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RIO DE JANEIRO 2012

PRODUÇÃO DE ÁCIDO PERÍLICO POR BIOCONVERSÃO DO LIMONENO

UTILIZANDO A LEVEDURA Yarrowia lipolytica.

OTIMIZAÇÃO DO BIOPROCESSO.

Roberta Trovão Santos

ROBERTA TROVÃO SANTOS

Aluna do Curso de Ciências Biológicas

Matrícula 0823800123

RIO DE JANEIRO 2012

Trabalho de Conclusão de Curso, TCC, apresentado ao Curso de Graduação em Ciências Biológicas, da UEZO como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas, sob a orientação da Doutora Maria Antonieta Ferrara.




iii

Elaborado por Roberta Trovão Santos

Aluna do Curso de Ciências Biológicas da UEZO

Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com

Grau:.....................

Rio de Janeiro, 16 de julho de 2012.

RIO DE JANEIRO 2012




Adriano Arnóbio, Mestre em Ciências Médicas Examinador I

Ronaldo Figueiró, Doutor em Ecologia Examinador II e Presidente

Sérgio Henrique Seabra, Doutor em Ciências Biológicas Suplente

Maria Antonieta Ferrara, Doutora em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos

Orientadora (Fiocruz/Farmanguinhos)

iv

Dedico este trabalho aos meus familiares.

v

Agradeço a Deus pela oportunidade de concluir o nível

superior, à minha família que sempre me apoiou e esteve

ao meu lado; ao meu noivo pela força e paciência nos

momentos difíceis; aos meus amigos que me ajudaram e

compreenderam minha ausência; à minha orientadora,

Drª Maria Antonieta Ferrara que sempre me forneceu

orientação segura para este trabalho e aos meus

colaboradores.

vi

Este trabalho faz parte de um projeto desenvolvido em

parceria entre Farmanguinhos – FIOCRUZ e o

Instituto de Química – UFRJ.

As análises de CG/DIC foram realizadas em

Farmanguinhos – FIOCRUZ.

O trabalho experimental foi desenvolvido no

laboratório de Tecnologia Enzimática (ENZITEC)

coordenado pela professora Elba P. S. Bon.

O trabalho foi financiado pelo Cnpq e pela Faperj.

vii

Resumo

O Brasil é o maior produtor e exportador de suco de laranja e durante sua

fabricação são gerados subprodutos como o óleo limoneno. Este óleo é amplamente

distribuído na natureza e estudos mostram sua eficácia no tratamento de algumas doenças,

mas a dosagem requerida seria muito alta tornando esse tratamento inviável. Por este

motivo seus derivados álcool e ácido perílico começaram a ser investigados. O álcool

perílico apresenta efetividade no tratamento de gliomas malignos recorrentes e outros tipos

de câncer. Seu uso terapêutico já evoluiu para ensaios clínicos em fase I/II. O ácido

perílico e derivados também têm sido reportados como possuindo atividade anticâncer e

antimicrobiana. Os processos de bioconversão oferecem vantagens técnicas, econômicas e

ambientais em comparação com a síntese química, como formação de produtos com

químio, régio e enantiosseletividade, menor formação de subprodutos, uso de condições

brandas de reação e baixo consumo de energia.

No presente trabalho utilizou-se um planejamento experimental para otimizar a

biotransformação do limoneno em ácido perílico através da levedura Yarrowia lipolytica.

Verificou-se a influência das variáveis temperatura, pH, limoneno, massa celular e

nutrientes para determinar quais possuem significância 1 através de um planejamento

fatorial fracionado. A maior produção de ácido perílico (1216,8 mg/L) foi obtida na

temperatura de 20°C, pH 7,2, concentração inicial de limoneno de 0,5% v/v, concentração

de células de 20 g/L e solução de nutrientes de 10% v/v. As variáveis massa celular,

concentração de limoneno e pH apresentaram significância nos níveis testados para

otimização da produção do ácido perílico.

