RADICAIS LIVRES

BONS, MAUS E NATURAIS

LINUS PAULING 1954 Prêmio Nobel de Química.

Dedicou-se ao estudo dos RADICAIS LIVRES: responsáveis

pelo aparecimento de doenças e pelo envelhecimento do

organismo.

(1901-1994)

Base das ligações

covalentes entre os

átomos

1970 Uso de megadoses de vitamina C.

1000 mg de vitamina C: reduziria 45% dos resfriados.

Ingestão diária recomendada é de 60mg.

Linus :12000 mg/dia

As teorias de Pauling:

Medicina

Ortomolecular

Equilíbrio químico do

organismo

Vitaminas , minerais e

nutrientes

Existe inúmeros grupos de pesquisa que estudam os

radicais livres:

No Brasil:

Associação dos radicais livres com doenças;

Compostos naturais com propriedades

antioxidantes;

Síntese de compostos antioxidantes .

O QUE É RADICAL LIVRE?

É uma espécie química que possui um elétron

desemparelhado, ou seja, ocupando um orbital

atômico ou molecular sozinho.

Molécula altamente instável e reativa, meia vida muito curta tenta estabilizar-se....

Retirando elétrons, de moléculas estáveis...

Integrantes da estrutura celular...

Lipídios, Proteínas e DNA

Representação dos orbitais mais externos

RADICAL

LIVRE

composto

“normal”:

ESTÁVEL

MOLÉCULA

ESTÁVEL

MOLÉCULA

INSTÁVEL

Exemplo:Formação do radical livre superóxido (O2-.), que é

derivado do oxigênio molecular.

1. O O2 é composto por dois átomos de O:

2. Para formar o O2, os 2 elétrons solitários do subnível p de um O

fazem intercâmbio com os 2 elétrons de outro O, formando um

composto estável com 12 elétrons na última camada (L).

3. Quando no metabolismo normal ocorrer uma redução do

O2, forma o radical superóxido (O2-.), considerado instável por

possuir número ímpar (13) de elétrons na última camada L:

Produzidos:

-Quebra de

ligações

covalentes.

Nos

sistemas

biológicos

resultam de

reações de

óxido-

redução.

Todo radical livre de oxigênio é uma ESPÉCIE REATIVA DE OXIGÊNIO, mas nem toda espécie

reativa de oxigênio é um radical livre de oxigênio!!!

O

Cl

Br

N

Radical mais comum e abundante da célula

Primeira das espécies formadas pela redução do oxigênio por um

único elétron, pode agir como oxidante ou como redutor, dando

origem a outras espécies reativas.

Produzido pela cadeia de transporte de elétrons ou por ação de

células fagocitárias (neutrófilos, monócitos, e macrófagos) para

defesa bactericida.

Altamente reativo, meia vida de milissegundos e, em razão disso,

dificilmente atravessa as membranas, não pode se difundir para

longe do sítio de origem.

Radical Superóxido (O2•-)

O2 + e- O2•-

Formado principalmente na matriz mitocondrial, durante o

processo de redução do oxigênio, ou pela dismutação do

radical superóxido pela enzima SOD.

Metabólito do oxigênio extremamente deletério, porque

participa da reação que produz o OH. em presença de

metais como o Ferro.

O H2O2 é muito difusível dentro e entre as células in vivo

Peróxido de hidrogênio (H2O2)

2 O2•-

+ 2H+ H2O2 + O2

Experimento

H2O2 não reage

diretamente com DNA

H2O2 permeia membranas

celulares e gera radical

OH. in situ em razão dos

metais de transição

ligados ao DNA

Quelante impede íons

metálicos participe

reações óxido-redução

Espécie mais reativa e mais letal, tem uma meia-vida

extremamente curta (10-9), reagindo rapidamente com os

alvos celulares + próximos lesar DNA, proteínas,

carboidratos e lipídios.

Radical hidroxila (OH.)

Modificações de

bases purínicas e

pirimidínicas,

levando à

inativação ou

mutação do DNA.

Pode inativar

várias proteínas

ao oxidar seus

grupos sulfidrilas

(-SH) a pontes

dissulfeto (-SS).

Reações importantes p/ formação do

Radical hidroxila (OH.)

Não há enzima que catalisa a sua remoção capacidade

maior de lesar as células.

Radical peroxila (LOO.) e radical alcoxila (LO.)

São formados durante a decomposição de

peróxidos orgânicos e reações de carbono

radicalar com oxigênio

PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA

METAIS

Quais são as fontes de EROs?

FONTES ENDÓGENAS

São produzidos em organismos AERÓBIOS tanto

em situações NORMAIS quanto PATOLÓGICAS.

Respiração

aeróbia Peroxissomos

Citocromo P-450

Inflamação

Mitocôndria

Mitocôndrias 90% do

oxigênio molecular

consumido pelos

organismos aeróbios

ATP produzido

durante o metabolismo

dos nutrientes

Estágio 1: moléculas combustíveis são

degradadas levando a formação de

Acetil- CoA.

