UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA

PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR

Prospecção de genes de interesse biotecnológico: uma abordagem metagenômica.

Rita de Cássia Barreto da Silva

NATAL RN 2009

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA

PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR

Prospecção de genes de interesse biotecnológico: uma abordagem metagenômica.

Rita de Cássia Barreto da Silva

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.

Orientador: Profª. Drª. Lucymara Fassarella Agnez Lima

NATAL RN 2009

Divisão de Serviços Técnicos

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede

Silva, Rita de Cássia Barreto da. Prospecção de genes de interesse biotecnológico : uma abordagem

metagenômica / Rita de Cássia Barreto da Silva. Natal, RN, 2009. 70 f. : il. Orientador: Lucymara Fassarella Agnez Lima. Dissertação (mestrado) Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro

de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular.

1. DNA Reparo Dissertação. 2. Hidrolases Dissertação. 3. Metagenoma

Dissertação. 4. Gene Biotecnologia Dissertação. 5. Biossurfactantes Dissertação. I. Lima, Lucymara Fassarella Agnez. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BCZM

Agradecimentos mais que especiais

A Deus, em primeiro lugar, que se faz presente em todos os dias da minha

vida.

Aos meus pais, por me amarem tanto, se importarem com o que é

importante para mim, respeitando sempre minhas escolhas, e por serem eles os

meus pais. Aos meus irmãos Toinho e Cássia que nem percebem, mas acabam me

mimando como se eu que fosse a caçula dos três. A minha família como um todo,

sempre atenta e disponível.

A minha orientadora, Profª Drª Lucymara Fassarella Agnez-Lima, agradeço a

oportunidade, baseada desde sempre na confiança mútua, cada bronca e afago nos

, além do

exemplo e modelo a ser seguido.

Ao meu amor pra toda a vida e melhor amigo, Fabrinni Portela (pedaço de

mim), simplesmente essencial.

Minhas amigas, Priscila e Bianca que adoro e admiro demais, companheiras

de épocas que deixaram saudades e de épocas que ainda virão, porque não estão

nem loucas de sair da minha vida, e por isso serão pra sempre Pri (de Rita e Bianca)

e Bianca (de Rita e Pri).

Ao grupo Metagenoma, formado por pessoas super especiais e parceiras no

sucesso deste trabalho, realizado e discutido sempre em equipe, onde cada um teve

a sua participação que será sempre lembrada. Incluo entre as boas lembranças

aquelas que nos remetem aos muitos momentos de dificuldades, mas que não

deixam de ter o seu valor, pois se tornaram preciosos em nosso processo de

formação, além de ter nos unido em torno de uma só META.

Em especial a Del e Deb que se tornaram companheiras e amigas

Uaska querido já há anos, e, uma feliz e necessária inclusão ao grupo; Mark,

Mariana e Jaci, integrantes interessados e prestativos, que ainda vão dar o que falar

e, por último, mas super importantes Ralfo e Angel. E ainda, a Thiago Cabral pelas

excelentes coletas de solo em João Câmara-RN.

A Profª Drª Katia Castanho Scortecci com quem aprendi muito nesse último

ano e para quem tenho muito mesmo a agradecer, principalmente ao carinho e

paciência.

A minha banca de qualificação que me auxiliou bastante e me fez acreditar

ainda mais em meu trabalho, composta pelo Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa

Egito e pelas Profas Dras Adriana Ferreira Uchôa e Silvia Regina Batistuzzo de

Medeiros.

Ao Prof. Dr. Carlos FM Menck por ter me concedido a honra de te-lo em

minha banca da defesa, juntamente com as Profas Dras Katia C. Scortecci e

Lucymara F. Agnez-Lima

Jeff, Lelinha, Aninha, Bia, Renata, Adilson, Denise e Jule sempre amigos e

disponíveis. E por fim a todos que fazem o LBMG e, contribuem para que meu dia-

dia seja muito mais legal, Angélica, Vivi, Leonam, Thayse, Iza, Carol, Andrea, Fábio,

Amanda, Naldo, Waleska, Valeska, Juliana e Julianeeeeeeeeeeeeeeee.

E ainda a amigos de turma com quem convivi durante os anos de graduação

e, alguns, durante os anos de mestrado também e que contribuíram para que

fossem etapas muito felizes e por isso têm seu lugar garantido em minhas

memórias: Grace, Geyza, Ério, Jeff, Denise, Jule, Juju, Joana, Miguel, Léo, Lúcio,

Rodrigo, Pablo e Leandro, além, lógico, de Pri e Bianca.

RESUMO O número total de células procarióticas na Terra tem sido estimado em 4 a 6x1030 sendo que apenas cerca de 1% dos microrganismos presentes no meio ambiente pode ser cultivado, através de técnicas padrão de cultivo e plaqueamento, se apresentando, portanto, como um enorme pool biológico e genético que pode ser explorado, visando a identificação e a caracterização de genes com potencial biotecnológico. Dentro desta perspectiva, a abordagem metagenômica foi aplicada neste trabalho a partir de metodologias de seleção funcional visando à identificação de novos genes relacionados ao reparo de DNA e/ou resistência a estresse oxidativo, genes relacionados com atividade de degradação de hidrocarbonetos, e atividade hidrolítica (lipase, amilase e protease). Com esse objetivo, uma biblioteca metagenômica, construída a partir de amostras de solo coletadas no município de João Câmara RN, foi analisada funcionalmente utilizando meios sólidos contendo substratos específicos (atividade hidrolítica), suplementados com H2O2 (reparo de DNA e/ou resistência a estresse oxidativo) e meio liquido suplementado com óleo árabe leve (atividade de degradação de hidrocarbonetos). Após confirmação da atividade e exclusão de falsos-positivos foram obtidos 49 clones, sendo 2 positivos para atividade amilase, 22 resistentes ao estresse oxidativo gerado por H2O2 e 25 com atividade de degradação de hidrocarbonetos, cuja análise das seqüências revelou,além de proteínas hipotéticas, dienolactona hidrolase, DNA polimerases, acetiltransferase, fosfotransferase, metiltransferase, endonucleases entre outras, cuja coerência com as funções ensaiadas, ressalta o sucesso da abordagem metagenômica aliada a metodologias funcionais e, os resultados obtidos bastante promissores. PALAVRAS CHAVE: Metagenoma, Biotecnologia, Hidrolases, Reparo de DNA, Biossurfactantes.

ABSTRACT The total number of prokaryotic cells on Earth has been estimated at 4 to 6x1030 and only about 1% of microorganisms present in the environment can be cultivated by standard techniques of cultivation and plating. Therefore, it is a huge biological and genetic pool that can be exploited, for the identification and characterization of genes with biotechnological potential. Within this perspective, the metagenomics approach was applied in this work. Functional screening methods were performed aiming to identify new genes related to DNA repair and / or oxidative stress resistance, hydrocarbon degradation and hydrolytic activities (lipase, amylase and protease). Metagenomic libraries were built utilizing DNA extracted from soil samples collected in João Câmara RN. The libraries were analyzed functionally using specific substrate containing solid medium (hydrolytic activity), supplemented with H2O2 (DNA repair and / or resistance to oxidative stress) and liquid medium supplemented with light Arabian oil (activity, degradation of hydrocarbons). After confirmation of activity and exclusion of false-positive results, 49 clones were obtained, being 2 positive for amylase activity, 22 resistant to oxidative stress generated by H2O2 and 25 clones active for hydrocarbons degradation. Analysis of the sequences showed hypothetical proteins, dienelactona hydrolase, DNA polymerase, acetyltransferase, phosphotransferase, methyltransferase, endonucleases, among other proteins. The sequence data obtained matched with the functions tested, highlighting the success of metagenomics approaches combined with functional screening methods, leading to very promising results. Key words: Metagenome, Biotechnology, Hydrolases, DNA repair, Biosurfactants

LISTA DE FIGURAS Figura 1. A. Fazenda de Sisal. B. Solo onde ocorre a queima da castanha. Figura 2 - Placa-teste Oil spreading. A seta exemplifica abertura de halo no óleo em presença de sobrenadante clone PL18E. Figura 3 - Tubo-teste para obter o Índice de Emulsificação, anteriormente ao passo de agitação em vortex. (1) indica amostra a ser testada, (2) indica o corante azul de metileno e (3) indica o volume adicionado de querosene. Figura 4 - Seleção primária para atividade protease realizada em duplicata em meio YMA modificado contendo 1% de leite em pó desnatado. Falsos positivos capazes de formar halo indicativo de atividade. Figura 5 - Seleção para atividade amilase realizado em meio YMA modificado contendo 1% de amido de milho e adição de Iodo após período de incubação. A - Placa PL6p3, após adição de iodo, não iluminada em transluminador, com lâmpada fluorescente. B - Placa PL6p3 em transluminador. A seta exemplifica clone PL6 3A com atividade amilolítica. Figura 6 - Confirmação de atividade de degradação de hidrocarbonetos. A esquerda, placa ao 10 dia e a direita placa ao 150dia. As setas indicam atividade de degradação. Figura 7 - Teste de habilidade de emulsificação. As setas indicam o querosene não emulsificado por DH10B. A. Sobrenadante (a esquerda) e cultura (a direita) do clone PL33F; B. Sobrenadante (a esquerda) e cultura (a direita) DH10B com plasmídeo vazio. Figura 8. Fase de crescimento em que foi avaliada a habilidade de emulsificação. A curva (A) indica a liberação do biossurfactante no início da fase estacionária para o clone PL18A, igualmente ao observado para os clones PL18B, PL112A, PL112H e DH10B controle (ver também Tabela 4). A curva (B) indica liberação do biossurfactante durante a fase exponencial para o clone PL33F, semelhante ao obtido pelo clone PL22C (ver também Tabela 4).

