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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA ESCOLA DE NUTRIÇÃO YTANA TADEU OLIVEIRA SANTOS QUALIDADE SANITÁRIA DE HORTALIÇAS CULTIVADAS EM UM DISTRITO SANITÁRIO DE SALVADOR-BA E EFICIÊNCIA DE SOLUÇÕES ANTIMICROBIANAS SOBRE LINHAGENS DE ESCHERICHIA COLI Salvador 2007

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA ESCOLA DE NUTRIO

YTANA TADEU OLIVEIRA SANTOS QUALIDADE SANITRIA DE HORTALIAS CULTIVADAS EM UM DISTRITO SANITRIO DE SALVADOR-BA E EFICINCIA DE SOLUES ANTIMICROBIANAS SOBRE LINHAGENS DE

ESCHERICHIA COLI

Salvador 2007

YTANA TADEU OLIVEIRA SANTOS

QUALIDADE SANITRIA DE HORTALIAS CULTIVADAS EM UM DISTRITO SANITRIO DE SALVADOR-BA E EFICINCIA DE SOLUES ANTIMICROBIANAS SOBRE LINHAGENS DE

ESCHERICHIA COLI

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao da Escola de Nutrio, Universidade Federal da Bahia, como parte dos requisitos para obteno do ttulo de Mestre em Alimentos, Nutrio e Sade. Orientador: Profa. Dra. Rogeria Comastri de Castro Almeida Co-orientador: Prof. Dr. Paulo Fernando de Almeida

Salvador 2007

Santos, Ytana Tadeu Oliveira S237 Qualidade Sanitria de hortalias cultivadas em um distrito sanitrio de

Salvador-Ba e eficincia de solues antimicrobianas sobre linhagens deEscherichia coli / Ytana Tadeu Oliveira Santos. Salvador, 2007.

85 f.

Orientador: Profa. Dra. Rogeria Comastri de Castro Almeida Co-orientador: Prof. Dr. Paulo Fernando de Almeida Dissertao (mestrado) Universidade Federal da Bahia. Escola de Nutrio,

2007.

1. Microbiologia de Alimentos. 2. Hortalias. 3. Irrigao (Agricultura). I.Universidade Federal da Bahia - Escola de Nutrio. II. Almeida, RogeriaComastri de Castro. III. Almeida, Paulo Fernando de. IV. Ttulo.

CDU: 664

YTANA TADEU OLIVEIRA SANTOS

QUALIDADE SANITRIA DE HORTALIAS CULTIVADAS EM UM DISTRITO

SANITRIO DE SALVADOR-BA E EFICINCIA DE SOLUES ANTIMICROBIANAS SOBRE LINHAGENS DE ESCHERICHIA COLI

Dissertao apresentada como requisito obteno do grau de Mestre em Alimentos, Nutrio e Sade, Escola de Nutrio, Universidade Federal da Bahia. Banca examinadora: Rogria Comastri de Castro Almeida

Doutora em Engenharia de Alimentos (Universidade Estadual de Campinas) Universidade Federal da Bahia Alase Gil Guimares

Doutora em Tecnologia de Alimentos (Universidade Estadual de Campinas) Universidade Federal da Bahia Elisa Teshima

Doutora em Cincia e Tecnologia de Alimentos (Universidade Federal de Viosa) Universidade Estadual de Feira de Santana Salvador, ______ de ______________ de 2007.

Aos meus pais, Gildo e Snia que sempre me apoiaram e, com muito esforo, conseguiram proporcionar tudo o que tenho hoje. Ao meu companheiro Fbio pela pacincia e carinho dispensado. Ao meu amigo Augusto, pelo incentivo para a realizao deste trabalho, pela fora, ajuda e disponibilidade desde o incio desta batalha. A todos os colegas da Vigilncia Sanitria, especialmente da Vigilncia Sanitria de Salvador, pela rdua e gratificante misso da proteo e defesa da sade.

AGRADECIMENTOS A Deus, por ter me dado tanto nesta vida. A minha orientadora, Profa.. Dra. Rogeria Comastri de Castro Almeida, pelo incentivo, ajuda e pelos momentos de preciosa orientao no decorrer deste trabalho. Aos meus familiares e amigos, pela compreenso e pacincia pelas minhas faltas durante o convvio familiar nos longos perodos em que fiquei envolvida com as atividades necessrias realizao desta pesquisa; A minha grande colega e amiga Clotilde pelo apoio nas horas difceis, incentivo e ajuda nos momentos crticos desta batalha. Aos meus amigos e colegas Augusto e Antnia Maria pela fora, ajuda, carinho e apoio que sempre me ofereceram. A Vigilncia Sanitria do Municpio de Salvador-Ba pela imensa colaborao para a execuo deste trabalho. A toda a equipe do Distrito Sanitrio Cabula Beiru em especial a Dra. Ftima Moraes, Irani Ferreira e colegas da vigilncia sanitria pela colaborao e apoio. A equipe do Laboratrio de Biotecnologia e Ecologia de Microrganismo (LABEM), em especial ao Prof. Dr. Paulo Fernando de Almeida e a aluna Jaqueline, pela disponibilidade do laboratrio e pela ajuda prestada. Ao Laboratrio Central Gonalo Muniz - LACEN e sua equipe pela disponibilidade do laboratrio e pela colaborao prestada. Ao amigo Lucas Assis pela importante ajuda e disponibilidade sempre. A Karine Nogueira, pela preciosa ajuda durante a execuo das anlises. Ao Prof. Dr. Tomomasa Yano da Universidade Estadual de Campinas pela colaborao na realizao das anlises para a deteco de citotoxinas. A Profa. Dra. Rizia de Cssia Vieira Cardoso pela ajuda e apoio dispensados no incio do mestrado. Ao Prof. Dr. Gilnio e Profa. Dra. Luciara pela colaborao na conduo das anlises estatsticas. Ao Programa de Ps-graduao em Nutrio, Alimentos e Sade da Universidade Federal da Bahia, pela oportunidade de realizao deste mestrado. A todos os demais que de alguma forma contriburam para a realizao deste trabalho.

Quem me dera ao menos uma vez que o simples fosse visto como o mais importante....

Renato Russo

RESUMO O consumo de hortalias cruas constitui um importante meio de transmisso de vrias doenas infecciosas, dentre estas se destacam aquelas provocadas por bactrias patognicas, ocasionando com freqncia surtos de Doenas Veiculadas por Alimentos (DVA). Deficincias no controle em qualquer uma das etapas da produo podem comprometer a qualidade sanitria das hortalias. Nas hortas existentes em nosso meio observam-se prticas agrcolas inadequadas durante a produo das hortalias, dentre estas a utilizao de gua contaminada, comprometendo a qualidade final dos produtos. Desta forma, torna-se necessrio o controle durante todas as etapas que precedem o consumo, incluindo a lavagem e sanitizao adequadas destes vegetais. O cloro um dos principais agentes sanitizantes permitido pela legislao brasileira, porm atualmente, seu uso vem sendo contestado devido possibilidade da formao de substncias carcinognicas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade higinico-sanitria de hortas, hortalias e gua de irrigao e a eficcia sanitizante de produtos contendo cidos orgnicos de cadeia curta sobre linhagens de Escherichia coli inoculadas artificialmente em alface. Foram investigadas cinco hortas, 140 amostras de hortalias distribudas entre alface, coentro, couve e hortel, e 45 amostras de gua de irrigao. Para avaliao da qualidade sanitria das hortas foi aplicado um check-list e para avaliar as hortalias e guas de irrigao foram conduzidas anlises microbiolgicas pertinentes. Em etapa posterior, foi investigada a eficcia sanitizante de cidos orgnicos de cadeia curta sobre duas linhagens de Escherichia coli inoculadas separadamente em alface e em seguida submetidas aos tratamentos por 15 minutos, empregando solues de vinagre de lcool, suco de limo, mistura suco de limo e vinagre (1:1) e mistura suco de limo,vinagre e gua (1:1:1). Os resultados demonstraram que 40% das hortas apresentam condies higinico-sanitrias totalmente insatisfatrias e as anlises microbiolgicas revelaram elevados ndices de contaminao por coliformes termotolerantes nas hortalias com 82% de amostras contaminadas, contagens entre < 0,3 a 1500 NMP/g, presena de E. coli em 32% das amostras e ausncia de Salmonella spp. Na gua de irrigao tambm foram encontrados ndices elevados de coliformes termotolerantes, com 87% de amostras contaminadas, contagens entre < 2 a 2100 NMP/100 mL, e presena de E. coli em 56% das amostras. Um total de 69% das amostras das guas no atendeu ao padro vigente para coliformes termotolerantes. Os resultados obtidos a partir do check-list no foram condizentes com as anlises microbiolgicas. Quanto aos tratamentos com as solues antimicrobianas, verificou-se que no houve diferena estatisticamente significativa (p

ABSTRACT The consumption of raw vegetables is surely an important mean to transmit several infectious diseases, among them must be highlight the ones caused by pathogenic bacteria, which frequently cause outbreaks of foodborne diseases. Deficiencies regarding the control of any of the stages of production may harm vegetables sanitary quality. Among the patches observed it can be notice inadequate practices while growing the vegetables such as the use of contaminated water, which may affect the quality of the products to be harvested. This way, there is a strong necessity in order to control all the stages which precede consumption, including the adequate washing and sanitization of such vegetables. Chloral is one of the main sanitization agents allowed by Brazilian laws. However, currently, its use has been contested due to the possibility to form carcinogenic substances. This work aims to evaluate the hygienic-sanitary quality of patches, vegetables and irrigation water and the sanitizing efficacy of products containing simple series organic acids against Escherichia coli strains artificially inoculated in lettuce plots. Five patches have been investigated, 140 samples of vegetables ranging from lettuce, cilantro, savoy cabbage and mint, and 45 samples of irrigation water. A check-list form was used in order to evaluate the sanitary quality of vegetable patches and the adequate microbiological analysis to investigate the vegetables themselves as well as irrigation water. Afterwards, the object investigated was the sanitizing efficacy of organic acids against two Escherichia coli strains inoculated separately in lettuce, which were after submitted to a 15-minute treatment consisting on the application of alcohol vinegar, lemon juice, a mix of lemon juice and vinegar (1:1), as well as lemon juice, vinegar and water (1:1:1). Results showed that 40% of the patches present unsatisfactory hygienic-sanitary conditions and the microbiological analysis revealed high rates of contamination for thermotolerant coliforms in vegetables with 82% of samples infected, counts between < 0.3 and > 1500 MPN/g, presence of E. coli in 32% of the samples and the absence of Salmonella spp. In irrigation water there were also found high rates of thermotolerant coliforms, with 87% of the samples contaminated, counts between < 2 and 2100 MPN/100 mL, and the presence of E. coli in 56% of the samples. A total of 69% of the water samples did not in compliance to the existing standards of thermotolerant coliforms. The results obtained over the check-list havent machted with the microbiological analyses. Concerning the treatment with antimicrobial solutions, it has been verified that there was no significant statistic difference (p

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Caracterizao das hortas do Distrito Sanitrio Cabula Beiru (DSCB) de Salvador - Ba e avaliao pelo check-list.

