produção de nanopartículas poliméricas com tamanho...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC
Centro de Ciências Naturais e Humanas
Programa de Pós-Graduação em BIOTECNOCIÊNCIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno: Anderson Marques de Oliveira
RA: 13031512
Orientador: Fernando Carlos Giacomelli
Produção de Nanopartículas Poliméricas com Tamanho
Controlado com Potencial Aplicação na Liberação
Controlada de Agentes Antitumorais.
2
A presente dissertação foi realizada inteiramente pelo autor no período de maio de 2012 a abril de 2014, no Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência da UFABC sob a orientação do Prof. Dr. Fernando Carlos Giacomelli.
Anderson Marques de Oliveira
Orientador: Dr. Fernando Carlos Giacomelli
3
“É muito melhor arriscar coisas grandiosas, alcançar triunfos e glórias,
mesmo expondo-se a derrota, do que formar fila com os pobres de espírito
que nem gozam muito nem sofrem muito, porque vivem nessa penumbra
cinzenta que não conhece vitória nem derrota.”
Theodoro Roosevelt
À minha esposa Roseane e meus filhos Emanuel e Emanueli por todo o apoio nos momentos mais difíceis e por entenderem que a ausência no momento das batalhas se justifica com um futuro glorioso e uma união
consolidada.
4
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus pela Saúde, e por ser a principal fonte de força e por conceder-
nos o livre arbítrio e a capacidade de pensar.
Ao meu orientador Fernando Carlos Giacomelli pelos conhecimentos e apoio em todo o
tempo sobre tudo pela confiança e total assistência durante todo o tempo de mestrado e
desenvolvimento desta dissertação.
A minha esposa Roseane M. S.M. Oliveira por todo apoio, compreensão, por todo o
incentivo, encorajamento e por sonhar junto comigo em todo o tempo e me manter com
os pés no chão quando preciso. Te amo!!
A minha mãe, a professora Gladys Marques de Farias, por sempre acreditar em mim e
por ser o melhor exemplo de pessoa a seguir.
Ao meu Pai José Alfredo por todo apoio, incentivo e compreensão além é claro dos
“puxões de orelha” nas horas certas.
A meus filhos por me motivarem em todo o tempo e por comemorarem juntos comigo
todos os momentos de vitória e por me alegrarem nos momentos de tristeza.
Ao professor Dr. Jean-Jacques Bonvent por me fazer acreditar que nada é tão difícil que
não possa ser superado.
A Professora Dra. Marcella Milazzotto por todos os conhecimentos, pelo carinho,
incentivo e atenção dispensados.
Ao professor Dr. Wanius Garcia pelos conhecimentos e pelos conselhos dispensados em
todo o tempo.
A todos os docentes do UFABC que de alguma forma acrescentaram conhecimento e
valores nessa curta caminha que é o mestrado acadêmico.
5
Ao suporte financeiro da FAPESP (Proc. 2012/17841-5) pelo financiamento através de
bolsa de estudos durante parte do período de mestrado acadêmico.
Ao suporte financeiro da FAPESP (Proc. 2012/14087-8) e do CNPq (Proc.
4706082012-9) para a execução experimental do projeto de pesquisa proposto.
6
Sumário
1. RESUMO ............................................................................................................... 12
2. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 13
3. OBJETIVOS ........................................................................................................... 14
4. REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 15
4.1. POLÍMEROS BIODEGRADÁVEIS ..................................................................... 15
4.2. NANOPARTICULAS POLIMÉRICAS ................................................................ 17
4.3. PRINCIPAIS TIPOS DE NANOMEDICAMENTOS POLIMÉRICOS ............... 17
4.3.1. CONJUGADOS POLÍMERO-FÁRMACO ........................................................... 17
4.3.2. MICELAS POLIMÉRICAS ................................................................................... 18
4.3.3. LIPOSSOMAS ....................................................................................................... 20
4.3.4. NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS BIODEGRADÁVEIS ............................ 21
4.4. PRINCIPAIS APLICAÇÕES DE NANOMEDICAMENTOS POLIMÉRICOS .. 22
4.4.1. DIAGNÓSTICO POR IMAGEM .......................................................................... 22
4.4.2. TERAPIA E DIAGNÓSTICO (TERANÓSTICOS) .............................................. 22
4.4.3. TERAPIAS CONTRA O CÂNCER ...................................................................... 23
4.5. O CÂNCER E A NANOMEDICINA .................................................................... 23
4.5.1. O EFEITO EPR ...................................................................................................... 24
4.6. MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS .... 26
4.6.1. EVAPORAÇÃO DO SOLVENTE ........................................................................ 26
4.6.2. SALTING OUT ...................................................................................................... 27
4.6.3. DIÁLISE ................................................................................................................. 27
4.6.4. NANOPRECIPITAÇÃO ........................................................................................ 28
4.7. ASPECTOS FÍSICO-QUÍMICOS RELACIONADOS AO PROCESSO DE
NANOPRECIPITAÇÃO ........................................................................................ 29
7
4.7.1. O EFEITO MARANGONI ..................................................................................... 29
4.7.2. EFEITO OUZO ...................................................................................................... 29
5. METODOLOGIA ................................................................................................... 32
5.1. MATERAIS UTILIZADOS ................................................................................... 32
5.2. PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS ....................................................... 32
5.3. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS ............................................. 33
6. RESULTADOS E DISCUSSÕES .......................................................................... 35
6.1 INFLUÊNCIA DA RAZÃO SOLVENTE:ÁGUA ................................................ 37
6.2. INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE POLÍMERO .................................... 40
6.3. INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA ................................................................... 43
6.4. INFLUÊNCIA DA FORÇA IÔNICA .................................................................... 45
6.5. INFLUÊNCIA DAS PROPRIEDADES DO POLÍMERO .................................... 46
6.6. INFLUÊNCIA DO SOLVENTE ORGÂNICO ...................................................... 47
6.7. INFLUÊNCIA DA MISTURA DE SOLVENTES ................................................ 52
7. CONCLUSÕES ...................................................................................................... 53
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. .................................................................. 54
8
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura química dos polímeros biodegradáveis utilizados nas investigações
PLGA (A), PCL (B) e PBS/PBDL (C). ......................................................................... 16
Figura 2 Representação esquemática de um conjugado polímero-fármaco (A) e a
estrutura molecular do agente quimioterápico doxorubicina (DOX) conjugado ao
polímero N-(2-hidroxipropil) metacrilamida (PHPMA) através de uma ligação
hidrazona (ligante) (R1R2C=NNH2) sensível ao pH (B). ............................................. 18
Figura 3. Representação esquemática de uma micela polimérica de PMPC40-b-
PDPA70 sensível ao pH carregada com fármaco hidrofóbico (A) e representação da
estrutura molecular do copolímero em bloco PMPC40-b-PDPA70 (B). .................... 19
Figura 4. Representação esquemática de um lipossoma carregado com fármaco
hidrofílico (A) e estrutura molecular de uma variante do fosfolipídio fosfatidilcolina
enfatizando a sua cabeça hidrofílica (B)......................................................................... 20
Figura 5. Representação esquemática de uma nanoesfera (A) e de uma nanocápsula (B).
A direita está representada a estrutura molecular do poli (ácido lático-co-ácido
glicólico) – PLGA (C), um dos polímeros mais utilizados na preparação de PNPs. ..... 21
Figura 6. Representação esquemática do acúmulo de nanopartículas em regiões de
tumor sólido devido ao efeito EPR. ................................................................................ 25
Figura 7. Diagrama ternário de fases que representa esquematicamente a formação de
nanopartículas a partir do método de nanoprecipitação ................................................. 31
Figura 8. Funções de correlação temporal (A), respectivas distribuições de RH (B) e
aparência visual das PNPs de PLGA01 produzidas a partir de diferentes solventes
orgânicos: DMF (●), acetona (○) e THF (■) (C). A concentração polimérica total e a
razão solvente:água foram mantidas constantes (1,4 mg.mL-1 e 0,4 respectivamente).. 35
9
Figura 9 . Imagens de TEM para nanopartículas de PLGA01 produzidas a partir de
DMF (A), acetona (B) e THF (C). Dado de SAXS e ajuste correspondente (linha sólida)
para PNPs de PLGA01 produzidas a partir de DMF (D). .............................................. 37
Figura 10. Influência da razão solvente:água nas características estruturais das
nanopartículas de PLGA01 preparadas por nanoprecipitação: dimensão RH (A), índice
de polidispersão (B) e potencial-ζ (C). A concentração polimérica foi mantida constante
(1,4 mg.mL-1). ................................................................................................................. 38
Figura 11. Influência da concentração de polímero nas características estruturais das
nanopartículas de PLGA01 preparadas por nanoprecipitação: raio hidrodinâmico (A),
índice de polidispersão (B) e potencial-ζ (C). A razão acetona:água foi mantida
constante igual a 0,4. ...................................................................................................... 40
Figura 12. Influência da temperatura nas características estruturais das nanopartículas
de PLGA01 preparadas por nanoprecipitação: raio hidrodinâmico (A), índice de
polidispersão (B) e potencial-ζ (C). A concentração polimérica e a razão acetona:água
foram mantidas constantes em 1,4 mg.mL-1 e 0,4 respectivamente. .............................. 43
Figura 13. Influência da força iônica no Antisolvente nas características estruturais das
nanopartículas de PLGA01 preparadas por nanoprecipitação: raio hidrodinâmico (A),
índice de polidispersão (B) e potencial-ζ (C). A concentração polimérica e a razão
acetona:água foram mantidas em 1,4 mg.mL-1e 0,4 respectivamente. ........................... 45
Figura 14. Influência do parâmetro de interação do solvente orgânico-água (χsolvente-
água) no tamanho, índice de polidispersão e potencial-ζ das nanopartículas de PLGA01
preparadas por nanoprecipitação.. .................................................................................. 50
Figura 15. RH das nanopartículas poliméricas de PLGA01 preparadas por
nanoprecipitação em função de φTHF em misturas DMF:THF (A) e misturas
acetona:THF (B). RH das nanopartículas poliméricas de PBS:PBDL preparadas por
nanoprecipitação em função do φTHF em misturas de acetona:THF (C). ........................ 52
10
ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1. Características dos polímeros biodegradáveis utilizados e propriedades físico-
químicas das PNPs produzidas por nanoprecipitação. ................................................... 46
Tabela 2. Propriedades Físico-químicas dos solventes e polímeros utilizados nos
protocolos de nanoprecipitação. ..................................................................................... 48
Tabela 3. Tamanho (RH), índice de polidispersão e potencial-zeta (ζ) de uma variedade
de nanopartículas poliméricas preparadas por nanoprecipitação a partir de diferentes
solventes orgânicos. ........................................................................................................ 51
11
ÍNDICE DE ABREVIATURAS DLS espalhamento de luz dinâmico
EPR enhanced permeability and retention effect
PNPs nanopartículas poliméricas
PBS:PBDL polibutileno succinato-co-butileno dilinoleato
PCL policaprolactona
PEG polietilenoglicol
PLA poliácido láctico
SAXS espalhamento de raios-X a baixos ângulos
12
1. RESUMO
A aplicação de nanopartículas poliméricas na área biomédica tem avançado em
ritmo acelerado. Dentre os diversos polímeros e copolímero aprovados pelas agências
reguladoras para a preparação de nanopartículas poliméricas visando aplicações
biomédicas, o PLGA - poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) - vem sendo um dos mais
utilizados por exibir excelente biocompatibilidades e tempo de biodegradação
adequado. Particularmente no campo da nanomedicina, a habilidade de se controlar a
dimensão de nanopartículas é essencial. Muitas vezes estas estruturas precisam
atravessar barreiras biológicas distintas para se acumularem em locais de difícil acesso
tal como o interior de sítios tumorais. A capacidade das Nanopartículas Poliméricas
(PNPs) de se acumularem em sítios tumorais está essencialmente vinculada ao efeito
EPR (do inglês Enhanced Permeability and Retention). O efeito EPR é dependente de
uma série de fatores que estão relacionados essencialmente com as características do
sítio tumoral. Geralmente nanopartículas com dimensões inferior a RH 100 nm são
preferencialmente acumuladas em sítios tumorais, após a administração intravenosas.