Palavras-chave: Limoneno, biotransformação, Yarrowia lipolytica, ácido perílico, planejamento experimental.

viii

Abstract

Brazil is the largest producer and exporter of orange juice and during its

manufacture byproducts such as the mono terpene limonene are generated. This oil is

widely distributed in nature and studies show its effectiveness in treating some diseases,

but the dosage required would be very high making suchtreatment unfeasible. For this

reason its derivatives perillyl alcohol and perillic acid began to be investigated. The perillyl

alcohol presents effectiveness in the treatment of recurrent malignant gliomas and other

types of cancer. Its therapeutic use has progressed to clinical trials in phase I / II. Perillyl

acid and its derivatives have also been reported as having antimicrobial and anticancer

activity. The bioconversion processes offer technical, economic and environmental

advantages when compared to chemical synthesis, such as chemo, region and

enantioselectivity, less formation of byproducts, use of milder reaction conditions and low

energy consumption.

In this study an experimental design was performed to optimize the

biotransformation of limonene to perillyl acid using the yeast Yarrowia lipolytica. The

influence of temperature, pH, limonene, cell mass and nutrients was evaluated through a

fractional factorial design. The highest yield of perillyl acid (1216.8 mg / L) was obtained

at 20 °C, pH 7.2, initial concentration of limonene 0.5% v / v, cell concentration of 20 g / L

and nutrient solution 10% v /v. The variables cell mass, limonene concentration and pH

were significant at the levels tested to optimize the production of perillyl acid.

Keywords: Limonene, biotransformation, Yarrowia lipolytica, perillyl acid, experimental

design.

ix

SUMÁRIO

Página RESUMO .............................................................................................................. vii ABSTRACT........................................................................................................... viii 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1

1.1 Limoneno..................................................................................................... 2 1.2 Derivados perílicos ..................................................................................... 3 1.3 Microrganismo............................................................................................ 4 1.4 Bioprocesso.................................................................................................. 5 1.5 Justificativa.................................................................................................. 6

2. OBJETIVOS...................................................................................................... 7 2.1 Objetivo geral.............................................................................................. 7 2.2 Objetivo específico..................................................................................... 7

3. METODOLOGIA ............................................................................................ 8 3.1 Microrganismo............................................................................................ 8 3.2 Bioconversão............................................................................................... 8 3.3 Planejamento fatorial fracionado.............................................................. 8 3.3.1 Planejamento experimental I............................................................... 9 3.3.2 Planejamento experimental II............................................................. 10 3.4 Metodologia analítica.................................................................................. 11

3.4.1 Quantificação da massa celular, dosagem de glicose e determinação do pH............................................................................................................ 11 3.4.2 Análise por cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de chama (CG/DIC)..................................................................... 11

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................ 12 4.1 Planejamento experimental I.................................................................... 12 4.1.1 Etapa de crescimento celular.............................................................. 12 4.1.2 Etapa de bioconversão......................................................................... 12

4.1.3 Análise de terpenos por Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização de Chama (CG/DIC).................................................................... 13 4.1.4 Análise estatística............................................................................... 14

4.2 Planejamento experimental II.................................................................. 15 4.2.1 Etapa de crescimento celular.............................................................. 15

4.2.2 Etapa de bioconversão......................................................................... 15 4.2.3 Análise de terpenos por Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização de Chama (CG/DIC).................................................................... 16 4.2.4 Análise estatística................................................................................ 18

5. CONCLUSÃO..................................................................................................... 19 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 20

x

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Porcentagem dos rendimentos de suco e dos principais subprodutos da indústria do suco de laranja.............................................................................................................. 1

Figura 2. Estrutura química do limoneno......................................................................... 2

Figura 3. Estrutura química do limoneno e de seus derivados perílicos.......................... 3

Figura 4. Microscopia óptica da Y. lipolytica................................................................... 4

Figura 5. Gráfico indicando os setores industriais que utilizam a biotransformação...... 5

Figura 6. Gráfico da concentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limoneno (delineamento fatorial fracionado 25-1).................................................... 13

Figura 7. Gráfico de pareto indicando os valores de significância de p para as variáveis testadas em 24h............................................................................................................... 14

Figura 8. Gráfico de pareto indicando os valores de significância de p para as variáveis testadas em 48h............................................................................................................... 15

Figura 9. Gráfico da concentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limoneno (delineamento fatorial fracionado 24-1).................................................. 18

Figura 10. Gráfico de Pareto indicando os valores de significância de p para as variáveis testadas em 24h............................................................................................................. 19