49

TABELA 2 Distribuio da ocorrncia de coliformes termotolerantes em hortas do Distrito Sanitrio de Salvador - BA, de acordo com o tipo de hortalia estudada.

52

TABELA 3 Valores mnimos e mximos do Nmero Mais Provvel (NMP)/ g de coliformes termotolerantes em hortalias cultivadas em hortas do DSCB de Salvador Ba.

53

TABELA 4 Ocorrncia de coliformes termotolerantes em hortalias de acordo com a horta do DSCB de Salvador - Ba.

54

TABELA 5 Presena de Escherichia coli de acordo com o tipo de hortalia cultivada em hortas do DSCB de Salvador Ba.

55

TABELA 6 Presena de Escherichia coli em hortalias de acordo com as hortas do DSCB de Salvador - Ba.

56

TABELA 7 Valores mnimos e mximos do Nmero Mais Provvel (NMP) de coliformes totais e coliformes termotolerantes em guas de irrigao, utilizadas em hortas do DSCB de Salvador - Ba.

59

TABELA 8 Freqncia de coliformes totais e coliformes termotolerantes em guas de irrigao utilizadas em hortas do DSCB de Salvador - Ba.

59

TABELA 9 Frequncia de Escherichia coli em guas de irrigao utilizadas em hortas do DSCB de Salvador - Ba.

60

TABELA 10 Percentual de amostras da gua de irrigao que no atenderam ao padro microbiolgico para coliformes termotolerantes (CONAMA, 2005).

62

TABELA 11 Eficcia dos tratamentos sobre Escherichia coli O157: H7 inoculada artificialmente em folhas de alface, aps 15 minutos de contato.

65

TABELA 12 Eficcia dos tratamentos sobre Escherichia coli-Ls inoculada artificialmente em folhas de alface, aps 15 minutos de contato

67

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Preparo da suspenso bacteriana 44

FIGURA 2 Ocorrncia de coliformes termotolerantes de acordo com o tipo de hortalia

51

FIGURA 3 Ocorrncia de E. coli de acordo com o tipo de hortalia cultivada em hortas do DSCB / Salvador-Ba

55

FIGURA 4 Ocorrncia de coliformes totais e termotolerantes em gua de irrigao de hortas do DSCB / Salvador-Ba

60

FIGURA 5 Ocorrncia de E. coli na gua de irrigao 61

FIGURA 6 Percentual de amostras de gua de irrigao que no atenderam ao padro da CONAMA

62

FIGURA 7 Eficcia dos tratamentos sobre E. coli O157:47 e E. coli-Ls inoculadas

artificialmente em alface

57

SUMRIO

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

1 INTRODUO 11

2 OBJETIVOS 13

2.1 Objetivo geral 13

2.2 Objetivos especficos 13

3 REFERENCIAL TERICO 14

3.1 Hortalias 14

3.2 Qualidade sanitria das hortalias 15

3.2.1 Bactrias do grupo coliforme/ Escherichia coli 17

3.2.2 Salmonella spp. 21

3.3 Prticas agrcolas: Condies higinicas sanitrias dos locais de produo, insumos e manipuladores.

23

3.4 gua de irrigao 24

3.4.1 Qualidade microbiolgica e doenas veiculadas pela gua de irrigao 25

3.5 Consideraes sobre o controle sanitrio na produo de hortalias e doenas veiculadas por alimentos

28

3.6 Sanitizao de hortalias 30

3.6.1 Agentes sanitizantes e a sua eficincia na eliminao de patgenos 31

4 MATERIAL E MTODOS 35

4.1 Material 35

4.1.1 Alimentos 35

4.1.2 Cepas dos microrganismos de referncia 35

4.1.3 Solues de tratamento 35

4.1.4 Meios de cultura e reagentes 35

4.1.5 Equipamentos 37

4.2 Mtodos 38

4.2.1 Local de estudo 38

4.2.2 Desenho de estudo 38

4.2.3 Cadastramento e caracterizao higinico-sanitria das hortas 38

4.2.4 Investigao higinico-sanitria das hortalias e da gua de irrigao 39

4.2.5 Investigao da eficincia sanitizante de solues contendo cidos orgnicos sobre E. coli O157: H7 e E. coli isolada de alface (Lactuca sativa).

44

4.2.6 Investigao da presena de citotoxinas nas cepas isoladas de E. coli. 46

5 RESULTADOS E DISCUSSO 48

5.1 Caracterizao e investigao das condies higinico-sanitrias das hortas 48

5.2 Investigao da qualidade higinico-sanitria das hortalias 51

5.3 Investigao da qualidade sanitria da gua de irrigao 58

5.4 Avaliao da eficincia de solues antimicrobianas sobre linhagens de Escherichia coli inoculadas artificialmente em alface

64

6 CONCLUSO 72

7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 74

APNDICE

ANEXOS

11

1 INTRODUO

O consumo de hortalias vem sendo cada vez mais incentivado no mundo atual diante

de todos os seus benefcios nutricionais conhecidos. Porm, principalmente as hortalias

folhosas, constituem um importante meio de transmisso de vrias doenas toxinfecciosas,

tendo sido reportadas como fonte potencial de microrganismos patognicos, contribuindo para

a elevao dos casos de doenas veiculadas por alimentos (DVAs) (FDA, 1998; BUCK,

WALCOTT & BEUCHAT, 2003).

A contaminao microbiolgica uma das mais relevantes para a sade pblica,

considerando os elevados ndices de doenas veiculadas por alimentos (DVAs), provocados

por microrganismos patognicos em todo o mundo (OMS, 2003). O consumo de verduras

cruas desempenha um importante papel na transmisso de vrias doenas toxinfecciosas,

destacando-se a prtica freqente da irrigao de hortas com guas contaminadas como uma

das principais fontes de contaminao das mesmas (AMORIM, 2003; BASTOS, 2002).

Os riscos microbianos que afetam a segurana dos alimentos podem estar presentes em

qualquer ponto da cadeia produtiva, desde o cultivo, colheita, lavagem, armazenamento,

transporte, comercializao, e finalmente na mesa do consumidor (RANTHUM, 2002).

As pesquisas existentes em nosso meio para avaliar a qualidade sanitria de hortalias,

em sua grande maioria, s ocorrem nos locais de distribuio e comercializao das mesmas,

poucas se referem ao local de cultivo ou incio da cadeia produtiva, onde deveria ter seu

controle e monitoramento iniciados. Portanto, de um modo geral, dentre os fatores que

concorrem para a contaminao de hortalias, devem ser investigados o meio ambiente em

que as mesmas so produzidas, destacando-se a gua de irrigao, a situao higinico-

sanitria das hortas, as prticas agrcolas empregadas como tambm a situao de sade e

hbitos higinicos dos trabalhadores das hortas.

No Distrito Sanitrio Cabula Beiru (DSCB), municpio de Salvador-Bahia, a

horticultura uma prtica visvel. Fatores culturais, alternativas de sustentabilidade,

condies de clima e solo favorveis, contribuem para esta atividade neste local. Seus

produtos so consumidos pela populao local e distribudos para centros de abastecimento

em Salvador e adjacncias.

12

No DSCB as hortas esto localizadas em regies de declives, onde geralmente vivem

pessoas de baixa renda, sem ordenamento do uso do solo, saneamento bsico precrio e

ausncia de outros servios pblicos fundamentais. O destino dos esgotos e guas servidas

feito com freqncia em rios e riachos locais, contaminando as guas superficiais e lenis

freticos com material fecal. Por sua vez, a grande maioria dos produtores, pela dificuldade ao

acesso ou por desinformao, utiliza destas guas adjacentes s hortas para irrig-las, sem

nenhum tratamento prvio, fato que repercutir na qualidade sanitria das hortalias

produzidas. Contudo, mesmo existindo um controle sanitrio nestas etapas que antecedem a

oferta final do produto, difcil garantir que estes alimentos cheguem incuos mesa do

consumidor. Dessa forma, a prtica da sanitizao deve ser utilizada como complementao

s boas prticas de produo (BPF), visando reduzir com maior segurana a presena de

microrganismos patognicos no alimento.

O processo de sanitizao das hortalias considerado uma etapa crtica para a

segurana no consumo do alimento e a seleo dos sanitizantes a serem empregados deve ser

baseada no apenas na eficcia dos mesmos, mas tambm na segurana do ponto de vista

toxicolgico (NASCIMENTO, 2002). O hipoclorito de sdio o agente mais comumente

empregado, porm alm de possuir efeito limitado sobre determinados microrganismos, pode

produzir substncias denominadas trihalometanos, comprovadamente carcinognicas

(FERRARIS et al., 2005; DUNNICK & MELNICK, 1993).

Considerando-se o fato acima citado, h um interesse por parte das indstrias de

alimentos em desenvolver sanitizantes alternativos que sejam mais eficazes que o hipoclorito

de sdio para reduzir ou eliminar patgenos humanos em produtos frescos, e que no

possuam efeitos deletrios sade. Os cidos orgnicos de cadeia curta, por serem

considerados substncias reconhecidas como seguras (GRAS), tm sido muito utilizados

como alternativa em estudos de reduo da populao bacteriana em alimentos.

Diante do exposto, realizou-se esse estudo para investigar a qualidade higinico-

sanitria de hortalias e gua de irrigao das mesmas, atravs de anlises microbiolgicas,

avaliando-se tambm as condies ambientais e higinico-sanitrias das hortas que as

produziam. Tambm foi objeto desse estudo a avaliao da ao sanitizante de produtos

contendo cidos orgnicos de cadeia curta e sua combinao sobre linhagens de Escherichia

coli, inoculadas artificialmente em folhas de alface (Lactuca sativa).

13

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar a qualidade higinico-sanitria de hortas, hortalias e gua de irrigao e a

eficcia sanitizante de produtos contendo cidos orgnicos de cadeia curta sobre linhagens de

Escherichia coli inoculadas artificialmente em alface (Lactuca sativa).

2.2 Objetivos Especficos

Avaliar as condies higinico-sanitrias de hortas atravs da aplicao de formulrio

semi-estruturado do tipo check-list.

Avaliar as condies higinico-sanitrias das hortalias investigando a presena de

Salmonella spp. e o Nmero Mais Provvel de coliformes termotolerantes/ E. coli.

Avaliar as condies higinico-sanitrias da gua de irrigao investigando o Nmero

Mais Provvel de coliformes totais e coliformes termotolerantes/ E. coli.

Comparar os resultados encontrados com os padres microbiolgicos vigentes.

Avaliar a eficcia sanitizante de vinagre, suco de limo, mistura vinagre e suco de

limo, e mistura vinagre, suco de limo e gua, sobre duas linhagens de Escherichia

coli inoculadas artificialmente em alface.

14

3 REFERENCIAL TERICO

3.1 Hortalias

.

Originria da Europa e da sia, a alface (Lactuca sativa) pertence famlia Asteracea

e a verdura mais consumida no Brasil (EMBRAPA, 2006). A alface possui um caule

diminuto ao qual se prendem as folhas, podem ser do tipo lisa ou crespa, fechando-se ou no

na forma de um cone. A colorao das plantas pode variar do verde-amarelado at o verde

escuro e tambm pode ser roxa, dependendo do cultivar. classificada comercialmente em

Americana, Crespa, Lisa, Mimosa e Romana. Desses tipos, o mais consumido a alface

Crespa (TRANI et al., 2005).

