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LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS

Aluna: Bertha Dévora Agurto BerdejoOrientador: Ricardo Antunes Azevedo

SUMÁRIO

� Introdução� Aminoácidos

�Vias Metabólicas� Diferentes vias

�Via Metabólica do Aspartato� Quatro essenciais

�Estratégias de Pesquisa� Três formas

�Considerações Finais

�O que são aminoácidos� Molécula que contém os grupos funcionais amina e

ácido carboxílico. � Formam a estrutura das proteínas

�Aminoácidos Essencias� São vinte tipos de aminoácidos incorporados nas

proteínas, � nove (lisina, treonina, metionina, fenilalanina, triptofano,

isoleucina, leucina, valina e histidina) são denominados essenciais � não são sintetizados por humanos e animais monogástricos, sendo

adquiridos nas dietas alimentares.

INTRODUÇÃO

INTRODUÇÃO

� Características

� As enzimas que atuam na síntese destes aminoácidos estão normalmente localizadas dentro dos cloroplastos das folhas ou em plastídeos de órgãos não fotossintéticos, como raiz e sementes.

� Principais moléculas de acumulo de nitrogênio para as plantas.

� Mais de 300 aminoácidos não protéicos foram isolados de plantas, os quais tem papel importante na medicina, nutrição e agricultura

� Importância

� Desempenham importantes funções� transportadores de nitrogênio para diferentes partes nos vegetais,

� reguladores em diversos processos envolvidos em resposta a diferentes condições ambientais,

� relacionados também com a qualidade nutricional das proteínas presentes nas sementes.

INTRODUÇÃO

� Síntese

� São sintetizados nos vegetais em complexas vias metabólicas sujeitas a uma regulação muito complexa e restrita para evitar o desperdício de energia e de nutrientes importantes como, carbono, nitrogênio e enxofre.

� A regulação das vias metabólicas é feita por enzimas, substratos e pelos próprios aminoácidos obtidos como produtos finais

INTRODUÇÃO

� Assimilação de Nitrogênio

� Normalmente, o nitrato é a principal fonte de nitrogênio disponível para as plantas.

� O nitrato absorvido pelas raízes é reduzido e incorporado na célula através de uma série de reações catalisadas por enzimas assimilatórias.

� Inicialmente, o nitrato absorvido é reduzido a nitrito em uma reação catalisada pela enzima nitrato redutase (NR, EC 1.6.6.1).

� Posteriormente, o nitrito é reduzido a amônio pela ação da enzima nitrito redutase (NiR, EC 1.7.7.1),

� O amônio é convertido em aminoácidos pela ação das enzimas glutamina sintetase e glutamato sintase (GS - GOGAT; EC 6.3.1.2 e EC 1.4.7.1, respectivamente)

INTRODUÇÃO

INTRODUÇÃO

COO-

C H

R

+H3N

aminoácidosNH4

+

amônia

N2 Intermediáriosda via glicolítica

Intermediáriosdo ciclo doácido cítrico

Intermediáriosda via

das pentoses

COO-

C H

R

Esqueletocarbônico

BIOSÍNTESE DE AMINOÁCIDOS

Via metabólica dos aminoácidos

Ser Gly Cys

Ser Gly Cys

As sínteses de serina e glicina

estão intimamente relacionadas

com a via de fotorrespiração nos

vegetais. São transportados para

outros órgãos e usados como

precursores da cisteína e da

glutationa.

Na ausência de fotorrespiração a serina também é sintetizada a partir de fosfoglicerato, uma vez sintetizado, o aminoácido serina éconvertido em glicina.

• Serina

O aminoácido glicina formado é, então, utilizado para a síntese de serina nas mitocôndrias.

• Glicina

O glicolato formado nos cloroplastos é oxidado a glioxalato e convertido a glicina nos peroxissomos.

• Cisteína

Regula a estrutura e a função das proteínas.

O mais importante constituinte da glutationa.

O esqueleto de carbono é cedido pela serina.

Ser Gly Cys

Tyr Phe Trp

• Via do Shikimato

-20% do carbono fixado pela planta passa por esta via.

-Todas as enzimas estão localizadas no cloroplasto, mas há evidências de que ocorre uma segunda via no citoplasma.