Por outro lado, estas estruturas também precisam ser suficientemente grandes (2RH > 10
nm) para que não sejam excretadas rapidamente através da filtração renal. Levando-se
em conta as considerações mencionadas acima, o objetivo do presente trabalho foi
investigar em detalhes a influência de parâmetros físico-químicos e a sua relação com o
tamanho final de PNPs produzidas por nanoprecipitação. Demonstrou-se que
nanopartículas biodegradáveis de PLGA livres de surfactante e com dimensão variável
entre RH 28 nm e RH 130 nm podem ser produzidas com sucesso utilizando-se o
processo de nanoprecipitação. A dimensão de PNPs de PLGA poder ser controlada
através do ajuste da concentração polimérica, da escolha do solvente orgânico e pelo
ajuste da temperatura e da força iônica da fase aquosa. Os dados experimentais
adquiridos também mostraram que a interação polímero-solvente não tem relevância
substancial na dimensão final dos coloides poliméricos produzidos. Foi também
evidenciado que o tamanho hidrodinâmico de PNPs pode ser precisamente e
linearmente ajustado utilizando-se misturas de solventes orgânicos. Desta fora, sugere-
se que PNPs podem ser produzidas com tamanho sob demanda, podendo ser utilizadas
em uma variada gama de aplicações terapêuticas que tem sua eficácia essencialmente
dependente do tamanho.
13
2. INTRODUÇÃO
No século 21, a nanotecnologia tem se mostrado como uma das áreas mais
promissoras no que se refere a avanços tecnológicos e científicos, uma vez que trabalha
com matérias em escala nanométrica (10-9 m) o que significa um trilhão de vezes menor
que o metro. 1,2A nanotecnologia tem sido amplamente explorada pela indústria de
materiais que tem desenvolvido desde artigos esportivos, automotivos, cosméticos e de
vestuário.3,4 O aumento da aplicação de nanomateriais na medicina tem tomado forma
com o empenho de diversos grupos de pesquisa tanto da indústria como no meio
acadêmico em aplicar a nanotecnologia com fins médicos,5 seja para diagnóstico por
imagem, vacinas ou liberação controlada de fármacos.6
A aplicação de nanotecnologia no campo da medicina quer seja para fins de
diagnóstico ou para fins terapêuticos, deu origem a nanomedicina. A característica mais
marcante da nanomedicina é a possibilidade de se desenvolver nanomateriais com
estruturas em dimensões similares a estruturas biológicas como DNA, vírus, proteínas e
bactérias. Sendo assim, tais nanomateriais podem apresentar um maior tempo de meia
vida plasmática (t1/2) e assim, serem empregados no tratamento, diagnóstico e prevenção
das mais variadas doenças.7 Por se mostrar uma área tão promissora, a nanomedicina
tem se destacado como um dos ramos científicos interdisciplinares por exigir daqueles
que se envolvem na pesquisa, conhecimentos das mais diversas áreas tais como:
bioquímica, físico-química, biologia molecular e celular, farmacodinâmica e
farmacocinética. A nanomedicina engloba biosensores, biomarcadores,
nanomedicamentos com função terapêutica, agentes diagnósticos, por imagem, e
teranósticos. Teranósticos são nanomateriais funcionalizados com propriedades tanto de
diagnóstico bem como propriedades terapêuticas em um único complexo.8 A aplicação
da nanomedicina no combate ao câncer tem sido o foco das pesquisas tanto da academia
quanto da indústria farmacêutica, principalmente pelas possibilidades que surgiram após
a descoberta do efeito de aumento da permeabilidade e retenção (do inglês Enhanced
Permeability and Retention Effect - EPR) por Hiroshi Maeda e col.9
14
3. OBJETIVOS
Os principais objetivos do presente trabalho estão elencados abaixo:
• Avaliar a as condições experimentais para a preparação de sistemas
nanoestruturados complexos produzidos a partir de uma série de polímeros e
copolímeros biocompatíveis, e com potencial aplicação na liberação controlada de
agentes antitumorais através do mecanismo de EPR.
• Encontrar as condições adequadas de nanoprecipitação para a fabricação de
nanopartículas com dimensões inferiores a 200 nm (2RH < 200 nm) para diversos
sistemas investigados;
• Investigar as variáveis físico-químicas concentração, força iônica, razão
solvente:antisolvente, mistura de diferentes solventes orgânicos e temperatura, bem
como a sua influência no tamanho final das nanopartículas poliméricas produzidas.
15
4. REVISÃO DA LITERATURA
4.1. POLÍMEROS BIODEGRADÁVEIS
Polímeros são materiais sólidos com alto peso molecular. Um polímero é composto
por diversas unidades de repetição chamadas de meros unidas por ligações covalentes.
As características dos diferentes polímeros estão relacionadas com a quantidade de
meros e com as características físico-químicas destes materiais. Materiais poliméricos
podem ser não degradáveis, parcialmente degradáveis ou completamente degradáveis.
Polímeros completamente degradáveis são vantajosos e desejáveis por serem
provenientes de fontes renováveis, por serem facilmente degradados no meio ambiente
ou nos organismos vivos através de processos enzimáticos.10
Materiais poliméricos apresentam a vantagem de serem facilmente manipulados
para atender a necessidades de formas e tamanhos, apresentam boa estabilidade térmica,
baixa toxicidade, compatibilidade e biodegradabilidade. Além disso, os métodos de
obtenção destes polímeros podem ser de fácil a média complexidade. Por isso, estes
materiais podem ser aplicados aos mais diversos fins, sobretudo na encapsulação, em
sistemas de distribuição e liberação de drogas.11,12
Existe atualmente um grande número de polímeros e copolímeros disponíveis para a
preparação de nanopartículas. Os mais utilizados para a entrega de drogas são os da
família dos poliésteres biodegradáveis incluindo a policaprolactona (PCL), poli ácido
lático (PLA), polibutileno sucinato-co-butileno dilinoleato (PBS:PBDL),13,14 e o poli
(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA).15,16,17,18 O PLGA exibe excelente
biocompatibilidade19 e biodegradação adequada em condições fisiológicas.20 Sendo
assim, nanopartículas poliméricas de PLGA tem sido largamente utilizadas para
encapsular drogas e em estudos de entrega de drogas,16,21 embora demostrem em
determinadas situações uma baixa eficiência de encapsulação e elevada liberação inicial
da droga (efeito Burst).22,23,24
As estruturas químicas dos principais polímeros biodegradáveis listados acima
estão mostradas na Figura 1.
16
A)
B)
C)
Figura 1. Estrutura química dos polímeros biodegradáveis utilizados nas investigações
PLGA (A), PCL (B) e PBS:PBDL (C).
Nanopartículas formadas a partir destes polímeros além de serem biodegradáveis e
biocompatíveis apresentam a vantagem de poderem ser sintetizadas com tamanho
abaixo de RH 100 nm. Vários são os fatores que tornam as nanopartículas poliméricas
com pequenas dimensões vantajosas para a aplicação biológica, dentre os quais estão: o
aumento da absorção intracelular, eficácia no encapsulamento de fármacos, perfil de
liberação adequado, biodistribuição ajustável e elevada eficácia terapêutica.25 Estes
polímeros podem ainda ter sua característica hidrofílica aumentada através da
conjugação com o poli(etilenoglicol) - PEG ou da conjugação com outros polímeros
hidrofílicos, reduzindo assim a adsorção superficial e a captação pelo sistema reticulo
endotelial (RES).26,27,28
17
4.2. NANOPARTICULAS POLIMÉRICAS
As nanopartículas poliméricas podem acomodar no seu interior um enorme número
de diferentes componentes ativos tais como fármacos, agentes de contraste, proteínas e
ácidos nucleicos, podendo assim ser utilizadas em uma enorme gama de aplicações
biomédicas. Particularmente, nanopartículas poliméricas tem recebido substancial
atenção devido a sua versatilidade e devido ao fato de suas estruturas poderem ser
modificadas no intuito de encapsular e liberar agentes terapêuticos ou de contraste de
maneira controlada nos sítios de ação desejados, bem como para responder a estímulos
externos ou fisiológicos específicos.29,30
Existem atualmente diferentes tipos de nanopartículas poliméricas. Pesquisas
interdisciplinares na interface da ciência de polímeros, medicina, biologia celular e
ciência farmacêutica acontecem já há certo tempo no intuito de se produzir
nanocarreadores ou agentes de contraste poliméricos. Nesta classe estão incluídos
conjugados do tipo polímero-fármaco, micelas de copolímeros em bloco, lipossomas e
nanopartículas biodegradáveis nas quais agentes ativos são quimicamente conjugados
ou fisicamente incorporados. Na próxima seção serão descritos sucintamente os
principais tipos de nanopartículas polímeros com potencial aplicação no campo da
nanomedicina.
4.3. PRINCIPAIS TIPOS DE NANOMEDICAMENTOS POLIMÉRICOS
4.3.1. CONJUGADOS POLÍMERO-FÁRMACO
Conjugados polímero-fármaco são nanomedicamentos constituídos de uma cadeia
polimérica de tamanho adequado, geralmente hidrossolúvel, na qual agentes
terapêuticos são quimicamente conjugados através da utilização de um ligante
peptídico, proteico ou de outra natureza orgânica conforme representado
esquematicamente na Figura 2. Esta estratégia mostrou melhorar a especificidade
celular de fármacos de baixa massa molecular. O principal desafio científico-
tecnológico para a otimização da eficácia terapêutica de conjugados polímero-fármaco
está em se encontrar ligantes estáveis durante a circulação sistêmica e que sejam ao
18
mesmo tempo capazes de liberar o agente terapêutico a uma velocidade otimizada no
local específico de ação, por exemplo, um sítio tumoral.7
Figura 2. Representação esquemática de um conjugado polímero-fármaco (A) e a
estrutura molecular do agente quimioterápico doxorubicina (DOX) conjugado ao
polímero N-(2-hidroxipropil) metacrilamida (PHPMA) através de uma ligação
hidrazona (ligante) (R1R2C=NNH2) sensível ao pH (B).31,32
A Figura 2 mostra a representação esquemática do conjugado polímero-fármaco
poli (hidroxipropilmetacrilamida)-doxorubicina (PHPMA-DOX). A conjugação neste
caso é realizada utilizando-se um ligante sensível ao pH (grupo hidrazona). Este tipo de
nanomedicamento melhora a eficácia terapêutica do agente antitumoral doxorubicina
quando comparada a eficácia do agente quimioterápico administrado na sua forma
livre.31
4.3.2. MICELAS POLIMÉRICAS
Micelas poliméricas são geralmente produzidas em solução aquosa pela auto-
organização espontânea de copolímeros em bloco anfifílicos. Os copolímeros em bloco
anfifílicos são polímeros formados por uma sequência de monômeros de caráter
hidrofóbicos ligados covalentemente a uma sequência de monômeros de caráter
hidrofílico. Em contato com o ambiente aquoso, a fração hidrofóbica forma o núcleo
micelar estabilizado pela fração hidrofílica. Geralmente, estas estruturas possuem
A
B
19
formato esférico e estrutura do tipo núcleo-coroa. O tamanho médio de micelas
poliméricas varia na maioria dos casos entre 10-100 nm. Desta maneira, fármacos
lipofílicos podem ser solubilizados no interior do núcleo micelar aumentando
significativamente a sua concentração no ambiente aquoso.
Além da eficiência de encapsulação, a liberação controlada e/ou especifica de
um fármaco de natureza hidrofóbica pode ser modulada quando utilizados polímeros
sensíveis a variações de PH. O fato de nosso organismo possuir ambientes com
diferentes valores de pH torna o desenvolvimento de nanopartículas para liberação
controlada de agentes terapêuticos sensíveis a mudanças de pH um campo de estudos
bastante importante. A Figura 3 representa esquematicamente a formação de uma
micela polimérica a partir do copolímero em bloco poli [2-(metacriloiloxi)
etilfosforilcolina]40-b-poli [2-(diisopropilamino)-etil metacrilato]70 ou PMPC40-b-
PDPA70. Em contato com a água, o PDPA (fração hidrofóbica) se agrega formando o
núcleo micelar enquanto que os blocos hidrofílicos de PMPC estabilizam a
nanopartículas. O núcleo micelar de PDPA pode desta maneira acomodar fármacos
hidrofóbicos que podem ser liberados em sítios específicos de ação.