Figura 11. Gráfico de Pareto indicando os valores de significância de p para as variáveis testadas em 48h............................................................................................................. 19

xi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Desenho de triagem de Placket-Burman utilizado para determinar os parâmetros

significativos estatisticamente (planejamento fatorial fracionado 25-1)......................... 9

Tabela 2. Desenho de triagem de Placket-Burman utilizado para determinar os parâmetros

significativos estatisticamente (planejamento fatorial fracionado 24-1).......................... 10

Tabela 3. Valores de pH e glicose correspondente a cada amostra em t=0, t=24 e t=48h do

planejamento experimental I........................................................................................... 12

Tabela 4. Valores de pH e glicose nas amostras iniciais e após 24 e 48 horas de

bioconversão do limoneno do planejamento experimental II....................................... 16

Tabela 5. Concentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limoneno

(delineamento fatorial fracionado 24-1)........................................................................ 17

1. INTRODUÇÃO

O maior produtor e exportador

década de 80 é o Brasil, produzindo mais de 50% do volume mundial e exportando 98% de

sua produção, conforme dados da

sucos cítricos (www.citrusbr.com.br)

subprodutos com valor comercial são obtidos e

e o farelo de polpa cítrica (RODRIGUES, 2006

óleos essenciais para uso em indústrias alimentícias e farmacêuticas.

apresentar compostos com atividade biológica, como limonóides e seus glicosídeos, que

causaram a inibição de tumores cancerígen

(REDA et al., 2005). A figura 1 apresenta

subprodutos da indústria do

Figura 1- Porcentagem dos rendimentos

e exportador de suco de laranja industrializado

produzindo mais de 50% do volume mundial e exportando 98% de

, conforme dados da CitrusBR - Associação Nacional dos

sucos cítricos (www.citrusbr.com.br). Durante o processo de fabricação

com valor comercial são obtidos entre eles estão os óleos essenciais, limoneno

(RODRIGUES, 2006). Uma alternativa rentável é a extração de

em indústrias alimentícias e farmacêuticas.


causaram a inibição de tumores cancerígenos induzidos em ratos, camundongos e ramsters

A figura 1 apresenta os rendimentos de suco e

indústria do suco de laranja.

Porcentagem dos rendimentos de suco e dos principais subprodutos da indústria do suco de laranjaFonte: http://laranjadositio.com.br/prop.php

industrializado do mundo desde a

produzindo mais de 50% do volume mundial e exportando 98% de

Associação Nacional dos Exportadores de

processo de fabricação do suco vários

estão os óleos essenciais, limoneno

Uma alternativa rentável é a extração de

Estes óleos podem


os induzidos em ratos, camundongos e ramsters

de suco e dos principais

principais subprodutos da indústria do suco de laranja.

1.1 Limoneno

O limoneno, 4-isoprenil

pertencente à família dos terpenos

(HUDES et al., 2000). É usado como ingrediente para sabor cítrico em óleos artificiais e

fragrâncias. Pode ser utilizado em tintas, resinas, bebidas não

(CHOW et al., 2002).

O isômero S-(-)-limoneno é principalmente encontrado numa variedade de plantas e

ervas como Mentha spp, enquanto

das cascas de limão e laranja e do óleo essencial

prevenção da desidratação e inibição de crescimento microbiano suas funções naturais nos

vegetais (DEMYTTENAERE

Desde a década de 80, o limoneno é reconhecido como um agente com ações

quimiopreventivas e quimioterapêuticas (OLIVEIRA, 2010

durante a iniciação e a produção da carcinogênese em diversos tumores (

2002) e pode estar relacionado à inibição da isoprenilação de proteínas da família G,

incluindo membros da famíli

considerado um potencial

utilidade clínica e seus m

investigados (BOIK, 2001).

isoprenil-1-metil-ciclo-hexeno, é um monoterpeno monocíclico

pertencente à família dos terpenos encontrado em frutas cítricas, como laranja e limão

, 2000). É usado como ingrediente para sabor cítrico em óleos artificiais e

Pode ser utilizado em tintas, resinas, bebidas não-alcóolicas, sor

limoneno é principalmente encontrado numa variedade de plantas e

spp, enquanto R-(+)-limoneno é o componente majoritário dos óleos

das cascas de limão e laranja e do óleo essencial de alcarávia (Carum carvi


DEMYTTENAERE & DE KIMPE, 2001).


mioterapêuticas (OLIVEIRA, 2010). O limoneno foi eficiente

durante a iniciação e a produção da carcinogênese em diversos tumores (


incluindo membros da família Ras (HAAG et al., 1992). A partir daí o limoneno foi

considerado um potencial agente anticâncer, mas a dose de 1000 mg/Kg/dia limitou sua

utilidade clínica e seus metabólitos álcool perílico e ácido perílico

, 2001). A figura 2 apresenta a estrutura química do limoneno.

