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Habilitada ANVISA/REBLAS Provedor Alternativo CAP Certificada ISO 9001 Parceria ControlLab Questionário - Proficiência Clínica Área: Coagulação Rodada: Set/2009 O questionário com as imagens coloridas, encontra-se no site www.controllab.com.br, na área de clientes Offline. Página 1 de 5 Tema TROMBOFILIA HEREDITÁRIA E ADQUIRIDA Elaboradora Marjorie Paris Colombini, Doutora em Medicina, Patologista Clínica responsável pelo Laboratório de Coagulação da DLC HC FMUSP, e áreas de Hematologia e Coagulação do Laboratório Clínico do Hospital Israelita Albert Einstein. Texto Introdutório Trombofilia é definida como uma condição de risco aumentado para o desenvolvimento de trombose podendo ser congênita ou adquirida. Embora possam ser afetados ambos os leitos vasculares, esse termo é usado preferencialmente para o tromboembolismo venoso. Este estado depende de fatores de risco (condições extrínsecas) que agiriam por si ou facilitados pela existência prévia de distúrbios congênitos da coagulação e/ou da fibrinólise (condições intrínsecas). A Antitrombina (AT) e o sistema Proteína C Ativada (PCA) cujos componentes são a trombomodulina, a Proteína S (PS) e a própria Proteína C (PC) são os principais reguladores do processo da coagulação, e o fazem de forma direta, sendo denominados inibidores naturais da coagulação. A AT inibe a trombina e alguns fatores ativados, como o Xa, IXa e o XIa, enquanto a PCA inativa os fatores Va e VIIIa, cofatores essenciais para a geração da trombina. A perda funcional hereditária ou adquirida de qualquer um desses componentes favorece a ocorrência dos fenômenos trombóticos. Condições que apresentam ganho funcional também propiciam o surgimento de trombose, pois favorecem o aumento da geração de trombina. Um dos principais exemplos é o da mutação de Leiden, onde a substituição de um único aminoácido no sítio de clivagem 506 do fator V (Arg506Gln) confere a este, a capacidade de resistir à inativação pela PCA. Outras condições relacionadas a trombofilia hereditária são a hiperprotrombinemia devido à presença da mutação G20210A da protrombina, e possivelmente a hiperhomocisteinemia moderada devido a alterações nas enzimas que participam de sua via metabólica, a metilenotetrahidrofolato redutase e a cistationina beta-sintetase. Mais raramente, outros componentes do processo da coagulação podem apresentar alterações quantitativas ou qualitativas que os associem aos eventos tromboembólicos. São eles: o fibrinogênio, nas raras condições de disfibrinogenemias; o plasminogênio; o ativador do plasminogênio tecidual e seus inibidores, nas condições de fibrinólise imperfeita; o aumento dos níveis plasmáticos de alguns fatores, como os do VIII, por exemplo; entre outras possibilidades. Dentre as causas adquiridas que predispõe à trombose destaca-se a Síndrome Antifosfolípide, cuja presença dos anticorpos antifosfolípides, em especial o anticoagulante lúpico, com capacidade de se ligar a proteínas fixadas nas membranas fosfolipídicas, induz à ativação da coagulação, e consequentemente ao aumento da geração de fibrina nos mais variados sítios anatômicos, como a retina, o sistema nervoso central, coronárias, pulmão, placenta, entre outros. Há ainda, um grande número de potenciais fatores de riscos adquiridos, como a imobilidade, o aumento da idade, grandes cirurgias, câncer, a hiperhomocisteinemia secundária a deficiências nutricionais, que por si só, ou em associação a condições hereditárias pré-existentes, resultam na formação de trombose. Nas mulheres, acresce-se ainda a gravidez, o período puerperal, o uso de contraceptivos e terapia de reposição hormonal. AVALIAÇÃO LABORATORIAL DAS PRINCIPAIS CAUSAS DE TROMBOFILIA 1) Anticoagulantes naturais: a AT, PC e PS podem ser investigadas quanto à função ou concentração antigênica. Os métodos que avaliam a atividade, os testes funcionais, são os coagulométricos e os amidolíticos ou cromogênicos; e os testes imunológicos que possibilitam a quantificação antigênica dessas proteínas são o imunoensaio enzimático (ELISA), a imunoeletroforese, a turbidimetria, a nefelometria, a imunodifusão radial e o radioimunoensaio. Existem diferentes subtipos de deficiências, sendo alguns somente antigênicos e outros apenas com função diminuída. Esta condição reforça a necessidade de que a escolha do teste recaia sobre as metodologias funcionais. Fica reservado a metodologia imunológica o papel de auxiliar na classificação dos subtipos das deficiências encontradas. Os ensaios funcionais coagulométricos na grande maioria dos casos são baseados no TTPA e sofrem uma série de interferências como as da presença de heparina, do anticoagulante lúpico, dos inibidores dos fatores de coagulação, da resistência à proteína C ativada secundária à mutação de Leiden ou causa adquirida, apresentando, portanto, baixa sensibilidade e especificidade. Já os ensaios cromogênicos são de simples e rápida execução, adaptam-se a uma série de equipamentos, apresentam excelente exatidão e precisão, embora com um maior custo. Utilizam substratos sintéticos que mimetizam a sequência de aminoácidos que a enzima que se quer estudar reconhece de modo específico. O peptídeo sintético encontra-se unido a um grupamento cromogênico, e tão logo haja a clivagem do substrato pela enzima ativa haverá a emissão de cor, e a intensidade desse processo será quantificada. A proteína S deverá ser avaliada por ELISA utilizando anticorpo específico monoclonal já direcionado à fração livre (ativa), a única forma capaz de discriminar os indivíduos portadores desta deficiência. A investigação por metodologias gênicas para as mutações da AT, PC e PS não é possível na prática laboratorial por haverem centenas delas já identificadas.

