Practica del biofuel:Integrantes: Sofía Villabrille Alvedro, María Yáñez Veiga, Carolina Borrajo Álbarez, Adrián Estévez Rodríguez.

Recta calibrado: medida absorbancia de los patrones de p-nitrofenol

Tabla 1

Actividad 1: Determinar la tasa de reacción en presencia ausencia de enzima:

Datos experimentales:

Tabla 3 (del manual del alumno)

Tabla 2

Tabla 4

Para calcular la concentración de p-nitrofenol presente en las cubetas utilizamos la ecuación de la recta de calibración obtenida con los patrones:

Gráfico 2

Análisis de resultados1. Tasa inicial de formación de producto.

Al principio, hay mucho sustrato disponible para llevarse a cabo la reacción, pero según se va agotando el sustrato para formar p-nitrofenol disminuye la cantidad de producto formado.

En nuestro caso, al final de la gráfica vemos un descenso notable del producto, pero debemos tener en cuenta que el dato tomado para los 6 minutos no corresponde a nuestro grupo, por lo que, pese a ser parecido puede no concordar con lo ocurrido en nuestro experimento.

De no ser este el caso, debemos asumir que pasados los 6 minutos, el p-nitrofenol se descompone o sufre alguna modificación que nos impide detectarlo (aunque eso solo ocurre en nuestro caso, nuestros compañeros no observan esta caída).

Para cuantificar la tasa inicial de formación basta con calcular la pendiente de la recta:

Tasa = (79,291 nmol -45,996 nmol)/(4min – 2 min) = 16,647 nmol/min.

1. Conversión de sustrato en producto

Vemos como la absorbancia aumenta con el tiempo, para descender al final del todo. Esto puede deberse a que el dato que consideramos a los 6 minutos no corresponde a nuestro grupo y debido a las diferentes condiciones de ambos grupos puede darse el caso que este valor sea más elevado que el correspondería a nuestro experimento.

Mirando la gráfica podemos calcular las tasas de formación de producto, con y sin enzima:

- con enzima: (79,291 nmol -45,996 nmol)/(4min – 2 min) = 16,647 nmol/min

- sin enzima: (5,720nmol -6,048nmol)/(8 min – 0 min)= -0,041 nmol/min que podemos despreciar .

Por lo que podemos concluir que es gracias a la acción de la enzima, en presencia del sustrato, que se forma el p-nitrofenol en las cubetas de reacción.

También que según avanza el tiempo se forma más p-nitrofenol hasta llegar a un punto (donde queda poco sustrato por transformar) en el que esta relación deja de ser lineal.Cuestiones

1 – ¿Se ha observado algún cambio en las cubetas de reacción y en las de control durante el tiempo en el que se llevó a cabo la experiencia?.

Sí. Al retirar del tubo de reacción en introducir en la cubeta de reacción al tiempo indicado se apreciaba un color amarillento. Teniendo todas las cubetas juntas, se apreciaba que la coloración se hacía más intensa cuanto más tiempo dejásemos actuar la enzima.

En las cubetas de control no se apreció ningún cambio a simple vista.

2 - ¿Qué sucedió en las cubetas después de añadir la mezcla enzima/sustrato a la solución de parada?.

Apareció una coloración amarilla que aumentaba progresivamente según el tiempo que dejamos actuar al enzima.

3 – Describe la reacción química que ocurre en el experimento.

Usamos un sustrato artificial llamado p-nitrofenil-glucopiranósido.

Al romperse por acción de la enzima (celobiasa) produce p-nitrofenol y glucosa. Al parar la reacción con una solución de parada de pH básico el p-nitrofenol adquiere un color amarillo. La cantidad de color amarillo es proporcional a la cantidad de p-nitrofenol que hay en la disolución.

4 – Describe la cantidad de producto obtenida por la acción de la enzima comparándola con el tubo de control (en el que no se añadió enzima).

Trascurridos 8 minutos, en la cubeta de enzima/sustrato obtenemos casi 100 nmol de p-nitrofenol, mientras que en la cubeta de control tras el mismo tiempo hay la misma cantidad de producto que al inicial el experimento (en nuestro caso en concreto hay incluso menos, pero eso se debe a que añadimos la cantidad de sustrato con una pipeta Pasteur y por tanto el volumen añadido no es exacto, provocando este tipo de discordancias).

5 – Si esperases 15 en lugar de 8 minutos… ¿crees qué se produciría más producto que parando a los 8 minutos? Explica tu respuesta.

Se formará más producto hasta que se agote el sustrato que añadimos inicialmente. Cuando se agota todo el sustrato, la enzima no puede transformarlo en producto, llegando así al tope de producto formado.

No obstante, como la cantidad de producto aumenta con el tiempo, se formaría más producto si esperamos 15 minutos (el que resulte de transformar el sustrato que todavía no se catalizó a los 8 minutos).

6 - ¿Cómo se puede estimar la concentración de producto?

