativo)
Presença (ou ausência) de coliformes totais por 100 mL.
Presença (ou ausência) de E. coli por 100 mL.
ATIVIDADES
1. Expresse os resultados quantitativo e qualitativo.
INTRODUÇÃO
A higienização é utilizada com o objetivo de preservar a qualidade
microbiológica de vários ambientes ou alimentos. Pode ocorrer em duas etapas distintas,
onde a primeira corresponde à limpeza que, tem como objetivo principal à remoção de
resíduos orgânicos e minerais aderidos à superfície, constituídos principalmente por
proteínas, gorduras e sais minerais, e depois, a sanificação, para eliminar micro-
organismos patogênicos e reduzir o número de alteradores em níveis aceitáveis.
O procedimento de limpeza pode remover 90% ou mais dos micro-organismos
associados à superfície, porém não possui a capacidade de matá-los, o que pode
posteriormente ocasionar a adesão de tais micro-organismos em outras superfícies. A
sanificação é definida como a operação que visa à destruição de micro-organismos em
níveis toleráveis. Os sanificantes físicos ou químicos eliminam células vegetativas de
micro-organismos de importância para a saúde pública e outros não patogênicos
encontrados nas superfícies de equipamentos, utensílios, manipuladores e dos
ambientes.
Na sanificação por meios físicos emprega-se calor (vapor; água quente) e
radiação ultravioleta, enquanto que na sanificação por agentes químicos utilizam-se
compostos clorados, iodóforos, composto quartenário de amônia, ácido peracético,
peróxido de hidrogênio, ou seja, utilizam-se desde ácidos orgânicos até agentes
umectantes complexos.
A redução do número de microrganismos quando se utilizam sanificantes
químicos depende, entre outras coisas, das propriedades microbicidas do agente, da
concentração, da temperatura e do pH, bem como do grau de contato entre o sanificante
e os microrganismos, sendo que esse pode ser conseguido por agitação, turbulência (uso
de ultra-som) e baixa tensão superficial, vale ressaltar, que os vários microrganismos
apresentam resistência diferente aos esterilizantes químicos.
A determinação do sanificante eficiente é freqüentemente realizada nos testes de
suspensão e ocasionalmente por testes baseados na superfície. Os testes de suspensão
têm uma variedade de benefícios, como por exemplo, eles são relativamente simples e
não requerem equipamentos especializados e extensos no laboratório, além de possuir
mão-de-obra barata. Dentro dos testes metodológicos é possível testar uma diversidade
PRÁTICA 13
CONTROLE DE BIOFILME MICROBIANO: Agentes químicos
PRÁTICA 2
PREPARO DE MEIO DE CULTURA
de variáveis incluindo o tempo de contato, temperatura, tipos de microrganismos e
superfícies de interferência. Porém, o maior problema, é que eles não refletem
necessariamente condições de uso.
OBJETIVOS
Verificar a eficiência de agentes químicos sobre o biofilme.
EQUIPAMENTOS E UTENSÍLIOS
Pipetas, bico de Bunsen, tubos de ensaio com água peptonada, placas com Ágar
nutriente, caldo nutriente, placas de Petri estéril, cepas padrão de Escherichia coli e
Bacillus subtilis, cupons de diferentes materiais, swabs, hipoclorito de sódio 2% , ácido
peracético 0,2%.
PROCEDIMENTO
Adesão das células bacterianas
Adicionar em placas de Petri de 140 mm de dimensão, os cupons, 60 mL de
caldo nutriente e 1 mL de cada cultura.
Incubar a 37 ºC por 5 dias.
Enumeraçã das células aderidas
Retirar com auxilio de uma pinça um cupom, lavá-lo em água destilada estéril,
para a eliminação de células não aderidas;
Remover o biofilme utilizando-se swab padronizado esterilizado.
Transferir os swabs para tubos contendo água peptonada 0,1% (v/v), sendo, em
seguida, agitados em vórtex, por 2 minutos.
Promover diluição seriada;
Empregar a técnica de espalhamento em superfície em caldo nutriente.
Incubar as placas a 37 ºC, por, aproximadamente, 24 horas, sendo realizada, ao
final desse período, a contagem padrão em placas, expressa em UFC/cm2
Sanificação
Retirar um cupom da placa de Petri,
Transferí-lo para 10 mL de solução sanificante e movimentar suavemente, para
melhor contato do agente químico com o biofilme, durante 15 minutos, à
temperatura ambiente;
Enxaguar os cupons em água destilada estéril;
Realizar esfregaço com swabs estéreis;
Transferir os swabs para tubos contendo água peptonada 0,1% (v/v), sendo, em
seguida, agitados em vórtex, por 2 minutos.
Promover diluição seriada;
Empregar a técnica de espalhamento em superfície em caldo nutriente.