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Page 1: Questionário - Proficiência Clínica Parceria ControlLab · AVALIAÇÃO LABORATORIAL DAS PRINCIPAIS CAUSAS DE TROMBOFILIA 1) Anticoagulantes naturais: a AT, PC e PS podem ser investigadas

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Rodada: Set/2009

O questionário com as imagens coloridas, encontra-se no site www.controllab.com.br, na área de clientes Offline.

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Tema TROMBOFILIA HEREDITÁRIA E ADQUIRIDA

Elaboradora Marjorie Paris Colombini, Doutora em Medicina, Patologista Clínica responsável pelo Laboratório deCoagulação da DLC HC FMUSP, e áreas de Hematologia e Coagulação do Laboratório Clínico do HospitalIsraelita Albert Einstein.

Texto Introdutório Trombofilia é definida como uma condição de risco aumentado para o desenvolvimento de trombose podendoser congênita ou adquirida. Embora possam ser afetados ambos os leitos vasculares, esse termo é usadopreferencialmente para o tromboembolismo venoso. Este estado depende de fatores de risco (condiçõesextrínsecas) que agiriam por si ou facilitados pela existência prévia de distúrbios congênitos da coagulaçãoe/ou da fibrinólise (condições intrínsecas).

A Antitrombina (AT) e o sistema Proteína C Ativada (PCA) cujos componentes são a trombomodulina, aProteína S (PS) e a própria Proteína C (PC) são os principais reguladores do processo da coagulação, e ofazem de forma direta, sendo denominados inibidores naturais da coagulação. A AT inibe a trombina e algunsfatores ativados, como o Xa, IXa e o XIa, enquanto a PCA inativa os fatores Va e VIIIa, cofatores essenciaispara a geração da trombina. A perda funcional hereditária ou adquirida de qualquer um desses componentesfavorece a ocorrência dos fenômenos trombóticos.

