UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS

DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045

Trabalho realizado pela Médica Veterinária MSc Maria Tereza Barreto Guedes sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e

Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.

RADIOIMUNOENSAIOS (RIA)

CARACTERÍSTICAS GERAIS

• 1959 Berson e Yalow – primeiro RIA para quantificação de insulina.

• O RIA foi a primeira técnica imunológica padronizada capaz de detectar e quantificar substâncias da ordem de nano a picogramas.

• Torna-se então possível determinar qualquer tipo de molécula biológica, desde que haja um receptor específico e que a molécula biológica possa ser marcada.

CARACTERÍSTICAS GERAIS

o DEFINIÇÃO

• O termo radioimunoensaio (RIA) é mais empregado em ensaios com antígenos marcados.

• O termo imunorradiométrico (IRMA) é utilizado em ensaios com anticorpos marcados.

CARACTERÍSTICAS GERAIS

• Apresenta alta sensibilidade que é conferida pela detecção radioativa.

• O RIA também apresenta elevada especificidade.

• Graças à sua especificidade, os ensaios podem acontecer diretamente no líquido biológico.

• Por causa da sua sensibilidade, o volume de amostra pode ser menor.

CARACTERÍSTICAS GERAIS

o Vantagens • Método muito sensível,

específico e de alta afinidade.

• Baixo custo.

• Requer pouca amostra.

• Rápido.

CARACTERÍSTICAS GERAISo Desvantagens• Instabilidade dos radioisótopos.

• Risco operacional.

• Necessidades de medidas

especiais.

• Elevado custo de biossegurança

e problemas com o descarte de

material.

o Alta sensibilidade → permite dosagem de substâncias não encontradas em concentrações suficientes para serem percebidas por outras técnicas.

• polipeptídios, catecolaminas, esteróides, antibióticos, hormônios tireoidianos, proteínas, vitaminas, drogas e outras.

• vírus da hepatite B.• marcador tumoral.

APLICAÇÕES

PRINCÍPIOS

Reação de competição por um receptor comum entre uma substância a ser determinada e a mesma substância marcada radioisotopicamente.

PRINCÍPIO GERAL

Componentes• Anticorpo radioativo• Antígeno radioativo• Amostra a ser

testada• Leitor radiométrico

Leitor radiométrico

o 125 I • É o radioisótopo mais comumente empregado.• Meia vida de 57,5 dias.• Liga-se facilmente aos resíduos de tirosina das proteínas.• Produz radiação Υ.• Estabilidade menor que 3H.• Dosagem de hormônios protéicos.

o Trítio (3H) •Produz radiação β .• Dosagem de esteróides.

o Carbono 14

CARACTERÍSTICAS DOS MARCADORES

TIPOS DE RIA PARA QUANTIFICAÇÃO DE Ag

o De competição com Ag marcado.

o De competição com Ac marcado.

o Sanduíche ou captura de Ag.

o Para detecção de IgE:

• Paper Radioimmunosorbent Test (PRIST).

• Radioallergosorbent Test (RAST).

TIPOS DE RIA

Inicialmente, uma quantidade conhecida de anticorpos específicos é colocada na fase sólida.

YEm seguida, adiciona-se o antígeno marcado com 125 I.

Uma amostra de soro de um paciente suspeito é então acrescentada.

O antígeno, se presente no soro, compete com o antígeno radioativo pelos sítios de ligação nos anticorpos.

A quantificação é feita em aparelho específico para a leitura de radioatividade. A concentração das moléculas antigênicas presentes na amostra é inversamente proporcional à leitura de radioatividade.

DE COMPETIÇÃO COM Ag MARCADO

Y

Y

Antígeno marcado Antígeno do soro Y Anticorpo específico

Inicialmente, antígenos são fixados na fase sólida.

A seguir, acrescenta-se a amostra do paciente.

Os anticorpos específicos e marcados com o radioisótopo são acrescentados.

Se a amostra for positiva, haverá a formação do complexo Ag/Ac com o Ag do soro.

Quanto maior a quantidade de antígeno na amostra, maior será a ligação destes aos anticorpos, formando imunocomplexos, que serão retirados por lavagem e assim reduzindo a leitura da radioatividade.

DE COMPETIÇÃO COM Ac MARCADO

Antígeno marcado Antígeno do soro Y Anticorpo marcado

Y

YY

Teste realizado em duas etapas:

Primeira etapa:1) Fixação de Acs não marcados na fase

sólida.

4) Deverá ocorrer uma primeira lavagem para eliminação de componentes não específicos.

Segunda etapa:1) Acrescenta-se um segundo anticorpo

específico e marcado, que formará o “sanduíche”.

2) A formação do imunocomplexo será revelada por este segundo anticorpo.

SANDUÍCHE OU CAPTURA DE Ag

2) Adição da amostra (que contém Ag específicos contra o Ac fixado e outros componentes não específicos).

3) Os Ac capturam os Ag específicos da amostra.

Antígeno do soro Y Ac marcado Y Ac não marcado Componentes não específicos

Y

YY

Y

TIPOS DE RIA PARA DETECÇÃO DE IgE

Anticorpos anti-IgE e não marcados são fixados na fase sólida.

Acrescenta-se o soro a ser pesquisado para a presença de IgE. Em caso positivo, haverá a união do anticorpo IgE + anticorpo anti-IgE.

Após lavagem para retirada do excesso de Ac não ligado, acrescenta-se anticorpos anti-IgE marcados com isótopo para que haja a revelação da amostra.Após lavagem, procede-se com a leitura. A determinação da concentração de IgE total presente na amostra ocorrerá através de cálculo que relacionará os valores obtidos com uma determinada curva padrão.

PAPER RADIOIMMUNOSORBENT TEST (PRIST)

Y Ag IgE da amostra Y Ac anti-IgE marcado Y Ac anti-IgE não marcado

YY YYY YY

YY

O alérgeno específico para o Ac IgE pesquisado é previamente fixado ao fundo do tubo na fase sólida.

Acrescenta-se soro do paciente. Havendo presença de IgE específica ao alérgeno em questão, haverá a formação do complexo Ag/Ac.

Acrescenta-se o anticorpo anti-IgE marcado, e este se liga ao Ac IgE pesquisado.

A reação então será revelada através do segundo anticorpo.

RADIOALLERGOSORBENT TEST (RAST)

YY

Alérgeno Y IgE do soro do paciente Y Ac anti-IgE marcado

YY