Figura 2 – Estrutura química do limoneno.

2

monoterpeno monocíclico

, como laranja e limão

, 2000). É usado como ingrediente para sabor cítrico em óleos artificiais e

alcóolicas, sorvetes e doces

limoneno é principalmente encontrado numa variedade de plantas e

limoneno é o componente majoritário dos óleos

Carum carvi), sendo a



O limoneno foi eficiente

durante a iniciação e a produção da carcinogênese em diversos tumores (CHOW et al.,


., 1992). A partir daí o limoneno foi

mg/Kg/dia limitou sua

etabólitos álcool perílico e ácido perílico passaram a ser

apresenta a estrutura química do limoneno.

1.2 Derivados Perílicos

O ácido, álcool e o aldeído perílico podem ser obtidos a partir da

limoneno de acordo com a reação indicada na figura

literatura demonstrando a eficácia

mamários, pancreáticos e cerebrais (

2006b e 2007; MATOS et al

na ativação de proteínas apoptóticas e

leucêmicas (CLARK, 200

adenocarcinoma (ELEGBEDE

metástase em células da glia (

células de câncer de pulmão (

2002) e proliferação de células de tumor de mama (

álcool perílico é metabolizado no fígado formando

(YERUVA et al., 2007).

recorrentes já evoluiu para testes clínicos em fase I/II (

Poucos estudos do

do álcool perílico, mas já existem descrições de atividades antitumorais como capacidade

de inibir isoprenilação da proteína

de IL-2 (SCHULZ et al., 1997

de tumor pulmonar (YERUVA

antimicrobiana, podendo ser utilizado como agente de preservação na indústria de

cosméticos (RIEKS et al., 2004

bioconversão do limoneno através da

Figura 3 – Estrutura química do limoneno e de seus derivados perílicos.

erílicos

e o aldeído perílico podem ser obtidos a partir da

limoneno de acordo com a reação indicada na figura 3. Existem diversos estudos na

eficácia do álcool na atividade regressora de diferentes tumores

mamários, pancreáticos e cerebrais (YURI et al., 2004; DA FONSECA

et al., 2008) na inibição da angiogênese (LOUTRARI

na ativação de proteínas apoptóticas e na capacidade de causar apoptose em células

CLARK, 2006), em tumor pulmonar (YERUVA et al

ELEGBEDE et al., 2003; WISEMAN et al., 2007

glia (BALASSIANO et al., 2002), na inibição da

células de câncer de pulmão (XU et al., 2004), na inibição da migração (

proliferação de células de tumor de mama (YURI et al., 2004

álcool perílico é metabolizado no fígado formando majoritariamente o ácido perílico

). Seu uso terapêutico no tratamento de gliomas malignos

iu para testes clínicos em fase I/II (DA FONSECA et al

Poucos estudos do ácido perílico foram encontrados na literatura comparados

, mas já existem descrições de atividades antitumorais como capacidade

isoprenilação da proteína Ras (HOLSTEIN & HOHL, 2003), de

., 1997), de bloquear o ciclo celular e causar apoptose em células

YERUVA et al., 2007). O ácido perílico apresenta também


., 2004). Uma alternativa para a produção desse ácido é a

bioconversão do limoneno através da levedura Yarrowia lipolytica em ácido perílico

Estrutura química do limoneno e de seus derivados perílicos.