Condições que apresentam ganho funcional também propiciam o surgimento de trombose, pois favorecem oaumento da geração de trombina. Um dos principais exemplos é o da mutação de Leiden, onde a substituiçãode um único aminoácido no sítio de clivagem 506 do fator V (Arg506Gln) confere a este, a capacidade deresistir à inativação pela PCA. Outras condições relacionadas a trombofilia hereditária são ahiperprotrombinemia devido à presença da mutação G20210A da protrombina, e possivelmente ahiperhomocisteinemia moderada devido a alterações nas enzimas que participam de sua via metabólica, ametilenotetrahidrofolato redutase e a cistationina beta-sintetase.

Mais raramente, outros componentes do processo da coagulação podem apresentar alterações quantitativasou qualitativas que os associem aos eventos tromboembólicos. São eles: o fibrinogênio, nas raras condiçõesde disfibrinogenemias; o plasminogênio; o ativador do plasminogênio tecidual e seus inibidores, nascondições de fibrinólise imperfeita; o aumento dos níveis plasmáticos de alguns fatores, como os do VIII, porexemplo; entre outras possibilidades.

Dentre as causas adquiridas que predispõe à trombose destaca-se a Síndrome Antifosfolípide, cuja presençados anticorpos antifosfolípides, em especial o anticoagulante lúpico, com capacidade de se ligar a proteínasfixadas nas membranas fosfolipídicas, induz à ativação da coagulação, e consequentemente ao aumento dageração de fibrina nos mais variados sítios anatômicos, como a retina, o sistema nervoso central, coronárias,pulmão, placenta, entre outros.

Há ainda, um grande número de potenciais fatores de riscos adquiridos, como a imobilidade, o aumento daidade, grandes cirurgias, câncer, a hiperhomocisteinemia secundária a deficiências nutricionais, que por si só,ou em associação a condições hereditárias pré-existentes, resultam na formação de trombose. Nas mulheres,acresce-se ainda a gravidez, o período puerperal, o uso de contraceptivos e terapia de reposição hormonal.

AVALIAÇÃO LABORATORIAL DAS PRINCIPAIS CAUSAS DE TRO MBOFILIA

1) Anticoagulantes naturais: a AT, PC e PS podem ser investigadas quanto à função ou concentraçãoantigênica. Os métodos que avaliam a atividade, os testes funcionais, são os coagulométricos e osamidolíticos ou cromogênicos; e os testes imunológicos que possibilitam a quantificação antigênica dessasproteínas são o imunoensaio enzimático (ELISA), a imunoeletroforese, a turbidimetria, a nefelometria, aimunodifusão radial e o radioimunoensaio.

Existem diferentes subtipos de deficiências, sendo alguns somente antigênicos e outros apenas com funçãodiminuída. Esta condição reforça a necessidade de que a escolha do teste recaia sobre as metodologiasfuncionais. Fica reservado a metodologia imunológica o papel de auxiliar na classificação dos subtipos dasdeficiências encontradas.

Os ensaios funcionais coagulométricos na grande maioria dos casos são baseados no TTPA e sofrem umasérie de interferências como as da presença de heparina, do anticoagulante lúpico, dos inibidores dos fatoresde coagulação, da resistência à proteína C ativada secundária à mutação de Leiden ou causa adquirida,apresentando, portanto, baixa sensibilidade e especificidade. Já os ensaios cromogênicos são de simples erápida execução, adaptam-se a uma série de equipamentos, apresentam excelente exatidão e precisão,embora com um maior custo. Utilizam substratos sintéticos que mimetizam a sequência de aminoácidos que aenzima que se quer estudar reconhece de modo específico. O peptídeo sintético encontra-se unido a umgrupamento cromogênico, e tão logo haja a clivagem do substrato pela enzima ativa haverá a emissão de cor,e a intensidade desse processo será quantificada.

A proteína S deverá ser avaliada por ELISA utilizando anticorpo específico monoclonal já direcionado à fraçãolivre (ativa), a única forma capaz de discriminar os indivíduos portadores desta deficiência.

A investigação por metodologias gênicas para as mutações da AT, PC e PS não é possível na práticalaboratorial por haverem centenas delas já identificadas.