O Coentro (Coariandrum sativum L.), tambm conhecido como cheiro-verde pertence

famlia Apiaceae, foi originado do sul europeu e do oriente e, acredita-se que chegou ao

Brasil trazido pelos portugueses (EMBRAPA, 2006). uma hortalia bastante usada como

condimento em todo o Brasil, principalmente nas regies norte e nordeste e em menor

proporo no sudeste. Suas folhas so bastante utilizadas na culinria, em diversos pratos

tpicos, no tempero de carnes alm de molhos e saladas. J a sua semente bastante til na

indstria de condimento para a carne defumada, fabricao de pes, doces e licores finos

(ALVES et al., 2005).

A couve (Brassica oleracea), originria da costa do Mediterrneo, uma planta que

apresenta grande diversidade, sendo a couve manteiga como um dos 22 tipos encontrados

no Brasil, a mais comumente produzida e consumida. Possui folhas verde-claras, tenras, lisas

ou pouco onduladas, com pecolo e nervuras verde-claras (EMBRAPA, 2006). Seu uso

muito apreciado em todo o Brasil na forma de salada crua, cozida ou na elaborao de sucos.

A hortel (Menta villosa), originria da sia e Europa, uma planta medicinal e

aromtica cultivada tambm em todo o Brasil e largamente utilizada pelas indstrias

qumicas, farmacuticas e de alimentos (PAULUS, 2005). Como alimento, seu uso muito

apreciado como tempero em diversas preparaes e tambm como ingrediente na elaborao

de sucos em combinao com algumas frutas.

15

Segundo Moretti (2003), as hortalias constituem parte integrante da dieta da

populao mundial. No Brasil, de acordo com o ltimo levantamento realizado atravs da

Pesquisa de Oramento Familiar (2003), o consumo de frutas e hortalias ainda se encontra

abaixo dos nveis recomendados. Na Bahia de acordo com as informaes da Central de

Abastecimento S.A. (CEASA, 2005), entre o perodo de 2002 a 2005, houve um crescimento

significativo na comercializao de hortalias folhosas como a alface, coentro, couve e

hortel.

Em relao s recomendaes dirias na ingesto de hortalias, as diretrizes dietticas

atuais recomendam a diminuio do consumo de gordura, acar e sal, manuteno do peso

desejvel e aumento do consumo de hortifrutigranjeiros e gros (WHO, 2003). Ao mesmo

tempo em que os benefcios de sade relacionados ao consumo destes produtos j esto

claramente estabelecidos, necessrio garantir tambm que as mesmas apresentem uma

qualidade sanitria adequada, visando garantir o fornecimento de um alimento seguro sade

dos comensais.

3.2 Qualidade sanitria das hortalias

A alimentao tem sido motivo de preocupao em vrios pases do mundo (WHO,

2003) e adequar a produo de alimentos demanda crescente da populao tem sido um

grande desafio. Entretanto, este desafio no se resume apenas em atender a essa nova

demanda, mas tambm em oferecer alimentos com qualidade satisfatria e livres de agentes

contaminantes (BALBANI & BUTUGAN, 2001).

Com o processo de globalizao atual, verificou-se uma maior preocupao com a

segurana alimentar, tanto no aspecto quantitativo ligado a oferta do alimento, quanto no

aspecto qualitativo, o que torna mais evidente os problemas relativos qualidade dos

alimentos para consumo humano (CAVALCANTI, 2004).

Nesse ltimo aspecto, as principais preocupaes a respeito das contaminaes

alimentares esto centradas geralmente em torno dos riscos de contaminao microbiolgica,

resduos de pesticidas, utilizao inadequada de aditivos alimentares, contaminantes qumicos

incluindo as toxinas biolgicas, adulteraes e mais recentemente as transformaes advindas

da engenharia gentica, como os alimentos transgnicos, substncias alergnicas, resduos de

16

medicamentos de uso veterinrio e hormnios (OMS, 2002).

Apesar dos riscos inerentes presena de todos os contaminantes supracitados, a

contaminao microbiolgica umas das mais relevantes para a sade pblica, considerando

os elevados ndices de doenas veiculadas por alimentos (DVAs), provocados por

microrganismos patognicos em todo o mundo (OMS, 2003).

O nmero de surtos de DVAs ocasionado pelo consumo de frutas e hortalias in

natura tem aumentado ao longo dos anos, fato este observado em vrios pases do mundo,

onde este grupo de alimentos tem sido considerado como fonte potencial de microrganismos

patognicos (FDA, 1998; BUCK, WALCOTT & BEUCHAT, 2003).

A maioria dos pases que dispem de sistemas operantes para notificar casos de

doenas veiculadas pelos alimentos tem documentado aumentos significativos durante as

ltimas dcadas, e os principais microrganismos implicados so Salmonella spp,

Campylobacter jejuni e Escherichia coli do tipo enterohemorrgica (OMS, 2002).

Todo alimento apresenta uma microbiota natural bastante varivel, concentrada

principalmente na regio superficial (BRENES, 2002). Ao lado desta microbiota natural, os

alimentos esto sujeitos contaminao por diferentes microrganismos, provenientes da

atmosfera ambiental, da manipulao, utenslios, equipamentos, dentre outros, conhecidos

como fatores extrnsecos (VALSECHI, 2006).

Segundo Janisiewicz et al.(1999), as frutas e os vegetais contm os nutrientes

necessrios para o crescimento rpido de bactrias patognicas. E apesar das barreiras

mecnicas, como a casca, que impede a entrada dos microrganismos para o interior destes

alimentos, quando estas se encontram com fissuras ou so cortadas, esta barreira rompida,

criando assim uma oportunidade para a colonizao bacteriana.

A microbiota presente em vegetais frescos constitui-se basicamente de

microrganismos pertencentes famlia Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae

(NASCIMENTO et al., 2005). Entre os gneros da famlia Enterobacteriaceae, encontra-se a

Escherichia, sendo a principal espcie a Escherichia coli, pertencente ao grupo dos

coliformes termotolerantes (FRANCO, 1996).

17

3.2.1 Bactrias do grupo coliforme/ Escherichia coli

As bactrias do grupo coliformes compreendem os coliformes totais e

termotolerantes; neste grupo se incluem as bactrias em forma de bastonetes Gram-negativos,

no esporognicos, aerbios ou anaerbios facultativos, capazes de fermentar a lactose com

produo de gs, entre 24 a 48 horas a 35C, os coliformes totais, e em 24 horas a 44,5 C os

coliformes termotolerantes (CUNHA, 2006).

O grupo dos coliformes totais inclui espcies que podem ser originrias do trato

gastrintestinal de humanos e animais de sangue quente e outras no entricas. J o grupo dos

coliformes termotolerantes inclui bactrias originrias do trato gastrintestinal, o gnero

Escherichia e outras de origem no fecal, como os gneros Enterobacter e Klebsiella

(FRANCO & LANDGRAF, 1996).

A presena de coliformes termotolerantes nos alimentos pode indicar qualidade

higinico-sanitria insatisfatria dos mesmos, quer seja pela contaminao da matria-prima e

do produto nas fases de processamento ou mesmo quando acabado, podendo inferir tambm, a

respeito da potencial presena de patgenos nestes substratos (AMNCIO et al., 2003).

Marques (2003) adverte, porm, que a presena de coliformes termotolerantes em

alimentos menos representativa, como indicao de contaminao fecal do que a

enumerao de Escherichia coli, por ser, como j foi citado, uma bactria predominante da

microbiota intestinal.

A Escherichia coli distribui-se a partir das fezes, habitat especfico e ou primrio,

alcanando o solo e sendo veiculada principalmente atravs da gua at os vegetais

(AMNCIO et al., 2003).

A Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) aprovou o regulamento

tcnico sobre padres microbiolgicos para alimentos, atravs da Resoluo da Diretoria

Colegiada (RDC), n 12 de 02 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001a). Esta resoluo

estabelece planos de amostragem, no qual se define o nmero de unidades a serem analisadas,

bem como o tamanho destas; define os microrganismos que devem ser estudados para cada

tipo de alimento e estabelece os padres, normas e especificaes de acordo com outros

rgos internacionais que definiro se o produto ser aprovado ou no. Para as hortalias in

natura, no sanitizadas, esta legislao estabelece parmetro apenas para a Salmonella spp.,

18

que ausncia em 25g da amostra. Com relao presena de bactrias do grupo coliformes,

essa Resoluo somente apresenta padres para hortalias prontas para o consumo.

No Brasil, algumas pesquisas tm sido conduzidas para verificar a qualidade

higinico-sanitria das hortalias que so ingeridas in natura. Dentre os microrganismos

pesquisados, os coliformes termotolerantes so frequentemente includos. Vrios desses

estudos demonstram a relevncia deste problema, ou seja, a presena desses microrganismos,

muitas vezes em altos nmeros, nas amostras estudadas (TAKAYANAGUI et al., 2000;

NOGUEIRA, 2002; CABRINI et al., 2002; NASCIMENTO et al., 2005; PAULA, 2003;

SIMES et al., 2001; RIBEIRO et al., 2005).

Takayanagui et al. (2000), em Ribeiro Preto - SP analisaram 129 hortas identificando

irregularidades em 20,1% delas, destacando-se a elevada concentrao de coliformes

termotolerantes em 17% das mesmas. Cabrini et al. (2002) avaliando 42 amostras de alface

comercializada nos mercados da cidade de Limeira-SP, verificaram que quase 100% das

mesmas (41) apresentaram coliformes totais e 17 apresentaram E. coli. Simes et al. (2001),

em Campinas-SP, tambm investigaram a presena desse grupo de bactrias em hortalias e

condenaram pela anlise bacteriana 22,3% das amostras colhidas em hortas desta cidade.

Ribeiro et al. (2005) encontraram nmeros mais elevados no isolamento de coliformes

termotolerantes em 60 amostras de alface colhidas em hortas da Ilha de So Lus - MA, ou

seja, 83,3% de amostras positivas para o microrganismo.

Apesar de a Escherichia coli exercer um efeito benfico sobre o organismo,

suprimindo a multiplicao de bactrias prejudiciais e sintetizando algumas vitaminas,

existem algumas cepas que desenvolveram a habilidade de causar doena. Estas cepas

patognicas de E. coli podem ser divididas pelo menos em seis categorias diferentes com

esquemas patognicos distintos (SILVA et al., 2003; NATARO & KAPER, 1998).

Dentre as linhagens de E. coli patognicas as mais estudadas so: Escherichia coli

enterotoxignica (ETEC), Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC). Escherichia coli

enteropatognica (EPEC), Escherichia coli enterohemorrgica (EHEC ou VTEC),

Escherichia coli enteroagregativa (EaggEC) ( AMNCIO et al., 2003).

A E. coli enterotoxignica (ETEC) est normalmente associada s diarrias nos pases

em desenvolvimento e conhecida tambm como diarria do viajante. A E. coli

enteropatognica (EPEC) e a E. coli enteroinvasiva (EIEC) infectam principalmente crianas

19

menores de dois anos nos pases em desenvolvimento, sendo que a EPEC tem sido reportada

como causa importante de diarria no recm nascido (BALBANI & BUTUGAN, 2001). A

Escherichia coli enteroagregativa (EaggEC) uma linhagem que se dispe de poucos dados e

sua patogenicidade parece estar relacionada com a adeso mucosa intestinal, sendo esta

diferente das demais cepas, podendo causar diarria aquosa (LANDGRAF, 1996).