Estágio 2: O acetil CoA entra no ciclo do

ácido citrico onde é oxidado

enzimaticamente.

A energia liberada das oxidações é

conservada nos transportadores de elétrons

reduzidos NADH e FADH2.

Estágio 3: As coenzimas são oxidadas e os

elétrons conduzidos por uma cadeia

transportadora de elétrons até o

oxigênio(aceptor final de elétrons ) que é

completamente reduzido a água . Durante a

passagem desses elétrons uma grande

quantidade de energia é liberada e

conservada na forma de ATP,:

Fosforilação oxidativa. Manter processos

vitais

Estágio da respiração celular

Principal fonte fisiológica de EROS.

Do O2 consumido na CR 95 a 98% é reduzido por 4e- a

H2O, através de etapas subseqüentes de reduções parciais

por um e-.

2 a 5% do O2 é reduzido de forma incompleta por um só

elétron, formando o radical superóxido.

Cadeia respiratória

2 a 5%

95 a 98%

Cadeia respiratória

Provável sítio de formação do radical O2.- devido

ao vazamento de elétrons a nível da coenzima Q, entre

o complexo I e complexo III da CR.

A evidências de formação de outras EROs: peróxido de

hidrogênio e radical hidroxila.

Camundongos nocautes para expressão de Cu,Zn-

SOD1sensível aos oxidantes;

Privados de Mn-SODmorrem 10 dias após o nascimento

Um adulto de 70 kg em repouso :

353 litros de oxigênio/dia =14,7 mol de oxigênio/dia

1% do oxigênio for reduzido para superóxido= 0,147

mol de superóxido/dia, ou 1,7 kg em um ano.

Dieta rica em calorias, Mitocôndrias e

radicais livres A energia que a célula precisa para

exercer as suas funções é retirada dos

nutrientes ingeridos

Enquanto houver nutrientes à

disposição ela continua a trabalhar e

produzir Radicais livres

Desgaste mitocondrial

Envelhecimento

ENVELHECIMENTO NORMAL consequência do acúmulo

em biomoléculas de lesões promovidas pelos EROS durante

o metabolismo normal.

OH.....

Responsável pela

detoxificação de drogas podem

converter-se em intermediários

reativos que iniciam a

peroxidação lipídica.

Catalisa reações que geram

O2.- mediante mecanismos

dependentes de NADPH.

Citocromo P450

Condições p/ formação de RL

envolve íons de metais de

transição, oxigênio e reações de

transferência de elétrons

Utiliza oxigênio para hidroxilação

de seus substratos aumentando

sua polaridade, com o fim de

torná-los mais solúveis e ajudar

na sua excreção.

-

Citocromo P450

Neutrófilos e macrófagos

combatem os

microorganismos invasores

pela síntese de ERO.

Possuem a enzima NADPH

oxidase, que reduz 100% do O

ao radical O2.- que em

presença de Fe2+ transforma-

se no radical OH.

Quando ativados por proteínas

específicas que sinalizam o

organismo invasor:

Aceleração do consumo de O2

“EXPLOSÃO RESPIRATÓRIA”

Fagocitose

Phox = “phagocyte oxidase”

Defesa contra invasores

Herbicidas;

Antibióticos;

Poluentes do ar;

Raios X, ;

Raios UV;

Cigarro;

Álcool;

Alimentos

FONTES EXÓGENAS

Radiação A incidência da radiação UV, raios X e gama produz o radical

OH. nas células da pele.

Papel importante na carcinogênese

EROs depletam os sistemas de defesa antioxidantes;

CIGARRO

Fumaça do cigarro mistura

complexa (4000 compostos)

Cada tragada produz cerca de

1014 EROs;

Radicais superóxido, hidroxila,

peróxido de nitrogênio,

oxigênio singlete, óxido nítrico,

radical alcoxila, peroxila,

peroxinitrito e dióxido de

nitrogênio.

A produção contínua de EROs durante os processos

metabólicos levou ao desenvolvimento de muitos mecanismos

de defesa antioxidante para limitar os níveis intracelulares e

impedir a indução de danos.

Os seres humanos só conseguem tolerar o oxigênio porque,

no processo evolutivo, nossos ancestrais desenvolveram

poderosos mecanismos que minimizam seus efeitos tóxicos.

Antioxidantes Neutralizam as EROs gerados pelo

metabolismo celular ou por fontes

exógenas, impedindo o ataque

sobre os lipídios, as proteínas e o

DNA, evitando a formação de

lesões e perda da integridade

celular.

•Os radicais livres se formam em condições fisiológicas

em proporções controladas por mecanismos de defesa

celular;

Em condições patológicas a produção de RL pode

aumentar substancialmente.