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2) Fator V Leiden: a pesquisa da Resistência a PCA (RPCA) consiste na avaliação funcional para estamutação, uma vez que, cerca de 95% dos pacientes portadores apresentam positividade para esse teste. Oteste tradicional consiste na realização do TTPA com a amostra teste diluída em plasma deficiente no fator Vnuma concentração final de 5% a 20%, com e sem adição do reagente “PCA”. O resultado é expresso pelarelação dos tempos “TTPA + PCA” / TTPA. Relações menores que o valor estabelecido para o ensaio,geralmente < que 1.5, falam a favor da presença da resistência.

A positividade deste teste autoriza a análise do DNA pelos ensaios de biologia molecular para a confirmaçãoda presença da mutação Leiden e a identificação dos indivíduos homozigotos ou heterozigotos.

3) Anticoagulante Lúpico: seu screening consiste na utilização de testes funcionais dependentes defosfolípides, portanto, triadores. As opções incluem o Tempo do Veneno de Víbora de Russell diluído(dVVRT) e o TTPA sensível ao anticorpo. Quando os testes triadores apresentam prolongamento de seustempos, o estudo da mistura com pool de plasma normal deverá ser realizado na proporção 1:1, e se estefalhar em corrigir os tempos prolongados, a presença de um inibidor deverá ser suspeitada. Nessa condição,deverá ser realizado o teste confirmatório ou de neutralização que consiste na adição de excesso defosfolípide padrão ou hexagonal ao teste screening afetado, e havendo correção ou o encurtamento dostempos da coagulação, fica evidenciada a presença do anticorpo fosfolípide dependente.

Questão 1 Complete a frase e assinale a alternativa correta : Trombofilia pode ser definida como o risco ___________de desenvolver trombose, podendo ser este congênito ou adquirido, acometendo em especial o territóriovascular ___________ em indivíduos mais ___________ e na ___________ de um fator desencadeante.

1. Aumentado; venoso; jovens; presença;

2. Diminuído; arterial; idosos; presença;

3. Aumentado; venoso; jovens; ausência;

4. Aumentado; arterial; idosos; ausência.

Questão 2 Complete a frase e assinale a alternativa correta : A investigação laboratorial das principais causas detrombofilia deve ser realizada ___________ do evento agudo, uma vez que os anticoagulantes naturais têmsuas concentrações ___________ nessa fase, resultando em falsos resultados. O uso da ___________prejudica principalmente a investigação laboratorial da ___________, assim como, a ___________compromete a avaliação do anticoagulante lúpico pelo ensaio do tempo do veneno de víbora de Russell.

1. Próximo; diminuídas; anticoagulação oral; protrombina mutante; heparina;

2. Longe; diminuídas; anticoagulação oral; antitrombina; heparina;

3. Próximo; aumentadas; heparina; protrombina mutante; heparina;

4. Longe; diminuídas; heparina; antitrombina; anticoagulação oral.

Questão 3 Correlacione metodologia laboratorial x defeito hemostático entre as colunas abaixo e assinale a alternativacorreta :

1. Funcional cromogênica;

2. Funcional coagulométrica;

3. Antigênica imunoenzimática;

4. Molecular - análise do DNA.

A. Fator V Leiden;

B. Antitrombina;

C. Proteína S fração livre;

D. Anticoagulante Lúpico.

1. 1 D; 2 B; 3 C; 4 A;

2. 1 B; 2 D; 3 C; 4 A;

3. 1 C; 2 A; 3 D; 4 B;

4. 1 B; 2 A; 3 C; 4 A.

Questão 4 Assinale a alternativa incorreta em relação a mutação de Leiden:

1. O fator V Leiden na sua forma heterozigota é a causa mais comum de trombofilia hereditária entre apopulação em geral, e sua prevalência entre os pacientes com trombose venosa é estimada em 20%;

2. Sua pesquisa por biologia molecular não pode ser realizada na vigência da anticoagulação oral, pois aproteína C é uma proteína plasmática vitamina k dependente;

3. É possível inferir sua presença através de um teste funcional denominado Resistência à Proteína CAtivada (RPCA) que consiste no TTPA realizado com amostra teste diluída em plasma deficiente no fatorV, acrescida da proteína C ativada;

4. No ensaio da RPCA a adição da Proteína C Ativada (PCA) visa prolongar o tempo do TTPA quandocomparado ao TTPA realizado de forma padrão, ou seja, sem a ação da PCA.