A Escherichia coli enterohemorrgica (EHEC ou VTEC), caracteriza-se pela produo

de uma toxina chamada de verotoxina (VT) ou "shiga-like" toxina (ST), similar produzida

pela bactria Shigella dysenteriae tipo I, associadas colite hemorrgica (HC) e Sndrome

Urmico Hemoltica (HUS) (WEAGANT et al., 1995; FENG, 1995).

O comportamento sorolgico da Escherichia coli enterohemorrgica identificado por

meio de antissoros preparados contra as trs variedades de antgenos que podem estar

presente: O, antgeno somtico; K, antgeno capsular e H, antgeno flagelar. Existem vrios

sorovares catalogados, sendo O26: H11 e O157: H7 os mais citados, destacando-se este

ltimo como agente etiolgico da grande maioria de surtos fora do Brasil (KOBAYASHI,

2001).

Estas cepas diferem das demais cepas de E.coli em algumas caractersticas,

destacando-se a no fermentao do sorbitol, a no produo da enzima -glicuronidase e o

seu crescimento pobre ou nulo a 44C (MARCH & RATNAM, 1986). A Escherichia coli

O157: H7 apresenta tambm a habilidade para se desenvolver em valores de pH prximos a 3

e 4, o que a distingue de outros patgenos e atribui-lhe a caracterstica cido-resistente

(DOYLE, 1989).

A sintomatologia decorrente da doena provocada pela Escherichia coli O157: H7

caracteriza-se inicialmente por um quadro severo e sbito de HC, acompanhado

posteriormente por diarria aquosa, sangramento e no caso de pacientes com a imunidade

mais baixa, pode evoluir para um grave acometimento renal, a HUS (FDA, 2006a).

A Escherichia coli O157 foi isolada pela primeira vez em 1975, nos Estados Unidos, a

partir de fezes de doentes que apresentavam diarria sanguinolenta. Entretanto, o seu

reconhecimento como microrganismo responsvel pela gnese desta enfermidade s ocorreu

na dcada de 80, associado a um surto ocorrido em estados americanos, aps o consumo de

hambrgueres contaminados pela bactria, oriundos de uma grande rede de fast-foods

(DOYLE, 1989; TAUXE, 1997).

20

Na dcada de 90 ocorreu um surto maior envolvendo 600 pessoas e quatro mortes,

provocadas tambm pelo consumo de hambrgueres em uma rede de lanchonete, o que

contribuiu para aumentar a sua importncia como patgeno de veiculao alimentar (BELL,

GOLDOFT, GRIFFIN, 1994). A partir da, as pesquisas demonstraram que o trato intestinal

de ruminantes, particularmente bovinos e ovinos, parece ser o principal reservatrio das cepas

enterohemorrgicas de E. coli O157: H7 (TAUXE, 1997).

A transmisso de E. coli O157: H7 em surtos e casos de HC e HUS, sempre esteve

relacionada principalmente ao consumo de produtos de origem animal, especialmente a carne

bovina e seus derivados, leite cru e iogurte (DOYLE, 1989; FDA, 1998). Nos ltimos 10

anos, no entanto, verificou-se um aumento significativo no nmero de surtos associados a

outros alimentos alm da carne, em particular as frutas, os sucos de frutas, os vegetais e as

saladas preparadas com vegetais (FDA, 2006a). Recentemente, o Food and Drug

Administration - FDA notificou um surto envolvendo 26 estados americanos, onde 183 casos

da doena provocada pela E. coli O157: H7 foram relatados, incluindo 29 casos com a

sndrome urmica hemoltica (HUS), tendo sido registrada uma morte. O surto foi atribudo

ao espinafre consumido cru ou em preparaes onde o mesmo era utilizado cru (FDA, 2006c).

Segundo informaes do Centers for Disease Control and Prevention (FDA, 2006b),

so estimados 73.000 casos de infeco por Escherichia coli O157: H7 e 61 mortes por ano

nos Estados Unidos. A infeco pode ocorrer atravs do consumo de alimentos contaminados

ou pela transmisso da bactria de uma pessoa para outra devido a hbitos higinicos

inadequados.

No Brasil, de maneira especfica, ainda no h relatos de surtos epidmicos

relacionados E. coli O157: H7 (AMNCIO et al., 2003).

O Centro de Vigilncia Epidemiolgica do Estado de So Paulo (CVE/SP, 2002),

registrou no perodo de 1998 a 2000, 15 casos de HUS em hospitais pblicos do Estado, com

histrico anterior de diarria e possvel associao com E. coli O157: H7. Nos casos em que

foi feita a coprocultura, a presena de E.coli foi detectada, mas o agente no foi isolado e/ou

sorotipado para confirmao.

No Rio Grande do Sul, um estudo retrospectivo de casos de HUS ocorridos no

Hospital Universitrio da Universidade Federal de Santa Maria, no perodo de maro de 1997

a agosto de 1999, apontou a existncia de 31 casos da doena em crianas com idade de dois

21

a 57 meses (CVE/SP, 2002). Esses relatos confirmam a existncia da sndrome hemorrgica

urmica - HUS no pas e deixam clara a necessidade de monitoramento dessa bactria em

diferentes produtos e regies (SILVA et al., 2003).

A dose infectante para a contaminao humana por Escherichia coli O157: H7 no

conhecida, porm avaliando-se dados de surtos, incluindo a habilidade do organismo de ser

transmitido de pessoa a pessoa, a dose pode ser similar quela de Shigella spp., ou seja,

apenas 10 organismos so suficientes para causar a doena (FDA, 2006a).

No perodo de janeiro de 1997 a outubro de 1999 foi feito uma investigao quanto a

ocorrncia de Escherichia coli 0157: H7 em 2.095 amostras de alimentos produzidos no sul e

sudeste do Brasil, incluindo 1.111 amostras de produtos crneos (hambrguer e lingia), 115

amostras do ambiente industrial (frigorficos) e 869 amostras de vegetais (alface, chicria e

rcula), porm no foi detectada a presena do patgeno em nenhuma das amostras analisadas

(SILVA et al., 2003).

3.2.2 Salmonella spp.

A Salmonella outro gnero de grande relevncia como patgeno alimentar

pertencente famlia Enterobacteriaceae; so bacilos Gram-negativos, no produtores de

esporos, anaerbios facultativos, produzem gs a partir da glicose (exceto Salmonella Typhi),

so capazes de utilizar o citrato como nica fonte de carbono, sendo a maioria mvel

(FRANCO & LANDGRAF, 1996).

O principal reservatrio desta bactria o trato gastrintestinal do homem e de animais,

principalmente aves e sunos. Este gnero abriga as espcies causadoras de febre tifide

(Salmonella Typhi), febres entricas (Salmonella Paratyphi A, B, C) e das enterocolites que

genericamente se enquadram no grupo das doenas designadas por salmoneloses (FRANCO

& LANDGRAF, 1996).

Pesquisas tm demonstrado que a Salmonella pode sobreviver por at 87 dias em gua

de abastecimento pblico, 115 dias em solo de jardim, acima de 30 meses em esterco bovino

seco e 28 meses em fezes de aves infectadas (FARIAS, 2000).

A dose infectante do microrganismo pode variar entre 15 a 20 clulas a depender da

22

idade e da imunidade da pessoa infectada e do tipo de cepa envolvida (FDA, 2006c). Estima-

se de dois a quatro milhes de casos de salmoneloses nos Estados Unidos anualmente, sendo

os sorotipos mais comuns o Typhimurium e o Enteritidis (CDC, 2005; FDA, 2006d,2006e).

No Brasil o sorotipo de Salmonella mais freqentemente isolado de casos de infeces

humanas e tambm de materiais de origem no humana, principalmente alimentos, a

Salmonella Enteritidis (BRASIL, 2002).

Levantamento realizado entre os anos de 1991 a 1995, pelo Instituto Adolfo Lutz de

So Paulo, com 2.254 linhagens isoladas de casos de infeces humanas e 3.236 de materiais

de origem no humana, evidenciou um aumento significativo na participao da S. Enteritidis,

ou seja, um incremento de 1,2% para 64,9% entre as amostras humanas e de zero para 40,7%

para as amostras no humanas, com expressivo aumento a partir de 1993, particularmente em

ovos, aves (matrizes) e amostras do meio ambiente (TAVECHIO et al., 1996).

Apesar da principal fonte de transmisso de Salmonella ser os alimentos de origem

animal, vrios estudos realizados com produtos de origem vegetal detectaram a presena da

bactria nos mesmos. Takayanagui et al. (2000), em Ribeiro Preto, SP, analisaram hortalias

provenientes de 129 hortas, encontrando a presena de Salmonella spp. em 3,1% das mesmas.

Bruno et al. (2005) tambm estudando vegetais minimamente processados, detectaram a

presena de Salmonella spp. em 66,6% das amostras de hortalias e tubrculos e em 26% das

frutas investigadas. Pal et al. (2002) encontraram Salmonella spp. em cinco (16,6%) das 30

amostras analisadas de vegetais crus (frutas e hortalias), comercializadas em restaurantes do

Rio de Janeiro, RJ. Sousa et al. (2002) investigaram a presena do microrganismo em sucos e

nctares de frutas comercializados por uma indstria em Belm-PA, e encontraram

positividade em 4,2 % das amostras analisadas.

Embora os sorotipos mais isolados no Brasil pertenam Salmonella Enteritidis, a

febre tifide provocada pela Salmonella Typhi tambm uma preocupao atual, pois se trata

de uma doena de distribuio mundial associada situao precria de saneamento bsico,

higiene pessoal e ambiental. Transmitida principalmente atravs da ingesto de gua ou de

alimentos contaminados com fezes humanas ou com urina. Ocorre no Brasil de forma

endmica, com algumas epidemias onde as condies so mais precrias (BRASIL, 2006a).

23

3.3 Prticas agrcolas: Condies higinicas sanitrias dos locais de produo, insumos e

manipuladores.

Pelo fato das hortalias serem produzidas sob diferentes condies climticas,

estruturais e utilizando-se prticas agrcolas diversas, pressupe-se que os perigos

microbiolgicos variem entre estes sistemas. Portanto, todos os procedimentos devem ser

conduzidos sob condies higinicas e estruturais satisfatrias, visando minimizar os riscos

potenciais a sade do consumidor (FDA, 1998).

Os riscos microbianos que afetam a segurana dos alimentos podem estar presentes em

qualquer ponto da cadeia produtiva, desde o cultivo, colheita, lavagem, armazenamento,

transporte, comercializao e finalmente na mesa do consumidor (RANTHUM, 2002).

Durante o cultivo, as fontes potenciais de contaminao devem ser identificadas.

Freqentemente observam-se irregularidades com a gua utilizada, o adubo, saneamento

bsico, a presena de animais nos locais de produo, alm de outras deficincias na infra-

estrutura dos locais de produo e manejo agrcola (MORETTI, 2003).