3

e o aldeído perílico podem ser obtidos a partir da oxidação do

Existem diversos estudos na

atividade regressora de diferentes tumores

DA FONSECA et al., 2006a,

LOUTRARI et al., 2004)

capacidade de causar apoptose em células

et al., 2007) e em

., 2007), na inibição de

ção da proliferação de

migração (WAGNER et al.,

., 2004). Em humanos o

majoritariamente o ácido perílico

Seu uso terapêutico no tratamento de gliomas malignos

et al., 2006b; 2007).

encontrados na literatura comparados aos

, mas já existem descrições de atividades antitumorais como capacidade

de inibir a produção

bloquear o ciclo celular e causar apoptose em células

apresenta também atividade


. Uma alternativa para a produção desse ácido é a

ácido perílico.

Estrutura química do limoneno e de seus derivados perílicos.

4

1.3 Microrganismo

A Y. lipolytica é uma levedura estritamente aeróbia, dimórfica, eucarioto, do reino

Fungi, pertencente à classe dos Ascomicetos, subclasse Hemiascomicetos, anteriormente

conhecida como Candida lipolytica (BARTH & GAILLARDIN, 1997) e apresenta

hidrofobicidade celular (MARTINS, et al., 2009). É amplamente utilizada pelas indústrias

na produção de ácido cítrico e proteínas, sendo classificada como segura (GRAS -

Generally Regarded as Safe) pela FDA (American Food and Drug Administration). A

figura 4 apresenta uma microscopia óptica da Y. lipolytica.

Estudos iniciais de caracterização do sistema enzimático de oxidação do limoneno

por Y. lipolytica indicaram que a levedura é capaz de oxidar ambos os enantiômeros R-(+)-

e S-(-)-limoneno e que a presença de oxigênio molecular é essencial para a bioconversão

desta molécula.

Figura 4 – Microscopia óptica da Y. lipolytica.

Fonte: Próprio autor.

1.4 Bioprocesso

Por bioconversão ou biotransformação

de células íntegras (vegetais ou microbianas)

de um número pequeno de

de alto valor agregado. Nos últimos anos vários pesquisadores tem se dedicado ao estudo

de bioprocessos porque diferentemente dos processos químicos, que requerem

valores de pH, temperaturas e pressões extremo

condições brandas com consequente

catalisadas por enzimas apresentam

menor formação de subprodutos

técnicas, econômicas e ambientais em comparação com a síntese química.

permitiu a introdução de reação catalisada por enzimas gerando compostos opticamente

puros além do desenvolvimento de rotas mais eficientes (

biotransformação pode ser utilizada para a

cosméticos, detergentes, perfumaria,

possível observar a biotransformação industrial em diversos setores sendo o farmacêutico

majoritário.

Figura 5 – Gráfico indicando os s

ou biotransformação subentende-se o uso de enzimas isoladas ou

gras (vegetais ou microbianas) para a conversão, através de uma reação ou

de um número pequeno de reações, de uma molécula precursora (xenobiótico) em

Nos últimos anos vários pesquisadores tem se dedicado ao estudo

de bioprocessos porque diferentemente dos processos químicos, que requerem

raturas e pressões extremos, as conversões microbianas ocorrem sob

com consequente menor consumo energético. Além disso, as reações

apresentam químio-, régio- e enantiosseletividade

ubprodutos. Assim, os processos de bioconversão oferecem vantagens

técnicas, econômicas e ambientais em comparação com a síntese química.


envolvimento de rotas mais eficientes (LOUGHLIN, 2000

pode ser utilizada para a produção de fármacos ou intermediários quirais,

cosméticos, detergentes, perfumaria, aromas, fragrâncias, dentre outras.


Gráfico indicando os setores industriais que utilizam a biotransformação.Fonte: LIESE, et al., 2006.

5

o uso de enzimas isoladas ou

conversão, através de uma reação ou

reações, de uma molécula precursora (xenobiótico) em produtos

Nos últimos anos vários pesquisadores tem se dedicado ao estudo

de bioprocessos porque diferentemente dos processos químicos, que requerem, em geral,

s, as conversões microbianas ocorrem sob

m disso, as reações

e enantiosseletividade e, portanto,

processos de bioconversão oferecem vantagens

técnicas, econômicas e ambientais em comparação com a síntese química. Essa estratégia


LOUGHLIN, 2000). A

fármacos ou intermediários quirais,

dentre outras. Na figura 5 é


etores industriais que utilizam a biotransformação.