LISTA DE TABELAS Tab. 1 Clones resistentes ao estresse oxidativo gerado por H2O2 e/ou MMS Tab. 2. Clones com atividade amilase

Tab. 3 Clones positivos para atividade de degradação de hidrocarbonetos. Tab.4 Resultados obtidos a partir dos testes Oil spreading e Índice de emulsificação com os clones e DH10B com plasmídeo vazio.

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 1 1.1 Diversidade biológica dos microrganismos 1 1.2 Metagenoma 1 1.3 Isolamento de DNA ambiental 3

1.4 Contaminantes 4 1.5 Enriquecimento 4

1.6 Bibliotecas metagenômicas 5 1.7 Análise das bibliotecas metagenômicas 5 1.8 Aplicação da abordagem metagenômica 6 1.9 Amilases, lipases e proteases 7 1.10 Reparo de DNA e/ou resistência a estresse oxidativo 8 1.11 Degradação de hidrocarbonetos 10 1.11.1 Os biossurfactantes 10 2 JUSTIFICATIVA 12 3 OBJETIVOS 13 3.1 Objetivo geral 13 3.2 - Objetivos específicos 13 4 MATERIAL E MÉTODOS 14 4.1 Coleta das amostras ambientais 14 4.2 - Extração do DNA ambiental 15 4.3 Montagem da biblioteca metagenômica 15 4.4 Tratamento das pontas dos fragmentos gerados por sonicação 16 4.5 Preparação do vetor 16 4.6 - Clonagem do DNA metagenômico 17 4.7 - Seleção funcional 19

4.7.1 - Reparo de DNA e/ou resistência a estresse oxidativo 19 4.7.2 - Atividade amilase e protease 20 4.7.3 - Atividade lípase 20

4.7.4 - Degradação de hidrocarbonetos 21 4.7.4.1 - Habilidade de sintetizar biossurfactantes 22 4.8 - Extração do DNA plasmideal 24 4.9 Confirmação da presença do inserto 25

4.10 Reação de seqüenciamento 25 4.11 - Análise das seqüências 26 5 RESULTADOS 27 5.1 Construção da biblioteca 27 5.2 Ensaios funcionais 27 5.2.1 Reparo de DNA e/ou resistência a estresse oxidativo 27 5.2.2 Atividade protease 32 5.2.3 Atividade amilase 32 5.2.4 Atividade lipase 34 5.2.5 Atividade de degradação de hidrocarbonetos 34 6 DISCUSSÃO 41 7 CONCLUSÃO 55 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 56

1 INTRODUÇÃO

1.1 Diversidade biológica dos microrganismos

Os microrganismos têm papel central na evolução geológica, geoquímica e

biológica; catalisam transformações únicas e indispensáveis nos ciclos

biogeoquímicos da biosfera (são capazes de reciclar carbono, fósforo e nitrogênio da

matéria orgânica morta), produzem importantes componentes da atmosfera da terra

e representam uma larga porção de diversidade genética (Lorenz e Schleper, 2002;

Xu, 2006).

A estrutura das comunidades microbianas de muitas amostras ambientais é

altamente complexa e diversa (Torsvik et al., 1990). Os microrganismos são

encontrados em todo nicho ecológico sobre a Terra, sendo estimado o número total

de células procarióticas em torno de 4 a 6x1030 (Whitman et al., 1998). Estima-se

que 1 g de solo pode conter cerca de 10 bilhões de microrganismos e possivelmente

cerca de 4.000 10.000 diferentes espécies (Torsvik et al., 1990; Knietsch et al.,

2003).

A complexidade destas comunidades apresenta um desafio para a

biotecnologia, desde que, estimativas indicam que cerca de 99% dos

microrganismos presentes em muitos ambientes naturais não são cultiváveis

utilizando técnicas tradicionais de cultivo e plaqueamento, o que tem limitado o

conhecimento quanto a ecologia microbiana e suas potencialidades para aplicação

biotecnológica (Amann et al., 1995). De fato, a maioria das espécies em muitos

ambientes ainda não foi descrita e isto não será possível até que novas

metodologias de cultivo sejam desenvolvidas (Entcheva et al., 2001). É provável,

ainda, que a fração não cultivada inclua diversos microrganismos distantemente

relacionados aos microrganismos cultiváveis (Amann et al., 1995).

1.2 Metagenoma

Entre os métodos utilizados em estudos de genética de microrganismos não

cultivados, a metagenômica tem emergido como uma estratégia eficaz,

correspondendo à análise genômica de comunidades microbianas complexas

encontradas em habitats naturais (Handelsman et al., 1998). Para tanto, o DNA total

é extraído de amostras ambientais e clonado em vetores como plasmídeos,

cosmídeos e BAC, o que vem permitindo o estudo de genomas de organismos

presentes em um dado ambiente sem a necessidade de cultivo (Handelsman, 2004).

O termo metagenoma é derivado do conceito estatístico de meta-análise (o

processo de combinar estatisticamente análises separadas) e genômica (a análise

ampla do material genético de um organismo) (Schloss e Handelsman, 2003). Foi

cunhado em 1998 por Handelsman e colaboradores e, agora, é também

adequadamente aplicado para alguns estudos anteriores a denominação da

estratégia como, por exemplos: o trabalho de Torsvik et al.(1990) que purificaram

DNA de uma fração bacteriana isolada do solo; o trabalho realizado por Schmidt et

al. (1991) que com o intuito de minimizar a seleção de seqüências particulares

caracterizaram seqüências de rRNA 16S de uma população de picoplancton a partir

da clonagem direta, em fago tendo E.coli como cepa hospedeira; e o trabalho de

Healy et al. (1995) no qual obtiveram clones expressando celulase de um ambiente

Esta abordagem tem potencial para descobrir novos genes, proteínas e vias

metabólicas que podem ser exploradas para processos industriais. Pode funcionar

ainda como um grande catálogo representativo de microrganismos, permitindo

compreender e predizer o impacto da indústria, da agricultura e de outras atividades

na diversidade procariótica e, compreender, ainda, a evolução de patógenos e de

bactérias potencialmente úteis como, por exemplo, as degradadoras de xenobióticos

(Toussaint et al., 2003).

Os objetivos dos projetos metagenoma geralmente incluem (1) identificar

genes funcionais e/ou novas vias metabólicas, (2) estimar a diversidade microbiana,

(3) compreender a dinâmica da população de uma comundidade inteira, (4) montar o

genoma de um organismo não cultivado e, (5) identificar biomarcadores úteis para

classificar um tipo de processo ocorrido em ambientes específicos, como um

ambiente poluído, por exemplo (Rajendhran e Gunasekaran, 2008).

1.3 Isolamento de DNA ambiental

Devido a grande variedade dos tipos de solo e objetivos dos pesquisadores,

numerosos protocolos para isolar DNA do solo têm sido descritos (Leff et al.,1995;

Zhou et al., 1996; Tien et al., 1999; Miller et al., 1999; Liles et al., 2008) e dividem-se

basicamente em indiretos e diretos.

Na abordagem indireta ou de fracionamento, os microrganismos são

fisicamente separados do substrato, anteriormente a etapa de lise celular, permitindo

assim, a obtenção de DNA especificamente procarioto. Esta estratégia é indicada

para amostras de solos contendo uma grande quantidade de contaminantes (Ono et

al., 2007; Liles et al., 2008). O estresse mecânico no DNA genômico liberado é

bastante reduzido o que, conseqüentemente, gera fragmentos muito grandes (20kb

a 500kb) com o potencial de conter genes ou operons que podem ser clonados em

vetores como cosmídeo ou BAC (Daniel, 2004).

Como desvantagem desse método tem-se a possível perda de

microrganismos durante a preparação da fração bacteriana devido a falhas na

separação do substrato ou lise ineficiente da parede celular, gerando conseqüente

sub-representação do DNA metagenômico obtido (Leff et al., 1995; Daniel, 2004).

Por outro lado, protocolos de isolamento direto são adequados para vários

tipos de solo, são menos trabalhosos e geram um maior rendimento de DNA de alto

peso molecular uma vez que os microrganismos são lisados no contexto do

substrato, ou seja, não ocorre o passo prévio de separação, sendo também incluídos

no processo de lise, os microrganismos fortemente aderidos às partículas do solo

(Tsai e Olson, 1991; Lorenz e Schleper, 2002).

A eficiência de extração resulta geralmente em fragmentos de DNA

alcançando de 1kb a 50kb, devido a lise mecânica, tornando o DNA obtido

adequado primariamente para clonagem em vetores plasmídeos ou fago, contendo

promotores fortes para facilitar a expressão gênica do fragmento clonado, mas

também tem sido usada para preparação de bibliotecas de grandes insertos

utilizando cosmídeos e BACs (Lorenz e Schleper, 2002).

1.4 Contaminantes

Um problema relacionado a extração do DNA diretamente do solo é a

possibilidade de co-extração de DNA extracelular bem como, ácidos húmicos e

outros contaminantes, tornando crucial passos de purificação mais eficientes (Miller

et al.,1999; Rajendhran e Gunasekaran, 2008).

O DNA extracelular corresponde ao DNA - advindo de fungos, bactérias ou

de células de plantas mortas - presente na amostra antes do tratamento de extração,

por estar fixado às partículas do solo, e, uma vez co-extraído com os ácidos

nucléicos liberados, de células recentemente lisadas, pode consequentemente,

induzir uma superestimação do número de bactérias viventes naquele ambiente

(Courtois et al., 2001).