Figura 3. Representação esquemática de uma micela polimérica de PMPC40-b-
PDPA70 sensível ao pH carregada com fármaco hidrofóbico (A) e representação da
estrutura molecular do copolímero em bloco PMPC40-b-PDPA70 (B).
A B
20
No exemplo acima, o núcleo de PDPA responde ao pH devido à presença do grupo
amina terciário, sendo promissor para a fabricação de nanocarreadores poliméricos
sensíveis ao pH.33
4.3.3. LIPOSSOMAS
Lipossomas são nanoestruturas vesiculares auto-organizadas a partir de
fosfolipídios anfifílicos (Figura 4).
Figura 4. Representação esquemática de um lipossoma carregado com fármaco
hidrofílico (A) e estrutura molecular de uma variante do fosfolipídio fosfatidilcolina
enfatizando a sua cabeça hidrofílica (B).
O resultado desta auto-organização são estruturas que apresentam um
compartimento interno hidrofílico e, portanto, estas nanoestruturas são apropriadas para
o carregamento e a liberação controlada de fármacos hidrossolúveis tais como proteínas
terapêuticas e DNA. Agentes hidrofóbicos e pouco solúveis em água podem, entretanto,
serem aprisionados na região hidrofóbica da membrana lipídica. Contudo, a capacidade
de carga é bastante limitada e conduz geralmente a formação de estruturas instáveis.
Dentre todos os tipos de nanomedicamentos a base de matéria mole investigados até o
momento, lipossomas têm se demostrado os de maior sucesso clínico com várias
formulações aprovadas pelo FDA (Food and Drug Administration) para o tratamento de
A B
21
câncer. O FDA é o órgão governamental dos Estados Unidos responsável pelo controle
dos medicamentos. Lipossomas cobertos com o polímero polietilenglicol (PEG) tem um
maior tempo de meia vida plasmática in vivo, e assim podem ser acumuladas em
tumores sólidos devido ao efeito EPR. Um exemplo de sucesso de carregador
lipossômico é o Doxil® (Doxorubicina encapsulada em lipossomas recobertos por
polietilenglicol com diâmetro em torno de 150 nm).34 Esta formulação aumenta de 25%
para 46% o nível de resposta quando comparado com o tratamento quimioterápico
convencional (a combinação de adriamicina, bleomicina e vincristina). Lipossomas
também estão sendo investigados como carregadores de agentes de contraste.
Entretanto, os testes clínicos até o momento são escassos.
4.3.4. NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS BIODEGRADÁVEIS
As nanopartículas poliméricas biodegradáveis são estruturas nanométricas
preparadas a partir de materiais poliméricos de fácil decomposição em meio fisiológico.
Assim como no caso de micelas poliméricas, no caso de nanopartículas poliméricas
biodegradáveis, fármacos hidrofóbicos são aprisionados em nanopartículas.
Dependendo do método de preparação escolhido e da aplicação desejada é possível
obter-se nanocápsulas ou nanoesferas.35 Nanocápsulas são sistemas vesiculares em que
o fármaco está confinado a uma cavidade geralmente oleosa rodeada por uma parede
polimérica, enquanto nanoesferas são sistemas matriciais nos quais o fármaco é
fisicamente e uniformemente disperso conforme esquematicamente representado na
Figura 5.
Figura 5. Representação esquemática de uma nanoesfera (A) e de uma nanocápsula (B).
A direita está representada a estrutura molecular do poli (ácido lático-co-ácido
glicólico) - PLGA (C), um dos polímeros mais utilizados na preparação de PNPs.
A B
C
22
Nos últimos anos, nanopartículas poliméricas biodegradáveis têm atraído atenção
considerável como dispositivos de entrega de agentes ativos, principalmente no
direcionamento de fármacos anticarcinogênicos.
4.4. PRINCIPAIS APLICAÇÕES DE NANOMEDICAMENTOS
POLIMÉRICOS
4.4.1. DIAGNÓSTICO POR IMAGEM
Polímeros com marcação radioativa desenvolvidos para facilitar o diagnóstico por
imagem são investigados desde os anos 90. Os primeiros sistemas fabricados foram os
baseados no polímero hidrossolúvel PHPMA (veja Figura 2) marcados com sondas do
tipo 123I, 125I e 131I. Estes sistemas foram utilizados no diagnóstico por imagem de
pacientes com câncer utilizando-se a técnica de tomografia computadorizada por
emissão de fóton único (SPECT).36 Entretanto, até o momento, são poucos os sistemas
que progrediram para utilização clínica. Dendrímeros (polímeros ramificados) também
têm sido investigados como agentes para imagem através de ressonância magnética
(MRI) uma vez que este tipo de material tem a capacidade de carregar quantidades
consideráveis de sondas.
A utilização de sondas poliméricas para tomografia por emissão de positrons
(PET) representa atualmente um novo conjunto de ferramentas analíticas e de
diagnóstico por imagem. Por exemplo, foram produzidos copolímeros de PHPMA
contendo sondas do tipo 18F (t1/2 ~ 1.8 h)37 ou sondas com tempo de meia-vida
substancialmente maiores tais como 72As (t1/2 ~ 26 h) e 74As (t1/2 ~ 17.8 dias).38
4.4.2. TERAPIA E DIAGNÓSTICO (TERANÓSTICOS)
O conjugado polímero-fármaco PHPMA-DOX contendo pequenas quantidades de
co-monômero para possibilitar a marcação radioativa foi o primeiro sistema polimérico
desenvolvido para imagem através de tomografia computadorizada por emissão de fóton
único (SPECT) nas terapias de combate ao câncer.39 Ferramentas como esta são de
importância ímpar para se investigar a relação farmacocinética-farmacodinâmica de
nanomedicamentos. Atualmente, um número grande de sistemas multifuncionais
23
baseados em matéria mole está sendo desenvolvido para o carreamento de fármacos e
mapeamento por imagem simultâneo, incluindo polímeros do tipo PGA40 e PHPMA41
conjugados com doxorubicina e gemcitabina, também com capacidade de mapeamento
de células tumorais por SPECT.
4.4.3. TERAPIAS CONTRA O CÂNCER
Recentemente se mostrou que o emergente campo da nanomedicina apresenta
potencial, e novas estratégias para o tratamento de sítios tumorais, sendo uma das áreas
de grande interesse atual. É de conhecimento geral que os tratamentos tradicionais são
limitados pelo curto tempo de circulação na corrente sanguínea dos agentes antitumorais
e a baixa especificidade de sua ação. Tecidos normais também são expostos aos
quimioterápicos fatalmente danificando células saudáveis. Por outro lado, o
carreamento de agentes quimioterápicos no interior de nanopartículas possibilita que
estes agentes sejam de forma mais seletiva conduzidos para os sítios tumorais,
aumentando assim a eficácia terapêutica e limitando a exposição dos tecidos saudáveis.
A partir desta seção, será dada ênfase à utilização de nanomedicamentos com potencial
aplicação no tratamento do câncer. Uma abordagem simples das características dos
tumores de origem sólida, os possíveis alvos terapêuticos no tratamento e os desafios a
serem superados serão enfatizados.
4.5. O CÂNCER E A NANOMEDICINA
O câncer é uma das principais causas de mortes no mundo. A Organização Mundial
de Saúde (OMS) estima que a doença será a causa de morte de 84 milhões de indivíduos
entre 2005 e 2015. O câncer não é uma doença única, mas um conjunto de mais de 200
patologias, caracterizado pelo crescimento descontrolado de células anormais e como
consequência ocorre a invasão de órgãos e tecidos adjacentes envolvidos, podendo se
disseminar para outras regiões do corpo, dando origem à tumores em outros locais. Os
tumores são classificados em sólidos (linfomas, carcinomas e sarcomas) ou neoplasias
hematológicas (leucemias). Para uma terapia efetiva, é necessário melhorar o nosso
conhecimento em relação à fisiopatologia do câncer, descobrir novos compostos
anticarcinogênicos e desenvolver novas tecnologias biomédicas. Atualmente, o
24
desenvolvimento de terapias contra o câncer tem se tornado um desafio multidisciplinar,
necessitando da colaboração da área clínica com as áreas de ciências biológicas,
ciências dos materiais e engenharia biomédica.
O principal objetivo das terapias contra o câncer é aumentar a sobrevida e a
qualidade de vida dos pacientes.42 Atualmente, o método mais utilizado para
tratamentos de câncer é a quimioterapia. Devida à eficácia dos compostos
farmacológicos atuais, a seletividade aos tecidos é uma questão de extrema importância.
Na maioria dos tratamentos empregados atualmente, a dose que alcança o interior de
tumores sólidos é limitada, resultando em uma resposta muitas vezes ineficaz.
As novas estratégias em investigação atualmente focam no aumento da eficácia
de tratamentos quimioterápicos e estão geralmente baseadas nas particularidades dos
sítios tumorais, os quais apresentam características diferentes dos tecidos normais.
Neste contexto, o conhecimento fisiopatológico dos tecidos tumorais e suas diferenças
quando comparados a tecidos normais emerge como uma alternativa para tentar
contornar a falta de especificidade dos tratamentos quimioterápicos convencionais.43,44
4.5.1. O EFEITO EPR
Inicialmente descoberto por Matsumura e Maeda, o efeito do aumento da
permeabilidade e retenção (efeito EPR) tem sido a descoberta norteadora de muitos
estudos na busca de tratamentos efetivos de combate ao câncer.45 Diversos estudos
relacionados à entrega de drogas têm sido publicados, representando potencial avanço
no combate ao câncer. O Efeito EPR tem por base as alterações fisico-químicas que
ocorrem nas regiões tumorais, sobretudo de tumores sólidos, que acabam por diferenciar
as células tumorais das celulas saudáveis. Neste caso, o transporte de macromoléculas
maiores de 40 kDa para o interior de sítios tumorais é facilitada.46,47
Dentre estas alterações, destacam-se a vasculatura anormal, oxigenação deficiente e
acidez do microambiente, além de pressão variável. A vasculatura tumoral apresenta
fenestrações (poros) decorrentes do crescimento desordenado, irregular e rápido de
tecidos provocado pela necessidade de se suprir as demandas de oxigênio das células
tumorais. Os altos níveis de proliferação celular (angiogeneses) conduzem a um
aumento na permeabilidade vascular. Mudanças estruturais na patofisiologia vascular
devidas a angiogênese representam grandes oportunidades para o uso de sistemas
25
nanoparticulados de longa-circulação para fármacos que se acumulam devido ao efeito
EPR48
Macromoléculas e nanocarreadores (com dimensões entre RH 20 – RH 100 nm) são
geralmente muito grandes para extravasarem e se acumularem em tecidos saudáveis.
Entretanto, possuem dimensões adequadas para atravessarem a vasculatura
desorganizada e porosa das regiões tumorais, sendo acumulados no interior de seus
interstícios. Contudo, tais estruturas também precisam apresentar caracteristicas de
biocompatibilidade para permanecer maior tempo na circulação sanguinea sem serem
eleminados antes de o acúmulo promovido pelo efeito EPR. A dimensão dos poros
endoteliais em sítios tumorais varia de 10 nm a 2 µm.49 Além disso, os vasos linfáticos
possibilitando um maior tempo de meia vida t1/2 estão ausentes ou não-funcionais nestes
locais, contribuindo para uma ineficiente drenagem. Nanocarreadores que alcançam o
interstício tumoral não são removidos de forma eficaz e são desta maneira, retidos no
tumor., Este fenômeno é descrito pelo “R” do efeito EPR o qual está esquematizado na
Figura 6.