ESTRESSE OXIDATIVO

Estresse oxidativo = Estado de Desequilíbrio =

Doença

Pode resultar de

uma situação em

que ocorre uma

diminuição nos

níveis das defesas

antioxidantes, uma

elevada produção

de EROs ou uma

combinação de

ambos os fatores; EROs: O2

- , H2O2 , OH-

Antioxidantes

Esse quadro de estresse oxidativo pode causar danos a todas

as estruturas celulares, incluindo DNA, lipídios e proteínas;

Distúrbios do equilíbrio entre a formação e a remoção das

espécies reativas são importantes na patogênese de muitas

doenças, como por exemplo, no câncer, diabetes, Alzheimer,

Parkinson, hipertensão.

Biomarcadores de estresse

oxidativo

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PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA

Cadeia de reações, que resulta deterioração oxidativa de

ácidos graxos poliinsaturados das membranas biológicas.

importante alvo para o ataque de EROs:

HO•, O2•-, •NO2, RO•, ROO

., íons Cu e Fe

H metilênicos bis-

alílicos que são mais

suscetíveis à

abstração por agentes

oxidantes

Uma vez determinado o carbono de um lipídio oxidado, esta

oxidação se propaga por toda a membrana por reações em

cascata, degradando os lipídeos em outras moléculas.

Radical de

lipídeo Radical

peroxila

Hidroperóxido

de lipídeo

Reação em cadeia: INICIAÇÃO, PROPAGAÇÃO E

TERMINAÇÃO

Processo promove grave alteração da membrana

celular, causando perda da fluidez, alteração da função

secretora e dos gradientes iônicos transmembrana;

Além disso, tem sido observada perda da seletividade

na troca iônica, com liberação do conteúdo de

organelas, levando à formação de produtos citotóxicos

(MDA) e até a morte celular;

Peroxidação Lipídica Oxidação dos lipídios pode ser avaliada pelo MDA (Malondialdeído)

- produto de quebra de hidroperóxidos de lipídeos)

Ensaio referido como substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

(TBARS).

A sua condensação com o ácido tiobarbitúrico (TBA) forma produtos, que podem ser determinados por absorção no visível (532 nm) ou por fluorescência (λ exc= 515 nm e λem = 553 nm).

TBARS

Medida peroxidação

Ácidos graxos

Membranas

Alimentos

Vantagens:

o Plasma/Soro é adicionado o

TBA reage com MDA

em meio ácido e alta temperatura, cromógeno

róseo, medido espectrofotometricamente (532nm).

Proteínas

Macromolécula mais abundante

Catalisadores

Transportam e armazenam outras moléculas (O2)

Fornecem apoio mecânico e proteção imunitária

Controlam o crescimento e a diferenciação celular

Proteína Carbonil

Teste geral do dano oxidativo das

proteínas

Várias ROS atacam resíduos de

aminoácidos das proteínas

Histidina, arginina, lisina e

prolina

Produzir produtos com grupos

carbonil (destroi a estrutura da

proteína)

Proteína Carbonil

Método baseado na reação do

DTNB c/ o grupo carbonila

Espectrofotômetro a 370nm

Nmol/g de proteína

Quantificar Proteína total

DNA Radical hidroxila (OH.) ataca diferentes sítios do DNA .

Os radicais hidroxila atacam todas as posições do açúcar da

desoxirribose levando a quebras em uma ou nas duas fitas do

DNA.

Causa modificações e ruptura das ligações entre as bases

nitrogenadas, resultando em mutações, levando à senescência.

celular

Devido ao seu baixo custo e

versatilidade o Ensaio Cometa

tornou-se a técnica mais utilizada

na análise danos no DNA

Amplamente usado em

Genética Toxicológica, Nutrição,

Pesquisa e Potencial Uso no

Tratamento do Câncer.

Método de avaliar dano no DNA

Como é realizado? Eletroforese de células isoladas

As células, englobadas em gel e espalhadas sobre uma lâmina, são

submetidas a uma corrente elétrica como uma força

proporcionando a migração dos segmentos de DNA livres

resultantes de quebras, para fora do núcleo.

DOENÇAS RELACIONADAS COM OS RADICAIS LIVRES

Peróxidos lipídicos

Danos nas proteínas

Concentrações de nitrotirosina plasmáticas foram

normalizadas :

Antes da cirurgia 1.5 ± 0.4 nmol N-Tyr/mol Tyr

1 mês 2.8 ± 0.6 nmol N-Tyr/mol Tyr

6 months 1.0 ± 0.3 nmol N-Tyr/mol Tyr

24 months 0.7 ± 0.3 nmol N-Tyr/mol Tyr

INFARTO DO MIOCÁRDIO

Bagatini e cols. 2007

TBARS Proteína carbonil

Câncer do útero Diabetes

Peroxidação Lipídica

Proteína Carbonil- LEUCEMIA

HIPERCOLESTEROLEMIA

Duarte e cols. 2007

TBARS

Diabetes experimental X Resveratrol

Schmatz e cols. 2008

ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL

Corrêa e cols. 2007

Proteína carbonil TBARS