producao de acido succinico por actinobacillus

DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO BIOTECNOLGICO PARA A PRODUO DE CIDO SUCCNICO POR Actinobacillus

succinogenes

EELLCCIIOO RR IIBBEEIIRROO BBOORRGGEESS

Tese de Doutorado, apresentada ao Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos para Obteno do Grau de Doutor em Cincias (DSc)

ORIENTADOR: Prof. Nei Pereira Jr, PhD

Universidade Federal do Rio de Janeiro Escola de Qumica

2011

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Prog. Ps-Grad. TPQBq/EQ/UFRJ Elcio Ribeiro Borges, 2011

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DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO PARA PRODUO DE CIDO SUCCNICO POR Actinobacillus Succinogenes

ELCIO R IBEIRO BORGES

Tese de Doutorado apresentada ao Curso de Ps-Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos para a Obteno do Grau de Doutor

em Cincias (DSc)

Universidade Federal do Rio de Janeiro Escola de Qumica

2011

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DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO BIOTECNOLGICO PARA PRODUO DE CIDO SUCCNICO POR Actinobacillus Succinogenes

Elcio Ribeiro Borges

Tese submetida ao Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos da Escola de Qumica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessrios obteno do grau de Doutor em Cincias, sob orientao do Prof. Nei Pereira Jr.

Banca examinadora:

Prof. Nei Pereira Junior, PhD (EQ/UFRJ) (Orientador-Presidente)

Profa. Gisella Maria Zanin, DSc (DEQ/UEM)

Prof. Paulo Luiz de Andrade Coutinho, DSc (BRASKEN)

Profa. Ins Conceio Roberto, DSc (EEL/USP)

Prof. Donato Alexandre Gomes, DSc (EQ/UFRJ)

Profa. Ldia Maria Melo Santa Anna, DSc (PETROBRAS)

EQ/UFRJ 2011

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F ICHA CATALOGRFICA

Borges, Elcio Ribeiro.

DESENVOLVIMENTO DE UM PROCESSO BIOTECNOLGICO PARA PRODUO DE CIDO SUCCNICO POR Actinobacillus Succinogenes / Elcio Ribeiro Borges Rio de Janeiro, 2011.

Tese (Doutorado em Cincias) Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, Escola de Qumica, Programa de Ps-Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos, 2011.

Orientador: Nei Pereira Jr., PhD.

1. cido succnico 2. Fermentao 3. Bagao de cana-de-aucar 4. Gs carbnico

I. Pereira Jr., Nei (Orient.) II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Escola de Qumica. Ps-Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos. III. Ttulo.

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memria de minha me, Lucia Helena Ribeiro Borges, memria do meu irmo, Erick Anderson Ribeiro Borges,

Famlia e entes queridos, Saudosamente,

Dedico

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"A cada dia que vivo, mais me conveno de que o desperdcio da vida est no amor que no damos, nas foras que no usamos, na prudncia

egosta que nada arrisca."

Carlos Drummond de Andrade

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AGRADECIMENTOS

Ao meu querido orientador, Professor Nei Pereira Jr, pelo presente concedido atravs da possibilidade de fazer parte de uma jornada de conhecimentos e vivenciar experincias, bastante sustentadoras, no mbito profissional e pessoal. Saber enxergar, sem ressalvas, a potencialidade de cada aluno e acrescent-los em sua rotina de trabalho, de forma enriquecedora, um privilgio daqueles que possuem uma racionalidade intuitiva, contribuindo imensamente para elevar o potencial de nossa Universidade. Diante de tanto talento e contribuio, palavras a mais se tornam mera redundncia. No obstante, qualquer tentativa de registrar minha gratido, em algumas linhas, no suficiente para estimar a imensido de minha admirao, respeito e inspirao. Porm, cada pgina traz consigo a presena sensvel de uma felicidade invisvel, silenciosa, sempre motivada e direcionada por uma orientao de notvel qualidade, excelncia e singularidade;

Ao Departamento de Engenharia Bioqumica e seus funcionrios, especialmente ao tcnico Luiz Cludio, pelo fundamental apoio no ambiente de trabalho e pela indispensvel atuao administrativa. Alm do convvio, amizade e confiana conquistados ao longo dos ltimos anos, de forma incisiva e verdadeira;

minha famlia, pela gratificante oportunidade de solidificar diversos valores pessoais de carter, envolvendo acertos e erros no educantrio terrestre, contribuindo para o meu crescimento e amadurecimento;

minha querida e saudosa me, Lucia Helena Ribeiro Borges, pela constncia de seus ensinamentos repletos de amor, carinho e incentivos. Mesmo ausente, fisicamente neste plano, conforta e emana a vibrao que alimenta a minha f e esperana, ajudando a superar de forma obstinada toda e qualquer provao;

Aos companheiros de trabalho, Patrcia, Flvia, Vernica, Eleandro, Liliana, Mariana, Ludmylla, Fabio, Diogo, Carolina, Paulo, Vanessa, Roberto, Gabriel, Jorge, Graziela e a todos aqueles que fizeram parte de gratas recordaes;

Danielle Silveira dos Santos, particularmente, pela presena inevitavelmente sustentadora em todos os momentos aparentemente difceis, contribuindo efetivamente para formulao e definio do real significado das palavras amizade e confiana;

Ao Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos da Escola de Qumica da UFRJ, pela agradvel recepo e convivncia diria;

Ao CNPq, FAPERJ e PETROBRAS pelo apoio financeiro.

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RESUMO

BORGES, Elcio Ribeiro. Desenvolvimento de um processo para produo de cido succnico por Actinobacillus succinogenes. Orientador: Nei Pereira Jr. Escola de Qumica - Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2011.

Atualmente, a maioria do cido succnico produzido comercialmente feito por sntese qumica. Entretanto, recentemente a ateno tem sido focalizada na produo microbiana de cido succnico por microrganismos como uma alternativa para a sntese qumica. Neste trabalho objetivou-se definir uma estratgia de produo de cido succnico, por Actinobacillus succinogenes CIP 106512, em fermentaes com hidrolisado hemicelullsico de bagao de cana-de-acar. Inicialmente, trs estratgias de planejamentos experimentais sequenciais foram adotadas para a otimizao do processo. Adicionalmente, o processo de Sacarificao e Fermentao Simultneas (SSF), tambm foi realizado. Em uma primeira etapa, foi desenvolvido um Planejamento Fatorial Fracionado PFF 241, seguido de um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR), para se estimar o efeito de cada varivel. As melhores concentraes de nutrientes para formulao do meio de cultivo, segundo o resultado predito pelo modelo foram: NaHCO3, 10,0 g/L; MgSO4, 3,0 g/L; Extrato de levedura, 2,0 g/L e KH2PO4, 5,0 g/L. Posteriormente, um Planejamento Fatorial Fracionado PFF 2 5-1 foi delineado para a avaliao das seguintes condies: concentrao de substrato, extrato de levedura, temperatura, agitao e pH. A validao das condies timas, em biorreator instrumentado, para produo de cido succnico a partir da frao hemicelulsica do bagao de cana-de-acar, resultou em uma concentrao final de produto igual a 40,3 g/L, com 80,0 g/L de concentrao inicial de xilose, sob agitao de 150 rpm a 37C. Finalmente, um modelo cintico simples para a produo de cido succnico a partir de glicose, incluindo os termos de inibio pelo substrato e pelo produto, foi proposto baseando-se em modelos encontrados na literatura. O perfil de crescimento celular da bactria A. succinogenes pode ser expresso por um modelo de Monod expandido, incorporando a inibio causada pela concentrao de glicose e pelos cidos orgnicos (metablitos secundrios) acumulados durante a fermentao. Com outros modelos elaborados, como o de Andrews, Levenspiel e Luedeking-Piret foi obter condies para descrever a formao do produto e o perfil de subprodutos. Em todos os casos, as simulaes do modelo mostraram-se satisfatrias e de acordo com os dados experimentais, sendo possvel facilitar a compreenso do aspecto cintico da fermentao durante a converso em cido succnico. O modelo proposto pode ser til para o desenvolvimento e o aperfeioamento dos processos para a produo de cido succnico a partir de fontes renovveis.

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ABSTRACT

BORGES, Elcio Ribeiro. Development of a process for succinic acid production by Actinobacillus succinogenes. Supervisor: Nei Pereira Jr. High School of Federal University of Rio de Janeiro Brazil , 2011.