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Questão 5 Assinale a alternativa incorreta sobre osconceitos abaixo:

1. A púrpura neonatal fulminante (ilustrada aolado) é uma condição rara de extremagravidade que acomete recém nascidoshomozigotos para deficiência da proteína C;

2. O teste laboratorial de escolha parainvestigação funcional da proteína C é ocromogênico, tendo como substrato sintéticoos fatores V ou VIII ativados, alvosfisiológicos do sistema PCA in vivo;

3. O uso do anticoagulante oral não invalida a pesquisa laboratorial da proteína C, diferentemente daheparina de baixo peso molecular;

4. A proteína S é o cofator obrigatório para que a PCA possa exercer seu papel de proteína reguladora dacoagulação. A forma livre que corresponde a aproximadamente 40% do total é a fração ativa, e os 60%restantes circulam complexados ao complemento (C4bp) e não apresentam função.

Questão 6 Relacione as opções verdadeiro (V) ou falso (F) e escolha a alternativa correta :

( ) Hiperprotrombinemia está frequentemente associada à presença da mutação G20210A da protrombina, eembora seja um fator de risco independente para a doença tromboembólica, a mensuração dos níveisplasmáticos da protrombina não tem valor;

( ) No grupo dos pacientes trombofílicos usualmente realiza-se a análise do DNA para detectar a presençada protrombina mutante;

( ) Hiperhomocisteinemia é um fator de risco para trombose arterial e venosa, sendo sua pesquisaobrigatoriamente realizada por métodos moleculares;

( ) A hiperhomocisteinemia adquirida é encontrada em condições de diferentes hábitos de vida (alcoolismo,tabagismo, etc...), nas deficiências vitamínicas (B6, B12 e ácido fólico) e em certas doenças renais e datireóide.

1. V, V, F, V;

2. F, V, V, F;

3. V, F, F, V;

4. F, F, V, V.

Paciente feminina, 30 anos, há três semanas diagnosticada com trombose venosa profunda em membroinferior esquerdo e em uso do anticoagulante oral, refere como antecedentes pessoais enxaqueca frequente edois abortamentos tardios (3º trimestre gestacional), sem mais queixas.

Caso Clínico 1

De acordo com o caso clínico acima responda as questões de 7 a 9:

Questão 7 Qual a hipótese diagnóstica mais provável?

1. Não há relação entre a condição atual e as demais queixas, podendo portanto, ser descartada apossibilidade de trombofilia hereditária;

2. Trombofilia adquirida - síndrome do anticorpo antifosfolípide;

3. Deficiência de plasminogênio;

4. Hiperhomocisteinemia.

Questão 8 Das alternativas abaixo qual a indicada para a investigação laboratorial desta paciente?

1. Dosagem da homocisteina sérica, Tempo de Trombina (TT) e contagem plaquetária;

2. Antitrombina, proteína C e proteína S;

3. Anticoagulante lúpico e anticardiolipina (IgG e IgM);

4. Fibrinogênio e plasminogênio.

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Questão 9 Quais os métodos/ ensaios deverão ser utilizados para investigar a opção apontada na questão anterior?

1. Metodologia coagulométrica e técnica de Clauss para avaliação do fibrinogênio;

2. Metodologia cromogênica ou amidolítica para avaliação funcional da antitrombina e proteína C eimunoeletroforese para avaliação da fração livre da proteína S;

3. Cromatografia líquida de alta pressão para determinação da homocisteína; coagulométrica paramensuração do tempo de trombina e contagem automatizada por impedância para contagemplaquetária;

4. Metodologia Elisa para a determinação da anticardiolipina IgG e IgM e metodologia coagulométrica paraos ensaios do Tempo do Veneno de Víbora de Russell diluído (dVVRT) e TTPA sensível à presença doanticoagulante lúpico.