Figura 6. Representação esquemática do acúmulo de nanopartículas em regiões de
tumor sólido devido ao efeito EPR.49
Visto que estas peculiaridades não são encontradas em tecidos normais, o
conhecimento do efeito EPR está se tornando um paradigma promissor no
desenvolvimento de terapias contra o câncer. Como resultado destas características
26
anatômicas e patofisiológicas únicas dos tecidos tumorais em comparação com tecidos
normais, a concentração de macromoléculas e nanopartículas poliméricas encontradas
nestes tecidos chegam a ser 100 vezes maior do que a encontrada em tecidos
normais.45,46,47,48,49
4.6. MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS
POLIMÉRICAS
A produção de nanopartículas poliméricas pode partir tanto da polimerização de
monômeros quanto de polímeros pré-formados. Dentre as estratégias para produção de
PNPs a partir de polímeros pré-formados, destacam-se as técnicas de evaporação do
solvente, salting-out, diálise e nanoprecipitação.
4.6.1. EVAPORAÇÃO DO SOLVENTE
No método da evaporação do solvente, os dois processos mais comuns são o
preparo de emulsão simples óleo em água (O/A) onde a fase oleosa é composta de um
polímero dissolvido em solvente orgânico e a fase aquosa é composta por um agente
estabilizador, e o preparo de emulsões duplas que consistem e uma fase água em óleo
(A/O) e uma segunda fase água-óleo-água (A/O)/A.50 Nesse método são utilizadas
técnicas de homogeneização e ultrassom seguidas da evaporação do solvente que se dá
por agitação a temperatura ambiente sob pressão reduzida. As nanopartículas são
obtidas após centrifugação e lavagem com água destilada para remoção de tensoativos.
Nesse método são relevantes para a síntese dos nanopartículas poliméricas os seguintes
parâmetros: temperatura de preparação, método de evaporação do solvente, volume da
fase aquosa interna, concentração de surfactante e massa molecular do polímero. No
método de evaporação do solvente, a quantidade de agente estabilizador pode
influênciar no tamanho da partícula, onde geralmente quanto maior a quantidade de
agente estabilizador menor o tamanho obtido. Nas emulsões duplas esse efeito parece
ser irrelevante. O método de evaporação do solvente apresenta a vantagem de ser
simples e prático. Por outro lado, apresenta como pontos negativos o fato de ser
demorado e a possível coalescência das nano gotas durante o processo de
evaporação.52,51
27
4.6.2. SALTING OUT
O salting out é um método de emulsificação diferente do método de evaporação de
solvente, onde não se utiliza solventes orgânicos. O método baseia-se na separação de
um solvente miscível em água a partir da solução aquosa por meio de um efeito de
salting out. O processo salting out pode ser considerado como uma alteração do
processo de emulsificação. Polímero e droga são inicialmente dissolvidos em um
solvente tal como a acetona, a qual é subsequentemente emulsionada em um gel aquoso
contendo o agente de salting out (eletrólitos, tais como cloreto de magnésio, cloreto de
cálcio, acetato de magnésio, ou não eletrólitos tais como a sacarose) e um estabilizador
coloidal, tais como polivinilpirrolidona ou hidroxietilcelulose. Esta emulsão de
óleo/água é diluída com um volume suficiente de água ou solução aquosa para melhorar
a difusão da acetona na fase aquosa, induzindo, assim a formação de nanoesferas. O
efeito reverso salting out é obtido pela diluição da emulsão com adição de excesso de
água provocando a precipitação de polímeros dissolvidos em gotículas de emulsão. Esse
método apresenta a vantagem de não utilizar solventes orgânicos nem tensoativos nos
processos de síntese de nanopartículas poliméricas. Em contra partida, pesa contra este
método o fato de se produzir nanopartículas com tamanho elevado (2RH > 250 nm) e a
impossibilidade de se controlar as interações poliméricas o que fatalmente afeta a
morfologia das PNPs produzidas.50,51,52
4.6.3. DIÁLISE
Nesse método, polímeros são dissolvidos em solventes orgânicos e colocados em
tubos de diálise com corte de peso molecular apropriado. A diálise é realizada contra
um não-solvente miscível no solvente orgânico. O deslocamento do solvente para o
interior da membrana é seguido pela agregação progressiva de polímeros decorrentes da
perda de solubilidade com a formação de uma solução homogênea de nanopartículas.
Dentre os parâmetros que afetam este método estão o tipo de solvente empregado, tipo
de não-solvente e concentração de polímero na fase orgânica. O fato de existir uma
membrana no sistema de diálise é muito vantajoso pois permite a troca completa do
solvente do polímero contra o não-solvente. Por outro lado, são fatores limitantes para o
28
emprego deste método a obtenção de nanopartículas de tamanho elevado, além do
processo ser demorado quando se visa o aumento de escala de produção.50,52
4.6.4. NANOPRECIPITAÇÃO
O método de nanoprecipitação é o mais atrativo do ponto de vista comercial haja
vista sua simplicidade e baixo custo energético. A técnica de nanoprecipitação foi
proposta por Fessi e col.52,53 Neste procedimento, os polímeros pré-formados são
inicialmente dissolvidos em um bom solvente completamente miscível em água
(acetona, THF, DMF, acetato de etila, etanol). Em seguida, a fase orgânica contendo o
polímero que vai formar as NPs é vertida sobre uma fase aquosa sob agitação
magnética. Quando a fase orgânica e a fase aquosa estão em contato, ocorre a rápida
difusão da fase orgânica para a fase aquosa transportando consigo um determinado
número de cadeias poliméricas dissolvidas. Com a adição progressiva de solvente
orgânico para a solução aquosa, a qualidade do solvente é progressivamente reduzida e
as cadeias dos polímeros entram numa condição de supersaturação, se agregando e
formando nanopartículas. Tais PNPs tendem a ter forma esférica desde que ocorra uma
distribuição homogênea da quantidade total de polímero em solução durante a
nanoprecipitação. Os parâmetros que influênciam na formação das nanopartículas estão
relacionados às propriedades físico-químicas associados com a adição da fase orgânica
na fase aquosa tais como tempo de difusão, método de adição e a razão entre estas fases.
O método de nanoprecipitação tem a seu favor o fato de ser rápido, fácil e reprodutível.
Este método favorece a obtenção de nanopartículas esféricas de distribuição estreita e
não necessita de fontes de energia externa. Dentre as desvantagens estão a
heterogeneidade das PNPs formadas que acaba por limitar o encapsulamento de drogas
em certas condições. 54
Levando- se em conta que todos os métodos apresentam vantagens e também
possuem suas limitações, a escolha de um método específico é geralmente determinada
pelas características físico-químicas do fármaco utilizado. Outros aspectos como a
estabilidade da substância ativa sob as condições operacionais tais como agitação, os
volumes necessários, o tempo consumido, a viabilidade de aumento na escala e os
custos envolvidos devem ser considerados.17,50
29
4.7. ASPECTOS FÍSICO-QUÍMICOS RELACIONADOS AO PROCESSO
DE NANOPRECIPITAÇÃO
O mecanismo de formação instantânea de PNPs poliméricas via nanoprecipitação
ainda é motivo de controvérsias. Alguns grupos de pesquisa sugerem que a formação
ocorre devido à turbulência interfacial entre as duas fases líquidas (orgânica e aquosa)
que são governadas pelo efeito Marangoni. Entretanto, publicações recentes mostraram
que o efeito Ouzo parece ser mais satisfatório para explicar o mecanismo de formação.55
4.7.1. O EFEITO MARANGONI
O Efeito Marangoni é também conhecido como efeito Gibbs-Marangoni e sugere
que as propriedades físico-químicas do solvente orgânico e sua interação com o meio
aquoso são fatores fundamentais no processo de formação das nanopartículas. Segundo
esta teoria, a formação de nanopartículas é resultado da agregação de polímero
estabilizado em gotículas de emulsão sem relação aparente com os processos de
nucleação e crescimento. Partículas com tamanho submicrométrico são formadas devido
a uma diferença de tensão superficial entre o solvente orgânico e o não-solvente (água)
usados no processo. O solvente aquoso que apresenta alta tensão superficial atrai
fortemente o solvente orgânico de baixa tensão superficial. A diferença de tensão
superficial provoca turbulência interfacial, interferindo no mecanismo de equilíbrio do
sistema resultando na diminuição da energia livre. Perturbações na interface do sistema
originam padrões de circulação e movimentos que geram uma convecção interfacial.
Tais perturbações da interface superficial promove o aumento da transferência de
massa entre as duas fases. A mistura entre as fases aquosa e orgânica conduz a quebra
das gotas da fase orgânica em gotas cada vez menores até a formação de gotas com
tamanho submicrométrico. O fluxo do solvente a partir destas regiões de baixa tensão
superficial leva a agregação do polímero na superfície orgânica e a precipitação do
polímero leva a formação de nanopartículas.35,53
4.7.2. EFEITO OUZO
Nos países do Mediterrâneo é um costume beber aguardente contendo essência de
anis conhecida como “ouzo” misturada com água. A mistura dos dois líquidos incolores
30
resulta em uma solução de aspecto leitoso. Isto acontece porque quando a água é
adicionada à bebida, o anis que antes se encontrava solúvel na solução alcoólica torna-
se insolúvel e se organiza em pequenas gotas devido à diminuição da qualidade do
solvente, uma vez que água e etanol apresentam boa afinidade. As pequenas gotas de
óleo de anis promovem o espalhamento da luz dando a bebida aparência leitosa. Tal
fenômeno foi batizado de “efeito ouzo”.56,57,58
O ''efeito Ouzo'' é observado quando uma solução de polímero hidrofóbico é trazida
rapidamente de uma região de fase 1 para uma região metaestável, entre as regiões das
curvas binodal e espinodal, pela adição de um não-solvente (Figura 7). Isto ocorre
quando se mistura certas porções de não-solvente, um solvente e um soluto que
produzem uma dispersão de duas fases relativamente estáveis denominada dispersão
metaestável. Uma grande vantagem do preparo de dispersões líquido-líquido através do
“efeito ouzo” é a possibilidade de se preparar dispersões livres de surfactantes,
estabilizantes e sem qualquer tipo de agitação mecânica. A ilustração do efeito Ouzo
para a formação de nanopartículas poliméricas em um diagrama de fases de três
componentes está representada na Figura 7, onde a concentração do polímero está na
abcissa e a concentração do solvente orgânico na ordenada. A concentração do não-
solvente é encontrada na diferença. Através deste diagrama de fases é possível se
demonstrar a curva binodal (curva de miscibilidade-limite) que separa a região bifásica
da região homogênea, como uma função da temperatura ou da fração molar, além do
limite de estabilidade termodinâmica com a curva espinodal (curva-limite de
estabilidade) que separa a região instável da região metaestável.60,59
Os locais do diagrama onde a energia livre de Gibbs não é minimizada são
denominados de região metaestável ou região Ouzo.55 Nesta região a concentração de
polímeros tende a estar suficientemente diluída resultando na nucleação do polímero e a
formação de nanoparatículas.56
Esta abordagem sugere que as variações de tensão interfacial que suportam a teoria
do efeito Marangoni podem não ser crítico para a formação de partículas. Neste caso,
quando a solução de polímero está em contato com o não solvente, o solvente difunde-
se para a fase aquosa, criando um local de supersaturação de moléculas de polímero que
conduz ao processo de nucleação e crescimento.
31
Figura 7. Diagrama ternário de fases que representa esquematicamente a formação de
nanopartículas a partir do método de nanoprecipitação (adaptado da referência 59).
Este cenário pressupõe que a taxa de mistura e o processo de difusão molecular
associado são extremamente rápidos, em comparação com a velocidade de nucleação.
Assim, quando as fases são misturadas a energia livre do sistema muda de tal forma que
a separação de fases é energeticamente mais favorável e as moléculas de polímero
coalescem formando núcleos.56,57,58,59
32
5. METODOLOGIA
5.1. MATERAIS UTILIZADOS
A fabricação de nanopartículas poliméricas biodegradáveis teve como ponto de partida
o poliéster biodegradável PLGA. Foram utilizados neste trabalho três diferentes amostras
de poli (ácido láctico-co-ácido glicólico): PLGA01 (L:G 50:50, Mw = 60.000 g.mol-1,
Mw/Mn = 2,0), PLGA02 (L:G 65:35, Mw = 75.000 g.mol-1, Mw/Mn = 1,9) e PLGA03
(L:G 85:15, Mw = 75.000 g.mol-1, Mw/Mn = 1,5).