6

1.5 Justificativa

A oxidação química do limoneno tem sido ensaiada para obtenção dos derivados

perílicos contudo não tem resultado satisfatória por, invariavelmente, gerar uma mistura de

produtos com propriedades físico-químicas semelhantes, o que exige métodos sofisticados

e caros de purificação. Assim, a bioconversão apresenta-se como alternativa interessante

para a obtenção destes compostos.

Este trabalho enfoca a obtenção do ácido perílico, agente anticâncer e antimicrobiano, a

partir do monoterpeno limoneno – subproduto abundante da indústria de cítricos.

Apresenta caráter inovador pautado pelo uso da bioconversão aplicada à obtenção de

compostos de alto valor agregado a partir do aproveitamento de subprodutos da

agroindústria.

7

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Otimizar a produção de ácido perílico a partir da biotransformação do R-(+)-

limoneno catalisada pela levedura Y. lipolytica.

2.2 Objetivo específico

Utilizar planejamento experimental a fim de verificar quais das variáveis

(temperatura, pH, limoneno, massa celular e nutrientes) tem significância 1 na produção

de ácido perílico.

8

3. METODOLOGIA

3.1) Microrganismo

A linhagem da levedura Y. lipolytica ATCC 18942, cedida pelo INCQS/FIOCRUZ,

capaz de oxidar o limoneno com elevados rendimentos foi utilizada nos experimentos a

seguir.

3.2) Obtenção de massa celular e bioconversão

O crescimento da levedura foi feito em meio extrato de malte glicose (YMB) a

28°C, sob agitação de 200rpm por 48h.

Para a bioconversão, a massa celular obtida por centrifugação a 3000 rpm foi

quantificada e ressuspendida em meio contendo tampão fosfato de sódio 50 mM e R-(+)-

limoneno. As misturas reacionais foram incubadas a 200 rpm. Após o período de

bioconversão, as células foram separadas por centrifugação. Os sobrenadantes foram

utilizados para análise de pH, nutrientes consumidos, glicose e produtos de bioconversão.

Composição do Meio de Cultura YMB:

- Extrato de levedura 3,0 g/L;

- Extrato de malte 3,0 g/L;

- Peptona 5,0 g/L;

- Glicose 10,0 g/L.

3.3) Planejamento fatorial fracionado

Realizou-se um planejamento fatorial fracionado 25-1 no planejamento I para

estudar o efeito das seguintes variáveis independentes na etapa de bioconversão: pH,

temperatura, concentração de limoneno, concentração de massa celular e adição de

nutrientes. E um planejamento fatorial fracionado 24-1 no planejamento II para estudar o

efeito das seguintes variáveis independentes na etapa de bioconversão: pH, temperatura,

concentração de limoneno e adição de nutrientes. Foi utilizado o Programa JMP – versão 8

para a montagem do desenho de triagem e análise dos resultados.

9

3.3.1) Planejamento experimental I

Utilizou-se o desenho de triagem de Placket-Burman para determinar os parâmetros

significativos estatisticamente conforme descrito na tabela 1. Neste experimento foi testado

a influência de cinco variáveis (massa celular, temperatura, pH, limoneno e adição de

nutrientes) na produção de ácido perílico através do planejamento fatorial fracionado 25-1.

Neste caso, o limoneno foi adicionado uma única vez, ao início da bioconversão;

todos os experimentos foram conduzidos por 48 h, tendo-se retirado alíquotas com 24 h e

48 h para as determinações analíticas.

Tabela 1- Desenho de triagem de Placket-Burman utilizado para determinar os parâmetros

significativos estatisticamente (planejamento fatorial fracionado 25-1).

* Solução de nutrientes: extrato de levedura 3 g/L; extrato de malte 3 g/L; peptona 5 g/L;

glicose 10 g/L.

10

3.3.2) Planejamento Experimental II

Utilizou-se o desenho de triagem de Placket-Burman para determinar os parâmetros

significativos estatisticamente conforme descrito na tabela 2. Neste experimento foi testado

a influência de quatro variáveis (temperatura, pH, limoneno e adição de nutrientes) na

produção de ácido perílico através do planejamento fatorial fracionado 24-1.