Questão 10 Correlacione fase pré-analítica x impacto na avaliação laboratorial das trombofilias entre as colunas abaixo eassinale a alternativa correta :

1. Garroteamento prolongado;

2. Uso de aspirina;

3. Gravidez;

4. Uso de heparina.

A. Deficiência de Proteína S;

B. Deficiência de Antitrombina;

C. Aumento dos níveis do fator VIII;

D. Não causa impacto.

1. 1C, 2D, 3A, 4B;

2. 1A, 2C, 3B, 4D;

3. 1B, 2A, 3C, 4D;

4. 1D, 2B, 3C, 4A.

Questão 11 Alterações em alguns dos componentes do sistema fibrinolítico, embora mais raras, parecem contribuir para aocorrência de fenômenos trombóticos. Qual das opções abaixo não se “encaixa” com a afirmação feita?

1. Plasminogênio;

2. Inibidor do Ativador do Plasminogênio tecidual (PAI-1);

3. Ativador do Plasminogênio tecidual (t-PA);

4. Trombomodulina.

As questões 12, 13 e 14 deverão ser respondidas com base no quadro abaixo:

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Questão 12 Paciente portador de doença autoimune, com quadro clínico de trombose sugestivo de síndromeantifosfolípide e sem história familiar de trombofilia, realiza pesquisa laboratorial do anticorpo anticoagulantelúpico com resultado positivo para a presença do anticorpo. Assinale a alternativa correspondente à ordem deexecução correta de testes laboratoriais indicados no quadro acima:

1. D > C > I > F > B;

2. D > C > E > I;

3. D > G > A;

4. D > I > F > B.

Questão 13 Considere agora a realização dessa pesquisa em um paciente com trombose devido à presença da mutaçãode Leiden e em uso de heparina. Qual a sequência correta de execução representaria esse caso?

1. D > G > A;

2. D > C > H > A;

3. D > F > B;

4. D > H > A.

Questão 14 Paciente masculino, 47 anos, procura serviço médico devido empastamento doloroso de membro inferioresquerdo. Refere ainda, um episódio de amaurose súbita há seis meses, sem causa esclarecida. Depois deconfirmado a TVP, foi encaminhado para investigação da provável causa. Realiza inúmeros testes e dentreeles a pesquisa do anticoagulante lúpico. Qual sequência de testes você espera encontrar na realizaçãodessa pesquisa?

1. D > C > H > B;

2. D > E > C > A;

3. D > C > F > H > B;

4. D > H > I > C.

Questão 15 Paciente feminina, 55 anos, inicia terapêutica de reposição hormonal e apresenta quadro de dispnéia súbita,com hipótese diagnóstica de embolia pulmonar (TEP). Responda se verdadeiro (V) ou falso (F) e escolha aalternativa correta :

( ) A pesquisa prévia da deficiência congênita dos anticoagulantes naturais nesta paciente preveniria aocorrência do TEP e beneficiaria seus familiares.

( ) Para pacientes nessa faixa etária não é indicado pesquisar a mutação de Leiden, pois além de rara, essamutação impõe risco de trombose somente em população abaixo dos 25 anos.

( ) A pesquisa de alterações no plasminogênio é a mais indicada para esta paciente, pois o acometimento demulheres na menopausa é frequente, em especial na forma homozigótica.

( ) A pesquisa na vigência da trombose poderá ser feita apenas para as mutações pesquisáveis por biologiamolecular.

1. F, F, F, V;

2. V, F, V, F;

3. F, V, V, V;

4. V, F, F, F.

ReferênciasBibliográficas

• Marlar R.A., Fink L.M., Miller J.L. Laboratory Approach to Thrombotic Risk. In: Mc Pherson R.A., PincusM.R. Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 21st ed. Philadelphia.Elservier; 2007. p.770-8.

• Laffan M.A. & Manning R.A. Investigation of a thrombotic tendency. In: Lewis S. M., Bain B.J., Bates I.Dacie and Lewis Practical Haematology. 9th ed. London. Churchill Livingstone; 2002. p.391-413.