Nowadays the majority of succinic acid produced commercially is made by chemical synthesis. However, attention has been focused on microbial succinic acid production as an alternative to chemical synthesis. This work aims at defining a strategy for succinic acid production by Actinobacillus succinogenes from the hemicellulose hydrolysate of sugarcane bagasse. Additionally, the Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) has been processed. In a first approach, three sequencial experimental designs were performed for optimizing the succinic acid production. The first experiment consisted of a 241 fractional factorial design, and the second entailed a Central Composite Rotational Design so as to achieve optimal conditions. The optimal concentrations of nutrients predicted by the model were: NaHCO3, 10,0 g/L; MgSO4, 3,0 g/L; yeast extract, 2,0 g/L; KH2PO4. 5,0 g/L; wich these were experimentally validated. In the third experiment, the fermentation was carried out using a two-level fractional factorial design 25-1. The variables analyzed and their levels were: concentration of substrate; yeast extract, temperature, pH and agitation. Under the best conversion conditions, as determined by statistical analysis, the production of succinic acid was carried out bachwise in an instrumented bioreactor using sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate, yielding a concentration of 40,3 g/L, with 80,0 g/L of initial concentration, at temperature 37C and orbital agitation at 150rpm. Finally, the kinetic model was performed for succinic acid production by Actinobacillus succinogenes, based on models told in the researches, that use conditions for substrate and product inhibitions. The growth of Actinobacillus succinogenes strain could be showed by a modified Monod model incorporating inhibitions effects of substrate and products in the fermentation. In agreement with the literature, several models were able to describe the formation of organic acids presents during fermentation process. In all analyse, the kinetic model simulation showed a great adjustment with the experimental observations. The proposed model can be useful for the development and optimization of succinic acid production process, contributing to the subsequent studies.

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SMARIO AGRADECIMENTOS........................................................................................................ VII RESUMO ......................................................................................................................... VIII ABSTRACT........................................................................................................................ IX SMARIO ...........................................................................................................................X CAPTULO 1 .......................................................................................................................1 APRESENTAO DO TEMA DA TESE..............................................................................1 CAPTULO 2 .......................................................................................................................6 REVISO BIBLIOGRFICA................................................................................................6

2.1. cidos orgnicos......................................................................................................7 2.1.1. Aspectos histricos ...........................................................................................8 2.1.2. Comercializao................................................................................................8 2.1.3. cidos orgnicos como blocos de construo.................................................12

2.2. cido succnico ......................................................................................................15 2.2.1. Aplicaes do cido succnico.........................................................................16 2.2.2. Biopolmeros, bioplsticos e plsticos biodegradveis ....................................20 2.2.2.1. O Potencial das inovaes de base biotecnolgica em biopolmeros...........23

2.3. Aspectos mercadolgicos da produo mundial de cido succnico ......................24 2.4. Processos de produo de cido succnico ...........................................................26

2.4.1. Rota qumica ...................................................................................................26 2.4.2. Rota fermentativa ...........................................................................................27 2.4.2.1. Matrias-primas utilizadas na produo de cido succnico .........................28 2.4.3. Materiais lignocelulsicos................................................................................30 2.4.3.1. Celulose .......................................................................................................32 2.4.3.2. A Lignina ......................................................................................................33 2.4.3.3. A Frao Hemicelulsica..............................................................................33 2.4.4. Materiais lignocelulsicos e o contexto de biorrefinaria...................................34 2.4.5. Bagao de cana-de-acar .............................................................................35 2.4.6. Tipos de Pr-Tratamento.................................................................................36 2.4.6.1. Pr-tratamento cido ....................................................................................38 2.4.6.1.1. Inibidores do processo de fermentao.....................................................39 2.4.6.1.2. Processos de Destoxificao.....................................................................40 2.4.6.1.3. Pr-tratamento alcalino .............................................................................41 2.4.6.1.4. Hidrlise enzimtica da celulose ...............................................................41 2.4.7. Sacarificao e fermentao simultneas (SSF) .............................................44 2.4.8. Sacarificao com co-fermentao simultneas (SSCF).................................45 2.4.9. Microrganismos produtores de cido succnico..............................................46 2.4.9.1. Metabolismo na produo de cido succnico ..............................................49

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2.5. Processos de recuperao e purificao de cidos orgnicos ...............................52 2.5.1. Processos de separao e recuperao de cido succnico ...........................53

2.6. Modelagem e Simulao de Processos .................................................................56 2.6.1. Modelagem de Processos Biotecnolgicos .....................................................57 2.6.2. Modelos cinticos de crescimento microbiano ................................................61 2.6.3. Mtodos matemticos utilizados para a resoluo dos modelos ....................65 2.6.3.1. Mtodo dos resduos ponderados ...............................................................65 2.6.3.2. Mtodo de Colocao Ortogonal .................................................................65 2.6.3.3. Mtodo das Linhas .......................................................................................65 2.6.3.4. Mtodo de Runge-Kutta ...............................................................................65 2.6.3.5. Planejamento Experimental..........................................................................66

2.7. Estratgias de fermentao para a produo de cido succnico ..........................67 2.8. Consideraes gerais.............................................................................................72

CAPTULO 3 .....................................................................................................................74 JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS......................................................................................74

3.1. Justificativa.............................................................................................................74 3.2. Objetivo geral .........................................................................................................75

3.2.1. Objetivos especficos.......................................................................................76 CAPTULO 4 .....................................................................................................................77 MATERIAIS E MTODOS.................................................................................................77

4.1. Esterilizao das vidrarias e do meio de cultivo .....................................................78 4.2. Material microbiolgico...........................................................................................78

4.2.1. Microrganismo utilizado...................................................................................78 4.2.2. Manuteno do microrganismo .......................................................................78 4.2.3. Observao microscpica ...............................................................................79

4.3. Meios empregados para ativao, propagao e fermentao ..............................79 4.3.1. Meio de ativao para obteno do pr-inculo .............................................79 4.3.2. Inculo.............................................................................................................80 4.3.3. Meios de Fermentao....................................................................................82 4.3.4. Processo de propagao mediante aclimatao celular..................................83

4.4. Processos de fermentao em frascos agitados....................................................84 4.4.1. Fermentao em presena de CO2 na fase gasosa ........................................86

4.5. Avaliao da influncia da relao C:N no crescimento celular .............................87 4.5.1 Anlise estatstica ............................................................................................88

4.6. Planejamentos experimentais sequenciais para a otimizao................................88 4.6.1 Avaliao da influncia dos componentes do meio de fermentao (PFF) ......88 4.6.2. Delineamento Composto Central Rotacional...................................................89 4.6.3. Otimizao das condies de cultivo do processo atravs de PFF .................90

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4.6.4. Anlise estatstica ...........................................................................................90 4.7. Fermentao em biorreator instrumentado a partir de meio sinttico....................91 4.8. Fermentao em biorreator a partir da frao hemicelulsica................................92

4.8.1. Pr-tratamento cido.......................................................................................92 4.8.2. Fermentao em biorreator instrumentado......................................................92

4.9. Experimentos empregando a estratgia SSF ........................................................93 4.9.1. Pr-tratamento alcalino ...................................................................................93 4.9.2. Pr-hidrlise enzimtica ..................................................................................94 4.9.3. Processo SSF em biorreator ...........................................................................95

4.10. Desenvolvimento de um modelo para produo de cido succnico ....................95 4.10.1. Avaliao e estimao dos parmetros cinticos ..........................................96 4.10.2. Modelo para estimao dos parmetros........................................................98

4.11. Amostragem.........................................................................................................98 4.12. Mtodos Analticos ...............................................................................................99

4.12.1. Determinao de biomassa...........................................................................99 4.12.2. Determinaes quantitativas .......................................................................100 4.12.3. Medida do pH..............................................................................................101

4.13. Avaliao de resultados .....................................................................................101 4.13.1. Clculo de eficincia do processo ...............................................................101 4.13.2. Taxa instantnea especfica de crescimento microbiano ............................101 4.13.3. Tempo de duplicao ..................................................................................102 4.13.4. Variveis de Resposta................................................................................103

CAPTULO 5......................................................................................................................104 RESULTADOS E DISCUSSO ..............................................................................................104

5.1. Levantamento de informaes e panorama geral das pesquisas sobre AS .........105 5.2. Morfologia da linhagem Actinobacillus succinogenes...........................................107 5.3. Padronizao da metodologia para ativao celular e preparo de inculo ...........108