Além do PLGA, também foram utilizados os seguintes polímeros: poli(ε-
caprolactona) PCL (Mw = 65.000 g mol-1, Mw/Mn = 1,5) e o copoliéster randômico poli
(butilenosuccinato-co-dilinoleato) nomeado PBS:PBDL (Mw = 66.000 g.mol-1, Mw/Mn =
1,88).36 Todos os solventes orgânicos foram adquiridos da Sigma Aldrich e utilizados
como recebidos. A água utilizada passou por processo de tratamento MilliQ®.
5.2. PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS
As PNPs foram preparadas pelo método de nanoprecipitação a partir de soluções
poliméricas em estoque de diferentes concentrações definidas e em diferentes solventes
(acetonitrila, acetona, DMF, THF e DMSO). As nanopartículas foram preparadas através da
difusão da solução polimérica orgânica para dentro do não-solvente (água Milli-Q®) com o
uso de seringa à taxa de fluxo de 2 mL.min-1. A velocidade de agitação da fase aquosa foi
mantida fixa para todos os experimentos (350 rpm), sendo que o solvente, natureza do
polímero, concentração de polímero, razão solvente:água, temperatura, força iônica (através
da adição de NaCl) e a mistura de diferentes solventes orgânicos foram variáveis de estudo.
A eliminação do solvente se deu através do método de evaporação a temperatura ambiente
ou diálise, dependendo do ponto de ebulição. Soluções poliméricas na concentração final
constante (1,4 mg.mL-1) na razão solvente: água 0,4 de foram preparadas utilizando-se
7mg de polímeros (PLGA, PCL, PBS: PBDL) adquiridos da Sigma Aldrich solubilizando o
polímero em 2ml do solvente orgânico de escolha e posteriormente difundindo-se a solução
polimérica no antisolvente ( 5ml).
As análises de DLS e ELS foram realizadas utilizando o equipamento Zetasizer Nano
ZS (Malvern Instruments).
33
τπη6
2qTkR B
H =
2
4π θsen
λ
n=q
[ ]∫ −=− τττβ dtAtg )/exp()(1)(2
5.3. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS
As nanopartículas poliméricas produzidas foram posteriormente caracterizadas
utilizando-se as técnicas de espalhamento de luz dinâmico (DLS), espalhamento de luz
eletroforético (ELS), espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) e microscopia
eletrônica de transmissão (TEM). As funções de correlação temporal obtidas por DLS
foram ajustadas utilizando-se o método de Cumulantes de acordo com a Equação 1.60
(1)
Onde A é a amplitude da função de correlação, Γ é a taxa média de decaimento em um
sistema suficientemente diluído relacionada à difusão. O parâmetro µ2 é chamada de
cumulantes de segunda-ordem. O raio hidrodinâmico (RH) do objeto espalhante foi
calculado a partir dos tempos de relaxação (1/Γ ) usando a relação de Stokes-Einstein: 60
(2)
onde kB é a constante de Boltzmann, T é a temperatura absoluta, η é a viscosidade do
solvente e q é o vetor de espalhamento:
(3)
n é o índice de refração do solvente e θ o ângulo de espalhamento. O cumulante de
segunda ordem (µ2) foi usado para calcular a distribuição do tamanho das partículas
(µ2/Γ 2) os quais são a medida da largura das distribuições da taxa do decaimento
monomodal.
Para assegurar a distribuição monomodal das nanopartículas, as funções de
correlação temporal foram analisadas utilizando-se o algoritmo REPES (incorporado ao
programa GENDIST) o qual utiliza a transformação inversa de Laplace de acordo com a
Equação 4. 60
(4)
....2
- ln)(ln 221 ttΓAtg
µ+=
34
f(ka)
U E
2
3
εηζ =
onde t é o tempo de decaimento da função de correlação e β é um parâmetro
instrumental. A função resultante é o tempo de relaxação constituído geralmente de
muitos picos representado processos dinâmicos individuais. As distribuições de tempo
de relaxação foram convertidas em distribuições de RH novamente utilizando-se a
equação de Stokes-Einstein.
O potencial zeta (ζ) das nanopartículas foi determinado através das medidas de
mobilidade eletroforética (UE) e da conversão dos valores para potencial-ζ (mV)
utilizando a equação de Henry:60
(5)
onde ε é a constante dielétrica do solvente e η é a viscosidade . O parâmetro f(ka) é a
função de Henry calculada através da aproximação de Smoluchowski f (ka) = 1.5.
As medidas de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) foram realizadas na
linha SAXS1 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS- Campinas-SP-Brasil)
que opera em comprimento de onda de λ = 1.55 Å e possui um detector bidimensional
Dectris Pilatus 300K. As imagens 2D em todos os casos foram isotrópicas e foram
normalizadas pelo valor de transmissão da amostra utilizando-se o programa FIT2D. Os
perfis de I(q) vs. q resultantes foram corrigidos pela subtração do espalhamento do
solvente puro (água).
As imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram adquiridas
utilizando-se um microscópio JEM 200CX (Jeol, Japão). As imagens foram obtidas a
100 kV e registradas em uma câmera digital. As PNPs foram diluídas 100 vezes e uma
gota de 5µL foi depositada sobre uma malha de cobre recoberta por filme de carbono
para a aquisição de cada imagem.
35
6. RESULTADOS E DISCUSSÕES
O efeito da variação dos parâmetros físico-químicos concentração inicial de
polímero, natureza do solvente orgânico, razão solvente:água, temperatura, velocidade
de agitação da fase aquosa e utilização de misturas de diferentes solventes orgânicos no
tamanho final, distribuição de tamanhos e potencial zeta de PNPs biodegradáveis foi
investigado nesta etapa do trabalho.
Figura 8. Funções de correlação temporal (A), respectivas distribuições de RH (B) e
aparência visual das PNPs de PLGA01 produzidas a partir de diferentes solventes
orgânicos: DMF (●), acetona (○) e THF (■) (C). A concentração polimérica total e a
razão solvente:água foram mantidas constantes (1,4 mg.mL-1 e 0,4 respectivamente).
DMF THF Acetona
(C)
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
C (
t)
tempo (µs)
(A)
1 10 100 1000
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0(B)
Inte
nsid
ade
Nor
mal
izad
a
RH (nm)
36
Na Figura 8 são mostrados exemplos representativos das funções de correlação
temporal com o ajuste de Cumulantes (A), as respectivas distribuições de RH (B) e a
aparência visual das PNPs de PLGA01 produzidas na concentração final de 1,4 mg.mL-
1 e razão solvente:água (0,4) a partir de DMF, acetona e THF de acordo com a legenda.
Em todos os casos, o processo de nanoprecipitação resultou na distribuição de tamanhos
monomodal. O ajuste das funções de correlação através do método de Cumulantes
sugere distribuições estreitas (µ2/Γ 2 < 0.15). As distribuições monomodais também são
evidenciadas na Figura 8B para o tratamento das funções de correlação utilizando-se o
algoritmo REPES. A aparência visual das suspensões de PNPs é consideravelmente
dependente dos parâmetros físico-químicos investigados. As suspensões são totalmente
transparentes para partículas pequenas (~ 40 nm) e fracamente opacas para partículas
levemente maiores (~50-60 nm). A opalescência torna-se mais pronunciada com o
aumento do tamanho. Esta tendência pode ser qualitativamente vista na Figura 8C para
as PNPs preparadas a partir dos solventes orgânicos DMF (~ 25 nm), acetona (~ 51 nm)
e THF (~ 100 nm). Uma tendência similar foi observada como função da concentração
polimérica. O potencial zeta de todas as PNPs preparadas foi determinado como sendo
negativo, com valores entre -30,0 mV e -50,0mV dependendo das condições
experimentais.
A formação de nanopartículas foi também confirmada através da realização de
medidas de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e espalhamento de raios-X a
baixo ângulo (SAXS). Os dados representativos para PNPs de PLGA01 preparadas em
DMF são mostrados na Figura 9. Nas Figuras 9A-C pode se confirmar a formação de
PNPs esféricas. O dado experimental de SAXS da Figura 9D foi modelado
geometricamente como esferas homogêneas. O ajuste se mostra de boa qualidade e
resultou em valores de R = 31,0 nm e a polidispersão considerando a distribuição
logarítmica normal δ = 0,15. Dados de SAXS para partículas maiores não puderam ser
obtidos de maneira apropriada devido ao mínimo vetor de onda (q) acessível na linha
SAXS 1 do LNLS.
37
Figura 9. Imagens de TEM para nanopartículas de PLGA01 produzidas a partir de
DMF (A), acetona (B) e THF (C). Dado de SAXS e ajuste correspondente (linha sólida)
para PNPs de PLGA01 produzidas a partir de DMF (D).
Nesta primeira etapa de trabalho investigou-se detalhadamente a influência das
propriedades físico-químicas das fases aquosa e orgânica durante o processo de
nanoprecipitação e preparação das PNPs biodegradáveis. O principal polímero
escolhido para as investigações foi o PLGA devido a suas características bem
conhecidas de biocompatibilidade, biodegradação e por ser amplamente utilizado em
aplicações biomédicas. Assim, demonstrou-se que o tamanho de PNPs de PLGA pode
ser ajustado facilmente e precisamente entre 25-100 nm alterando os parâmetros físico-
químicos durante os protocolos de Nanoprecipitação.
6.1 INFLUÊNCIA DA RAZÃO SOLVENTE:ÁGUA
Levando-se em conta que acetona é um dos solventes orgânicos mais amplamente
utilizados na fabricação de PNPs através de nanoprecipitação, e devido a considerável
(A) (B)
(C)
0.1 110-6
10-5
10-4
10-3
10-2
10-1
100
(D)
I (q)
q (nm-1)
R = 31.0 nmδ = 0.15
38
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
40
50
60
70(A)
RH (
nm)
razao acetona:agua
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20 (B)
indi
ce d
e po
lidis
pers
ao
razao acetona:agua
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20(C)
razao acetona:agua
ζ (m
V)
segurança e fácil evaporação deste solvente, primeiramente foi estudada a influência da
razão solvente:água nas características finais das PNPs utilizando-se acetona. A razão
solvente:água variou a partir de 0,2 até 1,0 mantidas a concentração de polímero
constante (1,4 mg.mL-1). Os resultados experimentais são mostrados na Figura 10 para
PLGA01.
.
Figura 10. Influência da razão solvente:água nas características estruturais das
nanopartículas de PLGA01 preparadas por nanoprecipitação: dimensão RH (A), índice
de polidispersão (B) e potencial-ζ (C). A concentração polimérica foi mantida constante
(1,4 mg.mL-1).
39
Interessantemente a razão solvente:água teve um efeito comparativamente
pequeno no tamanho das partículas produzidas entre as razões de 0,4 e 1,0, embora para
a razão de 0,2 as PNPs produzidas apresentaram-se substancialmente maiores. Para
regiões de baixa razão solvente:água (0,2 até 0,8), o tamanho das partículas diminui
com o aumento da razão solvente :água. O tamanho das partículas foi reduzido de 67,8
nm para 44,0 nm com o aumento da razão solvente:água de 0,2 para 0,8. Este aumento
pode ser compreendido levando-se em conta a concentração constante e o aumento da
razão solvente: água. Neste caso, o número de sítios de nucleação aumenta,
consequentemente levando a formação de partículas menores. O número máximo de
sítios de nucleação provavelmente está em torno da região de razão solvente:água ~ 0,6-
0,8. Com o aumento da razão solvente:água acima de 0,6-0,8, supõe-se que o processo
de nucleação torna-se mais difícil levando a formação de menos sítios de nucleação e
consequentemente partículas maiores. Uma tendência similar foi observada na
preparação de PNPs de p(MMAstat-MAA) utilizando-se o protocolo de
nanoprecipitação a partir de acetona.61 A polidispersão, contudo, parece não ser afetada
pela razão solvente:água pois as PNPs apresentaram distribuição de tamanho estreitas
com valores sempre abaixo de 0,15 (Figura 10B).