A produo agrcola de hortalias provoca um desgaste muito grande da matria

orgnica do solo, pelo uso intensivo da mesma rea (BRASIL, 1999). Dessa forma, visando

aumentar a produtividade e melhorar o cultivo, os agricultores optam muitas vezes pelo uso

de adubos orgnicos, como por exemplo, o esterco animal, pelo baixo custo e pela sua

eficcia como fertilizante (EMBRAPA, 2001b). Essa fonte de adubo indevidamente tratada

pode conter patgenos e contaminar as hortalias, como por exemplo, a Escherichia coli

0157: H7, que pode sobreviver por at 70 dias nas fezes destes animais (TAUXE, 1997).

Culturas rentes ao solo, como algumas hortalias folhosas, so mais vulnerveis a

patgenos que podem sobreviver no solo, ou serem borrifadas com terras contaminadas

durante a irrigao ou chuvas fortes (FDA, 1998). Terras que foram usadas para outras

atividades, como solos que anteriormente serviram como depsitos de lixo, podem apresentar

contaminao por bactrias patognicas, pois contm matria orgnica em decomposio e

possivelmente material fecal (EMBRAPA, 2001a).

A rea de cultivo quando situada em regies ngremes favorece o escoamento de guas

superficiais contaminadas, situao essa que se agrava com a presena de residncias

prximas a este local que no dispem de drenagem adequada para as guas servidas (LEITE,

24

2000). Acresce a isso a presena de animais circulando nas hortas ou em reas prximas, pois

suas fezes constituem uma fonte de patgenos que podem contaminar as hortalias (MORETI,

2003).

Outros fatores como a inexistncia de instalaes sanitrias adequadas para os

trabalhadores ligados ao cultivo e colheita das hortalias implica em m administrao dos

dejetos humanos, podendo aumentar bastante o risco de contaminao da lavoura (LEITE,

2000).

De acordo com Silva Jr. (2001), a sade e a higiene pessoal dos trabalhadores que

entram em contato direto com os alimentos devem ser monitoradas. Funcionrios que

apresentam algum tipo de molstia, como ferimentos na pele infeccionados, diarria, gripe e

vmito, podem veicular microrganismos para os alimentos, devendo, portanto, serem

encaminhados para avaliao mdica e se necessrio afastados de suas atividades.

3.4 gua de irrigao

A gua est se tornando, cada vez mais um bem escasso e sua qualidade vem se

deteriorando muito rapidamente (OPAS, 2001). Em razo do crescimento natural da

populao e dos altos ndices de contaminao das fontes de gua, a oferta deste produto de

boa qualidade, principalmente em reas urbanas constitui um grande desafio (FILIZOLA et

al., 2002).

De acordo com o relatrio Situao Global de Suprimento de gua e Saneamento

do ano 2000, da Organizao Pan-americana de Sade, 2,4 bilhes de pessoas no vivem em

condies aceitveis de saneamento, enquanto 1,1 bilhes de pessoas no tm acesso a um

adequado abastecimento de gua (OPAS, 2001).

A gua utilizada na lavoura envolve diversas operaes, tais como: irrigao,

aplicao de pesticidas, fertilizantes e lavagem das hortalias (MORETTI, 2003). O principal

objetivo da irrigao consiste em fornecer gua s culturas de forma eficiente. Para satisfazer

a esta demanda cerca de 70% do consumo hdrico do mundo destina-se a esta finalidade

(GINESTE, 2004). A agricultura irrigada, em muitas situaes, a nica maneira de se

garantir a produo de alimentos, em bases sustentveis e com segurana, mesmo em perodos

de escassez de chuvas (AMORIM, 2003).

25

Os recursos hdricos utilizados para a irrigao, encontram-se segundo Oliveira et al.

(2001), na sua grande maioria, a partir de guas provenientes de rios, crregos e lagos

adjacentes s plantaes, sem nenhum tratamento prvio, podendo esta ser uma fonte

potencial de contaminao. Este problema torna-se ainda mais grave nos cintures verdes dos

grandes centros urbanos, onde quase toda a gua superficial est severamente contaminada

por efluentes municipais no tratados (MAROUELLI & SILVA, 1998).

De acordo com alguns pesquisadores, a contaminao microbiolgica das hortalias

durante o seu cultivo ocorre principalmente devido irrigao com gua contaminada ou

quando se utiliza adubo como dejetos humanos (FDA, 1998; OLIVEIRA & GERMANO,

1992; SILVA et al., 2005).

Os principais fatores que contribuem para contaminao microbiana destas guas so

as condies ecolgicas em que se encontram as fontes de gua, tais como: proximidade com

reas domsticas, poluentes do tipo lixo, currais, canais, esgotos, fossas, presena de adubo

orgnico prximo s fontes, declive acentuado do solo, presena de animais, poos artesianos

com as instalaes precrias e utilizao de gua proveniente de rios e riachos contaminados

(OLIVEIRA et al., 2001).

As guas residurias domsticas, quando utilizadas sem tratamento adequado, podem

contaminar o ambiente por concentrarem bactrias, parasitas e vrus que geram graves

problemas de sade pblica, uma vez que propagam enfermidades de veiculao hdrica, que

podem afetar no s os trabalhadores, mas tambm, os provveis consumidores das culturas

irrigadas (SOUSA et al., 2006).

No planejamento de irrigao todas as medidas devem ser tomadas para reduzir a

demanda de gua potvel para este fim, optando-se por vias alternativas, incluindo o reuso de

guas servidas. No entanto, as mesmas devem ser tratadas antes de serem utilizadas, medida

que nem sempre ocorre (SOUSA et al., 2006).

3.4.1 Qualidade microbiolgica e doenas veiculadas pela gua de irrigao

O transporte de microrganismos patognicos pela gua representa um fator importante

no comprometimento dos recursos hdricos e na disseminao de processos infecciosos, em

26

especial quando sistemas de abastecimento de gua e tratamento de esgotos so precrios

(RIVERA & MARTINS, 1996).

Os principais agentes biolgicos encontrados nas guas contaminadas so as bactrias,

os vrus e os parasitos (OMS, 2000). As doenas de veiculao hdrica so causadas

principalmente por microrganismos patognicos de origem entrica, animal ou humana,

transmitidas basicamente pela rota fecal-oral, ou seja, os microrganismos so excretados nas

fezes de indivduos infectados e ingeridos na forma de gua ou alimento contaminado por

gua poluda com fezes (AMARAL et al., 2003).

Nos pases em desenvolvimento, em conseqncia das precrias condies de

saneamento e da m qualidade das guas, as doenas de veiculao hdrica, como a febre

tifide, clera, salmonelose, hepatite A e verminoses, tm sido responsveis por diversos

surtos e elevadas taxas de mortalidade infantil. Nesses pases, as doenas diarricas

acometem em torno de 1,5 bilhes de crianas com at cinco anos de idade a cada ano (OMS,

2000).

Vrias agentes patognicos podem estar presentes em fontes de gua ou em guas

residurias, sendo que os principais envolvidos em surtos so: Shigella spp., Salmonella spp.,

Campylobacter spp., Escherichia coli, Vibrio cholerae, dentre outros (OMS, 2003;

MORETTI, 2003). Dessa forma, sempre que a gua permanecer em contato com produtos

agrcolas frescos, sua qualidade poder influenciar diretamente no potencial de contaminao

destes produtos (EMBRAPA, 2001a), especialmente quando a parte comestvel do alimento

exposta em contato direto com a gua contaminada, ou quando a irrigao realizada prxima

ao horrio de colheita (FDA, 2001).

Segundo, Steele & Odumeru (2004), o risco da transmisso de doenas causadas por

microrganismos patognicos presentes na gua de irrigao influenciado pelo nvel de

contaminao das mesmas, pela persistncia do patgeno na gua, no solo, na colheita e de

acordo com a rota da exposio.

27

As tcnicas de isolamento e identificao dos microrganismos patognicos a partir da

gua so complexas, onerosas e a obteno dos resultados demanda muito tempo, por isto ao

invs de verificar a presena de agentes patognicos, pesquisa-se a presena de

microrganismos indicadores de poluio fecal, representado pelos coliformes termotolerantes

(MARQUES, 2003).

A presena de coliformes totais nos alimentos no indica, portanto, a contaminao

fecal recente ou ocorrncia de enteropatgenos, sendo assim, a enumerao de coliformes

totais em gua menos representativa como indicao de contaminao fecal comparada

coliformes termotolerantes (LANDGRAF, 1996).

O padro microbiolgico para a gua de irrigao, vigente no Brasil, foi

regulamentado pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA), atravs da

Resoluo no. 357 de 17 de maro de 2005 (CONAMA, 2005). Esta normativa estabelece a

classificao das guas com base nos usos preponderantes, estabelecendo nveis de qualidade

a ser alcanado e ou mantidos. Assim a gua destinada irrigao de hortalias consumidas

cruas, recebe a classificao de Especial, tipo1, no devendo exceder um limite de 200

coliformes termotolerantes por 100 mililitros em 80% ou mais, em pelo menos seis amostras

coletadas durante o perodo de um ano, com freqncia bimestral.

Vrios estudos tm demonstrado a contaminao da gua de irrigao em hortas no

Brasil. Leite (2000) verificou atravs da anlise microbiolgica a presena de bactrias do

grupo coliformes totais em 93,5% das guas e coliformes fecais em 65,2% delas. Nogueira

(2003), em estudo com hortas no municpio de Jaboticabal, SP, encontrou 22,9% de

coliformes fecais na gua de irrigao no perodo chuvoso e 23,5% em perodo sem chuva.

Marques (2002), em Goinia Go encontrou em seu estudo 93,2% de contaminao

por coliformes termotolerantes e 86,41% de Escherichia coli na gua de irrigao de

hortalias.

Farache Filho et al. (2001) verificaram que entre as 47 hortas pesquisadas, 40,4%

tiveram pelo menos uma das amostras de gua acima do padro brasileiro vigente. Solomon et

al. (2002), estudando a transmisso de Escherichia coli O157: H7 s plantas atravs de dois

sistemas diferentes de irrigao, demonstraram a possibilidade de contaminao em ambos,

sendo que em um deles (sistema de pulverizao), um percentual significativo das culturas

permaneceu com a bactria at 20 dias aps a irrigao. Os resultados deste estudo sugerem

28

que no obstante o mtodo da irrigao usado, as colheitas podem se tornar contaminadas.

3.5 Consideraes sobre o controle sanitrio na produo de hortalias e doenas

veiculadas por alimentos

Um alimento pode apresentar risco sade por razes como: contaminao ou

crescimento microbiano; uso inadequado de aditivos qumicos; adio acidental de produtos

qumicos; poluio ambiental ou degradao de nutrientes. H um consenso geral de que o

problema mais importante do ponto de vista de sade pblica a ingesto de alimentos

contaminados por microrganismos patognicos (FRANCO & LANDGRAF, 1996).

A deficincia no controle da qualidade sanitria em qualquer uma das etapas da cadeia

alimentar, durante o cultivo, colheita, armazenamento, transporte e comercializao um

fator predisponente ocorrncia de casos ou surtos de doena veiculada por alimento (DVA)

(BRASIL, 2002).

A identificao dos riscos inerentes a um processo produtivo constitui ferramenta

valiosa para reconhecer as aes preventivas que possam ser implementadas (COSTA, 1999).