5.3.1. Cultivo de ativao em meio sinttico ...........................................................108 5.3.2. Cultivo de crescimento para obteno de inculo .........................................109 5.4. Processo de fermentao mediante estratgias de aclimatao celular ..............112 5.5. Avaliao do efeito da fonte de carbono e influncia da relao C:N ..................115 5.6. Planejamentos experimentais seqenciais para otimizao do processo ............119

5.6.1. Planejamento Experimental Fatorial Fracionado PFF 24-1 .............................119 5.6.2. Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) ...................................125

5.7. Planejamento Experimental Fatorial Fracionado PFF25-1 .....................................134 5.8. Ensaios experimentais em biorreator ...................................................................142

5.8.1. Formao de Subprodutos ............................................................................158 5.9. Avaliao da produo de cido succnico pelo processo SSF ...........................160

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5.10. Evoluo dos experimentos desenvolvidos na produo de cido succnico .....166 5.11. Comparao entre os processos a partir do hidrolisado hemicelulsico e SSF .168 5.12. Desenvolvimento de um modelo para produo de cido succnico ..................170

5.12.1. Classificao do perfil para o crescimento celular .......................................170 5.12.2. Classificao para o perfil de formao de produto e subprodutos .............175 5.12.3. Classificao do perfil de consumo de substrato.........................................175

5.13. Consideraes finais ..........................................................................................176 CAPTULO 6......................................................................................................................178 CONCLUSES ...................................................................................................................178

6.1. Concluses ..........................................................................................................178 6.2. Sugestes ............................................................................................................181

CAPTULO 7......................................................................................................................182 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .........................................................................................182

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LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1. Estrutura qumica do cido succnico............................................................................... 16 Figura 2.2. Produtos obtidos a partir do cido succnico ................................................................... 19 Figura 2.3. Polisteres alifticos e aromticos. .................................................................................. 21 Figura 2.4. Estruturas possveis para os copolmeros PET-co-PES.................................................. 23 Figura 2.6. Principais matrias-primas glicdicas e seus substratos correspondentes...................... 30 Figura 2.7. Polmeros constituintes do material lignoceulsico.......................................................... 30 Figura 2.8. Disposio das molculas de glicose......................................................................... 32 Figura 2.9. lcoois precursores da lignina ......................................................................................... 33 Figura 2.11. Esquema simplificado das rotas tecnolgicas (Biorrefinarias)....................................... 35 Figura 2.12. Enzimas envolvidas na hidrlise da celulose. ................................................................ 42 Figura 2.13. Diagrama de blocos do processo SSF........................................................................... 44 Figura 2.14. Diagrama de blocos do processo SSCF. ....................................................................... 45 Figura 2.15. Via bioqumica para sntese de succinato, por E. coli.................................................... 50 Figura 2.16. Metabolismo de A. succiniciproducens e A. succinogenes............................................ 51 Figura 2.17. Transporte de diferentes espcies atravs de uma membrana..................................... 53 Figura 2.18. Processo de separao e purificao de cido succnico ............................................. 54 Figura 2.19. Esquema de funcionamento de membranas bipolares de eletrodilise.......................... 55 Figura 2.20. Diagrama de blocos da produo de cidos orgnicos por fermentao...................... 55 Figura 2.21. Resumo de alguns parmetros, fenmenos e interaes dos estudos cinticos.......... 58 Figura 2.22. Classificao dos modelos matemticos ....................................................................... 59 Figura 2.23. Padres cinticos de crescimento celular e formao de produtos............................... 64 Figura 4.1. Esquema representativo das estratgias para a padronizao do inculo ..................... 81 Figura 4.2. Metodologia para propagao celular.. ............................................................................ 83 Figura 4.3. Esquema ilustrativo geral para crescimento celular e produo de cido succnico....... 85 Figura 4.4. Esquema ilustrativo do sistema de adio de CO2 .......................................................... 86 Figura 4.5. Biorreator BIOFLO III (New .Brunswick) utilizado na produo de cido succnico ........ 91 Figura 4.6. Etapas do pr-tratamento cido do bagao de cana-de-acar ...................................... 92 Figura 4.7. Etapas do pr-tratamento alcalino ................................................................................... 93 Figura 4.8. Aspecto da celulignina aps a pr-hidrlise enzimtica, em frascos agitados ............... 94 Figura 4.9. Celulignina aps a pr-hidrlise enzimtica, em biorreator ............................................ 94 Figura 4.10. Diagrama de blocos para o tratamento das amostras. .................................................. 99 Figura 4.11. Cromatograma tpico com identificao dos cidos orgnicos .................................... 101 Figura 5.1. Nmero de patentes e trabalhos publicados, at 2010.......................................... 105 Figura 5.2. Peridicos com maior nmero de publicaes e os temas mais estudados, at 2010 . 106 Figura 5.3. Observao microscpica das linhagens Actinobacillus succinogenes ....................... 107 Figura 5.4. Cintica de crescimento do cultivo de ativao da bactria A. succinogenes .............. 109 Figura 5.5. Cintica de crescimento do inculo em meio sinttico (xilose)...................................... 110 Figura 5.6. Cintica de crescimento do inculo em meio sinttico (glicose).................................... 110

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Figura 5.7. Cintica de crescimento do inculo contendo hidrolisado hemicelulsico diludo......... 111 Figura 5.8. Cintica de fermentao de em meio sinttico .............................................................. 112 Figura 5.9. Perfil de crescimento celular a partir das estratgias de propagao celular................ 113 Figura 5.10. Efeitos de diferentes fontes de carbono na produo de biomassa ........................... 115 Figura 5.11. Produo de biomassa em meio, com xilose, em diferentes razes C:N.................... 116 Figura 5.12. Produo de biomassa em meio, com glicose, em diferentes razes C:N.................. 116 Figura 5.13. Efeitos de diferentes fontes de carbono na concentrao de AS ................................ 118 Figura 5.14. Efeitos de diferentes fontes de carbono na concentrao de AS (histograma)........... 118 Figura 5.15. Histograma de influncia das variveis e suas interaes, do PFF 24-1 ..................... 123 Figura 5.16. Diagrama de Pareto para o efeito estimado das variveis ......................................... 124 Figura 5.17. Superfcie de resposta mostrando o efeito da interao entre as variveis. ............... 125 Figura 5.18. Histograma de influncia das variveis e suas interaes, para o DCCR................... 131 Figura.5.19.Superfcie de resposta dos efeitos combinados (DCCR) para xilose ........................... 132 Figura.5.20.Superfcie de resposta dos efeitos combinados (DCCR) para glicose.. ....................... 133 Figura 5.21. Diagrama de Pareto para os efeitos estimados pelo PFF 2 5-1 (24h) .......................... 139 Figura 5.22. Diagrama de Pareto para os efeitos estimados pelo PFF 2 5-1 (48h) .......................... 140 Figura 5.23. Superfcie de resposta da concentrao de cido succnico a partir de glicose ......... 141 Figura 5.24. Superfcie de resposta da concentrao de cido succnico a partir de xilose ........... 141 Figura 5.25. Fermentao em meio sinttico, com 22,0 g.L-1 de xilose........................................... 143 Figura 5.26. Fermentao em meio sinttico de composio definida aps otimizao. ................ 145 Figura 5.27. Fermentao do hidrolisado hemicelulsico, com 22,0 g.L-1 de xilose........................ 146 Figura 5.28. Fermentao em meio sinttico, com 52,0 g.L-1 de xilose........................................... 148 Figura 5.29. Fermentao em meio sinttico de composio definida aps otimizao ................. 149 Figura 5.30. Fermentao do hidrolisado hemicelulsico, com 52,0 g.L-1 de xilose........................ 151 Figura 5.31. Fermentao em meio sinttico, com 80,0 g.L-1 de xilose........................................... 152 Figura 5.32. Fermentao em meio sinttico de composio definida aps otimizao ................. 154 Figura 5.33. Fermentao do hidrolisado hemicelulsico, com 80,0 g.L-1 de xilose ........................ 155 Figura 5.34. Concentrao final de produto e subprodutos do processo SSF ................................ 161 Figura 5.35. Perfil cintico do processo SSF, em frascos agitados. ................................................ 162 Figura 5.36. Perfil cintico do processo de fermentao, em biorreator.......................................... 163 Figura 5.37. Perfil cintico do processo SSF com concentrao de glicose igual a 81,0 g.L-1........ 164 Figura 5.38. Evoluo da produo de cido succnico com o decorrer do trabalho ...................... 168 Figura 5.39. Avaliao dos efeitos da concentrao inicial de glicose sob a tx de cresc ................ 172 Figura 5.40. Perfil cintico de formao de cido succnico, crescimento celular e consumo de substrato (glicose). ........................................................................................................................... 173 Figura 5.41. Perfil cintico da formao dos cidos actico, frmico e ltico .................................. 174