Além disso, o potencial-ζ é um parâmetro de fundamental importância a partir
do qual se pode controlar a estabilidade das nanopartículas, além de ser um fator que
afeta a absorção celular.57,58 O potencial-ζ das PNPs de PLGA01 preparadas não é
dependente da razão solvente:água. Os valores determinados sempre estiveram na
estreita faixa de -30,0 mV até -40,0 mV. A carga superficial das PNPs (ζ < -30,0 mV)
sugere uma boa estabilidade da dispersão das PNPs produzidas evitando a agregação
devido à existência de forças de repulsão eletrostática. Consequentemente, as PNPs
preparadas sob estas condições demonstraram boa estabilidade por meses quando
estocadas em geladeira a 4oC.
Desta maneira, devido ao tempo gasto na evaporação de acetona (48 horas), e
tendo em vista que para quantidades maiores de acetona ficou evidenciado apenas uma
pequena redução na dimensão das nanopartículas (~ 6 nm), as investigações
comparativas subsequentes foram realizadas na razão solvente:água igual a 0,4.
40
0 5 10 1540
60
80
100
120
140(A)
RH
(nm
)
concentracao de PLGA01 (mg.mL-1)
0 5 10 150.00
0.07
0.14
0.21
0.28(B)
concentracao de PLGA01 (mg.mL-1)
Indi
ce d
e po
lidis
pers
ao
0 5 10 15-60
-50
-40
-30
-20(C)
concentracao de PLGA01 (mg.mL-1)
ζ (m
V)
6.2. INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE POLÍMERO
A influência da concentração de polímero no tamanho das nanopartículas, na
distribuição de tamanho e no potencial-ζ das PNPs na razão constante de acetona:água
igual a 0,4 é mostrada na Figura 11.
Figura 11. Influência da concentração de polímero nas características estruturais das
nanopartículas de PLGA01 preparadas por nanoprecipitação: tamanho hidrodinâmico
(A), índice de polidispersão (B) e potencial-ζ (C).
41
A concentração de polímeros foi sistematicamente variada entre 1,4 e 20,0
mg.mL-1. O aumento na concentração resultou no aumento substancial do tamanho das
nanopartículas. O tamanho (RH) das PNPs é linearmente dependente da concentração
de PLGA01 variando desde 51,8 nm até 128,5 nm. Previamente, outros autores
mostram que o volume das PNPs com características esféricas (e não o raio) seria
proporcional a concentração inicial de polímero para PLGA-b-PEG PNPs.62 Entretanto,
não foi evidenciado uma relação linear entre volume e concentração nas presentes
investigações.
Tendo em vista que as PNPs foram produzidas em uma grande quantidade de
não solvente, o aumento significativo do tamanho das PNPs como função da
concentração de polímero pode ser explicado pelo mecanismo de nucleação-
crescimento. A solução polimérica orgânica foi introduzida na fase aquosa durante a
nanoprecipitação e esta é dividida em pequenos domínios. A difusão e a precipitação
ocorreram quase que simultaneamente e logo que os núcleos poliméricos são formados,
eles aumentam de tamanho pela captura de moléculas de soluto da vizinhança até a
estabilização da repulsão eletrostática com o desaparecimento do crescimento das PNPs.
Portanto, a dimensão final das nanopartículas resultantes é determinada pelo número de
moléculas poliméricas disponíveis para agregação na vizinhança. O aumento do número
de cadeias poliméricas disponíveis por unidade de volume (aumento da concentração)
leva a um aumento no número de núcleos e consequentemente aumenta a probabilidade
de encontro entre estes núcleos. Cada encontro causa a agregação aumentando assim o
tamanho final das nanopartículas.
Além disso, a influência da concentração de polímero na viscosidade da solução
polimérica orgânica deve ser considerada. Com o aumento da concentração polimérica,
a solução orgânica torna-se obviamente mais viscosa devido ao aumento da intensidade
de interação polímero-polímero e polímero-solvente. Isto direciona para uma elevada
resistência de transferência de massa. A difusão da fase solvente-polímero para o
interior da fase aquosa torna-se dessa maneira mais lenta conduzindo ao aumento de
tamanho das PNPs.
As distribuições de tamanho tornaram-se mais largas nas condições onde
partículas maiores foram obtidas, tendo sido considerado o desvio padrão para
concentrações a partir de 5mg.mL-1 até atingir a estabilidade (Figura 11B). Isto pode ser
compreendido também considerando o processo de agregação. Quando as PNPs têm um
42
tamanho menor que o tamanho ideal considerando-se a estabilidade eletrostática, o
processo de agregação continua até se atingir um tamanho estável. O modelo de
agregação aleatória prevê que a polidispersão aumenta com o número de passos. Sendo
assim, pode se dizer que a polidispersão aumenta com o aumento do tamanho. De
maneira similar, foi possível observar uma consistente dependência do potencial zeta
como função da concentração polimérica (e consequentemente como função do
tamanho das PNPs). Com o aumento do tamanho de RH desde 51,8 nm para 128,5 nm, o
potencial-ζ foi deslocado na direção a valores menores em módulo, o que pode causar a
perda da estabilidade. O potencial-ζ negativo é atribuído ao deslocamento das cargas
negativas da ligação éster e das cargas negativas parcialmente ionizadas de grupos
carboxílicos do esqueleto polimérico do PLGA. Estes resultados são inesperados uma
vez que o aumento no tamanho das PNPs é devido ao aumento nos números de cadeias
poliméricas agregadas o que deveria deslocar os valores de potencial-ζ para valores
mais negativos. Para um melhor entendimento, tal tendência pode apenas ser explicada
se considerarmos que as PNPs produzidas são diferentes do ponto de vista estrutural.
Supostamente, o aumento na viscosidade da solução polimérica em função da
concentração polimérica deve elevar o tempo para as cadeias poliméricas de PLGA se
arranjarem na conformação mais favorável. Isto pode levar à incorporação de frações
hidrofóbicas do PLGA para dentro de domínios mais hidrofóbicos das PNPs
(presumidamente o interior do núcleo). Consequentemente, a rede de cargas superficiais
(i.e. potencial-ζ ) nas PNPs é reduzida visto que mais terminais carboxílicos são
enterrados no interior das nanopartículas. Isto pode influenciar a estabilidade das
partículas. Todavia, mesmo para as concentrações mais elevadas utilizadas, o potencial-
ζ sempre permaneceu mais negativo de -30,0 mV, o que é considerado um valor limite
de estabilidade para nanopartículas. Cabe ressaltar também que mudanças estruturais
das PNPs como função da concentração polimérica devem ser futuramente investigadas
com mais detalhes.
43
0 10 20 30 40 50 600.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Temperatura (oC)
indi
ce d
e po
lidis
pers
ao
(B)
0 10 20 30 40 50 60
40
45
50
55
60(A)
RH (
nm)
Temperatura (oC)
0 10 20 30 40 50 60-60
-50
-40
-30
-20(C)
Temperatura (oC)
ζ (m
V)
6.3. INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA
A temperatura das preparações das nanopartículas foi avaliada desde 05 até 55 oC. Os resultados são mostrados na Figura 12.
Figura 12. Influência da temperatura nas características estruturais das nanopartículas
de PLGA01 preparadas por nanoprecipitação: Tamanho das nanopartículas (A), índice
de polidispersão (B) e potencial-ζ (C). A concentração polimérica e a razão
acetona:água foram mantidas constantes em 1,4 mg.mL-1 e 0,4 respectivamente.
44
Observou-se uma redução substancial no tamanho das partículas como função
do aumento da temperatura. A temperatura foi avaliada a partir de 05 oC até 55 oC.
Nesta faixa de temperatura, o RH das partículas foi reduzido de 58,6 nm para 42,3 nm.
Conforme mencionado anteriormente, a nanoprecipitação é dependente da rápida
difusão da solução polimérica orgânica para dentro da fase aquosa. A rapidez da mistura
leva ao aumento da taxa de nucleação resultando na formação de nanopartículas
menores. O aumento da temperatura supostamente aumenta a velocidade da mistura
solvente:água. Isto também pode estar relacionado com a redução da viscosidade ou
com o aumento na afinidade termodinâmica da acetona pela água. A velocidade de
difusão do solvente orgânico bem como o tamanho das partículas não são governadas
pela viscosidade do solvente orgânico. Este tópico será discutido de maneira mais
detalhada adiante. Portanto, os resultados experimentais descritos aqui sugerem que a
interação termodinâmica entre a acetona e a água é provavelmente favorecida com o
aumento da temperatura. A maior afinidade entre a acetona e a água induz a rápida
mistura das fases orgânica e aquosa resultando numa alta na taxa de nucleação e na
formação de PNPs menores.
Por outro lado, não foram observadas tendências na polidispersão das amostras.
Os valores estiveram sempre entre ~ 0,07-0,10. O mesmo é válido para os valores de
potencial-ζ, os quais variaram randomicamente sempre na região negativa, contudo
sendo sempre inferiores a -30 mV.
45
6.4. INFLUÊNCIA DA FORÇA IÔNICA
A força iônica do antisolvente (água) foi variada a partir de 10-5mol.L-1 até 10-1
mol.L-1 durante a preparação das PNPs. A força iônica foi controlada pela variação da
concentração de NaCl e os resultados são mostrados na Figura 13. Existe uma clara e
substancial influência da força iônica no tamanho das nanopartículas.
Figura 13. Influência da força iônica nas características estruturais das nanopartículas
de PLGA01 preparadas por nanoprecipitação: Raio Hidrodinâmico (A), polidispersão
(B) potencial-ζ (C). A concentração polimérica e a razão acetona:água foram mantidas
constantes em 1,4 mg.mL-1 e 0,4 respectivamente.
10-5 10-4 10-3 10-2
60
75
90
105
(A)
RH (
nm)
força iônica (mol.L-1)ag
rega
dos
10-5 10-4 10-3 10-2
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
0.15
0.18 (B)
indi
ce d
e po
lidis
pers
ao
força iônica (mol.L-1)
10-4 10-3 10-2 10-1-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0(C)
ζ (m
V)
força iônica (mol.L-1)
46
O método de nanoprecipitação foi realizado utilizando concentração final de
PLGA01 de 1,4 mg.mL-1 da solução polimérica em acetona. Ocorreu um aumento no
tamanho das partículas em função da força iônica até 0,01 mol.L-1. Para valores de força
iônica acima de 0,01 mol.L-1, as dispersões de nanopartículas flocularam e partículas
estáveis não puderam mais ser produzidas. O aumento da concentração de NaCl reduz a
repulsão eletrostática entre as cadeias poliméricas de PLGA devido a presença dos íons
Na+. Portanto, as interações de van der Waals entre as cadeias tornam-se dominantes e
as partículas podem facilmente colidir levando à agregação e formação de grandes
partículas. Simultaneamente, pode ser observada uma pequena redução na polidispersão
das PNPs produzidas. Por outro lado, uma redução substancial no potencial-ζ das PNPs
foi observado. Este comportamento pode ser entendido se considerarmos a
neutralização da superfície do PLGA promovida pelos íons Na+. A diminuição das
cargas superficiais diminui o potencial-ζ resultante das PNPs.
6.5. INFLUÊNCIA DAS PROPRIEDADES DO POLÍMERO
O processo de nanoprecipitação também foi realizado utilizando-se diferentes
polímeros biodegradáveis, mantendo-se fixas todas as outras variáveis de
nanoprecipitação (razão solvente:água, concentração e temperatura). Os resultados estão
mostrados na Tabela 1.
Tabela 1. Características dos polímeros biodegradáveis utilizados e propriedades físico-
químicas das PNPs produzidas por nanoprecipitação.