-EPSPS penúltimo passo da viaalvo do glifosatoaumenta a concentração de shikimato

• Aromáticos

-Reguladores de crescimento

-Agentes químicos de defesa

-Atrativos para polinizadores

Tyr Phe Trp

Leu Val Ala

• Leucina e Valina

As reações ocorrem no cloroplasto, o carbono é derivado apenas de duas moléculas de piruvato.

Provavelmente estão relacionados à degradação de aminoácidos.

As vias metabólicas de síntese de leucina e valina são consideradas bioquimicamente paralelas.

• Alanina

Um dos aminoácidos mais simples

Pouco reativo quimicamente

Reconhecimento de substratos em sítios ativos ou de regulação enzimática

Leu Val Ala

Glu Gln Pro Arg His

• Glutamato e Glutamina

Inicialmente o amônio absorvido do solo ou reduzido a partir de nitrato via NR e NiR é assimilado em glutamina e glutamato via ciclo GS-GOGAT:

- GS: glutamina sintetase- GOGAT: glutamato

sintase

O Glutamato formado origina a Glutamina com o auxílio de amônio.

Glu Gln Pro Arg His

• Prolina

A prolina é sintetizada em outro ramo em quatro reações enzimáticas;

O principal aminoácido das proteínas de sementes;

Papel importante como osmoprotetor na resistência à seca;

Estoque de energia para o crescimento do tubo polínico;

Fixação de nitrogênio nos nódulos das raízes de leguminosas.

Glu Gln Pro Arg His

Glu Gln Pro Arg His

•Arginina

A síntese de arginina representa um conveniente mecanismo de armazenamento de nitrogênio, cada molécula écomposta por 4 átomos de nitrogênio. As sementes freqüentemente contêm uma alta concentração deste aminoácido.

Este aminoácido é acumulado em diferentes tecidos da planta e tem um papel importante em sua diferenciação, incluindo o florescimento, a nodulação da raiz e também a resistência ao estresse.

•Histidina:

- Aminoácido não essencial que apresenta funções essenciais como a manutenção do status de oxi-redução(Boldyrev, 1999).

- A quelação dos metais através de biomolécula serve como um mecanismo de defesa utilizado por algumas espécies para resistir a exposição a íons de metais tóxicos. Nas plantas denominadas hiperacumuladoras, por exemplo, a histidina é conhecido por iniciar a principal função da quelação e transporte de metais como zinco, níquel, cobalto e cobre lidando com a intolerância do metal (Lasat, 2000).

Glu Gln Pro Arg His

VIA METABÓLICA DO ÁCIDO ASPÁRTICO

� Devido a baixa concentração de lisina e treonina nas sementes de cereais, e sua importância como aminoácidos essenciais, estudos tem sido realizados para se obter um melhor entendimento da regulação da via metabólica.

• O AspartatoAspartato atua como

precursor comum em duas

vias metabólicas

A primeira conduz

à síntese do aminoácido

asparagina,

A segunda conduz à

síntese de quatro dos nove

aminoácidos essenciais:

lisina, treonina, metionina e

isoleucina.

Aspartato

β-Aspartil fosfato

AsparaginaAK

HSDHDHDPS

Lisina

Homoserina

Treonina

Metionina

Isoleucina

TS

β-aspartil fosfato

Asn Asp Lys Met Thr Ile

• Asparagina

-Composto usado no armazenamento e transporte de nitrogênio na planta

-As enzimas do metabolismo da asparaginaestão localizadas no citosol, embora estudos de seqüenciamento genético recentes confirmaram que as enzimas envolvidas na síntese dos restantes dos aminoácidos derivados do aspartato estão localizados no cloroplasto das folhas, ou em plastídeos dos orgãos não fotossintetizantes como as sementes e a raíz.

• Aspartato

Formado pelo processo de transaminação do ácido oxaloacético, originado no ciclo de Krebs nas mitocôndrias ou através da ação da enzima fosfoenolpiruvato carboxilase no citoplasma


• HSDH

A enzima HSDH catalisa a síntese de homoserina

Foi primeiramente estudada em procariotos e posteriormente em vegetais.