Entretanto, os contaminantes mais comuns incluem ácidos húmicos,

polissacarídios, ou uréia que exibem propriedades de solubilidade similares ao DNA,

e, desse modo, podem se ligar covalentemente ao DNA ou proteínas e, uma vez que

não são completamente removidos durante protocolos clássicos de extração,

acabam por interferir negativamente na atividade enzimática da taq DNA polimerase,

na atividade de endonucleases de restrição, em processos de transformação de

DNA e na eficiência de hibridizações DNA-DNA (Tebbe e Vahjen, 1993; Rajendhran

e Gunasekaran, 2008).

1.5 Enriquecimento

Diante do conhecimento das dificuldades associadas ao isolamento do DNA

ambiental para a construção de bibliotecas metagenômicas, uma alternativa para o

isolamento do DNA de uma comunidade microbiana é a realização de um passo de

pré-cultivo em laboratório utilizando-se de técnicas de enriquecimento (Entcheva et

al., 2001; Ono et al., 2007; Marzorati et al., 2007), nas quais uma pressão seletiva

baseada em critérios nutricionais, físicos ou químicos (Cowan et al., 2005) é capaz

de alterar e reduzir a diversidade geral da comunidade microbiana original,

favorecendo, desse modo, os microrganismos capazes de executar uma

característica alvo (Entcheva et al., 2001).

1.6 Bibliotecas metagenômicas

O isolamento e a purificação do DNA podem ser seguidos pela construção

de bibliotecas de DNA que pode ser realizada com pequenos insertos (< 10kb)

clonados em plasmídeos tendo Escherichia coli como cepa hospedeira (Knietsch et

al., 2003; Voget et al., 2003; Lee et al., 2004), assim como bibliotecas com grandes

insertos, como bibliotecas em cosmídeos (Entcheva et al., 2001; Courtois et al.,

2003; Schmeisser et al., 2003; Voget et al., 2003; Elend et al., 2006; Lee et al., 2007)

com insertos alcançando 25 a 40 kb e/ou bibliotecas em cromossomos artificiais

bacterianos (BAC) com tamanhos de insertos com quase 200 kb (Rondon et al.,

2000; Liles et al., 2003) as quais permitem a detecção de genes e operons.

E.coli ainda é a cepa hospedeira mais amplamente usada para clonagem e

expressão de qualquer gene derivado de metagenoma uma vez que é

geneticamente bem definida e fácil de transformar (Steele et al., 2009). Entretanto,

outros hospedeiros como Streptomyces lividans e Pseudomonas putida tem sido

empregados (Courtois et al., 2003; Martinez et al., 2004).

1.7 Análise das bibliotecas metagenômicas

Uma vez construída, as bibliotecas metagenômicas, podem ser analisadas

para uma ampla variedade de fenótipos ecológica e biotecnologicamente

interessantes (Elend et al., 2006) por (1) a análise baseada em seqüência ou (2)

análise baseada em atividade.

A análise baseada em sequência tem a vantagem de não depender da

expressão dos genes clonados. No entanto, para analisar bibliotecas

metagenômicas buscando clones que apresentem as seqüências de interesse, é

requerido o desenho de sondas de hibridização ou primers de PCR, os quais são

derivados de regiões conservadas de genes já conhecidos ou famílias de proteínas

(Fieseler et al., 2007).

Contudo, essa abordagem não é seletiva para genes completos (Daniel,

2004) e, além disso, apresenta grande probabilidade de obtenção de genes já

conhecidos, uma vez que, os primers e sondas são desenhados a partir do que já é

conhecido e conservado.

Alternativamente, pode ser realizado o sequenciamento aleatório de clones

metagenômicos, o qual permite identificar relações filogenéticas, novos genes e

deduzir vias metabólicas de bactérias não cultivadas (Schmeisser et al., 2003).

Genes novos são um grande desafio a ser vencido, uma vez que, se não é

observada similaridade com seqüências já descritas, em geral não tem sido possível

inferir funções. Diante disso, a análise baseada em atividade (análise funcional) é

indicada para identificação de clones que expressem uma característica desejada,

seguida pelo sequenciamento e caracterização do clone ativo através de análises

genéticas e bioquímicas. Essa abordagem é seletiva para genes inteiros e produtos

gênicos funcionais e, além disso, tem o potencial de detectar genes completamente

novos, codificando novos tipos e classes de enzimas ou identificar a síntese de

novos componentes bioativos, já que, a informação derivada de uma seqüência já

conhecida não é requerida (Schloss e Handelsman, 2003).

Entretanto, isso também, depende da disponibilidade de um ensaio para a

seleção da função de interesse que possa ser realizado eficientemente em larga

escala, uma vez que a freqüência de clones ativos é bastante baixa (Yun et al.,

2004) , visto a natureza complexa dos metagenomas, originados de uma mistura de

espécies e a necessidade da expressão da função de interesse na cepa hospedeira,

o que muitas vezes é dependente de agrupamento de vários genes requeridos para

a função (Uchiyama et al., 2005; Park et al.,2007).

O uso de um vetor de expressão bidirecional por LammLe et al., (2007) foi

uma alternativa interessante e eficiente para contornar essa desvantagem gerando

uma alta freqüência de clones positivos. Entretanto, geralmente, fatores regulatórios

cis e trans atuantes para eficiente transcrição, tradução e enovelamento da proteína

têm papeis cruciais in vivo (Park et al.,2007).

1.8 Aplicação da abordagem metagenômica

A metagenômica tem sido aceleradamente desenvolvida nessa última

década tendo como principal objetivo, melhor conhecer os genomas de

microrganismos não cultiváveis, os quais são vistos como uma enorme fonte

diversidade genética. Além disso, a metagenômica tem permitido uma melhor

compreensão da ecologia microbiana e ainda a descoberta de novas enzimas e

biomoléculas com potencial aplicação biotecnológica.

Estudos como os realizados por Voget et al. (2003) salientam o potencial de

usar a metagenômica para investigar ambientes para prospecção de novos genes,

normalmente detectados em isolados de outros ambientes não relacionados, por

exemplo, apesar do fato das agarases serem normalmente encontradas em

microrganismos marinhos Voget et al. (2003) analisando uma biblioteca

metagenômica, obtida a partir de amostra de solo, identificaram 12 genes para

agarases. Da mesma forma, uma nova classe da família rhodopsina, bem conhecida

em archaeas halofílicas, foi detectada em bacterias oceânicas e denominada

proteorodopsinas (DeLong, 2005).

Estratégias de seleção funcional para bibliotecas metagenômicas têm

identificado importantes genes de interesse industrial como amilases, lipases,

esterases, celulases, álcool oxidoredutases, quitinases, agarases, antibióticos, gene

de resistência a antibióticos, genes codificando enzimas para o metabolismo da 4-

hidroxibutirato, etc (Cottrell et al., 1999; Henne et al., 1999; Rondon et al., 2000;

Henne et al., 2000; Voget et al., 2003; Diaz-Torres et al., 2003; Knietsch et al., 2003;

Courtois et al., 2003; LeCleir et al., 2004; Lee et al., 2004; Ferrer et al., 2005; Elend

et al.,2006; Lee et al., 2007; Ibrahim et al., 2007; Vázquez et al., 2008).

Dentro desta perspectiva, a abordagem metagenômica foi aplicada neste

trabalho a partir de metodologias de seleção funcional visando à identificação de

novos genes com potencial biotecnológico, sendo alvo deste trabalho genes

relacionados ao reparo de DNA e/ou resistência a estresse oxidativo, genes

relacionados com atividade de degradação de hidrocarbonetos e/ou biossurfactante,

assim como com atividade hidrolítica (lipase, amilase e protease).

1.9 Amilases, lipases e proteases

As enzimas são proteínas vitais que catalisam reações bioquímicas com

grande especificidade, sendo capazes de acelerar em até 1014 vezes algumas

reações. Além de formarem a base do sistema metabólico dos organismos vivos,

essas proteínas proporcionam enormes oportunidades às indústrias por executarem

conversões biocatalíticas finas, eficientes e mais econômicas. Os microrganismos,

comparados a plantas e animais, representam a melhor fonte enzimática devido à

sua ampla diversidade bioquímica e susceptibilidade à manipulação genética

(Oliveira et al., 2006).

Diante disso, as enzimas são um dos produtos mais explorados pelo setor

biotecnológico, as quais são utilizadas em larga escala nas indústrias têxtil (amilase,

celulase, pectinase), de papel (lipase, xilanase, oxidoredutase), de detergentes

(celulase, lipase, protease), de couro (lipase, protease), de alimentos (pectinase,

lipase, amilase, protease), entre outras (Oliveira et al., 2006).

Enzimas proteolíticas clivam ligações peptídicas em outras proteínas. A

vasta diversidade de proteases, em contraste com a especificidade de sua ação tem

atraído atenção em todo o mundo para explorar suas aplicações biotecnológicas

(Ibrahim et al., 2007).

Enzimas lipolíticas incluem lipases, as quais hidrolisam longas cadeias

acilglicerois e as esterases que hidrolisam cadeias curtas (Ranjan et al., 2005). As

lipases são largamente usadas em modificações lipídicas, mas também encontram

inúmeras aplicações em outras áreas, como indústria de detergentes e na síntese

orgânica. As razões para o enorme potencial biotecnológico das lipases microbianas

incluem o fato de que são (1) estáveis em solventes orgânicos, (2) não exigem

cofatores, e (3) possuem uma ampla especificidade de substrato (Ranjan et al.,

2005).