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LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1. Pontos de ebulio, frmulas moleculares e constantes (Ka) . ..............................................7 Tabela 2.2. Ano de descoberta e/ou isolamento de alguns cidos orgnicos ..........................................8 Tabela 2.3. Blocos primrios produzidos por rota fermentativa ou qumica ............................................13 Tabela 2.4. Candidatos em potencial como blocos de construo ..........................................................13 Tabela 2.5. Valores de produtividade e rendimento de alguns cidos orgnicos...................................14 Tabela 2.6 . Caractersticas do cido succnico .......................................................................................16 Tabela 2.7. Composio de resduos agro-industriais .............................................................................31 Tabela 2.8. Constituintes bsicos de alguns materiais lignocelulsicos ..................................................31 Tabela 2.9. Parmetros para aplicao de processos de separao ......................................................53 Tabela 2.10. Tipos de modelos usados em processos microbianos........................................................59 Tabela 2.11. Modelos cinticos no estruturados . ..................................................................................62 Tabela 2.12. Modelos para formao de produto metablico inibitrio....................................................64 Tabela 2.13. Valores encontrados e calculados para diferentes estratgias de fermentao.................68 Tabela 4.1. Meio de manuteno (TSA)...................................................................................................79 Tabela 4.2. Composio do meio utilizado para pr-inculo....................................................................79 Tabela 4 3. Composio do meio de crescimento utilizado para inculo ................................................82 Tabela 4.4. Composio do meio sinttico para fermentao .................................................................82 Tabela 4.5. Composio qumica do meio lquido com diferentes razes C:N........................................87 Tabela 4.6. Parmetros e nveis usados no PFF 24-1...............................................................................89 Tabela 4.7. Parmetros e nveis usados no DCCR..................................................................................90 Tabela 4.8. Variveis analisadas no PFF e nveis codificados e reais. ...................................................90 Tabela 4.9. Composio do meio de fermentao, aps estudos de otimizao....................................91 Tabela 4.10. Condies operacionais do cromatgrafo .........................................................................100 Tabela 4.11. Condies operacionais do cromatgrafo (cidos orgnicos) ..........................................101 Tabela 5.1. Parmetros relevantes nos processos de propagao de clulas de A. succinogenes. ...111 Tabela 5. 2. Variveis de Resposta na Avaliao do Efeito da Aclimatao........................................114 Tabela 5.3. Influncia da concentrao inicial de substrato e da razo C:N no crescimento celular. ..117 Tabela 5.4. Matriz experimental do PFF 24-1 e concentrao final de cido succnico, para xilose......119 Tabela 5.5. Matriz experimental do PFF 24-1 e concentrao final de cido succnico, para glicose....120 Tabela 5.6. Anlise de varincia (ANOVA), no PFF 241 para xilose como fonte de carbono..............122 Tabela 5.7. Anlise de varincia (ANOVA), no PFF 241 para glicose como fonte de carbono............122 Tabela 5.8. Matriz experimental do DCCR investigando os efeitos dos nutrientes do meio (xilose) ....127 Tabela 5.9. Matriz experimental do DCCR investigando os efeitos dos nutrientes do meio (glicose) ..128 Tabela 5.10. Anlise de varincia (ANOVA) para xilose como fonte de carbono.................................129 Tabela 5.11. Anlise de varincia (ANOVA) para glicose como fonte de carbono...............................130 Tabela 5.12. Matriz experimental do planejamento fatorial fracionado PFF 25-1 para glicose ..............135 Tabela 5.13. Matriz experimental do planejamento fatorial fracionado PFF 25-1 para xilose ................135 Tabela 5.14. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 glicose (24h)................136

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Tabela 5.15. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 xilose(24h)...................137 Tabela 5.16. Efeitos estimados do p lanejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 para glicose (48h) ......138 Tabela 5.17. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 para xilose (48h)..........138 Tabela 5.18. Variveis de resposta obtidos para meio sinttico e hidrolisado hemicelulsico..............157 Tabela 5.19. Concentrao final de produto e subprodutos dos processos de fermentao ..............159 Tabela 5.20. Variveis de resposta e concentrao de produto e subprodutos pelo processo SSF. ..165 Tabela 5.21. Resultados finais e evoluo do processo para a produo de cido succnico ............167 Tabela 5.22. Produo de cido succnico a partir dos hidrolisados hemicelulsico e celulsico .......169 Tabela 5.23. Valores obtidos dos parmetros cinticos de fermentao..............................................171

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

SIGLAS

ABS: Absorvncia; AIE: Agncia Internacional de Energia; ANOVA: Anlise de varincia; ARD: Agro-industrie Recherches e Dveloppements; AS: cido succnico; AA: cido actico; AS: cido frmico; AL: cido ltico; ATP: Adenosina trifosfato; ATP: Adenosina trifosfato; ATP: Adenosina trifosfato; BHT: Butirolactona; CBH: Celobiohidrolases; CIP: Institut Pasteur Collection; CM: Concentrao mxima; CTA: Triacetato de celulose; DCCCF: Delineamento composto Central de Faces-centradas; DCCR: Delineamento Composto Central Rotacional; DNP: Diversified Natural Products; DOE: Departamento de Energias do EUA; DSP: Processo de Separao e Purificao; EBMP: Membranas bipolares de eletrodilise; ED: Eletrodilise; EDO: Equaes diferenciais ordinrias; EDP: Equaes diferenciais parciais; EL: Extrato de levedura; ELL: Extrao lquido-lquido; EMP: Embden-Meyerhof Pathway; EVOH: Copolmero de etileno e lcool vinlico; GL: Graus de Liberdade; GT: Grupo de trabalho; GT-6: Grupo de trabalho;

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CLAE: Cromatografia lquida de alta eficincia; IBGE: Instituto brasileiro de geografia e estatstica; IUPAC: Unio Internacional de Qumica Pura e Aplicada; IV: Infravermelho; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; LADEBIO: Laboratrio de Desenvolvimento de Bioprocessos-Departamento de Engenharia Qumica-Escola de Qumica/UFRJ; MAPA: Ministrio de Agricultura, Pecuria e Abastecimento; MBI: International, Myriant Technologies; MCG: Meio de Crescimento Guetler; MCL: Meio de Crescimento LADEBIO; MCT: Meio de Crescimento Triptona; MF: Microfiltrao; MQ: Mdia Quadrtica; NF: Nanofiltrao; OI: Osmose Inversa; P.E: Ponto de ebulio; P.F: Ponto de fuso; PA: Poliamida; PB: Plackett-Burman; PBS: Polibutilenosuccinato; PBT: Polibutilenotereftalado; PC: Pontos centrais; PCCell: Modelo e marca de membrana de eletrodilise(Electrodialysis Cell); PEP: Fosfoenolpiruvato; PES:Polisuccinato de etileno; PET: Polietileno tereftalato; PFF: Planejamento Experimental Fatorial Fracionrio; PFF: Planejamento Experimental Fatorial; PFF: Planejamento Fatorial Fracionrio; PHA: Polihidroxialcanoato; PIM: Polymer inclusion membranes; PROALCOOL: Programa Nacional do lcool; PST: Polisuccinato tereftalato; PVC: Poli (cloreto) de vinila; PVDC: Copolmero de cloreto de vinilideno; RSM: Superfcie de Resposta;

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SES: Succinato etileno succinato; SQ: Soma Quadrtica; TCA: Ciclo dos cidos tricarboxlicos; TCA: Ciclo dos cidos tricarboxlicos; TES: Tereftalato etileno succinato; TET: Tereftalato etileno tereftalato; THF: Tetrahidrofurano; TSA: Agar Triptona de Soja 500gr M/Difco TSA: Agar Triptona de Soja 500gr M/Difco; TSB: Caldo de Triptona de Soja - 500gr M/Difco; TSB: Caldo de Triptona de Soja - 500gr M/Difco; UF: Ultrafiltrao; UNICA: Unio de Agroindstria Canavieira de So Paulo