Se puede estimar comparando las disoluciones del experimento con la coloración de las disoluciones patrones.

Sí queremos saber cuanto tenemos (de forma más exacta), conociendo la concentración de los patrones y su absorbancia, obtenemos una recta de calibrado con cuya ecuación podemos obtener (con las absorbancias de las diferentes disoluciones del experimento) la concentración.

7- ¿Porqué la cantidad de luz absorbida es proporcional a la cantidad de producto en la disolución?

El p-nitrofenol se vuelve amarillo, cuanta más cantidad más intenso será el color.

Cuanto más color más absorbe la luz. Como resultado, a mayor cantidad de producto, más color y más absorbe la luz.

8 – Determina la tasa inicial de aparición de productos a partir de los valores de absorbancia.

Tasa = (79,291 nmol -45,996 nmol)/(4min – 2 min) = 16,647 nmol/min

9- ¿Y la tasa de producción de producto constante en el tiempo?

La pendiente de la curva suele ser constante con el tiempo, hasta un cierto punto. En este escasea el sustrato, por lo que la tasa de formación de producto disminuye, hasta llegar a cero (cuando se agota completamente el sustrato).

Actividad 2: Efecto de la temperatura en la velocidad de reacción.

Datos experimentales:

Cubeta Absorbancia Concentración (nmol)M1020 0,444096 28,0952M10222 0,76999 48,7132M10237 1,11358 70,4496

A partir de la recta de calibrado determinamos la concentración de p-Nitrophenol para cada una de las temperaturas.

Temperatura Absorbancia a 410 nm Concentración de p-Nitrophenol0º C 0,4441 32,6989250622º C (temperatura ambiente) 0,77 53,1772211537º C 1,1136 74,76771681

Ecuación:a (ordenada en el origen) -0,0762841b (pendiente) 0,01591441r2 0,99979961r 0,9998998

y= 0,0159x + 0,0762

Cuestiones:

1. ¿Cómo se puede determinar la tasa inicial de la reacción para cada temperatura?

La tasa inicial es igual a la cantidad de absorbancia entre 0 e 2 minutos y esto dividido entre 2. Se expresa como la producción de producto por minuto lo que coincide con la pendiente de la recta cuando se representa la concentración de producto obtenida en función del tiempo.

2. ¿A qué temperatura crees que este enzima trabaja mejor? ¿Cómo llegas a esa conclusión?

La enzima trabaja mejor a 37ºC. Esto es debido a que a esta temperatura hay una mayor tasa de producción de producto.

3. ¿Por qué las reacciones químicas ocurren más rápidamente a temperaturas más altas y más lentamente a más bajas?

La energía cinética de las moléculas es mayor a temperaturas más altas, y la consecuencia es un mayor número de colisiones entre ellas. A temperaturas más altas, la energía cinética media del sustrato es más alta.

4. ¿Por qué la mayoría de las reacciones enzimáticas son más lentas a temperaturas muy altas?

La mayor parte de las enzimas son proteínas y se desnaturalizan a temperaturas muy elevadas. Esto es así porque rompen las uniones entre los aminoácidos y la proteína pierde su conformación tridimensional. A altas temperaturas pueden romper los puentes de hidrógeno, las uniones iónicas o las de Van der Waals lo que deshace las estructuras terciarias y secundarias de la proteína. Sólo las uniones covalentes resisten; los únicos enlaces covalentes que intervienen en la estructura terciaria son los puentes disulfuro.

5. Si trabajases en un laboratorio en el que se pretende usar esta enzima para producir industrialmente glucosa, qué temperatura piensas que se tendrá que elegir para la reacción?

La enzima trabaja mejor a 37ºC. Por lo que en temperaturas no inferiores a 10ºC y tampoco superiores a 50º C.

7. Segundo esta actividad, ¿en qué tipo de ambiente crees que vive un organismo que produzca esta enzima in vivo? Justifica tu respuesta.

Como la enzima del ensayo es estable a temperaturas alta, es posible que el organismo viva en medios cálidos.

Para nota:

1. ¿Qué tipos de enlaces implicados en la estabilización de la estructura terciaria de una enzima romperán a altas temperaturas? ¿Cuáles no partirán?

Puentes disulfuro: No romperán, pues son enlaces muy fuertes.

Puentes de hidrógeno: Al ser enlaces débiles podrían romperse.

Enlaces fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofóbicas: Al ser enlaces débiles romperán.

Fuerzas electrostáticas: Son enlaces débiles, por lo que romperán.

2. ¿Se establecen enlaces covalentes entre las cadenas laterales de los aminoácidos?

Sí, como ya hemos hablado anteriormente de la presencia de puentes disulfuro.

3. ¿Cuál puede ser la desventaja de usar la temperatura más alta que cumpla una tasa de formación de producto más alta?

Se requiere energía para subir la temperatura a la que tiene lugar la reacción. De hecho, uno de los objetivos en la producción industrial de bioetanol es la reducción de la energía, puede ser mejor tener una reacción más lenta, pero más eficiente en términos de energía.