As amilases são responsáveis pela degradação da molécula de amido e

estão amplamente distribuídas na natureza. Apresentam grande importância

biotecnológica tais como aplicações nas indústrias têxteis, papel e celulose, de

couro, detergentes, cervejas, bebidas destiladas, panificação, cereais para

alimentação infantil, liquefação e sacarificação do amido, ração animal, indústria

química e farmacêutica (Oliveira et al., 2006).

1.10 Reparo de DNA e/ou resistência a estresse oxidativo

Além das seleções funcionais enzimáticas tradicionais, envolvendo detecção

de um produto do substrato oferecido, um número de outras seleções funcionais tem

sido relatado em projetos de metagenoma, entretanto, até o momento, são poucos

os exemplos acerca da aplicação da metagenômica em busca de genes

relacionados ao reparo de DNA e/ou resistência a estresse oxidativo (Yang et al.,

2006, Mori et al., 2008).

Esta abordagem é interessante do ponto de vista biotecnológico visando

aplicações na medicina e/ou indústria farmacêutica, por exemplo.

Na natureza, os microrganismos vivem sob uma variedade de condições

endógenas - como espécies reativas de oxigênio formadas durante o metabolismo

celular - e exógenas - como luz solar - capazes de gerar danos no DNA (Blokhina et

al., 2003, Wang, 2008); além de condições como, privação de nutrientes e variação

de pH ou temperatura (Nohmi, 2006).

Para se adaptar a ambientes e condições hostis, os organismos respondem

alterando seu padrão de expressão gênica, dependendo da condição estressante

enfrentada (Nohmi, 2006). Ocasionalmente, estresses ambientais podem resultar em

danos ao DNA tais como: perda, dimerização, alquilação, desaminação e oxidação

de bases, bem como quebra simples ou dupla-fita (Truglio et al., 2006).

Diante disso, o DNA genômico é constantemente monitorado e, para

assegurar a fiel transferência da informação genética, lesões são removidas por um

conjunto de enzimas, coletivamente conhecidas como sistemas de reparo de DNA.

Se não reparadas, as lesões de DNA podem resultar em mutações, recombinação

genética e inibição ou alteração de processos celulares primordiais, como replicação

e transcrição, dentre outros, se encontrando envolvidas com morte celular,

envelhecimento e doenças como câncer (Britt, 1999; Eisen e Hanawalt, 1999).

O grande número de tipos de danos a que o DNA está sujeito reflete a

variedade de mecanismos de reparo de DNA presentes nos organismos.

Basicamente, eles são classificados em: i) reparo direto, com a simples reversão da

lesão, retornando a conformação original da molécula de DNA; ii) reparo de excisão,

); iv)

reparo recombinacional, ou simplesmente; v) tolerância à lesão, quando a lesão não

é removida, mas há a manutenção das atividades essenciais da célula (como

transcrição de RNA ou replicação de DNA) (Friedberg, 2004; Sancar et al., 2004;

Zharkov et al., 2003; Martins-Pinheiro et al., 2007).

1.11 Degradação de hidrocarbonetos

A contaminação ambiental por produtos derivados do petróleo tem se

tornado um problema em todo o mundo. No Brasil, vários milhões de litros de óleo

tem sido acidentalmente liberados só nesta década (Batista et al., 2006). Por esta

razão, a busca de processos que possam evitar e remediar a contaminação

ambiental tem se intensificado. Processos de biorremediação envolvem a

aceleração da biodegradação natural em ambientes contaminados (Calvo et al.,

2008). É um método efetivo no qual os microrganismos utilizam os contaminantes

como fonte de carbono, resultando na transformação dos contaminantes em

componentes de baixo peso molecular (Pirôlo et al., 2008).

Apesar de não existir cepa bacteriana capaz de degradar todos os

componentes do petróleo, alguns microrganismos possuem uma ampla capacidade

para degradar vários tipos de hidrocarbonetos (Olivera et al., 2008). Diante disso,

estudos genéticos têm focado principalmente em vias aeróbicas de degradação e o

que se percebe, ao comparar as principais vias para o catabolismo de componentes

aromáticos em bactérias, é que os passos iniciais de conversão são executados por

diferentes enzimas, no entanto os componentes são transformados em um número

limitado de intermediários centrais (Okoh, 2006).

Estratégias de seleção para genes relacionados a vias de degradação de

hidrocarbonetos baseiam-se em um novo fenótipo de utilização da fonte de carbono

pelo hospedeiro, o qual permite a seleção direta de clones positivos no meio

contendo hidrocarboneto. Exemplos incluem a identificação de novos genes para

naftaleno dioxigenase (NFO) (Ono et al., 2007) e extradiol dioxigenases (EDO)

(Suenaga et al., 2007).

1.11.1 Os biossurfactantes

Uma vez que somente moléculas dissolvidas podem ser metabolizadas

pelos microrganismos (Krepsky et al., 2007), além da presença de enzimas

específicas para biodegradação de hidrocarbonetos, outras estratégias, são

naturalmente executadas pelos microrganismos para aumentar a disponibilidade

desses poluentes hidrofóbicos, como formação de biofilme e produção de

biossurfactante (Batista et al., 2006; Calvo et al., 2008).

Os biossurfactantes são um grupo estruturalmente diverso de moléculas

sintetizadas pelos microrganismos, extracelularmente ou como parte da membrana

celular, que exibem pronunciadas atividades de superfície e emulsificante (Mulligan,

2005; Rodrigues et al., 2006; Muthusamy et al., 2008; Katemai et al., 2008).

Vários microrganismos que são capazes de assimilar hidrocarbonetos

também são capazes de emulsificá-los durante o processo de degradação do

substrato e, desde então, tem sido relatado o isolamento de agentes emulsificantes

produzidos por estes (Cirigliano e Carman, 1984; Piskonen et al., 2008).

Quando comparados a surfactantes sintéticos, os biossurfactantes têm

várias vantagens, as quais são de grande interesse para aplicações biotecnológicas

e industriais, como menor toxicidade, maior biodegradabilidade, melhor

compatibilidade ambiental, habilidade emulsificante e desmulsificante, atividade

antimicrobiana, requerimento de pequenas dosagens, atividade específica a pH,

salinidade e temperaturas extremas, a habilidade de ser sintetizado a partir de

substratos renováveis, e ampla diversidade química (possibilitando aplicações

específicas) (Makkar e Cameotra,1997; Iwahori et al., 2001; Maneerat, 2005; Peng

et al., 2008).

Essas propriedades únicas permitem o uso de biossurfactantes e a possível

substituição dos surfactantes quimicamente sintetizados em um grande número de

aplicações industriais (Nitschke e Costa, 2007).

Exemplos de estudos sobre aplicações dos biossurfactantes têm focado na

recuperação melhorada do óleo (MEOR) e biorremediação de poluentes, nas

indústrias alimentícias (como emulsificantes, espumantes, molhantes,

solubilizadores, agentes antiadesivos), de cosméticos, biomedicina e terapêutica

(como agentes antimicrobianos, imunoreguladores e imunomoduladores) (Nitschke e

Costa, 2007; Muthusamy et al., 2008).

2 JUSTIFICATIVA

Apesar do equilíbrio químico da biosfera depender diretamente dos

microrganismos, os quais são essenciais para uma biosfera sustentável, o

conhecimento acerca da constituição e dinâmica dos ecossistemas microbianos,

responsáveis pela manutenção desse equilíbrio, é irrisório. O número total de células

procarióticas na Terra tem sido estimado em 4 a 6x1030 sendo que apenas cerca de

1% dos microrganismos presentes no meio ambiente pode ser cultivado através de

técnicas padrão de cultivo e plaqueamento se apresentando, portanto, como um

enorme pool biológico e genético que pode ser explorado para encontrar novos

genes, vias metabólicas inteiras, bem como seus produtos. Tornando-se

imprescindível investir em estudos que permitam o acesso ao patrimônio genético

dessas espécies, visando a identificação e a caracterização de genes com potencial

biotecnológico. Uma nova metodologia denominada de metagenoma está em

crescente desenvolvimento e gerando uma quantidade enorme de informações

biológicas, permitindo o acesso ao patrimônio genético de espécies microbianas

sem a necessidade de isolamento e cultivo em laboratório. Diversos estudos têm

confirmado que o acesso ao patrimônio genético das espécies através da

abordagem metagenômica oferece uma fonte quase ilimitada para encontrar novos

genes os quais codificam produtos gênicos biotecnologicamente relevantes.

Também são objetivos destes estudos, aumentar a nossa compreensão a cerca dos

processos ecológicos e moleculares nas comunidades microbianas, além de

aumentar a compreensão da informação genômica individuais de micróbios de uma

comunidade complexa.

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

O presente trabalho tem como principal objetivo a identificação de novos

genes de interesse industrial e/ou biotecnológico a partir de estratégias de

metagenoma e seleção funcional.

3.2 - Objetivos específicos

Extração de DNA a partir de amostras ambientais;

Construção de biblioteca metagenômica;

Seleção funcional de clones da biblioteca metagenômica expressando genes

codificando enzimas envolvidas na degradação de hidrocarbonetos;

Seleção funcional de clones expressando genes codificando enzimas

relacionadas a mecanismos de reparo e/ou manutenção da integridade

genômica;

Seleção funcional de clones expressando genes codificando enzimas com

atividades protease, amilase e lipase;

Sequenciamento dos clones selecionados para a identificação de genes e

predição de funções.