Qualitativamente, o peso molecular dos polímeros biodegradáveis parece
influênciar o tamanho final das nanopartículas sendo que PNPs de PLGA01 e
47
PBS:PBDL foram produzidas com os menores tamanho. Na série de polímeros de
PLGA, o tamanho aumentou na ordem PLGA01 < PLGA02 < PLGA03. Sugere-se que
esta tendência tenha sido influênciada pelo peso molecular e hidrofobicidade das
cadeias poliméricas biodegradáveis. A hidrofobicidade parece ter importância ímpar no
tamanho final das partículas produzidas, uma vez que PNPs de PCL (de peso molecular
similar a PBS:PBDL e PLGA01) conduziu a PNPs substancialmente maiores (RH ~ 90
nm). Uma vez que PCL possui hidrofobicidade superior a PLGA e PBS:PBDL63,64 a
interação polímero-água deve ter sido relevante para a formação de PNPs de tamanho
elevado. De maneira similar, a hidrofobicidade do PLGA pode ser estimada pela razão
lactideo:glicolideo (L:G). Valores elevados da razão L:G são relativos a polímeros de
elevada hidrofobicidade45e possivelmente maior tendência à agregação em contato com
água. O tamanho das partículas é maior quando elas são preparadas a partir de
polímeros mais hidrofóbicos. Com o aumento da razão L:G, as moléculas PLGA
preferem se agregar devido ao aumento na hidrofobicidade levando a formação de
nanopartículas maiores. Isto pode ser evidenciado por comparação das PNPs preparadas
a partir de PLGA02 e PLGA03. Adicionalmente, o tamanho das nanopartículas
aumentou com o peso molecular do polímero utilizado. Esta tendência se deve
provavelmente ao aumento do tamanho da cadeia polimérica quando a conformação
colapsada em contato com a água.
6.6. INFLUÊNCIA DO SOLVENTE ORGÂNICO
O método de nanoprecipitação foi realizado a partir dos seguintes solventes
orgânicos miscíveis em água: dimetilsufóxido (DMSO), acetona, acetonitrila e
tetraidrofurano (THF). Na Tabela 2 são mostrados os parâmetros físico-químicos mais
importantes dos solventes e polímeros investigados.
48
Tabela 2. Propriedades físico-químicas dos solventes e polímeros utilizados nos
protocolos de nanoprecipitação.
Como já mencionado anteriormente, a formação de PNPs através de
nanoprecipitação é um processo complexo que inclui o aparecimento de sítios de
nucleação seguido pelo crescimento e agregação. A velocidade de cada etapa determina
o tamanho final das partículas e as propriedades relacionadas. A partir da rápida
formação das PNPs (na escala de ~ 10 ms), a mistura da solução orgânica e água deve
ser a mais rápida possível para evitar correntes de solvente no antisolvente. A rápida
mistura leva a alta taxa de nucleação resultando na formação de nanopartículas
pequenas. Contudo, os resultados experimentais descritos aqui evidenciaram que a taxa
de mistura das fases aquosa e não aquosa não é governada pela viscosidade dos
solventes a partir do uso do DMF e DMSO (os solventes de maior viscosidade), os
quais levaram à formação das PNPs de menor tamanho. Portanto, a diferença no
tamanho não pode ser simplesmente relacionada com a diminuição da viscosidade do
solvente orgânico. De fato, a alta taxa de difusão do solvente pode ser alcançada
utilizando-se solventes orgânicos o mais compatível possível com água. A alta afinidade
49
2águasolvente ) - (
δδχ
RT
Váguaáguasolvente =−
solvente-água promove a alta taxa de difusão do solvente para o seio da fase aquosa a
formação de pequenas nanopartículas. Este feito foi observado em nossas investigações.
Quantitativamente, a compatibilidade solvente-água pode se expressar pelo parâmetro
de interação solvente-água (χSolvente-água) baseado no parâmetro de solubilidade de
Hildebrand (Tabela 2) como:
(6)
O parâmetro χsolvente-água descreve a interação entre moléculas de água e as
moléculas de solvente orgânico. Além disso, Vágua é o volume molar da água (calculado
e baseado na massa molar e na densidade), R é a constante dos gases, T a Temperatura
absoluta e δágua e δsolvente são os parâmetros de solubilidade da água e do solvente
orgânico respectivamente. O tamanho das PNPs como função do parâmetro de interação
(χsolvente-água) está mostrado na Figura 14. Existe uma tendência consistente de aumento
do tamanho das PNPs como função de χsolvente-água, onde para valores baixos deχsolvente-
água as PNPs formadas serão menores. O aumento no tamanho segue a ordem DMSO ~
DMF < acetonitrila < acetona <THF. Esta é a tendência a partir dos valores menores de
χsolvente-água para os valores maiores.
Os resultados sugerem que a alta afinidade solvente-água (baixoχsolvente-água)
conduz à formação de PNPs menores e confirmam que a miscibilidades solvente-água é
o fator de maior importância no fenômeno de iniciação-difusão e assim na formação de
PNPs por nanoprecipitação. Além do mais, a mesma tendência tem sido observada
como uma função da constante dielétrica do solvente onde a baixa constante dielétrica
do solvente resultará em nanopartículas finais maiores. A produção de PNPs de
EUDRAGIT® L 100-55 (um copolímero aniônico baseado no ácido metacrílico e
etilacrilato) por nanoprecipitação a partir de diferentes solventes (etanol, DMSO, álcool
isopropílico, acetona e acetato de etila) levaram a uma tendência similar.69 O mesmo
também foi observado na fabricação de PNPs de PLGA recobertas por PEG. Erro!
Indicador não definido.O índice de polidispersão (Figura 14B) e o potencial-ζ (Figura
14C) das PNPs produzidas não parecem ser afetados sistematicamente pela natureza do
50
3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
20
40
60
80
100
120(A)
DMSO
DMF
Acetonitrila
AcetonaRH (
nm)
χ(solvente-agua)
THF
3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
-50
-40
-30
(C)
DMSO
DMF
Acetonitrila Acetona
ζ (m
V)
χ(solvente-agua)
THF
3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.50.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25(B)
DMSO
DMF
Acetonitrila
Acetona
indi
ce d
e po
lidis
pers
ao
χ(solvente-agua)
THF
solvente orgânico. Todavia, os valores estiveram sempre abaixo de 0,15 e -30,0 mV
respectivamente.
Figura 14. Influência do parâmetro de interação do solvente orgânico-água (χsolvente-
água) no tamanho, índice de polidispersão e potencial-ζ das nanopartículas de PLGA01
preparadas por nanoprecipitação.
A produção de NPs poliméricas a partir de PCL e PBS:PBDL também foi
realizada em DMF, acetona e THF. A comparação com os resultados de PLGA01 é
mostrada na Tabela 3.
51
Tabela 3. Raio Hidrodinâmico (RH), índice de polidispersão e potencial-ζ de uma
variedade de nanopartículas poliméricas preparadas por nanoprecipitação a partir de
diferentes solventes orgânicos.
Como pode ser observado, para qualquer polímero, o tamanho das PNPs
aumenta na ordem DMF < acetona < THF. Consideramos estes resultados de
importância fundamental porque eles claramente confirmam que a interação solvente-
água é de fundamental importância uma vez que afeta o tamanho das PNPs
independente da natureza do polímero biodegradável. Além do mais, embora a mesma
tendência tenha sido observada, claramente as PNPs de PCL são substancialmente
maiores do que outras PNPs produzidas em todos os solventes. Intuitivamente,
parâmetros como viscosidade intrínseca da solução polimérica orgânica e
hidrofobicidade das cadeias poliméricas talvez tenham influência particular no tamanho
final das partículas. A viscosidade intrínseca das soluções poliméricas deve ser medida,
entretanto, acreditamos que o valor seja similar a do solvente puro, uma vez que, as
concentrações poliméricas utilizadas estiveram em torno de ~ 0.5% w/w (5,0 mg.mL-1).
Portanto, tal comportamento pode estar relacionado à alta hidrofobicidade do PCL
comparado com outros polímeros biodegradáveis. A interação polímero-solvente e a
Polímero Solvente RH (nm) Polidispersão ζ (mV)
PBS:PBDL
DMF 25,1 0,23 -36,8
Acetona 49,1 0,03 -33,9
THF 103,8 0,13 -37,4
PLGA01
DMF 29,9 0,27 -38,5
Acetona 52,1 0,12 -39,4
THF 109,7 0,05 -49,1
PLGA03
DMF 58,1 0,04 -32,4
Acetona 70,8 0,09 -24,6
THF 131,1 0,09 -33,7
PCL
DMF 63,9 0,24 -28,7
Acetona 88,6 0,10 -23,0
THF 212,1 0,28 -52,5
52
viscosidade intrínseca da solução polimérica orgânica parecem ter uma menor
influência no tamanho final das PNPs produzidas.
6.7. INFLUÊNCIA DA MISTURA DE SOLVENTES
O mesmo procedimento foi empregado para misturas de solventes. Os resultados
são mostrados na Figura 15.
Figura 15. RH de nanopartículas de PLGA01 como função de φTHF em misturas de
DMF:THF (A) e acetona:THF (B). RH de nanopartículas de PBS:PBDL preparadas por
nanoprecipitação como função de φTHF em misturas de acetona:THF (C).
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
20
40
60
80
100
120 (A)
RH (
nm)
φTHF
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
20
40
60
80
100
120 (B)
φTHF
RH (
nm)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
20
40
60
80
100
120
RH (
nm)
φTHF
(C)
53
Usando-se misturas de DMF:THF, observa-se uma relação linear entre o
tamanho e a razão volumétrica dos solventes empregados. As mesmas características
também foram evidenciadas para a produção de PNPs a partir de diferentes polímeros
biodegradáveis. Na Figura 15C está mostrado o exemplo representativo para
PBS:PBDL. A polidispersão e o potencial -ζ das PNPs produzidas parecem não ser
sistematicamente afetados pela natureza da fase orgânica, similar ao descrito para
solventes puros.
Estes resultados demonstra ser possível o preparo de PNPs com o tamanho
controlado pela simples utilização de mistura de solventes orgânicos, sendo de
relevância ímpar uma vez que sugerem que PNPs podem ser fabricados com tamanho
sob demanda para aplicações terapêuticas onde a eficácia essencialmente dependente da
dimensão. Imagina-se também que este procedimento possa ser utilizado para se
aumentar a eficiência de encapsulação de diferentes agentes terapêuticos. Investigações
nesta direção já estão sendo realizadas pelo grupo de pesquisa.
7. CONCLUSÕES
Nanopartículas de PLGA livres de surfactantes com raio hidrodinâmico (RH)
variando entre RH 25 nm e RH 130 nm foram obtidas com sucesso pelo controle de
vários parâmetros físico-químicos. O tamanho das PNPs de PLGA produzidas pode ser
controlado pelo ajuste da concentração polimérica, escolha do solvente orgânico,
alteração da temperatura e força iônica. Pela otimização de tais parâmetros, PNPs
uniformes com tamanhos abaixo de RH 100 nm puderam ser produzidas através do
processo de nanoprecipitação. O tamanho das PNPs é principalmente dependente do
solvente orgânico utilizado e da natureza do polímero.
Adicionalmente, foi também evidenciado que o tamanho hidrodinâmico de PNPs
pode ser precisa e linearmente ajustado utilizando-se misturas de solventes como fase
orgânica. Considerando as misturas de solventes orgânicos, quanto maior for a fração de
solvente orgânicos de elevada hidrofobicidade maiores serão as PNPs fornadas, sendo
assim, ajustando-se a fração orgânica de maior hidrofobicidade é possível se ajustar de
forma desejável o tamanho das PNPs.
O tamanho das PNPs é dependente da natureza do polímero e segundo
observado neste trabalho, quanto maior for a massa molecular e a hidrofobicidade do
54
polímero, maiores serão as PNPs produzidas. A interação polímero-solvente parece não
ter um papel substancialmente importante na dimensão final dos colóides poliméricos
produzidos.
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1 National Nanotechnology Initiative, The Initiative and its Implementation Plan,
NSTC/NSET Report, 2000. (12 de 07 de 2013). Fonte: nano.gov:
http://nano.gov/node/243
2 Wiek A, Gasser L, Siegrist M. Systemic scenarios of nanotechnology: Sustainable
governance of emerging technologies. Futures 41(5): 284-300, 2009.
3 Maynard A D, Aitken R J, Butz T, Colvin V, Donaldson K, Oberdörster G, Philbert
M A, Ryan J, Seaton A, Stone V, Tinkle S S, Tran L, Walker N J, Warheit D B.
Safe Handling of Nanotechnology. Nature 444: 267–269, 2006
4 http://www.conti-tyres.co.uk/conticycle/news_int_4.shtml.
5 Herman S. Mansur; Surface modified fluorescent quantum dots with
neurotransmitter ligands for potential targeting of cell signaling applications.