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NOMENCLATURA MATEMTICA

Ef: eficincia, expressa em porcentagem;

fd: fator de diluio empregado na soluo;

g: gramas; h: hora; Ka: constantes de dissociao cida; Kd: taxa de mortalidade especfica (h-1); Ki : constante de inibio do substrato (g/L); KS: constante de saturao do substrato (g/L); L: litro; mg: miligrama; MMAS: massa molecular do cido succnico; MMGl: massa molecular da glicose; mmol/L: milimol por litro; ms: coeficiente de manuteno energtic (g/g.h); P: concentrao de produto (g/L); P: concentrao final de cido succnico, g/L; PCRIT: concentrao crtica de produto (g/L); pH: potencial hidrogeninico; Po: concentrao inicial de cido succnico, g/L; QP: produtividade volumtrica em cido succnico, g/L.h; r

X : taxa de formao de biomassa (g/L.h); rSA : taxas de formao dos cidos succnico (g/L.h); S: concentrao final de substrato, g/L; So: concentrao inicial de substrato, g/L; T: temperatura, oC; td: tempo de duplicao, horas; tf: tempo de fermentao, horas; v/v: relao volume/volume; vvm: vazo de ar por volume de meio por minuto, min-1; X: concentrao final de biomassa, g/L; Xo: concentrao inicial de biomassa, g/L; YAA: fator de rendimento estequiomtrico para cido actico g/g; YAF: fator de rendimento estequiomtrico para cido frmico g/g; YAL: fator de rendimento estequiomtrico para cido ltico g/g;

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YP/S: fator de rendimento em produto por substrato consumido, g/g; YX/S: fator de rendimento em biomassa por substrato consumido, g/g; Z: Discrepncias quadrticas entre os dados experimentais e simulados

Letras gregas

max: taxa especfica mxima de crescimento (h-1); :::: taxa de crescimento especfico (h-1); AA: parmetro de formao de cido actico associado ao crescimento (g/g); FA: parmetro de formao de cido frmico associado ao crescimento (g/g); LA: parmetro de formao de cido ltico associado ao crescimento (g/g); SA: parmetro de formao de cido succnico associado ao crescimento (g/g); AA: parmetro de formao de cido actico no associado ao crescimento (g/g); FA: parmetro de formao de cido frmico no associado ao crescimento (g/g); LA: parmetro de formao de cido ltico no associado ao crescimento (g/g); AS: parmetro de formao de cido succnico no associado ao crescimento (g/g)

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CAPTULO 1 APRESENTAO DO TEMA DA TESE

Uma etapa fundamental para o desenvolvimento sustentvel de uma Sociedade a mudana da realidade dependente do petrleo para o uso abundante de recursos renovveis. Os impactos ambientais, decorrentes da queima de combustveis fsseis, representam uma realidade com a qual a Sociedade tem que conviver, controlar e se adaptar, necessitando de uma tomada de conscincia da importncia da questo e exigindo mudanas em muitos hbitos de consumo e comportamento (PEREIRA JR, 2010).

Grande parte dos especialistas sugere que, nos prximos anos, o petrleo se tornar mais escasso e consideravelmente mais caro do que nos dias atuais. Segundo o anurio Perspectiva de Energia Mundial (2010), as observaes descritas pela Agncia Internacional de Energia (AIE) indicam que sem a alterao da matriz energtica, os combustveis fsseis responderiam por 90% do aumento projetado na demanda mundial, at 2035. O crescimento da populao associado demanda por combustveis e produtos qumicos, tem aumentado a busca e o desenvolvimento para o uso mais diversificado de matria-prima renovvel (EMBREE et al., 2001; WILLKE & VORLOPO, 2004).

Neste contexto, a indstria qumica do sculo XXI ser obrigada a passar por uma completa reestruturao, recorrendo ao uso de recursos renovveis como matria-prima bsica e Biotecnologia para realizao de muitas transformaes qumicas (BRDTAC, 2002; NRC, 2000; WILKE, 2000).

A maior parte dos esquemas relacionados a uma indstria qumica a base de biomassa envolve um pequeno nmero de molculas intermedirias versteis, normalmente de baixa massa molar. Cada um destes intermedirios-base d origem a uma

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famlia de substncias qumicas derivadas, obtidas por meio de converses biolgicas ou, mais freqentemente, por reaes qumicas tradicionais, em um esquema muito similar ao que ocorre na indstria petroqumica atual (LYND et al., 1999). Nestes termos, um exemplo de intermedirio-base que tem sido bastante reportado na literatura o cido butanodiico, conhecido como cido succnico (WERPY & PETERSON, 2004). Sendo passvel de obteno por rota fermentativa, este cido tem o potencial para se tornar uma comoditie, produzido em larga escala, podendo se constituir na base para o fornecimento de uma srie de substncias intermedirias e produtos finais importantes na indstria qumica, principalmente de biopolmeros a partir de succinato, alm de ser um componente chave na produo de mais de 30 produtos comercialmete importantes, na indstria de alimentos, farmacutica e de cosmticos (MCKINLAY et al., 2007; ZEIKUS & JAIN, 1999; SONG & LEE, 2005).

Cabe ressaltar que o cido succnico pode substituir mais de 250 produtos qumicos derivados do benzeno, que conhecidamente carcinognico por todas as rotas de exposio (KERMANSHAHI et al., 2005). Somado a sua importncia como bloco de construo para o segmento industrial, uma vantagem adicional desta substncia qumica reside na sua produo por fermentao, a qual ocorre com consumo de CO2, fornecendo uma alternativa interessante para o problema de seqestro do carbono (VAN DER WERF & GUETLER, 1997).

A maioria dos cidos orgnicos existentes no mercado produzida via sntese qumica, gerando altos nveis de poluio. A evoluo do mercado mundial dos produtos derivados de matrias-primas agro-industriais est obrigando as empresas do Setor Qumico a incorporar novas tecnologias para alcanar maiores ndices de qualidade e eficincia. Na busca por produtos finais mais competitivos e rentveis, como por exemplo, cidos orgnicos e plsticos biodegradveis, o setor industrial vem sendo compelido a incorporar inovaes tecnolgicas, desenvolvimentos de novos sistemas produtivos e de equipamentos para processos que protejem o meio ambiente e gerem menor quantidade de poluentes (CORDOBA, 2001).

O Frum de Competitividade em Biotecnologia foi constitudo para definir as aes necessrias inscrio da rea de Biotecnologia entre as vrias opes estratgicas da Poltica Industrial, Tecnolgica e de Comrcio Exterior. O GT-6 vem avaliando o segmento da Biotecnologia Industrial e Outras Aplicaes, que tem como referncia a classificao de Biotecnologia Branca (White Biotechnology), como o setor que aplica recursos naturais para a produo industrial de bioprodutos de interesse comercial. As profundas alteraes ocorridas no setor agroindustrial com apropriao de novas tecnologias e a formao de grandes clusters de cadeia produtiva das culturas extensivas de soja, cana-de-acar e milho (produo de sementes ou mudas, plantio, colheita e beneficiamento) tm

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impulsionado a discusso sobre um novo modelo de indstria de transformao destas matrias-primas renovveis em produtos qumicos intermedirios e finais, atravs de modificaes fsicas, qumicas e biolgicas (PRADELLA, 2006).

Esse modelo pressupe integrao de processos e de fluxos de insumos, otimizao das utilidades industriais e da logstica de transporte, alto rendimento de converso, alta produtividade e ampla escala de produo, com a finalidade de reduzir custos, diversificar e flexibilizar a produo, para responder s demandas de mercado, modelo similar ao praticado pela indstria petroqumica. Por fazerem uso de matrias-primas de origem biolgica e possurem um forte componente de transformao bioqumica, prope-se o termo Biorrefinaria para designar os processos ou os arranjos industriais dessa natureza (PEREIRA JR, 2006).

As Biorrefinarias pertencem categoria dos agronegcios, devendo ser consideradas uma extenso da cadeia produtiva agrcola e, portanto, integradas fisicamente no processo de plantio, colheita, beneficiamento e transformao desses plantios. Dentro desta perspectiva, vrias categorias de produtos devem ser destacadas como candidatas potenciais para desenvolvimento do chamado comoditie de larga utilizao (RODRIGUEZ, 2006).