4 MATERIAL E MÉTODOS

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5 RESULTADOS

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6 DISCUSSÃO

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7- CONCLUSÃO

A abordagem metagenômica aplicada neste trabalho a partir de

metodologias de seleção funcional, visando à identificação de novos genes com

potencial biotecnológico, foi bem sucedida uma vez que foram obtidos 49 clones

positivos para as funções testadas, dos quais 29 foram seqüenciados até o

momento e apresentaram resultados promissores.

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abouseoud, M., Yataghene, A., Amrane, A., and Maachi, R., 2008, Biosurfactant production by free and alginate entrapped cells of Pseudomonas fluorescens, J Ind Microbiol Biotechnol 35(11):1303-8. Abouseouda, M., Maachib, R., Amranec, A., Bouderguaa, S., and Nabia, A., 2006, Evaluation of different carbon and nitrogen sources in production of biosurfactant by Pseudomonas fluorescens, Desalination 223 223:143 151. Amann, R. I., Ludwig, W., and Schleifer, K. H., 1995, Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation, Microbiol Rev 59(1):143-69. Ananthaswamy, H. N., and Eisenstark, A., 1977, Repair of hydrogen peroxide-induced single-strand breaks in Escherichia coli deoxyribonucleic acid, J Bacteriol 130(1):187-91. Batista, S. B., Mounteer, A. H., Amorim, F. R., and Totola, M. R., 2006, Isolation and characterization of biosurfactant/bioemulsifier-producing bacteria from petroleum contaminated sites, Bioresour Technol 97(6):868-75. Berra, C. M., and Menck, C. F. M., 2006, Estresse oxidativo, lesões no genoma e processos de sinalização no controle do ciclo celular, Quim. Nova Vol. 29 (No. 6):1340-1344, . Blokhina, O., Virolainen, E., and Fagerstedt, K. V., 2003, Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review, Ann Bot (Lond) 91 Spec No:179-94. Calucci, L., Capocchi, A., Galleschi, L., Ghiringhelli, S., Pinzino, C., Saviozzi, F., and Zandomeneghi, M., 2004, Antioxidants, free radicals, storage proteins, puroindolines, and proteolytic activities in bread wheat (Triticum aestivum) seeds during accelerated aging, J Agric Food Chem 52(13):4274-81. Calvo, C., Manzanera, M., Silva-Castro, G. A., Uad, I., and Gonzalez-Lopez, J., 2008, Application of bioemulsifiers in soil oil bioremediation processes. Future prospects, Sci Total Environ. Carlsson, J., and Carpenter, V. S., 1980, The recA+ gene product is more important than catalase and superoxide dismutase in protecting Escherichia coli against hydrogen peroxide toxicity, J Bacteriol 142(1):319-21.

Carrim, A. J. I., Barbosa, E. C., and Vieira, J. D. G., 2006, Enzymatic Activity of Endophytic Bacterial Isolates of Jacaranda decurrens Cham. (Carobinha-do-campo), Brazilian archives of biology and technology Vol.49,(n. 3):pp. 353-359. Cirigliano, M. C., and Carman, G. M., 1984, Isolation of a bioemulsifier from Candida lipolytica, Appl Environ Microbiol 48(4):747-50. Cottrell, M. T., Moore, J. A., and Kirchman, D. L., 1999, Chitinases from uncultured marine microorganisms, Appl Environ Microbiol 65(6):2553-7. Cottrell, M. T., Waidner, L. A., Yu, L., and Kirchman, D. L., 2005, Bacterial diversity of metagenomic and PCR libraries from the Delaware River, Environ Microbiol 7(12):1883-95. Courtois, S., Cappellano, C. M., Ball, M., Francou, F. X., Normand, P., Helynck, G., Martinez, A., Kolvek, S. J., Hopke, J., Osburne, M. S., August, P. R., Nalin, R., Guerineau, M., Jeannin, P., Simonet, P., and Pernodet, J. L., 2003, Recombinant environmental libraries provide access to microbial diversity for drug discovery from natural products, Appl Environ Microbiol 69(1):49-55. Courtois, S., Frostegard, A., Goransson, P., Depret, G., Jeannin, P., and Simonet, P., 2001, Quantification of bacterial subgroups in soil: comparison of DNA extracted directly from soil or from cells previously released by density gradient centrifugation, Environ Microbiol 3(7):431-9. Cowan, D., Meyer, Q., Stafford, W., Muyanga, S., Cameron, R., and Wittwer, P., 2005, Metagenomic gene discovery: past, present and future, Trends Biotechnol 23(6):321-9. Cunningham, R. P., and Weiss, B., 1985, Endonuclease III (nth) mutants of Escherichia coli, Proc Natl Acad Sci U S A 82(2):474-8. Dams-Kozlowska, H., and Kaplan, D. L., 2007, Protein engineering of wzc to generate new emulsan analogs, Appl Environ Microbiol 73(12):4020-8. Daniel, R., 2004, The soil metagenome--a rich resource for the discovery of novel natural products, Curr Opin Biotechnol 15(3):199-204. DeLong, E. F., 2005, Microbial community genomics in the ocean, Nat Rev Microbiol 3(6):459-69. Demple, B., Johnson, A., and Fung, D., 1986, Exonuclease III and endonuclease IV remove 3' blocks from DNA synthesis primers in H2O2-damaged Escherichia coli, Proc Natl Acad Sci U S A 83(20):7731-5.

Deutscher, J., Francke, C., and Postma, P. W., 2006, How phosphotransferase system-related protein phosphorylation regulates carbohydrate metabolism in bacteria, Microbiol Mol Biol Rev 70(4):939-1031. Diaz-Torres, M. L., McNab, R., Spratt, D. A., Villedieu, A., Hunt, N., Wilson, M., and Mullany, P., 2003, Novel tetracycline resistance determinant from the oral metagenome, Antimicrob Agents Chemother 47(4):1430-2. Durante-Rodriguez, G., Zamarro, M. T., Garcia, J. L., Diaz, E., and Carmona, M., 2006, Oxygen-dependent regulation of the central pathway for the anaerobic catabolism of aromatic compounds in Azoarcus sp. strain CIB, J Bacteriol 188(7):2343-54. Eisen, J. A., and Hanawalt, P. C., 1999, A phylogenomic study of DNA repair genes, proteins, and processes, Mutat Res 435(3):171-213. Elend, C., Schmeisser, C., Leggewie, C., Babiak, P., Carballeira, J. D., Steele, H. L., Reymond, J. L., Jaeger, K. E., and Streit, W. R., 2006, Isolation and biochemical characterization of two novel metagenome-derived esterases, Appl Environ Microbiol 72(5):3637-45. Entcheva, P., Liebl, W., Johann, A., Hartsch, T., and Streit, W. R., 2001, Direct cloning from enrichment cultures, a reliable strategy for isolation of complete operons and genes from microbial consortia, Appl Environ Microbiol 67(1):89-99. Ferrer, M., Golyshina, O. V., Chernikova, T. N., Khachane, A. N., Martins Dos Santos, V. A., Yakimov, M. M., Timmis, K. N., and Golyshin, P. N., 2005, Microbial enzymes mined from the Urania deep-sea hypersaline anoxic basin, Chem Biol 12(8):895-904. Fieseler, L., Hentschel, U., Grozdanov, L., Schirmer, A., Wen, G., Platzer, M., Hrvatin, S., Butzke, D., Zimmermann, K., and Piel, J., 2007, Widespread occurrence and genomic context of unusually small polyketide synthase genes in microbial consortia associated with marine sponges, Appl Environ Microbiol 73(7):2144-55. Franklin, A., Milburn, P. J., Blanden, R. V., and Steele, E. J., 2004, Human DNA polymerase-eta, an A-T mutator in somatic hypermutation of rearranged immunoglobulin genes, is a reverse transcriptase, Immunol Cell Biol 82(2):219-25. Friedberg, E. C., 2006, The eureka enzyme: the discovery of DNA polymerase, Nat Rev Mol Cell Biol 7(2):143-7. Friedberg, E. C., Fischhaber, P. L., and Kisker, C., 2001, Error-prone DNA polymerases: novel structures and the benefits of infidelity, Cell 107(1):9-12.