Entretanto, o desenvolvimento de estratgias para reduzir os riscos relacionados com a

alimentao, requer o conhecimento prvio de dados sobre as DVAs do local, para evidenciar

o problema sade pblica e facilitar o desenvolvimento de aes baseado nos riscos que

aquele alimento oferece (OMS, 2002).

As ltimas notificaes de doenas transmitidas por alimentos, no mundo, indicam o

surgimento de um novo cenrio epidemiolgico, caracterizado principalmente pela rapidez de

propagao, alta patogenicidade e carter cosmopolita dos agentes patognicos, com especial

destaque aos infecciosos, como Listeria monocytogenes e Salmonella spp. (LOPES, 2005).

A evoluo da dinmica das DVAs, incluindo o surgimento dos novos patgenos

acima referidos, a globalizao da economia e o intercmbio internacional, aumentam o risco

de contaminao dos alimentos (LOPES, 2005). H de se considerar tambm o crescente

aumento da populao implicando na necessidade de produo em grande escala de

alimentos, o aumento no consumo de fast-foods, processos de urbanizao desordenados, a

existncia de grupos populacionais vulnerveis ou mais expostos devido ao aumento da

expectativa de vida atravs do consumo de novas drogas e diagnsticos mais precoces, e o

29

deficiente controle dos rgos pblicos e privados (BRASIL, 2006b).

Outro fator contribuinte para o aumento das DVAs est relacionado a mudana de

hbitos alimentares, especificamente o aumento no consumo de vegetais frescos, frutas e

verduras sem a adequada higienizao ( BRASIL, 2006b; BUCK et al., 2003 ).

A vigilncia das DVAs fundamental para o fornecimento de alimentos incuos, pois

serve como eixo para direcionar as aes mais prioritrias, avaliar os programas preventivos

e de controle implementados, auxiliando tambm na identificao de questes que podem

surgir relacionadas inocuidade dos alimentos (OMS, 2004).

Na maioria das vezes, em funo da ausncia de sistemas de vigilncia sanitria ou

debilidade dos programas de controle das DVAs, principalmente nos pases em

desenvolvimento, as informaes mundiais existentes no representam a magnitude do

problema, estimando-se uma incidncia de 10% nos pases com sistemas de informao mais

eficientes e apenas 1% nos demais pases com sistemas incipientes, como o caso do Brasil

(RANTHUM, 2002).

O perfil epidemiolgico das DVAs no Brasil pouco conhecido, somente alguns

estados dispem de estatsticas e dados sobre os agentes etiolgicos mais comuns, alimentos

mais freqentemente implicados, populao de maior risco e fatores contribuintes (BRASIL,

2002).

O Art. 6, Pargrafo 1 da Lei Federal n 8.080 de 19/09/1990, que dispe sobre as

condies para a promoo, proteo e recuperao da sade, define a Vigilncia Sanitria

como um conjunto de aes capaz de eliminar, diminuir ou prevenir riscos a sade e de

intervir nos problemas sanitrios decorrentes do meio ambiente, da produo e circulao de

bens e da prestao de servios de interesse da sade. Esta atribuio da vigilncia sanitria

lhe confere um papel fundamental para que os alimentos oferecidos populao sejam

seguros e com qualidade (BRASIL, 1990).

Contudo, segundo Silva (1998), a ocorrncia de doenas infecciosas transmitidas por

alimentos pode ser vista como falha na implantao das medidas de inspeo e controle

vigentes no pas.

30

3.6 Sanitizao de hortalias

O risco de toxinfeces humanas por patgenos de origem alimentar, pode ser

reduzido prevenindo-se a contaminao dos alimentos, controlando o crescimento dos

microrganismos patognicos, removendo-os ou diminuindo-os atravs das lavagens e uso de

sanitizantes (BEUCHAT, 2004).

De acordo com o FDA (1988), a preveno da contaminao das hortalias

prefervel aplicao de agentes qumicos antimicrobianos, porm isto nem sempre

alcanado, devido existncia de falhas no controle das etapas que antecedem o consumo .

Segundo Silva Jr. (2001), a higienizao dos alimentos se caracteriza principalmente, pelos

processos atravs dos quais os alimentos se tornam higienicamente e sanitariamente

adequados para o consumo, utilizando-se vrias tcnicas de processamento, dentre estas os

produtos para limpeza e desinfeco dos alimentos.

A lavagem em gua corrente de boa qualidade pode reduzir em at 74% a carga

microbiana dos vegetais (LEITO et al., 1981), porm, no suficiente para manter a

contaminao em nveis seguros, sendo essencial aplicao de uma etapa de desinfeco

com agentes antimicrobianos (LEITO et al., 1981, TAKEUSHI & FRANK, 2001).

De acordo com o estudo realizado por NASCIMENTO (2002), aps a lavagem de

hortalias em gua corrente, as mesmas permaneceram com altos ndices de contaminao,

atribudas s etapas de produo, transporte e comercializao. Concluindo desta forma, que

apenas a lavagem em gua corrente no foi suficiente para diminuir a carga microbiana a

nveis seguros.

No entanto, Leito et al. (1981), ressaltam que a pr-lavagem em gua corrente um

requisito essencial para retirada da matria orgnica na superfcie das hortalias, diminuindo

assim a inativao dos sanitizantes qumicos utilizados posteriormente na etapa da

sanitizao. Para Brenes (2002), os agentes sanitizantes so substncias qumicas que podem

destruir ou reduzir substancialmente a populao de microrganismos presentes na gua de

lavagem e resfriamento, reduzindo a contaminao cruzada, como tambm podem reduzir,

mas no eliminar os patgenos da superfcie dos produtos.

A eficcia dos sanitizantes em produtos de origem vegetal frequentemente

questionada, em parte atribuda inacessibilidade dos sanitizantes na estrutura interna ou nos

31

tecidos destes vegetais, que podem abrigar patgenos (TAPIA DE DAZA & DIAZ, 1994).

Burnett & Beuchat (2000), destacam a presena da cutcula hidrofbica dos vegetais, as

superfcies morfolgicas diferentes e as abrases na epiderme dos vegetais, como fatores

limitantes para a eficcia dos sanitizantes. Outro fator importante so as prticas de

manipulao durante o processo de sanitizao dos alimentos, pois quando realizadas

inadequadamente, podem significar uma fonte potencial de contaminao (FDA, 1988;

LUENGO & LANA, 2007).

De acordo com Santana et al. (2002) a sanitizao de vegetais, sob o ponto de vista de

segurana alimentar, considerada etapa crtica do processamento, assim tambm como os

aspectos de higiene pessoal na manipulao do produto. Estatsticas de pases industrializados

revelam que 60% das intoxicaes alimentares so atribudas manipulao incorreta de

alimentos, sugerindo um ndice ainda mais elevado para os pases em desenvolvimento, em

funo das precrias condies de infra-estrutura e educao dos seus habitantes

(NASCIMENTO et al., 2002).

3.6.1 Agentes sanitizantes e a sua eficincia na eliminao de patgenos

A lavagem dos vegetais a prtica mais comum para se obter um produto mais seguro,

entretanto, a eficcia da operao de lavagem pode ser aumentada acrescentando solues

sanitizantes, objetivando a reduo e ou eliminao de microrganismos presentes nestes

alimentos (BERBARI et al., 2001).

A atividade germicida de sanitizantes utilizados na indstria de alimentos depende de

vrios fatores, entre estes: concentrao, tempo, temperatura, pH, solubilidade, concentrao

de matria orgnica, tipo de superfcie e espcie e populao do microrganismo que se quer

destruir (BEUCHAT et al., 2001; BRENES, 2002).

Segundo a Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 1995), um

sanitizante para ser considerado eficaz dever reduzir 99,999%, ou seja, cinco ciclos

logartmicos, da populao microbiana inicial. Vrios agentes sanitizantes vm sendo

utilizados na higienizao de frutas e hortalias, sendo os mais comumentes utilizados aqueles

base de cloro (BRENES, 2002). Porm, segundo Beuchat et al. (1988), o cloro utilizado nas

concentraes recomendadas (

32

no elimina mais do que dois ciclos logartmicos da microbiota de frutas e vegetais.

No estudo conduzido por Nascimento et al. (2003), foi realizada uma avaliao

comparativa da eficincia do hipoclorito de sdio a 200 mg L -1, dicloroisocianurato de sdio

a 200 mg L -1, cido actico 2,0% e 4,0%, cido peractico 80 mg L -1 e vinagre 6,0%, 25,0%

e 50,0% na sanitizao de uva. A anlise estatstica dos resultados demonstrou que todos os

sanitizantes testados apresentaram eficincia semelhante ou superior ao hipoclorito de sdio.

Fantuzzi et al. (2004) observaram que aps a sanitizao do repolho por 10 minutos,

temperatura ambiente, em solues sanitizantes de hipoclorito de sdio a 200 mg L-1,

composto orgnico clorado a 200 mg L-1 ou cido actico a 1%, a reduo de microrganismos

aerbios mesfilos foi de no mximo 1,8 log10 UFC g-1. Takeuchi & Frank (2001) avaliaram

o efeito do hipoclorito de sdio (200 mg L-1 de cloro residual livre/ 5 min/ 22C) sobre E.coli

O157: H7 inoculada na superfcie intacta e em cortes de folhas de alface, observando 0,3 e 0,4

redues decimais, respectivamente.

Segundo alguns pesquisadores, em adio ao limitado efeito da lavagem com

hipoclorito, o sistema pode produzir substncias carcinognicas como trihalometanos,

(FERRARIS et al., 2005; DUNNICK & MELNICK, 1993). Tais substncias so denominadas

subprodutos da clorao, originrias das reaes entre o cloro e as substncias orgnicas

presentes na gua, os cidos hmico e flvico (MACEDO et al., 2001).

H, portanto, um grande interesse em desenvolver sanitizantes alternativos para a

lavagem de vegetais e frutas, por parte das indstrias de alimentos, que sejam mais eficazes

que o hipoclorito para reduzir ou eliminar patgenos em produtos frescos, e que no possuam

efeitos deletrios ao organismo humano (NASCIMENTO et al., 2003).

Neste aspecto destacam-se os cidos orgnicos de cadeia curta, que embora no sejam

considerados sanitizantes, tm sido muito utilizados em estudos de reduo de populao

bacteriana em alimentos (FDA, 2001; NASCIMENTO et al., 2003).

Os cidos orgnicos de cadeia curta so produzidos a partir do metabolismo natural

das frutas e hortalias, entre estes se destacam: os cidos actico, benzico, ctrico, mlico,

srbico, succnico e tartrico (FDA, 2001). Os mesmos proporcionam uma proteo natural

contra a proliferao de patgenos bacterianos, visto que, a maioria destes microrganismos

no pode se desenvolver a um pH inferior a quatro, embora alguns tipos possam adaptar-se a

33

este pH e provocar enfermidades (BRENES, 2002).

A eficcia dos cidos orgnicos como sanitizantes ou antimicrobianos varia

amplamente com o tipo de cido empregado e com a clula bacteriana presente (BRENES,

2002). So compostos com caractersticas lipoflicas solveis em sua forma no dissociada, o

que permite sua entrada na clula, interferindo na fosforilao oxidativa, inibindo o transporte

de eltrons e a produo da adenina dinucleotdeo reduzido - NADH. Esse comprometimento

da atividade metablica em combinao com a acidificao do contedo celular resulta na lise

da clula (NASCIMENTO, 2002).