Colloids aad Surfaces B: Biointerfaces,111, 60-70,2013
6 Marites P. Melancon,Challenges to effective cancer nanotheranostics. Journal of
Controlled Release 164,177–182, 2012
7 Duncan R. Polymer therapeutics as nanomedicines: new perspectives. Current
Opinion in Biotechnology 22: 492–501, 2011.
8 Gautier, J.et al. Recent advances in theranostic nanocarriers of doxorubicin based
on iron oxide and gold nanoparticles. Journal of Controlled Release 169, 48–61,
2013
9 Maeda H., Greish, K., Fang J.; The EPR Effect and Polymeric Drugs: A Paradigm
Shift for Cancer Chemotherapy in the 21st Century. Journal of Controlled
Release Volume 193, 103-121, 2006.
10 Canevarolo Jr., S.V. Ciencia de Polímeros.U texto básico para tecnólogos e
engenheiros 2º Ed. São Paulo: Artiliber, 2006
11 Kolibaba, M.; et al. Biodegradable Polymers: Past, Present, and Future. ASAE
meting presentation, Fargo, EUA, 2003
12 Maeda, H. Nakamura, H. Fang,J; The EPR effect for macromolecular drug delivery
to solid tumors: Improvement of tumor uptake, lowering of systemic toxicity, and
55
distinct tumor imaging in vivo. Advanced Drug Delivery Reviews 65 559–569,
2013.
13 Bassavaraj, K. H; et.al Biopolimers as transdermal drug delivery systems in
dermatology therapy. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 27(2),
155–185 (2010).
14 Russell, J. et. al. Paclitaxel Nano-Delivery Systems: A Comprehensive Review. J.
Nanomed Nanotechol, 4, 164, 2013
15 Yallapu M.M.; Gupta, B.K.; Jaggi M, Chauhan,S.C.; Fabrication of curcumin
encapsulated PLGA nanoparticles for improved therapeutic effects in metastatic
cancer cells. J. colloid Interface sci 2010, 351, 9-29.
16 Bilati, U.; Allémann, E.;, Doelker E.; Development of a nanoprecipitation method
intended for the entrapment of hydrophilic drugs into nanoparticlesEur. J. Pharm.
sci 2005 ,24, 67–75.
17 Beck-Broichsitter, M.; Rytting, E.; Lebhardt, T.; Wang, X.; Kissel, T.; Preparation
of nanoparticles by solvent displacement for drug delivery: A shift in the “ouzo
region” upon drug loading.Eur. J. Pharm. sci 2010, 41, 244–253.
18 Xie,H.; Smith,W.; Fabrication of PLGA nanoparticles with a fluidic
nanoprecipitation system. J.Nanobiotechnology. 2010, 8:18.
19 Shive, M.S.; Anderson; J.M.; Biodegradation and biocompatibility of PLA and
PLGA microspheres. Adv Drug Deliv Rev 1997, 28,5-24.
20 Muthu, M. S.; Rawat, M. K.; Mishra, A.; Singh, S.; Preparation and
characterization of nanoparticles containing an atypical antipsychotic agent.
Nanomedicine, 2009, 5, 323–333.
21 Gref, R.; Minamitake, Y.; Peracchia, M. T.; Trubetskoy, V.; Torchilin, V.; Langer,
R. Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres. Science 1994, 263,
1600–1603.
22 Gaucher, G.; Marchessault, R. H.; Leroux, J. Polyester-based micelles and
nanoparticles for the parenteral delivery of taxanes. J. Control. Release 2010, 143,
2–12.
23 Govender T., S. Stolnik, M.C. Garnett, L. Illum, S.S. Davis, PLGA nanoparticles
prepared by nanoprecipitation: drug loading and release studies of a water soluble
drug, J. Control. Release. 1999, 57, 171–185.
56
24 Cascone, M.G.;, Pot, P.M.; Lazzeri, L.;, Zhu, Z.; Release of dexamethasone from
PLGA nanoparticles entrapped into dextran/poly(vinyl alcohol) hydrogels, J.
Mater. Sci. Mater. Med.2002 ,13, 265–269.
25 Morkved,T.L.; Chapman,B.R.; Bates,F.S.; Lodge, T.P.;Stepanek,P.; Almdal, K., In
Dynamic light scattering: The Method and Some Applications; Brown, W., Ed.;
Oxford Science Publications: Oxford, 1993.
26 Farochzad, O. C et. al.; Biodegradable, polimeric nanoparticle delivery system for
cancer therapy. Nanomedicine 2007; 669-680
27 Seierczewska M., Liu, G. Lee, S. Chen, X. High- Sensitivity nanosensores for
biomarker detection. Chemical Society Reviews 41: 2641-2655,2012
28 Lee N, Hyeon T. Designed synthesis of uniformly sized iron oxide nanoparticles for
efficient magnetic resonance imaging contrast agents. Chemical Society Reviews
41: 2575-2589, 2012.
29 Florindo, H.F; et.al. Immune system targeting by biodegradable nanoparticles for
cancer vaccines. Journal of Controlled Release 168 (2013) 179–199.
30 Pan Y, Du X, Zhao F, Xu B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of
proteins and cells. Chemical Society Reviews 41: 2912-2942, 2012.
31 Jäger E, Jäger A, Chytil P, Etrych T, Říhová B, Giacomelli F C, Štěpánek P,
Ulbrich K. Combination chemotherapy using core-shell nanoparticles through the
self-assembly of HPMA-based copolymers and degradable polyester. Journal of
Controlled Release 165: 153-161, 2013.
32 Ulbrich K, Šubr V. Polymeric anticancer drugs with pH-controlled activation.
Advanced Drug Delivery Reviews 193: 1023-1050, 2004.
33 Giacomelli F C, Stepánek P, Giacomelli C, Schmidt V, Jäger E, Jäger A, Ulbrich K.
pH-triggered block copolymer micelles based on a pH-responsive PDPA (poly[2-
(diisopropylamino)ethyl methacrylate]) inner core and a PEO (poly(ethylene
oxide)) outer shell as a potential tool for the cancer therapy. Soft Matter 7: 9316-
9325, 2011.
34 Barenholz Y C.Doxil® - The first FDA-approved nano-drug: Lessons learned.
Journal of Controlled Release 160: 117-134, 2012.
35 Schaffazick SR, Guterres SS, Freitas LL, Pohlmann AR. Caracterização e
estabilidade físico-química de sistemas poliméricos nanoparticulados para
administração de fármacos. Química Nova 26(5): 726-737, 2003.
57
36 Julyan P J, Seymour L W, Ferry D R, Daryani S, Boivin C M, Doran J, David J,
Anderson D, Christodoulou C, Young A M, Hesslewood S, Kerr D J. Preliminary
clinical study of the distribution of HPMA copolymers bearing doxorubicin and
galactosamine. Journal of Controlled Release 57(3): 281-290, 1999
37 Herth M M, Barz M, Moderegger D, Allmeroth M, Jahn M, Thews O, Zentel R,
Rösch F. Radioactive labeling of defined HPMA-based polymeric structures using
[18F]FETos for in vivo imaging by positron emission tomography.
Biomacromolecules 10: 1697-1703, 2009
38 Herth M M, Barz M, Jahn M, Zentel R, Rösch F. As-labeling of HPMA based
polymers for long-term in vivo PET imaging. Bioorganic & Medicinal Chemistry
Letters 20: 5454-5458, 2010.
39 Duncan R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug
Discovery 2: 347-360, 2003
40 Melancon M P, Li C. Multifunctional synthetic poly(L-glutamic acid)-based cancer
therapeutic and imaging agents. Molecular Imaging 10: 28-42, 2011
41 Lammers T, Subr V, Ulbrich K, Peschke P, Huber P E, Hennink W E, Storm G.
Simultaneous delivery of doxorubicin and gemcitabine to tumors in vivo using
prototypic polymeric drug carriers. Biomaterials 30: 3466-3475, 2009.
42 Byrne J D, Betancourt T, Brannon-Peppas L. Active targeting schemes for
nanoparticle systems in cancer therapeutics, Advanced Drug Delivery Reviews 60:
1615-1626, 2008.
43 Park J H, Lee S, Kim J H, Park K, Kim K, Kwon I C. Polymeric nanomedicine for
cancer therapy, Progress in Polymer Science 33: 113-137, 2008.
44 Moghimi S M, Hunter A C, Murray J C. Nanomedicine: current status and future
prospects, The Faseb Journal 19: 311-330, 2005.
45 Maeda H, Wu J, Sawa T, Matsumura Y, Hori K. Tumor vascular permeability and
the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled
Release 65: 271-284, 2000
46 Fang J, Nakamura H, Maeda H. The EPR effect: Unique features of tumor blood
vessels for drug delivery, factors involved, and limitations and augmentation of the
effect. Advanced Drug Delivery Reviews 63(3): 136-151, 2011
47 Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect.
Advanced Drug Delivery Reviews. 63(3): 131-135, 2011
58
48 Jain R K, Stylianopoulos T. Delivering nanomedicines to solid tumors. Nature
Reviews Clinical Oncology 7: 653-664, 2010.
49 Matsumura Y, Maeda H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer
chemotherapy: Mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the
antitumor agent smancs. Cancer Research 46: 6387-6392, 1986
50 Mora-Huertas et al. Polymer-based nanocapsules for drug delivery / International
Journal of Pharmaceutics 385 (2010) 113–142
51 Yadav et al. Different Techniques For Preparation Of Polymeric Nanoparticles- A
Review.Asian J Pharm Clin Res, Vol 5, Suppl 3, 2012, 16-23
52 Fessi, H., Devissaguet, J.P.; Puisieux, F., Thies, C:Process for the preparation of
dispersible colloidal systems of a substance in the form of nanoparticlesUS Patent,
5118528, 1988.
53 Fessi, H. Et al. Physicochemical characterization of polymeric nanocapsules and in
vitro realese evalution od indomethacin as a drug model. , Int. J. Pharm., 1989, 55,
R1–R4.
54 Galindo-Rodriguez, S., Allemann, E., Fessi, H., Doelker: Physicochemical
parameters associated with nanoparticle formulation in the salting-out,
emulsification-diffusion, and nanoprecipitation methods E. Pharm. Res. 2004, 21,
1428–1439.
55 Elsabahy M, Wooley K L. Design of polymeric nanoparticles for biomedical
delivery applications. Chemical Society Reviews 41: 2545-2561, 2012.
56 Elaissari, A. Influence of process and formulation parameters on the formation of
sub-micron particles by solvent displacement and emulsification-diffusion methods:
Critical comparison. Advances in Colloid and Interface Science 163 (2011) 90–122.
57 Kantz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneousLiquid-liquid
nucleation: “the ouzo effect” Langmuir, Vol. 19, No. 10, 2003.
58 Perevyazko, I.Y. Examination and optimization of the self-assembly of
biocompatible polymeric nanoparticles by high throughput Nanoprecipitation
.Nanoprecipitation .Soft Matter ,7,151-5030-5035.
59 Brick, M. C. Formation of Colloidal Dispersion of Organic Materials in Aqueous
Media by Solvent Shifting. Langmuir 19,16,6367-6380,2003
60 Giacomelli, F.C; Silveira, N.P.; Espalhamento de Luz Aplicado à Caracterização de
Polímeros e Nanopartículas, Centro de Nanociência e Nanotecnologia - CNANO.
59
(Org.). Tópicos em Nanociência e Nanotecnologia - Volume I. Porto Alegre:
Editora UFRGS, 2008, v., p. 93-106
61 Schubert, S. Nanoprecipitation and nanoformulation of polymers: from history to
powerful possibilities beyond poly (lactic acid). Soft Matter,7,1581-1588,2011.
62 Peer, D.; J. M. Karp, J. M.; Hong, S.; O. C. Farokhzad, R. Margalit, R. Langer,
Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy .Nat.
Nanotechnol.,2007,2,751-760.
63 Chou, L.Y.T. ;Ming,K.; Chan, W.C. w.; Strategies for the intracellular delivery
of nanoparticles.Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 233-245.
64 Zhang L, J.M. Chan, F.X. Gu, J-W. Rhee, A.Z. Wang, A.F. Radovic-Moreno, F.
Alexis, R. Langer, O.C. Farokhzad, ACS Nano, 2008, 2, 1696-1702.