Duas isoenzimas da HSDH têm sido observadas em vegetais

uma sensível a treonina, no citoplasmaoutra resistente à inibição por treonina.

• AK

Primeira enzima da via metabólica do ácido aspártico.

Inicialmente a AK foi estudada em microrganismos e posteriormente em diversas espécies vegetais como milho, arroz, sorgo

Duas isoenzimas distintas da AK têm sido descritas:

Isoenzima monofuncional e sensível à inibição por lisina, predominante

Presente em um polipeptídeo bifuncional apresentando um domínio de AK e outro de HSDH, sendo sensível à inibição por treonina

β-aspartil fosfato


• DHDPS

Dihidropicolinato sintase

Cloroplastos

Diferentemente do observado para as enzimas AK e HSDH, somente uma forma altamente sensível àinibição por baixas concentrações de lisina tem sido descrita

β-aspartil fosfato

• Lisina

É sintetizado a partir de β-aspartatosemialdeído em sete reações enzimáticas iniciadas pela ação da enzima DHDPS.


LOR

SDH

Lisina

Sacaropina

2-aminoadipato semialdeído

+

glutamato

• Catabolismo de Lisina

Duas enzimas estão envolvidas no catabolismo de lisina

LOR, lisina 2-oxoglutarato redutaseSDH, sacaropina desidrogenase

Embora as enzimas LOR e SDH possam estar presentes em vegetais como enzimas monofuncionais, a maior atividade da LKR e SDH está presente em um polipeptídeo bifuncional

O aminoácido lisina pode regular seu próprio catabolismo com as enzimas sendo moduladas diferencialmente em uma cascata de sinais intracelular envolvendo principalmente cálcio e um processo de fosforilação-desfosforilação da proteína.


β-aspartil fosfato • CGS e TS

Ensaios realizados in vitroindicaram que em plantas a enzima TS tem de 250 a 500 vezes mais afinidade pela OPH do que a enzima CGS

• Metionina

-1ª enzima cistationa-γ-sintase(CGS).

-Precursor de S-adenosilmetionina(SAM)

-Principal doador do grupo metil em reações de transmetilações

-Intermediário na biosintese de poliaminas e do fitohormonio etileno

• Treonina

1ª enzima treonina sintase (TS), induzida por SAM


β-aspartil fosfato

• Isoleucina

Treonina deaminase (TD) é a primeira enzima na síntese de Isoleucina.

Há duas isoformas de TD

-Biossintética: presente em tecido jovem em desenvolvimento, que sofre inibição por isoleucina

-Biodegradativa: presente em tecido velho, senescente, não sensível à inibição.


Inibição porfeedback sequencial

Multiplicidadeenzimática

� Os estudos bioquímicos, genéticos e moleculares da via do ácido aspártico levaram à compreensão de mecanismos importantes para a manipulação metabólica da via e para a elaboração de estratégias para produção de cereais com alto teor de lisina nas sementes.

Estratégias de Pesquisa

� Quatro principais estratégias têm sido utilizadas para produção de cereais que acumulam alta concentração de lisina� Melhoramento genético

� QPM

� Identificação de mutantes naturais

� Produção de plantas transgênicas

Estratégias de Pesquisa

• Objetivos

Foi realizado um estudo, em sementes imaturas, com as enzimas envolvidas na biossíntese de lisina, para obter o seu padrão de atividade.

• Quinoa

Importante fonte de proteínas devido a sua digestibilidade e composição balanceada de aminoácidos.

Pseudocereal

Identificação de Mutantes Naturais

As enzimas apresentaram um resultado similar nas três etapas de desenvolvimento indicando que qualquer uma das três etapas pode ser usado como fonte de atividade para o estudo das propriedades reguladoras das enzimas.

Assim para o estudo de atividade foram utilizadas as sementes com 20 DAP


A concentração total de aminoácidos solúveis permaneceu inalterada durante o desenvolvimento, com as folhas exibindo uma concentração maior que a das raízes.


Lisina nas concentrações de 1 e 5 mM inibiram a atividade de AK em 19,5% e 23,8% respectivamente.

Treonina nas concentrações de 1 e 5 mM inibiram a atividade de AK em 45,2% e 49,7%, respectivamente.