A atividade antimicrobiana dos cidos orgnicos pode ser classificada em duas

categorias: ao bacteriosttica, inibio do crescimento bacteriano e ao bactericida, que

seria a reduo do nmero de clulas viveis (BJORNSDOTTIR, 2005).

O vinagre e o suco de limo contendo os cidos actico e ctrico, respectivamente, so

usados como flavorizantes e acidificantes para saladas de vegetais e podem ser considerados

como sanitizantes alternativos para remover ou pelo menos reduzir a carga de patgenos, no

causando risco sade dos consumidores (SEGUN & KARAPINAR, 2004). Essas

substncias so geralmente reconhecidas como seguras ou General Recognized as Safe

(GRAS) pelo Cdigo Federal de Regulamentaes dos Estados Unidos. No Brasil, o cido

ltico e o cido peractico tm seu uso aprovado como sanitizantes para ovos, carcaas e

partes de animais de aougue, atravs das Resolues RDC n 7 de 02 de janeiro de 2001 e

RDC n 02 de 08 de janeiro de 2004 da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria,

respectivamente (BRASIL, 2001a, BRASIL, 2004). Porm em outros pases, o vinagre e o

cido actico podem ser utilizados. Esses produtos ganharam aceitao no comrcio

internacional tanto em funo das controvrsias da toxidade do cloro em alimentos, como

tambm por serem considerados to eficazes e seguros quanto o cloro (NASCIMENTO,

2002).

A atividade antimicrobiana dos cidos orgnicos de cadeia curta vem sendo estudada

por vrios pesquisadores. Silva et al. (2001), avaliaram a sanitizao de carcaas de frango

com solues de cidos orgnicos comerciais e suco de limo, e concluram que todos os

tratamentos foram eficientes na reduo da contaminao inicial, com destaque para o cido

actico que eliminou cepas de Salmonella spp. Castillo & Escartin (1994), avaliaram a

sobrevivncia do Campylobacter jejuni em mamo e em melancia aps a aplicao do suco

34

do limo superfcie de cubos inoculados das frutas, e observaram reduo significativa nas

contagens desta bactria durante o armazenamento das frutas.

Segun & Karapinar (2004) avaliaram a eficcia do suco de limo, vinagre e a mistura

de limo com vinagre na eliminao de Salmonella Typhimurium inoculada artificialmente

em rcula e cebola, conseguindo redues significativas, principalmente na mistura do

vinagre com o limo. Vijayakumar & Hall (2002), avaliando o efeito bacteriosttico e

bactericida da concentrao mnima de sanitizantes, incluindo o vinagre e suco de limo,

contra cepas de Escherichia coli em caldo tripticasena de soja (TSB), demonstraram que

estes sanitizantes em concentraes relativamente baixas apresentavam atividade bactericida

contra as cepas testadas.

Eiroa & Porto (1995), avaliaram o efeito bactericida de diferentes desinfetantes a base

de cloro e vinagre contra linhagens de Vibrio cholerae inoculados em alface e concluram que

o vinagre foi o melhor dos produtos avaliados, seguido em ordem decrescente de eficincia

pelos compostos base de dicloroisocianurato de sdio e hipoclorito de sdio.

35

4 MATERIAL E MTODO

4.1 Material

4.1.1 Alimentos

Alface crespa (Lactuca sativa), couve (Brassica oleracea), coentro (Coriadrum

sativum) e hortel (Mentha villosa).

4.1.2 Cepas dos microrganismos de referncia

Escherichia coli 0157: H7, Escherichia coli ATTCC 23229, Salmonella spp.,

Salmonella Typhi.

4.1.3 Solues de tratamento

Vinagre de lcool (Marca Minhoto); Limo, variedade Taiti

4.1.4 Formulrio estruturado tipo check-list

4.1.5 Meios de cultura e reagentes

Caldo Tripticase de Soja (TSB) (OXOID),

Caldo Tetrationato (MERCK)

Caldo Rappaport (MERCK)

Caldo Lauril Sulfato Triptose (MERCK),

Caldo EC (MERCK)

Caldo Lactosado Bile Verde Brilhante a 2% (MERCK)

Brain Heart Infusion Broth (BHI) (DIFCO)

gar entrico Hektoen ( HE) (MERCK)

36

gar Salmonella Shigella (SS) (MERCK)

gar Verde Brilhante (MERCK)

gar Tryptic Soy (TSA) (OXOID)

Meio SIM (DIFCO)

gar Eozina Azul de Metileno (EMB) (DIFCO)

gar MacConkey sorbitol (HIMEDIA), adicionado de 0,05mg/L de Cefixina

Agar Triple Sugar Iron (TSI) (DIFCO)

gar Lisina-ferro (LIA) (DIFCO)

Caldo VM-VP (Vermelho de metila/Voges Proskauer) (DIFCO)

gar Uria (DIFCO)

Agar Citrato de Simmons (DIFCO)

gua Peptonada Tamponada (DIFCO)

Tampo Fosfato de Butterfield (DIFCO)

Soluo alcolica de alfa-naftol

Hidrxido de potssio a 40%

Reagente de Kovacs (MERCK)

Reagente Vermelho de Metila

Hidrxido de sdio 0,1 N

Fenolftalena 1%

gua Peptonada a 0,1%

37

4.1.6 Equipamentos

Balana semi-analtica Marca: SANTER RC 2022

Autoclave vertical Marca FANEM

Autoclave vertical - Marca FABBE, modelo 106751

Estufa de incubao tipo BOD Marca: NOVA TICA, modelo NT 515

Banho-maria circulante Marca: FANEM, modelo 146

Incubadora Digital tipo shaker Marca INOVA, modelo 4080

Cmera de fluxo laminar Marca: TROX TECHNICK

Cabine de fluxo laminar - Marca: TROX, modelo classe biolgica II

Homogeneizador de amostras Marca: NOVA TICA

Balana semi-analtica Marca: MARTE, modelo 200

Balana analtica - Marca METTLE H15

Contador de colnias Marca PHOENIX, modelo EC 550

Agitador mecnico de tubos Marca PHOENIX, modelo AP 56

Estufa bacteriolgica Marca FANEM, modelo 002 CB

Potencimetro Marca: ANALYSER, modelo 300 M

Cmera cientfica Marca: INDREL RC 1500 D

E demais equipamentos comuns em laboratrio de microbiologia.

38

4.2 Mtodos

4.2.1 Local do estudo

Foi utilizado como local de estudo hortas comerciais, particulares, situadas na cidade

de Salvador-Ba, no Distrito Sanitrio Cabula Beiru (DSCB). O DSCB localiza-se na regio

central da cidade, correspondendo a uma rea de 25,3 km, com uma populao estimada em

385.109 habitantes (Bahia, 2006).

4.2.2 Desenho do estudo

Este estudo foi desenvolvido em duas etapas. Na primeira etapa, foi realizado um

estudo transversal de carter descritivo, onde foram avaliadas as condies higinico-

sanitrias das hortas e realizada investigao da qualidade higinico-sanitria das hortalias e

gua de irrigao. Na segunda etapa, foi feito um estudo experimental, onde avaliou-se a ao

do vinagre de lcool, suco de limo, mistura suco de limo e vinagre (1:1) e mistura suco de

limo, vinagre e gua (1:1: 1), sobre cepas de Escherichia coli inoculadas artificialmente em

folhas de alface cortadas.

4.2.3 Cadastramento e caracterizao higinico-sanitria das hortas

Para o cadastramento das hortas, foi aplicada a metodologia de busca ativa e

informaes prestadas pelas unidades de sade situadas no DSCB. Buscou-se atravs da

aplicao de um formulrio semi-estruturado (check-list), investigar as condies higinico-

sanitrias dos locais de produo das hortalias, objetivando detectar a presena de fatores de

riscos relacionados ao ambiente de produo (presena de focos de insalubridade, origem da

gua de irrigao, tipo de adubo, topografia do terreno, sade e hbitos higinico-sanitrio dos

trabalhadores), Este formulrio foi adaptado dos modelos propostos pela Diviso de

Vigilncia Sanitria da Bahia destinados inspeo em estabelecimentos da rea de alimentos

(BAHIA, 1996), e tambm de um check-list destinado ao Clube dos Produtores Relatrio

de Vistorias da cidade de Porto Alegre - RS (SONAE DISTRIBUIO BRASIL S.A., 2005).

Na aplicao desse formulrio foram atribudas notas a cada item investigado e, de acordo

39

com a pontuao final obtida, a horta era classificada: excelente (9,0 a 10,0); boa (7,0 a 8,9);

regular (5,0 a 6,9); ruim (3,0 a 4,9) e pssima (0,0 a 2,9).

Amostragem

a.Critrios para a seleo das hortas:

- Hortas com fins comerciais;

- Volume da produo de hortalias.

b. Critrios de incluso:

-Hortas produtoras de alface, couve, coentro e hortel;

- Hortas com maior volume de produo.

c. Critrios de excluso:

-Hortas no produtoras das hortalias selecionadas;

- Hortas com pequena produo.

d- Tamanho da amostra

Atendendo aos critrios acima, foram cadastradas 10 hortas e destas cinco (50%)

foram selecionadas para o estudo.

4.2.4 Investigao da qualidade higinico-sanitria das hortalias e gua de irrigao

Amostragem

a. Critrios para seleo das hortalias:

As variedades de hortalias para o estudo foram escolhidas levando-se em

considerao os seguintes fatores:

1) A forma de consumo, geralmente ingeridas cruas;

2) O freqente consumo por parte da populao;

40

3) A disponibilidade durante, praticamente, todos os meses do ano;

4) Hortalias que permanecem em contato direto com o solo, cujas folhas constituem a

parte comestvel e que, por sua estrutura fsica, oferece condies para reteno e

sobrevivncia de microrganismos nelas depositadas.

Dessa forma, as hortalias selecionadas foram: alface, coentro, couve e hortel.

b.Tamanho da amostra

Hortalias

Foi coletado um total de 140 amostras das hortalias selecionadas. Essas coletas foram

feitas em dias distintos, sendo que cada horta foi visitada por no mnimo cinco vezes, e a cada

visita coletava-se quatro amostras das diferentes hortalias. Estabeleceu-se, como unidade

amostral para as alfaces, o p (ou touceira), independentemente do peso ou tamanho que

apresentassem. Para a couve, hortel e coentro, considerou-se o mao, constitudo de folhas

agrupadas com peso aproximado de 200g. O tamanho da amostra foi baseado no plano de

amostragem proposto pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA), atravs do

Regulamento Tcnico sobre Padres Microbiolgicos para Alimentos, Resoluo da Diretoria

Colegiada (RDC) no.12 de 02 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001a). Cada horta estudada foi

considerada como um lote, visto que as mesmas condies de cultivo eram aplicadas.

gua de irrigao

Em cada horta foram coletadas 10 amostras da gua de irrigao para anlise, exceto

em uma das hortas que s foi possvel coletar cinco amostras, totalizando-se 45 amostras. As

coletas da gua de irrigao foram realizadas concomitantemente com as das hortalias, sendo

duas amostras por cada visita.