Friedberg, E. C., McDaniel, L. D., and Schultz, R. A., 2004, The role of endogenous and exogenous DNA damage and mutagenesis, Curr Opin Genet Dev 14(1):5-10. Gaillard, M., Vallaeys, T., Vorholter, F. J., Minoia, M., Werlen, C., Sentchilo, V., Puhler, A., and van der Meer, J. R., 2006, The clc element of Pseudomonas sp. strain B13, a genomic island with various catabolic properties, J Bacteriol 188(5):1999-2013. Galhardo, R. S., Rocha, R. P., Marques, M. V., and Menck, C. F., 2005, An SOS-regulated operon involved in damage-inducible mutagenesis in Caulobacter crescentus, Nucleic Acids Res 33(8):2603-14. Gardner, J. G., and Escalante-Semerena, J. C., 2008, Biochemical and mutational analyses of AcuA, the acetyltransferase enzyme that controls the activity of the acetyl coenzyme a synthetase (AcsA) in Bacillus subtilis, J Bacteriol 190(14):5132-6. Goerlich, O., Quillardet, P., and Hofnung, M., 1989, Induction of the SOS response by hydrogen peroxide in various Escherichia coli mutants with altered protection against oxidative DNA damage, J Bacteriol 171(11):6141-7. Hagensee, M. E., Bryan, S. K., and Moses, R. E., 1987, DNA polymerase III requirement for repair of DNA damage caused by methyl methanesulfonate and hydrogen peroxide, J Bacteriol 169(10):4608-13. Hagensee, M. E., and Moses, R. E., 1989, Multiple pathways for repair of hydrogen peroxide-induced DNA damage in Escherichia coli, J Bacteriol 171(2):991-5. Hamamura, N., Olson, S. H., Ward, D. M., and Inskeep, W. P., 2006, Microbial population dynamics associated with crude-oil biodegradation in diverse soils, Appl Environ Microbiol 72(9):6316-24. Handelsman, J., 2004, Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms, Microbiol Mol Biol Rev 68(4):669-85. Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy, J., and Goodman, R. M., 1998, Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products, Chem Biol 5(10):R245-9. Hare, J. M., Perkins, S. N., and Gregg-Jolly, L. A., 2006, A constitutively expressed, truncated umuDC operon regulates the recA-dependent DNA damage induction of a gene in Acinetobacter baylyi strain ADP1, Appl Environ Microbiol 72(6):4036-43. Healy, F. G., Ray, R. M., Aldrich, H. C., Wilkie, A. C., Ingram, L. O., and Shanmugam, K. T., 1995, Direct isolation of functional genes encoding cellulases

from the microbial consortia in a thermophilic, anaerobic digester maintained on lignocellulose, Appl Microbiol Biotechnol 43(4):667-74. Henne, A., Daniel, R., Schmitz, R. A., and Gottschalk, G., 1999, Construction of environmental DNA libraries in Escherichia coli and screening for the presence of genes conferring utilization of 4-hydroxybutyrate, Appl Environ Microbiol 65(9):3901-7. Henne, A., Schmitz, R. A., Bomeke, M., Gottschalk, G., and Daniel, R., 2000, Screening of environmental DNA libraries for the presence of genes conferring lipolytic activity on Escherichia coli, Appl Environ Microbiol 66(7):3113-6. Hewald, S., Josephs, K., and Bolker, M., 2005, Genetic analysis of biosurfactant production in Ustilago maydis, Appl Environ Microbiol 71(6):3033-40. Hewald, S., Linne, U., Scherer, M., Marahiel, M. A., Kamper, J., and Bolker, M., 2006, Identification of a gene cluster for biosynthesis of mannosylerythritol lipids in the basidiomycetous fungus Ustilago maydis, Appl Environ Microbiol 72(8):5469-77. Heyer, W. D., 2004, Damage signaling: RecQ sends an SOS to you, Curr Biol 14(20):R895-7. Horinouchi, S., 2003, AfsR as an integrator of signals that are sensed by multiple serine/threonine kinases in Streptomyces coelicolor A3(2), J Ind Microbiol Biotechnol 30(8):462-7. Hussain, H., Branny, P., and Allan, E., 2006, A eukaryotic-type serine/threonine protein kinase is required for biofilm formation, genetic competence, and acid resistance in Streptococcus mutans, J Bacteriol 188(4):1628-32. Hutcheon, G. W., Vasisht, N., and Bolhuis, A., 2005, Characterisation of a highly stable alpha-amylase from the halophilic archaeon Haloarcula hispanica, Extremophiles 9(6):487-95. Ibrahim, A. S. S., EI-Shayeb, N. M. A., and Mabrouk, S. S., 2007, Isolation and Identification of Alkaline Protease Producing Alkaliphilic Bacteria from an Egyptian Soda Lake, Journal of Applied Sciences Research 3(11):1363-1368. Ide, H., and Kotera, M., 2004, Human DNA glycosylases involved in the repair of oxidatively damaged DNA, Biol Pharm Bull 27(4):480-5. Ilori, M. O., Adebusoye, S. A., and Ojo, A. C., 2008, Isolation and characterization of hydrocarbon-degrading and biosurfactant-producing yeast strains obtained from a polluted lagoon water, World J Microbiol Biotechnol 24:2539 2545.

Iqbal, S., Khalid, Z. M., and Malik, K. A., 1995, Enhanced biodegradation and emulsification of crude oil and hyperproduction of biosurfactants by a gamma ray-induced mutant of Pseudomonas aeruginosa, Lett Appl Microbiol 21(3):176-9. Irgens, R. L., Gosink, J. J., and Staley, J. T., 1996, Polaromonas vacuolata gen. nov., sp. nov., a psychrophilic, marine, gas vacuolate bacterium from Antarctica, Int J Syst Bacteriol 46(3):822-6. Ishizaki, T., Tosaka, A., Nara, T., Aoshima, N., Namekawa, S., Watanabe, K., Hamada, F., Omori, A., and Sakaguchi, K., 2002, Leucine aminopeptidase during meiotic development, Eur J Biochem 269(3):826-32. Ivancic-Bace, I., Vlasic, I., Salaj-Smic, E., and Brcic-Kostic, K., 2006, Genetic evidence for the requirement of RecA loading activity in SOS induction after UV irradiation in Escherichia coli, J Bacteriol 188(14):5024-32. Iwahori, K., Tokutomi, T., Miyata, N., and Fujita, M., 2001, Formation of stable foam by the cells and culture supernatant of Gordonia (Nocardia) amarae, J Biosci Bioeng 92(1):77-9. Janion, C., 2008, Inducible SOS response system of DNA repair and mutagenesis in Escherichia coli, Int J Biol Sci 4(6):338-44. Jeon, C. O., Park, W., Ghiorse, W. C., and Madsen, E. L., 2004, Polaromonas naphthalenivorans sp. nov., a naphthalene-degrading bacterium from naphthalene-contaminated sediment, Int J Syst Evol Microbiol 54(Pt 1):93-7. Jones, B. V., Sun, F., and Marchesi, J. R., 2007, Using skimmed milk agar to functionally screen a gut metagenomic library for proteases may lead to false positives, Lett Appl Microbiol 45(4):418-20. Kajander, T., Lehtio, L., Schlomann, M., and Goldman, A., 2003, The structure of Pseudomonas P51 Cl-muconate lactonizing enzyme: co-evolution of structure and dynamics with the dehalogenation function, Protein Sci 12(9):1855-64. Karanth, S., Lyson, K., and McCann, S. M., 1999, Effects of cholinergic agonists and antagonists on interleukin-2-induced corticotropin-releasing hormone release from the mediobasal hypothalamus, Neuroimmunomodulation 6(3):168-74. Kästner, M., Breuer-Jammali, M., and Mahro, B., 1994, Enumeration and characterization of the soil microflora from hydrocarbon-contaminated soil sites able to mineralize polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), Appl Microbiol Biotechnol 41:267-273.

Katemai, W., Maneerat, S., Kawai, F., Kanzaki, H., Nitoda, T., and A, H. K., 2008, Purification and characterization of a biosurfactant produced by Issatchenkia orientalis SR4, J Gen Appl Microbiol 54(1):79-82. Kennelly, P. J., and Potts, M., 1996, Fancy meeting you here! A fresh look at "prokaryotic" protein phosphorylation, J Bacteriol 178(16):4759-64. Knietsch, A., Waschkowitz, T., Bowien, S., Henne, A., and Daniel, R., 2003, Construction and screening of metagenomic libraries derived from enrichment cultures: generation of a gene bank for genes conferring alcohol oxidoreductase activity on Escherichia coli, Appl Environ Microbiol 69(3):1408-16. Koch, B., Nielsen, T. H., Sorensen, D., Andersen, J. B., Christophersen, C., Molin, S., Givskov, M., Sorensen, J., and Nybroe, O., 2002, Lipopeptide production in Pseudomonas sp. strain DSS73 is regulated by components of sugar beet seed exudate via the Gac two-component regulatory system, Appl Environ Microbiol 68(9):4509-16. Konola, J. T., Sargent, K. E., and Gow, J. B., 2000, Efficient repair of hydrogen peroxide-induced DNA damage by Escherichia coli requires SOS induction of RecA and RuvA proteins, Mutat Res 459(3):187-94. Korolev, V. G., 2005, [Base excision repair: AP endonucleases and DNA polymerases], Genetika 41(10):1301-9. Krepsky, N., Da Silva, F. S., Fontana, L. F., and Crapez, M. A., 2007, Alternative methodology for isolation of biosurfactant-producing bacteria, Braz J Biol 67(1):117-24. Kurosawa, K., Hosaka, T., Tamehiro, N., Inaoka, T., and Ochi, K., 2006, Improvement of alpha-amylase production by modulation of ribosomal component protein S12 in Bacillus subtilis 168, Appl Environ Microbiol 72(1):71-7. Lammle, K., Zipper, H., Breuer, M., Hauer, B., Buta, C., Brunner, H., and Rupp, S., 2007, Identification of novel enzymes with different hydrolytic activities by metagenome expression cloning, J Biotechnol 127(4):575-92. Laspia, M. F., and Wallace, S. S., 1988, Excision repair of thymine glycols, urea residues, and apurinic sites in Escherichia coli, J Bacteriol 170(8):3359-66. Lealem, F., and Gashe, B. A., 1994, Amylase production by a Gram-positive bacterium isolated from fermenting tef (Eragrostis tef ), Journal of Applied Bacteriology 77(348-352).