Lys +Thr nas concentrações de 1 e 5 mM inibiram a atividade de AK 37,6% e 47,6%, respectivamente.

Controle lisina treonina metionina S-2-aminoetil L-cisteina

Sementes com 20 DAP


Lisina, Metionina e AEC não afetaram a atividade de HSDH.

Treonina nas concentrações de 1 e 5 mM inibiram a atividade de AK em 46,9% e 63,9% respectivamente.

Sementes com 20 DAP



A adição de lisina na mistura com treonina, nas concentrações de 1 e 5 mM induziu uma forte inibição da atividade de DHDPS, 65,3% e 69,9%, respectivamente.

AEC nas concentrações de 1 e 5 mM inibiram a atividade de DHDPS em 28,7%e 60,1%, respectivamente.

A treonina e a metionina não alteraram a atividade de DHPS

Sementes com 20 DAP



• Conclusões

-Presença de duas isoenzimas de AK

-Maior concentração de treonina nas sementes de Quinoa

-Presença de duas isoenzimas de HSDH

-Uma isoenzima de DHDPS altamente sensível à inibição por lisina

-Alta concentração de lisina (alta síntese de lisina e acumulo na forma solúvel)


� O estudo dos mutantes apresentando alterações na sensibilidade das enzimas AK e DHDPS aos aminoácidos lisina, treonina e ao AEC, contribuíram para a compreensão dos mecanismos regulatórios envolvidos na via metabólica do ácido aspártico, principalmente aos relacionados à regulação das enzimas chave da síntese de lisina AK e DHDPS. O uso de plantas transgênicas se revelou como uma importante metodologia para o estudo desta via metabólica.

Produção de Plantas Transgênicas

• Objetivo

Aumentar o acumulo de lisina livre combinando duas vias de transformação de milho.

-CordapA (Corynebacterium glutamicum) gene com expressão resistente ao feedback de lisina.

-Supressão do gene LKR/SDH


Embriões imaturos de milho

Agrobacterium Vetor binário pMON93066

+ de 90 indivíduos transformados R0

Cópia do gene marcador

autopolinização 16 linhas

+ de 100 sementes R1

Western blot 6 grãos por linha, aleatoriamente


• Western blot

A maioria das linhas 11/16 apresentaram expressão de CordapA e redução de LKR/SDH (a).

Duas linhas mostraram expressão do CordapA, mas sem redução de LKR/SDH (b).

Uma linha não apresentou expressão de CordapA, mas redução de LKR/SDH (c).

Duas linhas não apresentaram nem expressão, nem redução.

baa c


A análise de lisina livre em sementes maduras da R2, demonstrou que não ocorre acumulo de lisina nos grãos maduros de milho, quando transformados com apenas o gene CordapA.

Na transformação M115160, na qual a expressão de CordapA não foi significativa, o acumulo de lisina foi ~ 2x menor quando comparado com o acumulo nas transformações com expressão do CordapA e redução do LKR/SDH.

M – transformãção com os genes CordapA e LKR/SDH

S – transformação com o gene CordapA


• Conclusão

-Nova metodologia para aumentar a concentração de lisina em grãos de milho maduro.

-Transgene com CordapA e a supressão do gene LKR/SDH

-Constatou-se um aumento no acumulo de lisina solúvel de 2x e de 3x no total de lisina nas sementes transgênicas.


CONSIDERAÇÕES FINAIS

Algumas enzimas secundárias da via metabólica do aspartato ainda não tiveram sua regulação esclarecida por completo;

Entretanto, para as principais enzimas reguladoras da vai ou para aquelas que são alvo da ação de herbicidas, grandes avanços científicos foram alcançados;

Já foram clonados e expressos em E. coli diversos genes das enzimas da via metabólica, com isto foi possível a obtenção da estrutura cristalizada das enzimas, assim como o estudo de seu mecanismo de reação.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Espécies transgênicas de cereais e leguminosas, contendo o aumento ou redução da atividade de uma enzima tem demonstrado que a regulação da via pode ser dramaticamente alterada.

A meta de produzir linhagens comerciais viáveis com uma maior qualidade protéica, aumentando o conteúdo de aminoácidos essenciais nas sementes ainda tem que ser alcançada.

OBRIGADA!

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