Coleta das amostras

Hortalias

A coleta das hortalias foi feita de forma aleatria, procurando-se pontos eqidistantes

da horta para se ter uma melhor representatividade.

41

Com o auxlio de uma faca previamente esterilizada, as amostras foram coletadas

utilizando-se sacos plsticos individuais de 1 uso para coleta e acondicionamento das

mesmas. No momento da coleta as mos dos manipuladores foram protegidas por sacos

plsticos de 1 uso, evitando-se o contato direto com a amostra, de acordo com a tcnica

preconizada por Messer et al. (1992). Aps a coleta, as amostras foram imediatamente

transportadas para o laboratrio em caixas de isopor contendo gelo reciclvel, e submetidas s

anlises pertinentes.

gua de irrigao

As amostras foram retiradas de pontos diferentes e de acordo com a disponibilidade de

cada horta, sendo assim os pontos de escolha ficaram distribudos entre: diretamente das

fontes (cisternas, riachos, torneira e minadouros) e durante a irrigao atravs das mangueiras

utilizadas. Para a coleta das amostras utilizaram-se sacos estreis, especficos para este fim e

acrescentado de tiossulfato de sdio (0,5%) quando se tratava de gua potvel. No momento

da coleta as mos dos manipuladores foram protegidas por sacos plsticos de 1 uso, evitando-

se o contato direto com a amostra (MESSER et al., 1992). As amostras foram acondicionadas

em caixa de isopor contendo gelo reciclvel e transportadas imediatamente para o laboratrio

para proceder s anlises pertinentes.

Anlises microbiolgicas

Hortalias

Ao chegar ao laboratrio foram removidas as folhas externas das hortalias e

selecionadas aquelas situadas na parte interna para proceder s anlises microbiolgicas.

Investigao da presena de Salmonella spp.

A investigao da presena de Salmonella spp. foi baseada na metodologia preconizada por

Flowers et al. (1992), modificado por Instituto Nacional de Controle de Qualidade de Sade

(INCQS), procedendo-se o pr-enriquecimento em gua peptonada tamponada 0,1% ( 35C

por 24h), enriquecimento em caldo tetrationato (35C por 24h), caldo Rappaport, ( 42C por

24h) e isolamento em gar entrico Hektoen (HE), gar Samonella-Shiguella (SS) e gar

Verde Brilhante (BG), incubados a 35C por 24h. As colnias caractersticas foram

42

confirmadas preliminarmente pelo teste da urease e reao em Trplice Acar Ferro (TSI). A

confirmao final foi realizada em gar Lisina Ferro (LIA), produo de sulfito, indol e

motilidade em meio SIM, reduo do malonato, produo de acetona e reduo do vermelho

de metila (Voges - Proskauer/ Vermelho de Metila) e utilizao do citrato como nica fonte

de carbono (Meio Citrato de Simons ).

Investigao da presena de coliformes termotolerantes em hortalias:

A anlise foi fundamentada na determinao do Nmero Mais Provvel (NMP) de

coliformes termotolerantes, segundo a tcnica recomendada por Hitchins et al. (1992),

utilizando-se trs tubos por diluio. As amostras foram diludas em tampo fosfato de

Butterfield. Os tubos positivos (turvos com produo de gs), incubados a 35C durante 24h,

foram registrados e ento determinados o NMP/g de acordo com a tabela de Hoskins.

-Determinao de Escherichia coli

De acordo com Hitchins et al. (1992), os tubos positivos de EC foram estriados

separadamente em placas contendo o meio de cultura gar Eozina Azul de Metileno (EMB)

que foram incubadas a 35 C por 24 horas. Colnias nucleadas com centro preto com ou sem

brilho metlico, foram selecionadas para a confirmao do microrganismo. Foram realizados

os testes bioqumicos do IMViC para confirmao final, sendo consideradas como

Escherichia coli as culturas indol positivo ou negativo, VM positivo, VP negativo e citrato

negativo.

gua de irrigao

Investigao da presena de coliformes totais, termotolerantes e Escherichia coli

As anlises para a investigao de coliformes totais e termotolerantes foi feita

utilizando-se a metodologia do Nmero Mais Provvel (NMP), segundo a tcnica

recomendada por CLESCERI et al. (1988) para gua bruta, utilizando-se cinco tubos por

diluio. Para a primeira srie de cinco tubos foi adicionado 10 mL da amostra em 10 mL de

caldo LST em dupla concentrao. Na segunda srie de cinco tubos, adicionou-se 1 mL da

amostra em 10 mL de caldo LST em concentrao simples. Os tubos foram incubados a 35C

por 24 horas para observar se houve crescimento com produo de gs. Foram considerados

43

positivo-presuntivos os tubos que apresentaram crescimento e formao de gs. A

confirmao de coliformes totais foi realizada em caldo lactosado bile verde brilhante

(CLBV) a 2%, determinando-se o NMP/100 mL de coliformes totais atravs da tabela de

Hoskins.

Para a gua tratada, utilizou-se cinco tubos contendo 10 mL de caldo LST em dupla

concentrao e acrescentou-se 10 ml da amostra. Os tubos foram incubados a 35C por 24

horas para observar se houve crescimento com produo de gs. Foram considerados positivo-

presuntivos os tubos que apresentaram crescimento e formao de gs. A confirmao de

coliformes totais foi realizada em caldo lactosado bile verde brilhante (CLBV) a 2%,

incubados a 35C por 24 horas, determinando-se o NMP/100 mL de coliformes totais atravs

da tabela de Hoskins.

Para a confirmao de coliformes termotolerantes, uma alada dos tubos positivos para

coliformes totais foi transferida para tubos de caldo EC. Aps incubao a 44,5 C por 24

horas, os tubos mostrando produo de gs foram considerados positivos. O NMP/100 mL de

coliformes termotolerantes foi determinado de acordo a tabela de Hoskins.

-Isolamento e identificao de Escherichia coli

A partir dos tubos positivos de Caldo Escherichia coli (EC), foi estriada uma alada

em placas com gar Eozina Azul de Metileno (EMB) que foram incubadas a 35C por 24

horas. Colnias tpicas de Escherichia coli foram submetidas s provas bioqumicas do

IMViC, conforme j descrito nas anlises das hortalias. Foi considerado como positivo para

Escherichia coli as culturas com as seguintes caractersticas: Indol positivo ou negativo, VM

positivo, VP negativo e citrato negativo.

Anlises dos resultados

Os resultados encontrados na investigao da presena de Salmonella spp. em

hortalias foram comparados com os padres microbiolgicos vigentes para hortalias frescas

in natura, de acordo com a RDC n 12 /2001 (BRASIL, 2001a).

Os resultados encontrados na investigao do NMP de coliformes totais e

termotolerantes na gua de irrigao foram comparados com os padres microbiolgicos para

a gua de irrigao, de acordo com o CONSELHO NACIONAL DO MEIO AMBIENTE -

CONAMA, atravs da Resoluo no.357 de 17 de maro de 2005 (BRASIL, 2005).

44

4.2.5 Investigao da eficincia sanitizante de solues contendo cidos orgnicos de

cadeia curta sobre Escherichia. coli O157: H7 e Escherichia coli-Ls, isolada de alface

(Lactuca sativa)

Preparo da suspenso bacteriana de E. coli O157: H7 e E. coli-Ls.

Culturas bacterianas de E. coli O157: H7 e E. coli-Ls (isolada de alface) mantidas em

gar inclinado Tryptic Soja (TSA) foram subcultivadas em caldo BHI a 37 oC por 2 dias

consecutivos (48 horas), sob agitao em uma incubadora do tipo shaker (120 rpm). Aps a

incubao, 0,5 mL da cultura de E. coli O157: H7 ou E. coli-Ls foi adicionado superfcie de

placas contendo gar TSA (em duplicata), espalhando-se o inculo com auxlio de ala de

Drigaslki e incubando-se as placas a 37 C/ 24 horas. Posteriormente, a superfcie das placas

foram lavadas com 2 mL de gua peptonada a 0,1% tambm com o auxlio de ala de

Drigaslki, transferindo-se em seguida a suspenso obtida para tubos do tipo eppendorf

estreis. A partir desta suspenso foram realizadas diluies em tubos de ensaio contendo 9

mL de gua peptonada a 0,1% (1:10), em seguida inoculadas em duplicata na superfcie de

placas contendo gar TSA. Aps incubao a 37C/ 24 horas, placas contendo entre 30 e 300

colnias foram selecionadas para contagem do microrganismo. Este experimento foi repetido

por trs vezes (SEGUN & KARAPINAR, 2004, 2005). Para melhor compreenso, segue a

descrio do procedimento do preparo da suspenso bacteriana de E. coli O157: H7 e E. coli-

Ls, conforme a Figura 1.

FIGURA 1. Preparo da suspenso bacteriana 0,5 ml cada

Incubar 24 h/37C

Cepas de E. coli 1

Ativar/ 2dias consecut.

120rpm/37C Caldo BHI 9ml

TSA Lavar com 2 ml de H2O pep.

1ml 10-71ml 10-1 1ml 10-2 1ml 10-3 1ml 10-4 1ml 10-61ml 10-52 1ml

Suspenso do

inculo 0,1 ml cada

0,1 ml cada

0,1 ml cada

0,1 ml cada

0,1 ml cada

0,1 ml cada

0,1 ml cada

Incubar por 24h /37C Efetuar a contagem das colnias

45

Preparo das solues de tratamento

Tratamento I Vinagre de lcool

Tratamento II - Suco de limo

Tratamento III Mistura suco de limo e vinagre (1:1)

Tratamento IV - Mistura suco de limo, vinagre e gua (1:1:1)

Controle: gua peptonada tamponada

Limo taiti: Foi adquirido em supermercado da rede local, lavado com gua corrente,

dividido em metades com faca estril e seu suco obtido de modo assptico.

Vinagre de lcool: Foi adquirido em supermercado da rede local

Determinao da acidez: mtodo volumtrico (v/v) expresso em cido actico para

o vinagre e a mistura de limo com vinagre (AOAC, Mt. 930.35, 2000), e cido ctrico para

o suco de limo (AOAC, Mt. 942.15, 2000).

Preparo da amostra

Alface do tipo crespa de cultivo tradicional, adquirida em supermercado foi submetida

remoo das folhas externas (3 a 4) e do centro. As folhas restantes foram cortadas de modo

assptico em pedaos de 3 x 3 cm (aproximadamente 1 g), lavadas em gua fria corrente e

secas em papel de filtro estreis. Posteriormente, a alface cortada foi submetida luz

ultravioleta (30W, 50 cm de distncia) em cabine de fluxo laminar tipo II por 30 minutos (15

min de cada lado) para reduzir a microbiota natural (SEGUN & KARAPINAR, 2004, 2005).

Inoculao na alface

Volume de 2 mL do inculo de E. coli O157: H7 ou E. coli-Ls, anteriormente obtido

na concentrao aproximada de 1010 foi diludo em 200 mL de gua peptonada a 0,1 %,

resultando em aproximadamente 108 clulas. Aps esta etapa, 60 g de alface, j submetida ao

tratamento ultravioleta acima descrito, foram imersos na soluo contendo o inculo e ento

agitados em incubador do tipo shaker (120 rpm) por 1 min, temperatura de 21C para

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permiti