LeCleir, G. R., Buchan, A., and Hollibaugh, J. T., 2004, Chitinase gene sequences retrieved from diverse aquatic habitats reveal environment-specific distributions, Appl Environ Microbiol 70(12):6977-83. Lee, D. G., Jeon, J. H., Jang, M. K., Kim, N. Y., Lee, J. H., Lee, J. H., Kim, S. J., Kim, G. D., and Lee, S. H., 2007, Screening and characterization of a novel fibrinolytic metalloprotease from a metagenomic library, Biotechnol Lett 29(3):465-72. Lee, M. H., Lee, C. H., Oh, T. K., Song, J. K., and Yoon, J. H., 2006, Isolation and characterization of a novel lipase from a metagenomic library of tidal flat sediments: evidence for a new family of bacterial lipases, Appl Environ Microbiol 72(11):7406-9. Lee, S. W., Won, K., Lim, H. K., Kim, J. C., Choi, G. J., and Cho, K. Y., 2004, Screening for novel lipolytic enzymes from uncultured soil microorganisms, Appl Microbiol Biotechnol 65(6):720-6. Lee, Y. K., Yoon, B. D., Yoon, J. H., Lee, S. G., Song, J. J., Kim, J. G., Oh, H. M., and Kim, H. S., 2007, Cloning of srfA operon from Bacillus subtilis C9 and its expression in E. coli, Appl Microbiol Biotechnol 75(3):567-72. Leff, L. G., Dana, J. R., McArthur, J. V., and Shimkets, L. J., 1995, Comparison of methods of DNA extraction from stream sediments, Appl Environ Microbiol 61(3):1141-3. Liao, Y., Zhou, X., Yu, J., Cao, Y., Li, X., and Kuai, B., 2006, The key role of chlorocatechol 1,2-dioxygenase in phytoremoval and degradation of catechol by transgenic Arabidopsis, Plant Physiol 142(2):620-8. Liles, M. R., Manske, B. F., Bintrim, S. B., Handelsman, J., and Goodman, R. M., 2003, A census of rRNA genes and linked genomic sequences within a soil metagenomic library, Appl Environ Microbiol 69(5):2684-91. Liles, M. R., Williamson, L. L., Rodbumrer, J., Torsvik, V., Goodman, R. M., and Handelsman, J., 2008, Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms, Appl Environ Microbiol 74(10):3302-5. Lorenz, P., and Eck, J., 2005, Metagenomics and industrial applications, Nat Rev Microbiol 3(6):510-6. Lorenz, P., Liebeton, K., Niehaus, F., and Eck, J., 2002, Screening for novel enzymes for biocatalytic processes: accessing the metagenome as a resource of novel functional sequence space, Curr Opin Biotechnol 13(6):572-7.

Lorenz, P., and Schleper, C., 2002, Metagenome a challenging source of enzyme discovery, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (19 20):13 19. Makkar, R. S., and Cameotra, S. S., 1997, Biosurfactant production by a thermophilic Bacillus subtilis strain, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18:37 42. Makkar, R. S., and Cameotra, S. S., 2002, An update on the use of unconventional substrates for biosurfactant production and their new applications, Appl Microbiol Biotechnol 58(4):428-34. Maneerat, S., 2005, Production of biosurfactants using substrates from renewable-resources, Songklanakarin J. Sci. Technol., 27(3):675-683. Martinez, A., Kolvek, S. J., Yip, C. L., Hopke, J., Brown, K. A., MacNeil, I. A., and Osburne, M. S., 2004, Genetically modified bacterial strains and novel bacterial artificial chromosome shuttle vectors for constructing environmental libraries and detecting heterologous natural products in multiple expression hosts, Appl Environ Microbiol 70(4):2452-63. Martins-Pinheiro, M., Marques, R. C., and Menck, C. F., 2007, Genome analysis of DNA repair genes in the alpha proteobacterium Caulobacter crescentus, BMC Microbiol 7:17. Marzorati, M., de Ferra, F., Van Raemdonck, H., Borin, S., Allifranchini, E., Carpani, G., Serbolisca, L., Verstraete, W., Boon, N., and Daffonchio, D., 2007, A novel reductive dehalogenase, identified in a contaminated groundwater enrichment culture and in Desulfitobacterium dichloroeliminans strain DCA1, is linked to dehalogenation of 1,2-dichloroethane, Appl Environ Microbiol 73(9):2990-9. Miller, D. N., Bryant, J. E., Madsen, E. L., and Ghiorse, W. C., 1999, Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples, Appl Environ Microbiol 65(11):4715-24. Mori, T., Suenaga, H., and Miyazaki, K., 2008, A metagenomic approach to the identification of UDP-glucose 4-epimerase as a menadione resistance protein, Biosci Biotechnol Biochem 72(6):1611-4. Morikawa, M., Daido, H., Takao, T., Murata, S., Shimonishi, Y., and Imanaka, T., 1993, A new lipopeptide biosurfactant produced by Arthrobacter sp. strain MIS38, J Bacteriol 175(20):6459-66. Mulligan, C. N., 2005, Environmental applications for biosurfactants, Environ Pollut 133(2):183-98.

Nakar, D., and Gutnick, D. L., 2003, Involvement of a protein tyrosine kinase in production of the polymeric bioemulsifier emulsan from the oil-degrading strain Acinetobacter lwoffii RAG-1, J Bacteriol 185(3):1001-9. Nde, C. W., Fakhr, M. K., Doetkott, C., and Logue, C. M., 2008, An evaluation of conventional culture, invA PCR, and the real-time PCR iQ-Check kit as detection tools for Salmonella in naturally contaminated premarket and retail turkey, J Food Prot 71(2):386-91. Nde, C. W., Jang, H. J., Toghrol, F., and Bentley, W. E., 2008, Toxicogenomic response of Pseudomonas aeruginosa to ortho-phenylphenol, BMC Genomics 9:473. Nde, C. W., and Logue, C. M., 2008, Characterization of antimicrobial susceptibility and virulence genes of Salmonella serovars collected at a commercial turkey processing plant, J Appl Microbiol 104(1):215-23. Ngai, K. L., Schlomann, M., Knackmuss, H. J., and Ornston, L. N., 1987, Dienelactone hydrolase from Pseudomonas sp. strain B13, J Bacteriol 169(2):699-703. Nitschkea, M., and Costa, S. G. V. A. O., 2007 Biosurfactants in food industry, Trends in Food Science & Technology 18:252-259. Nohmi, T., 2006, Environmental stress and lesion-bypass DNA polymerases, Annu Rev Microbiol 60:231-53. Okoh, A. I., 2006, Biodegradation alternative in the cleanup of petroleum hydrocarbon pollutants, Biotechnology and Molecular Biology Reviews Vol. 1 (2):pp. 38-50 Oliveira, A. N., Oliveira, L. A., Andrade, J. S., and Chagas, A. F., 2006, Atividade enzimática de isolados de rizóbia nativos da amazônia central crescendo em diferentes níveis de acidez, Ciênc. Tecnol. Aliment., 204-210,:204-210,. Olivera, N. L., Nievas, M. L., Lozada, M., Del Prado, G., Dionisi, H. M., and Sineriz, F., 2008, Isolation and characterization of biosurfactant-producing Alcanivorax strains: hydrocarbon accession strategies and alkane hydroxylase gene analysis, Res Microbiol. Ono, A., Miyazaki, R., Sota, M., Ohtsubo, Y., Nagata, Y., and Tsuda, M., 2007, Isolation and characterization of naphthalene-catabolic genes and plasmids from oil-contaminated soil by using two cultivation-independent approaches, Appl Microbiol Biotechnol 74(2):501-10.

Park, H. J., Jeon, J. H., Kang, S. G., Lee, J. H., Lee, S. A., and Kim, H. K., 2007, Functional expression and refolding of new alkaline esterase, EM2L8 from deep-sea sediment metagenome, Protein Expr Purif 52(2):340-7. Park, S. Y., Kim, J. T., Kang, S. G., Woo, J. H., Lee, J. H., Choi, H. T., and Kim, S. J., 2007, A new esterase showing similarity to putative dienelactone hydrolase from a strict marine bacterium, Vibrio sp. GMD509, Appl Microbiol Biotechnol 77(1):107-15. Peng, F., Wang, Y., Sun, F., Liu, Z., Lai, Q., and Shao, Z., 2008, A novel lipopeptide produced by a Pacific Ocean deep-sea bacterium, Rhodococcus sp. TW53, J Appl Microbiol 105(3):698-705. Pirollo, M. P., Mariano, A. P., Lovaglio, R. B., Costa, S. G., Walter, V., Hausmann, R., and Contiero, J., 2008, Biosurfactant synthesis by Pseudomonas aeruginosa LBI isolated from a hydrocarbon-contaminated site, J Appl Microbiol 105(5):1484-90. Piskonen, R., Nyyssonen, M., and Itavaara, M., 2008, Evaluating the biodegradation of aromatic hydrocarbons by monitoring of several functional genes, Biodegradation 19(6):883-95. Polevoda, B., and Sherman, F., 2002, The diversity of acetylated proteins, Genome Biol 3(5):reviews0006. Prabhu, Y., and Phale, P. S., 2003, Biodegradation of phenanthrene by Pseudomonas sp. strain PP2: novel metabolic pathway, role of biosurfactant and cell surface hydrophobicity in hydrocarbon assimilation, Appl Microbiol Biotechnol 61(4):342-51. Pruthi, V., and Cameotra, S. S., 1997, Rapid identification of biosurfactant-producing bacterial strains using a cell surface hydrophobicity technique Biotechnology Techniques Vol 11, Number 9. Rajendhran, J., and Gunasekaran, P., 2008, Strategies for accessing soil metagenome for desired applications, Biotechnol Adv 26(6):576-90. Ranjan, R., Grover, A., Kapardar, R. K., and Sharma, R., 2005, Isolation of novel lipolytic genes from uncultured bacteria of pond water, Biochem Biophys Res Commun 335(1):57-65. Rodrigues, L., Banat, I. M., Teixeira, J., and Oliveira, R., 2006, Biosurfactants: potential applications in medicine, J Antimicrob Chemother 57(4):609-18. Rondon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L.,

Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., and Goodman, R. M., 2000, Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms, Appl Environ Microbiol 66(6):2541-7. Rosenberg, E., and Ron, E. Z., 1999, High- and low-molecular-mass microbial surfactants, Appl Microbiol Biotechnol 52(2):154-62. Rosenberg, E., Zuckerberg, A., Rubinovitz, C., and Gutnick, D. L., 1979, Emulsifier of Arthrobacter RAG-1: isolation and emulsifying properties, Appl Environ Microbiol 37(3):402-8. Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., and Linn, S., 2004, Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints, Annu Rev Biochem 73:39-85. Schlomann, M., Ngai, K. L., Ornston, L. N., and Knackmuss, H. J., 1993, Dienelactone hydrolase from Pseudomonas cepacia, J Bacteriol 175(10):2994-3001. Schloss, P. D., and Handelsman, J., 2003, Biotechnological prospects from metagenomics, Curr Opin Biotechnol 14(3):303-10. Schmeisser, C., Stockigt, C., Raasch, C., Wingender, J., Timmis, K. N., Wenderoth, D. F., Flemming, H. C., Liesegang, H., Schmitz, R. A., Jaeger, K. E., and Streit, W. R., 2003, Metagenome survey of biofilms in drinking-water networks, Appl Environ Microbiol 69(12):7298-309. Schmidt, T. M., DeLong, E. F., and Pace, N. R., 1991, Analysis of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing, J Bacteriol 173(14):4371-8. Sedgwick, B., Bates, P. A., Paik, J., Jacobs, S. C., and Lindahl, T., 2007, Repair of alkylated DNA: recent advances, DNA Repair (Amst) 6(4):429-42. Spies, M., Amitani, I., Baskin, R. J., and Kowalczykowski, S. C., 2007, RecBCD enzyme switches lead motor subunits in response to chi recognition, Cell 131(4):694-705. Steele, H. L., Jaeger, K. E., Daniel, R., and Streit, W. R., 2009, Advances in recovery of novel biocatalysts from metagenomes, J Mol Microbiol Biotechnol 16(1-2):25-37. Suenaga, H., Ohnuki, T., and Miyazaki, K., 2007, Functional screening of a metagenomic library for genes involved in microbial degradation of aromatic compounds, Environ Microbiol 9(9):2289-97.

Suresh Kumar, A., Mody, K., and Jha, B., 2007, Evaluation of biosurfactant/bioemulsifier production by a marine bacterium, Bull Environ Contam Toxicol 79(6):617-21. Takemoto, T., Zhang, Q. M., Matsumoto, Y., Mito, S., Izumi, T., Ikehata, H., and Yonei, S., 1998, 3'-blocking damage of DNA as a mutagenic lesion caused by hydrogen peroxide in Escherichia coli, J Radiat Res (Tokyo) 39(2):137-44. Tanaka, A., Takano, Y., Ohnishi, Y., and Horinouchi, S., 2007, AfsR recruits RNA polymerase to the afsS promoter: a model for transcriptional activation by SARPs, J Mol Biol 369(2):322-33. Tebbe, C. C., and Vahjen, W., 1993, Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast, Appl Environ Microbiol 59(8):2657-65. Tien, C. C., Chao, C. C., and Chao, W. L., 1999, Methods for DNA extraction from various soils: a comparison, Journal of Applied Microbiology 86:937-943. Tillotson, R. D., Wosten, H. A., Richter, M., and Willey, J. M., 1998, A surface active protein involved in aerial hyphae formation in the filamentous fungus Schizophillum commune restores the capacity of a bald mutant of the filamentous bacterium Streptomyces coelicolor to erect aerial structures, Mol Microbiol 30(3):595-602. Torsvik, V., Goksoyr, J., and Daae, F. L., 1990, High diversity in DNA of soil bacteria, Appl Environ Microbiol 56(3):782-7. Torsvik, V., Salte, K., Sorheim, R., and Goksoyr, J., 1990, Comparison of phenotypic diversity and DNA heterogeneity in a population of soil bacteria, Appl Environ Microbiol 56(3):776-81. Toussaint, A., Ghigo, J. M., and Salmond, G. P., 2003, A new evaluation of our life-support system, EMBO Rep 4(9):820-4. Tropel, D., and van der Meer, J. R., 2004, Bacterial transcriptional regulators for degradation pathways of aromatic compounds, Microbiol Mol Biol Rev 68(3):474-500. Truglio, J. J., Croteau, D. L., Van Houten, B., and Kisker, C., 2006, Prokaryotic nucleotide excision repair: the UvrABC system, Chem Rev 106(2):233-52. Tsai, Y. L., and Olson, B. H., 1991, Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments, Appl Environ Microbiol 57(4):1070-4.

Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., and Watanabe, K., 2005, Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes, Nat Biotechnol 23(1):88-93. Van Hamme, J. D., Singh, A., and Ward, O. P., 2003, Recent advances in petroleum microbiology, Microbiol Mol Biol Rev 67(4):503-49. Van Hamme, J. D., Singh, A., and Ward, O. P., 2006, Physiological aspects. Part 1 in a series of papers devoted to surfactants in microbiology and biotechnology, Biotechnol Adv 24(6):604-20. Vazquez, S. C., Hernandez, E., and Mac Cormack, W. P., 2008, Extracellular proteases from the Antarctic marine pseudoalteromonas sp. P96-47 strain, Rev Argent Microbiol 40(1):63-71. Vidal, A., Abril, N., and Pueyo, C., 1998, DNA sequence analysis of spontaneous lacI-d mutations in O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase-proficient and -deficient Escherichia coli, Mutagenesis 13(4):367-73. Voget, S., Leggewie, C., Uesbeck, A., Raasch, C., Jaeger, K. E., and Streit, W. R., 2003, Prospecting for novel biocatalysts in a soil metagenome, Appl Environ Microbiol 69(10):6235-42. Vomberg, A., and Klinner, U., 2000, Distribution of alkB genes within n-alkane-degrading bacteria, J Appl Microbiol 89(2):339-48. Walzer, G., Rosenberg, E., and Ron, E. Z., 2009, Identification of outer membrane proteins with emulsifying activity by prediction of beta-barrel regions, J Microbiol Methods 76(1):52-7. Wamelink, M. M., Struys, E. A., and Jakobs, C., 2008, The biochemistry, metabolism and inherited defects of the pentose phosphate pathway: a review, J Inherit Metab Dis 31(6):703-17. Wang, L., Qiao, N., Sun, F., and Shao, Z., 2008, Isolation, gene detection and solvent tolerance of benzene, toluene and xylene degrading bacteria from nearshore surface water and Pacific Ocean sediment, Extremophiles 12(3):335-42. Whitman, W. B., Coleman, D. C., and Wiebe, W. J., 1998, Prokaryotes: the unseen majority, Proc Natl Acad Sci U S A 95(12):6578-83. Wosten, H. A., and Willey, J. M., 2000, Surface-active proteins enable microbial aerial hyphae to grow into the air, Microbiology 146 ( Pt 4):767-73.

Wu, J. Y., Yeh, K. L., Lu, W. B., Lin, C. L., and Chang, J. S., 2008, Rhamnolipid production with indigenous Pseudomonas aeruginosa EM1 isolated from oil-contaminated site, Bioresour Technol 99(5):1157-64. Wyatt, M. D., and Pittman, D. L., 2006, Methylating agents and DNA repair responses: Methylated bases and sources of strand breaks, Chem Res Toxicol 19(12):1580-94. Xu, J., 2006, Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances, Mol Ecol 15(7):1713-31. Yang, H., To, K. H., Aguila, S. J., and Miller, J. H., 2006, Metagenomic DNA fragments that affect Escherichia coli mutational pathways, Mol Microbiol 61(4):960-77. Yang Zh, H., Xiao, Y., Zeng, G. M., Xu Zh, Y., and Liu, Y., 2007, Comparison of methods for total community DNA extraction and purification from compost, Appl Microbiol Biotechnol 74(4):918-25. Yew, W. S., Fedorov, A. A., Fedorov, E. V., Rakus, J. F., Pierce, R. W., Almo, S. C., and Gerlt, J. A., 2006, Evolution of enzymatic activities in the enolase superfamily: L-fuconate dehydratase from Xanthomonas campestris, Biochemistry 45(49):14582-97. Youssef, N. H., Duncan, K. E., Nagle, D. P., Savage, K. N., Knapp, R. M., and McInerney, M. J., 2004, Comparison of methods to detect biosurfactant production by diverse microorganisms, J Microbiol Methods 56(3):339-47. Yun, J., Kang, S., Park, S., Yoon, H., Kim, M. J., Heu, S., and Ryu, S., 2004, Characterization of a novel amylolytic enzyme encoded by a gene from a soil-derived metagenomic library, Appl Environ Microbiol 70(12):7229-35. Zeinali, M., Vossoughi, M., and Ardestani, S. K., 2007, Characterization of a moderate thermophilic Nocardia species able to grow on polycyclic aromatic hydrocarbons, Lett Appl Microbiol 45(6):622-8. Zharkov, D. O., Shoham, G., and Grollman, A. P., 2003, Structural characterization of the Fpg family of DNA glycosylases, DNA Repair (Amst) 2(8):839-62. Zhou, J., Bruns, M. A., and Tiedje, J. M., 1996, DNA recovery from soils of diverse composition, Appl Environ Microbiol 62(2):316-22.