Do ponto de vista do balano energtico, as Biorrefinarias podem ser extremamente eficientes, uma vez que os resduos lignocelulsicos podem ser aproveitados para produo de energia, que ser consumida na unidade industrial, gerando tambm crditos de carbono, passveis de comercializao (PRADELLA et al., 2006). A cana-de-acar e seus residuos constituem-se em fontes de carbono de baixo custo que podem minimizar os custos de produo em relao aos seus sucedneos advindos de petrleo.

O bagao de cana-de-acar apresenta-se como um dos materiais lignocelulsicos com maior potencial para a obteno de diversos produtos de interesse comercial. A separao seletiva das fraes do material lignocelulsico de acordo com suas caractersticas qumicas e/ou dos produtos a serem obtidos, representa uma das estratgias a serem adotadas no campo da Biotecnologia.

Sendo a hemicelulose e a celulose, as principais fraes estruturais do bagao de cana, representando uma fonte potencial de xilose e glicose, respectivamente, o presente trabalho investiga o desenvolvimento de um processo para a produo de cido succnico, por uma linhagem de Actinobacillus succinogenes. Porm, a obteno desses acares requer a aplicao de tcnicas que permitam a sua extrao seletiva. No caso da extrao de xilose, so utilizadas diferentes metodologias de solubilizao e hidrlise, dentre as quais o pr-tratamento cido normalmente empregado (BETANCUR & PEREIRA JR, 2010).

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Este trabalho faz parte de uma das linhas de pesquisas desenvolvidas nos Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos Escola de Qumica/ UFRJ, sob a coordenao do Prof. Dr. Nei Pereira Jr., intitulada Valorizao de Resduos Lignocelulsicos para o Aproveitamento Integral de Biomassas Residuais por Via Biotecnolgica.

No que se refere produo internacional, o nmero de pesquisas vm se destacando, de forma gradativa, ao longo dos ltimos anos, com diferentes tipos de microrganismos. Em relao ao cenrio nacional, possvel constatar alguns trabalhos em andamento acerca da produo de cido succnico nas universidades de grande potencial.

Organizao do trabalho

O presente trabalho encontra-se estruturado em 7 captulos e uma seo final, intitulada Anexos, incluindo os artigos publicados em peridicos internacionais. O captulo dois apresenta a Reviso Bibliogrfica dos aspectos relevantes ao assunto tratado, ressaltando a importncia da produo de cido succnico e suas potenciais utilizaes, alm de abordar aspectos cientficos, tecnolgicos e econmicos. Neste captulo, tambm so descritos, de forma sucinta, alguns fundamentos da modelagem matemtica de processos biotecnolgicos, incluindo mtodos matemticos freqentemente utilizados para resoluo destes modelos, alm de tcnicas para otimizao e controle de processos.

No captulo trs, intitulado Justificativas e Objetivos, so apresentados os motivos que levaram ao desenvolvimento desta tese, bem como os objetivos especficos desenvolvidos.

O captulo quatro refere-se descrio dos Materiais e Mtodos utilizados para a execuo deste trabalho, como por exemplo, detalhamento das metodologias experimental e analtica adotadas, bem como das tcnicas de planejamento experimental para a anlise dos resultados.

Os Resultados e Discusso relativos s principais anlises conduzidas encontram-se no quinto captulo. Para a otimizao dos parmetros e condies de processo, foram desenvolvidos planejamentos seqenciais para a realizao dos experimentos com maior grau de confiabilidade. Foi avaliada a hierarquia de efeitos estimados sobre a varivel de resposta do processo, bem como apresentados os estudos iniciais dos parmetros cinticos para a modelagem do processo visando produo de cido succnico, mediante o estudo do comportamento microbiano durante a fermentao. No captulo seis so registradas as Concluses e Sugestes do presente trabalho.

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Por fim, as Referncias Bibliogrficas so apresentadas no stimo captulo, atravs das quais todas as informaes contidas nesse texto podero ser localizadas e, obtidos mais detalhes sobre seus registros.

Com o desenvolvimento da presente pesquisa, foram publicados (ANEXO) os seguintes trabalhos:

Lista de trabalhos publicados em perdicos indexados: 1. Borges, E.R. & Pereira Jr., N. Succinic acid production from sugarcane bagasse

hemicellulose hydrolysate by Actinobacillus succinogenes. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, v. 13, p. 1-11, 2010.

2. Borges, E.R.; Souza, L.B.R & Pereira Jr, N. Study of succinic acid production by Actinobacillus succinogenes. Jornal of Life Sciences, v. 4, p. 5-12, 2010.

Trabalhos completos em congressos nacionais: 1. Borges, E.R.; Souza, L.B.R & Pereira Jr., N. Uso de biomassas para produo de

cio succnico por Actinobacillus succinogenes. IX SHEB - Seminrio de Hidrlise Enzimtica e Biomassas, Maring-PR, 23 -27/11/2009.

2. Borges, E.R.; Souza, L.B.R. & Pereira Jr, N. Recuperao e purificao de cido succnico obtido por um processo biotecnolgico. XXXIV ENEMP - Congresso Brasileiro de Sistemas Particulados, Campinas SP, 18 a 21/10/09.

3. Borges, E.R.; Souza, L.B.R & Pereira Jr, N. Estudo das variveis de processo na produo de cido succnico por Actinobacillus succinogenes. XVII SINAFERM Simpsio Nacional de Bioprocessos, Natal RN.

4. Borges, E.R.; Souza, L.B.R. & Pereira Jr, N. Produo de cido succnico por Actinobacillus succinogenes a partir do hidrolisado da frao hemicelulsica do bagao de cana-de-acar. XVIII SINAFERM Simpsio Nacional de Bioprocessos, Caxias do Sul RS. 24 a 27/07/2011. Situao: Aceito

Participao em eventos 1. Borges, E.R.; Souza, L.B.R. & Pereira Jr, N. Influncias das Variveis de

Processo na Produo de cido Succnico por Actinobacillus succinogenes. XXXI Jornada Giulio Massarani de Iniciao Cientfica, Artstica e Cultural da UFRJ, Rio de Janeiro.

2. Borges, E.R.; Souza, L.B.R. & Pereira Jr, N. Influncia da Razo C:N no Crescimento Celular e Biossntese de Metablitos Durante a Produo de cido Orgnico. XXX Jornada Giulio Massarani de Iniciao Cientfica, Artstica e Cultural da UFRJ, Rio de Janeiro.

3. Borges, E.R. & Pereira Jr, N. Succinic Acid Production from Sugarcane Bagasse by Actinobacilus succinogene. 32nd Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals. 2010. Orlando/Flrida.

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CAPTULO 2 REVISO BIBLIOGRFICA

Neste captulo so apresentados os diferentes aspectos tericos referentes temtica abordada: cidos orgnicos de interesse industrial; o cido succnico e suas aplicaes no mercado; microrganismos produtores e aspectos de metabolismo; o bagao de cana como matria-prima para a produo do cido succnico; algumas caractersticas relevantes ao processo de aproveitamento do material lignocelulsico e consideraes importantes sobre o uso dos cidos orgnicos como intermedirios na produo de plsticos biodegradveis e como blocos de construo para a produo de substncias qumicas de interesse comercial.

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2.1. cidos orgnicos

Os cidos orgnicos so importantes para a indstria de transformao, principalmente a qumica, farmacutica e de alimentos. Podem ser comercializados, tanto como cidos (com relativo grau de pureza), ou na forma de sais deles derivados.

Ao contrrio das principais fermentaes de alimentos e de bebidas cujas origens remontam antiguidade, os processos de produo desses cidos s comearam a ser desenvolvidos nos ltimos cem anos. A primeira fbrica, para produo em larga escala de uma substncia qumica por fermentao, comeou a operar em 1881 em Massachusetts (EUA) para produo de lactato de clcio, empregando bactrias.

Com exceo do cido clordrico presente no suco gstrico, os cidos mais comuns com os quais convivemos so orgnicos, ou seja, queles contendo tomos de carbono. Destes, o maior grupo o dos cidos carboxlicos, que so os cidos caracterizados pela presena do grupo funcional (COOH), a carboxila (SNYDER, 1995). As propriedades, para alguns cidos carboxlicos, classificados como mono e dicarboxlicos, de acordo com o nmero de carboxila presente em sua estrutura qumicas, so apresentadas na Tabela 2.1 (SOLOMONS, 1996; HARRIS, 1999).