Incubar as placas a 37 ºC, por, aproximadamente, 24 horas, sendo realizada, ao
final desse período, a contagem padrão em placas, expressa em UFC/cm2
ATIVIDADES
1. Qual o tempo mínimo necessário para matar os micro-organismos, utilizando os
agentes químicos?
2. Expresse os resultados obtidos.
BLACK, J. G. Microbiologia, fundamentos e perspectivas. 4. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2002, 829 p.
BRASIL. Vigilância e controle da qualidade da água para consumo humano/ Ministério
da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde. – Brasília: Ministério da Saúde, 2006. 212
p.
HARLEY, J. H.; PRESCOTT, L. M. Laboratory exercises in microbiology. 1. ed.
2002, 466p.
MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Microbiologia do Brock. 10 ed.
São Paulo: Printice Hall, 2004, 608 p.
PELCZAR Jr, M. J.; CHAN, E. C. S; KRIEG, N. R. Microbiologia – conceitos e
aplicações. 2 ed. São Paulo: Pearson Education do Brasil, vol. 1 e 2. 1996.
REFERÊNCIAS
ANEXO Preparo de meios e reagentes
Água de Diluição (Tampão Fosfato com Cloreto de Magnésio)
Solução A (Estoque)
KH2PO4 ________________ 34,0g
Água destilada ___________ completar para 1 litro
pH ____________________ 7,2 ± 0,2
Solução B (Cloreto de magnésio)
Cloreto de magnésio (MgCl2.6H2O) _______ 81,1g
Água destilada _______________________ 1 litro
Água de diluição
Solução A (estoque) ___________ 1,25mL
Solução B (MgCl2) ____________ 5,00 ml
Água destilada _______________ completar para 1 litro
Caldo Lactosado com Púrpura de Bromocresol (CL-PBC) – teste presuntivo
Extrato de carne _________ 3,0g
Peptona _______________ 5,0g
Lactose _______________ 5,0g
Púrpura de bromocresol
(1,0 mL da solução 1%) __ 0,01g
Água destilada _________ 1 litro
pH __________________ 6,9 ± 0,2
Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VBB) – teste confirmativo
Bile de boi __________________ 20,0g
Peptona ____________________ 10,0g
Lactose _____________________ 10,0g
Verde brilhante
ANEXO
(13,3ml da solução aquosa 0,1%)__ 0,0133g
Água destilada ________________ 1 litro
pH _________________________ 7,2 ± 0,2
Caldo E. coli com MUG
Triptose ____________________ 20,0g
Lactose _____________________ 5,0g
Sais biliares nº3 ______________ 1,5g
Fosfato dipotássico (K2HPO4) ___ 4,0g
Fosfato monopatássico (KH2PO4)_ 1,5g
Cloreto de sódio ______________ 5,0g
Água destilada ________________ 1 litro
4-metilumbeliferil-β-Dglicuronídeo_ 50 mg
pH _________________________ 6,0 ± 0,2
Ágar Cetrimide
Hidrolisado pancreático de gelatina ______ 20,0g
Cloreto de magnésio __________________ 1,4 g
Sulfato de potássio ___________________ 10,0g
Glicerol ____________________________ 10,0 mL
Cetrimide __________________________ 0,3g
Ágar ______________________________ 15,0g
Ágar King B
Peptona ______________ 20,0g
MgSO4 . 7H2O ________ 1,5g
K2HPO4 _____________ 1,5g
Glicerol ______________ 10 ml
Ágar King B __________ 15g
Soluções de corantes para a coloração de Gram
Cristal Violeta
Solução A:
Cristal violeta (90% pureza) _________ 2,0g
Etanol __________________________ 20,0 mL
Solução B:
Oxalato de amônio monohidratado ____ 0,2g
Água destilada ____________________ 20,0 mL
Misturar as soluções A e B, deixar de repouso por 24 horas e filtrar em papel de filtro
comum. Estocar em frasco escuro.
Solução de iodo (Lugol)
Iodo ____________________________ 1,0g
Iodeto de potássio _________________ 2,0g
Água destilada ____________________ 300,0 mL
Colocar o iodeto de potássio num almofariz, adicionar o iodo e homogeneizar com o
pistilo. Adicionar, consecutivamente, porções de 1 mL, 5 mL e 10 mL de água
destilada, homogeneizando a solução após cada adição. Em seguida, transferir a solução
para um frasco escuro, lavando o almofariz e pistilo com o restante da água destilada.
Safranina (contra-corante)
Safranina _________________________ 0,25g
Etanol 95% _______________________ 10,0 mL
Água destilada ____________________ 100,0 mL
Dissolver a safranina no álcool e adicionar a solução resultante aos 100,0 mL de água
destilada.