Actividad 3: efecto del pH en la velocidad de reacción

Datos experimentales:

Cubeta Absorbancia a 410 nm

M103P4 0,501632

M103P7 0,468388

M103P10 0,138006

Comparación con estándares:

pH Estándar más similar Cantidad de p-nitrofenol producida (nmol/L)

4 S3 25

7 S3 25

10 S2 12,5

Usando la ecuación de la recta de calibración podemos calcular la concentración de p-nitrofenol producida a los distintos pH, sustituyendo la absorbancia medida de nuestras cubetas por la y de la ecuación:

pH Absorbancia Concentración de p-nitrofenol (nmol/L)

4 0,501632 32,0272

7 0,468388 29,9363

10 0,138006 9,1576

Representación gráfica del efecto del pH en la formación de producto:

Análisis de los resultados:

Análisis cualitativo:

La tasa inicial de formación de producto a:pH 4: (25nmol – 0nmol)/(2min – 0min) = 12,5 nmol/min.pH 7: (25nmol – 0nmol)/(2min – 0min) = 12,5 nmol/min.pH 10: (12,5nmol – 0nmol)/(2min – 0min) = 6,25 nmol/min.

Análisis cuantitativo:La tasa inicial de formación de producto a:pH 4: (31,7352nmol – 0nmol)/(2min – 0min) = 15,8676 nmol/min.pH 7: (29,632nmol – 0nmol)/(2min – 0min) = 14,816 nmol/min.pH 10: (8,73081nmol – 0nmol)/(2min – 0min) = 4,3654 nmol/min.

pH Velocidad de reacción (nmol/min)

4 15,8676

7 14,816

10 4,3654

Representación gráfica del efecto del pH en la tasa de reacción enzimática:

Cuestiones:

1. Como se puede determinar la tasa inicial de la reacción para cada pH?

La tasa inicial de reacción es la concentración de producto producida durante el intervalo inicial dividido por el número de minutos que comprende dicho intervalo. Coincide con la pendiente inicial de la recta de producción de productos en función del tiempo.

2. A que pH parece trabajar mejor este enzima ¿Cómo llegaste a esta conclusión?

El pH óptimo de la enzima está alrrededor de pH 4. A ese valor la tasa inicial de producción de producto es la mas elevada.

3. Por que la mayor parte de las reacciones enzimáticas disminuyen a valores de pH muy altos y/ o muy bajos?

Los valores extremos de pH producen la rotura de los enlaces que mantienen estable la conformación tridimensional del enzima. El centro activo no tendría la misma forma y no sería capaz de catalizar la reacción. Cualquier cambio de pH, puede llevar a cambios en el centro activo del enzima.

4. Segun esta actividade, ¿en que tipo de ambiente piensas que vive un organismo que produzca este enzima?

En un entorno ácido (Ej. Parque Yellowstone) o en cualquier ambiente con pH neutro ya que también trabaja bien a pH 7 (aunque no tanto).

5. Justifica la respuesta.

Como hemos visto en la gráfica, este enzima trabaja mucho mejor a pH ácidos que básicos, por lo que un organismo que la produzca deberá estar en ambientes ácidos o neutros.

Actividad 4: Determinar el efecto de la concentración de la enzima en la velocidad de reacción

A partir de la recta de calibrado junto con las absorbancias determinamos la concentración de p-Nitrophenol.

Datos experimentales:

Muestra Tiempo Concentración (nmol/L)

Absorbancia

H1 1 56,216 0,88596H2 2 79,0395 1,24936H3 8 104,895 1,65947L1 1 47,2347 0,74663L2 2 63,4354 1,00271L3 8 94,926 1,50048

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

tiempo

[ ]

[ ] alta

[ ] baja

Velocidad de reacción:

Velocidad inicial de reacción para la concentración de la enzima alta = Cantidad de producto en 1 min / min => Vº= 56,216 nmol/min. Velocidad inicial de reacción para la concentración de la enzima bajo = Cantidad de producto en 1 min / min => Vº= 47,2347 nmol/min.

Actividad 5: Determinar el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción

A partir de la recta de calibrado junto con las absorbancias determinamos la concentración de p-Nitrophenol.

Datos experimentales:Muestra Tiempo Concentración

(nmol/L)Absorbancia

H1 1 19,04507 0,307453H2 2 39,0718 0,6176H3 8 151,084 2,38816L1 1 19,7339 0,311929L2 2 19,2447 0,304198L3 8 56,2134 0,888555

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

tiempo

[ ]

[ ] alta

[ ] baja

Como se puede apreciar la L2 es más baja que la L1 cuando tendría que ser más alta.

Velocidad de reacción:

Velocidad inicial de reacción para alta concentración de sustrato = Cantidad de producto en 1 min / min => Vº= 19,04507 nmol/min. Velocidad inicial de reacción para baja concentración de sustrato = Cantidad de producto en 1 min / min => Vº= 19,7339 nmol/min.