Tabela 2.1. Pontos de ebulio, frmulas moleculares e constantes de dissociao cida (Ka) de alguns cidos carboxlicos.

cidos monocarboxlicos Nome do cido (IUPAC/nome usual) Frmula molecular P.E/C Ka Metanico (frmico) HCOOH 100,5 1,80X10-4 Etanico (actico) CH3COOH 118 1,75x10-5 Propanco (propinico) CH3CH2COOH 141 1,34 x10-5 Butanico (butrico) CH3CH2CH2COOH 164 1,52 x10-5 Pentanico (valrico) CH3(CH2)3COOH 187 1,44 x10-5 Hexanico (caprico) CH3(CH2)4COOH 205 - Octanico (caprlico) CH3(CH2)6COOH 239 - Decanico (cprico, P.F. 31) CH3(CH2)8COOH 269 -

cidos dicarboxlicos

Butanodiico (succnico,P.F.187C) HOOC(CH2)2COOH 235 K = 6,2 x 10-5

K = 2,3 x 10-6

Pentanodiico (glutrico, P.F. 98 C) HOOC(CH 2)3COOH 303 K = 4,6 x 10-5

K = 3,7 x 10-6

Hexanodiico (adpico, P.F. 153 C) HOOC(CH 2)4COOH 340 K = 3,8 x 10-5

K = 3,8 x 10-6

Fonte: (SOLOMONS, 1996; HARRIS, 1999).

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A presena do grupo COOH confere aos cidos carboxlicos, entre outras propriedades, a de serem cidos fracos em meio aquoso e de apresentarem elevados pontos de ebulio devido facilidade com que formam interaes intermoleculares do tipo ligaes de hidrognio (LINTOMEN et al., 1990).

2.1.1. Aspectos histricos

A descoberta dos cidos orgnicos est intimamente relacionada ao desenvolvimento da qumica experimental. Neste contexto, Carl Wilhelm Scheele (1742-1786), um notvel qumico experimental sueco, desempenhou um papel primordial. Dentre os 15 a 20 mil experimentos atribudos a ele, esto as descobertas de compostos orgnicos de natureza cida (cidos carboxlicos e fenis), como os cidos tartrico (2,3dihidroxibutanodiico), mlico (2-hidroxibutanodiico), lctico (2-hidroxipropanico), oxlico (etanodiico), rico, glico (3,4,5-trihidroxibenzico) e ctrico (2-hidroxipropan-1,2,3-tricarboxlico) (FIORUCCI et al., 2002). Scheele fez uso de reaes e tcnicas que at ento estavam intimamente relacionadas com a Qumica Inorgnica (extraes por solventes, formaes de sais, diferenas de solubilidade). Uma atribuio destas descobertas e seus respectivos autores esto descritas na Tabela 2.2.

Tabela 2.2. Ano de descoberta e/ou isolamento de alguns cidos orgnicos e seus respectivo descobridores.

cido Data Pesquisador Fonte descoberta Frmico 1500 H. Brunschwigk Destilao por arraste de vapor de solues

contendo formigas Benzico 1556 M. Nostredame Sublimao da goma do benjoim (resina extrada do benjoeiro) Succnico 1600 Oswald Croll Sublimao do mbar (resina vegetal fssil) Tartrico 1770 C.W. Scheele Do resduo de fermentao do vinho Pcrico 1771 Peter Woulfe Do tratamento do ndigo com cido ntrico Oxlico 1760 J.C. Wiegleb Isolado do trevo azedo (oxalis) Oxlico 1776 C.W. Scheele Oxidao do acar com cido ntrico Ltico 1780 C.W. Scheele Fermentao do leite azedo rico 1780 C.W. Scheele Dos resduos da urina Ctrico 1784 C.W. Scheele Dos sucos de frutas ctricas Mlico 1785 C.W. Scheele Extrado do suco de ma Glico 1786 C.W. Scheele Das nozes da Gala

Fonte: (FIORUCCI et al., 2002)

2.1.2. Comercializao

Os cidos orgnicos apresentam muitas aplicaes nas indstrias qumica, farmacutica e alimentcia, com propriedades organolpticas importantes, tanto que o

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sabor azedo caracterstico foi o primeiro critrio para classificao destes compostos. Na indstria alimentcia, os cidos so adicionados por diferentes propsitos, aos alimentos. As funes mais importantes dessa adio so: conservantes devido participao em sistemas tampo, a habilidade de produzir um sabor azedo (onde o gerador o on hidrognio ou hidrnio - H3O+) e tambm, como acidulante, devido capacidade de modificar e intensificar o sabor de outros condimentos.

Como conservantes, atuam como sequestrantes de ons metlicos atravs do on carboxila, evitando a catlise de reaes de oxidao nos alimentos (GITIRANA, 2007). A adio de acidulantes comumente destinada s bebidas gasosas, principalmente aquelas s quais se procura dar sabor parecido ao das frutas; estas bebidas j apresentam leve teor cido, pelo CO2 que encerram em forma de cido carbnico (H2CO3). O pequeno grau de acidez dado pelos acidulantes faz com que estes sejam empregados como recursos de melhoria de sabores. Entre outros produtos em que os acidulantes so empregados, pode-se destacar: gelias artificiais, sorvetes, balas, ps para coberturas, produtos de confeitaria, etc. Os cidos orgnicos comumente usados na indstria de alimentos so os cidos: actico, ltico, ctrico, mlico, fumrico, succnico e tartrico (FENNEMA, 1985). Os cidos, frmico e actico tm cheiro intenso, irritante e paladar azedo. O cido fosfrico (H3PO4) o nico cido inorgnico empregado extensivamente como acidulante alimentar.

Os cidos de quatro a oito tomos de carbono tm odores desagradveis, como os cidos caprico (hexanico), caprlico (octanico) e cprico (decanico). Entretanto, em pequenas concentraes, os cidos carboxlicos so responsveis por muitas fragrncias. Os cidos, benzico, cinmico (3-fenil-2-propenico), mirstico (tetradecanico) e isovalrico (3-metilbutanico) esto presentes em leos essenciais, que so leos volteis, odorferos, de origem vegetal (SHREVE & BRINK, 1980).

Uma grande parte dos cidos orgnicos, oriundos de microrganismos, ou como intermedirios naturais em caminhos metablicos principais podem contribuir para o avano nas produes biotecnolgicas a partir de fontes renovveis. Por causa dos grupos funcionais dos cidos orgnicos, estas molculas so extremamente teis para a indstria qumica. Por exemplo, cido succinico poderia susbtituir o anidrido maleico, que possui um mercado bastante amplo na petroqumica (WERPY & PETERSEN, 2004).

Os cidos orgnicos so amplamente usados na indstria de alimentos como aditivos. Como agentes de processamento, so adicionados para controlar a alcalinidade de muitos produtos podendo agir como tampes ou simplesmente como agentes neutralizantes. Como conservantes, podem atuar desde agentes antimicrobianos at antioxidantes. Algumas caractersticas desses cidos orgnicos so abordadas a seguir:

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cido Metanico (frmico): causa do ardor das picadas de formiga, o mais simples dos cidos carboxlicos. Seu nome origina-se da palavra em Latim para formiga, formica.

cido Etanico (actico): o principal ingrediente do vinagre. Seu nome deriva do Latim acetum, que significa azedo. Conhecido e usado h tempos pela humanidade, usado como condimento e conservante de alimentos. A oxidao aerbica, por bactrias do gnero Acetobacter, do lcool a cido actico diludo (8%) um processo antigo, que produz o vinagre, uma soluo de cido actico aromatizada, obtida pela fermentao do vinho, da cidra, do malte ou do lcool diludo (SHREVE & BRINK, 1980). O cido actico para uso industrial e em laboratrios comercializado na forma de cido actico glacial (~99,5%), assim chamado porque em dias frios se solidifica com aspecto de gelo (P.F. 17 C). O cido actico o cido orgnico mais abunda nte, freqentemente utilizado como matria prima para se preparar outros produtos como steres acticos. Outra importante aplicao do cido actico como solvente para muitos processos industriais, como na fabricao de acetato de celulose e de produtos farmacuticos (SHI et al., 2005). Recentemente, muitos pesquisadores tm se esforado para determinar por que cidos orgnicos, como o cido actico funcionam como inibidores de crescimento de microrganismos patognicos e deteriorantes (JENSEN et al., 2003).

cido 2-acetoxibenzico (acetilsaliclico): conhecido como aspirina e empregado como antipirtico e analgsico, produzido pela reao de esterificao do cido saliclico (2-hidrxibenzico) com o anidrido actico (SHREVE e BRINK, 1980). O nome cido saliclico deriva do Latim e designa a rvore do salgueiro, salix. Os mdicos da Grcia Antiga conheciam as propriedades antipirticas e redutoras da febre, da casca desta rvore. Em 1829, o qumico francs Henri Leroux isolou da casca do salgueiro, o composto ativo na forma pura, a salicina, que uma molcula estruturalmente semelhante aspirina (SNYDER, 1995).

cido 2-hidroxi-1,2,3-propanotricarboxlico (ctrico): o responsvel pela acidez de frutas ctricas. Para emprego industrial, o cido ctrico fabricado pela fermentao aerbica do acar bruto (sacarose) ou acar de milho (dextrose) por uma linhagens especiais de Aspergillus niger. Seu maior emprego como acidulante em bebidas carbonatadas e alimentos. No campo mdico, empregado na fabricao de citratos e de sais efervescentes (SHREVE & BRINK, 1980).

cido etanodiico (oxlico): um cido dicarboxlico txico e presente em plantas, como espinafre e azedinhas. Embora a ingesto de cido oxlico puro seja fatal, seu teor na maioria das plantas comestveis muito baixo para apresentar um risco srio (SNYDER, 1995). um bom removedor de manchas e ferrugem, sendo usado em vrias preparaes comerciais de limpeza. Alm disso, a grande maioria dos clculos renais

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constituda pelo oxalato de clcio monohidratado, um sal de baixa solubilidade derivado deste cido. Seu nome (do Latimoxalis) resulta do seu primeiro isolamento do trevo azedo (Oxalis acetosella).

cido propanico (propinico): um cido monocarboxlico, saturado, de cadeia aberta, que apresenta um odor pungente, aroma e sabor suave, podendo ser usado como aromatizante (HEATH, 1978). O cido propanico o responsvel pelo cheiro caracterstico do queijo suo (SNYDER, 1995). Durante o perodo principal de maturao deste tipo de queijo, Propionibacterium shermanii e microrganismos similares, convertem cido ltico e lactatos aos cidos propinico e actico e a dixido de carbono. O gs CO2 gerado responsvel pela formao dos buracos caractersticos do queijo suo. Suas molculas se atraem por pontes de hidrognio e, solvel em gua, em qualquer proporo. O cido propinico e seus sais so amplamente usados como matria-prima em diferentes indstrias. Os steres do cido propinico so usados na indstria de perfumes e propionato de celulose utilizado na indstria de plsticos (GOSWAMI & SRIVASTAVA, 2000).

cido butanico (butrico): seu nome deriva do Latim butyrum, que significa manteiga; fornece um odor peculiar rancidez da manteiga. usado na sntese de aromas, em frmacos e em agentes emulsificantes (PARKER, 1997).

cido 2-hidroxipropanico (ltico): um hidrxicido carboxlico que contribui para o sabor de manteiga, e sua estrutura altamente polar com limitada volatilidade (FORSS & SUGISAWA, 1981). largamente distribudo na natureza, e comercialmente disponvel, sob a forma de soluo aquosa que incolor, inodora, viscosa e no voltil. usado na indstria de alimentos para inibir a deteriorao de azeitonas curadas e para ajustar acidez na produo de queijos (ANTUNES & CANHOS, 1983). Pode ser produzido por meio da fermentao bacteriana da lactose, acar do leite, por Streptococcus lactis. Fabricado industrialmente pela fermentao controlada de hexoses de melao, milho e leite, empregado no curtimento de couros, e na indstria alimentcia, como acidulante. O cido ltico tambm produzido pelo corpo humano. Quando a glicose metabolizada pela atividade muscular anaerbica, o cido ltico gerado nos msculos e, ento, decomposto (oxidado totalmente) a CO2 e H2O (LEHNINGER et al., 1995). Com o exerccio intenso, o cido ltico formado mais rapidamente do que pode ser eliminado. Esta acumulao transiente do cido ltico responsvel pela sensao de cansao e de dor muscular.

cido 2,4-hexadienico (srbico): encontrado em muitas plantas, e empregado como fungicida, conservante em alimentos e na manufatura de plsticos e lubrificantes (PARKER, 1997).

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cido pentanico (valrico): o responsvel pelo aroma do queijo Roquefort. Foi isolado pela primeira vez da raiz de uma valeriana (do Latim valere).

cido hexanodiico (adpico): um cido dicarboxlico. Seu nome vem do Latim adipem, que significa uma gordura, e reflete a observao de que o cido adpico uma das substncias formadas quando gorduras so oxidadas com cido ntrico. Sua importncia industrial est relacionada com a descoberta do nylon, um polmero de condensao, por Wallace H. Carothers e seus colaboradores, pesquisadores da empresa americana Du Pont. Eles descobriram que pela reao de polimerizao de uma mistura do cido adpico e 1,6-diaminohexano poderiam produzir o nylon (SNYDER, 1995; SHREVE & BRINK, 1980).

cido 3-oxo-L-gulofuranolactona (ascrbico): conhecido como vitamina C, tem seu nome qumico representando duas de suas propriedades: uma qumica e outra biolgica. Em relao primeira, um cido, embora este no pertena claramente classe dos cidos carboxlicos. Sua natureza cida em soluo aquosa deriva da ionizao de uma hidroxila de um dos grupos enlicos (pKa = 4,25) (DAVIES et al., 1991). Adicionalmente, o termo ascrbico representa seu valor biolgico na proteo contra a doena escorbuto, do Latim scorbutus (LEHNINGER et al., 1995).

2.1.3. cidos orgnicos como blocos de construo

Segundo o Departamento de Energia dos EUA (DOE) e a Comisso Europia, o cido succnico tm sido apontado como o cido orgnico de maior potencialidade acerca de uma variedade de aplicaes industriais. O mercado para este cido de aproximadamente 20.000 30.000 toneladas por ano, considerando a sua produo por rota qumica, a partir do anidrido maleico (KIDWELL, 2008). Compostos que apresentam uma ampla aplicao industrial, a partir dos quais se obtm uma srie de subprodutos, esto inseridos no conceito de blocos de construo, os quais constituem a base para o fornecimento de uma srie de substncias intermedirias e produtos finais, importantes na indstria qumica. (DELHOMME et al., 2009; WERPY et al., 2004).

As Tabelas 2.3 e 2.4, mostram a posio de destaque do cido succnico, em comparao com outros onze blocos de construo, obtidos por rota qumica ou biotecnolgica e os trinta candidatos que podem ser classificados e apresentados, de acordo com o nmero de carbono em sua estrutura e interesse industrial (PATEL et al., 2006). O interesse em processos de produo biotecnolgica vem sendo considerado uma alternativa vivel do ponto de vista ambiental, dentro do contexto de biorrefinaria. Com o crescente avano de processos acerca de produtos derivados de matrias-primas agro-industriais, vrios setores industriais se propem a alcanar maiores ndices de qualidade,

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com produtos finais mais competitivos e rentveis, como o cido succnico (DELHOMME et al., 2009) A produo de cidos orgnicos amplamente utilizada em escala industrial, sendo limitada a produo de cidos de origem microbiana, a qual vem apresentando vantagens econmicas sobre a sntese qumica destes compostos (MATTEY, 1992).

Tabela 2.3. Blocos primrios produzidos por rota fermentativa ou qumica

Blocos de construo cido succnico, fumrico e mlico

cido 2,5 furanodicarboxlico cido 3 hidrxipropinico

cido asprtico cido glucrico cido glutmico cido itacnico cido levulnico

3-hidrxibutirolactona

glicerol

sorbitol

Xilitol/ arabinitol Fonte: Top Value Added Chemicals from Biomass (DOE/GO-2006). U.S. Department of Energy

Tabela 2.4. Candidatos em potencial como blocos de construo

N de Carbono

Candidatos em potencial

1 Monxido de carbono & Hidrognio (gs de sntese) 2 nenh

producao de acido succinico por actinobacillus

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