Durante a bioconversão foi utilizado 20g/L de massa celular em todos os ensaios,

com agitação de 200 rpm; e variando as demais condições de acordo com o desenho de

triagem de Placket-Burman descrito na tabela 2. O limoneno foi adicionado uma única

vez, ao início da bioconversão, todos os experimentos foram conduzidos por 48 h a 25°C,

tendo-se retirado alíquotas com 24 h e 48 h para as determinações analíticas.

Tabela 2 - Desenho de triagem de Placket-Burman utilizado para determinar os parâmetros

significativos estatisticamente (planejamento fatorial fracionado 24-1).

* Solução de nutrientes: extrato de levedura 3 g/L; extrato de malte 3 g/L; peptona 5 g/L; glicose 10 g/L.

11

3.4) Metodologia Analítica

3.4.1) Quantificação da massa celular, dosagem de glicose e determinação do pH

A concentração de glicose foi determinada nos sobrenadantes da bioconversão

através do analisador bioquímico YSI 2700 Select. O pH das amostras foi avaliado

utilizando-se o equipamento da Beckman modelo ф 390. A concentração de massa celular

foi avaliada através de medidas de densidade ótica a 600 nm. Uma unidade de absorbância

corresponde a 0,444 g de células (peso seco) /L.

3.4.2) Análise por cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de

chama (CG/DIC)

As amostras de bioconversão foram encaminhadas à Plataforma Analítica de

Farmanguinhos/FIOCRUZ para a realização das análises por cromatografia gasosa.

Uma alíquota (1 mL) da amostra foi transferida para um tubo de centrífuga e 50 µL

de HCl 0,6 M foram adicionados para induzir a precipitação. Após centrifugação a 10.000

rpm por 10 min, o precipitado foi dissolvido em 2 ml de acetato de etila.

As análises foram feitas no equipamento HP modelo 6890N Network nas seguintes

condições:

• Injetor: temperatura: 270ºC, split: 1/15, fluxo: 2 mL/min, Gás de arraste: He;

• Forno: temperatura inicial: 50ºC, tempo inicial: 2 min, rampa de aquecimento:

10ºC/min, temperatura final: 250ºC, mantida por 8 min;

• Coluna: fabricante: HP-INNOwax, fase estacionária: polietilenoglicol da Agilent,

comprimento: 30metros, diâmetro interno de 250 µm, espessura de filme: 0,25 µm;

• Detector: ionização em chama, temperatura: 270ºC.

12

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1) Planejamento experimental I

4.1.1) Etapa de crescimento celular

Após 48h de crescimento da levedura foi realizado a quantificação da massa celular

do cultivo, que foi igual a 55,2 g/L.

4.1.2) Etapa de bioconversão

A tabela 3 apresenta os valores de pH e glicose referentes às amostras de

bioconversão. Foram observadas variações pequenas de pH em 24h e 48h com relação ao

pH inicial em todos os experimentos. Pode-se observar que em 24 horas de bioconversão a

concentração de glicose diminuiu em relação ao valor inicial, ou seja, a levedura Y.

lipolytica consumiu parte da glicose presente no meio. Isso também aconteceu nos

experimentos de tempo de 48horas de reação em relação aos de 24horas.

Tabela 3 - Valores de pH e glicose correspondente a cada amostra em t=0, t=24 e t=48h do

planejamento experimental I.

4.1.3) Análise de terpenosde Chama (CG/DIC)

Nos ensaios de 1 a 8 a concentração de ácido perílico ficou abaixo do limite de

detecção (200mg/L). Em todos os ensaios, a concentração de

48h de bioconversão e, conforme as condições experimentais, variou entre valores menores

do que 200 mg/L até 1216,8 mg/L


de células de 20 g/L e solução de nutrientes de 10% v/v, é cerca de 89% maior do

obtido nas condições do ponto central (644,4 mg/L).

Figura 6– Gráfico da concentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limonenoanálises de CG/DIC

de terpenos por Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização


detecção (200mg/L). Em todos os ensaios, a concentração de ácido perílico


do que 200 mg/L até 1216,8 mg/L de acordo com a figura 6. Este maior valor, obtido na


de células de 20 g/L e solução de nutrientes de 10% v/v, é cerca de 89% maior do

obtido nas condições do ponto central (644,4 mg/L).

oncentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limonenoanálises de CG/DIC (delineamento fatorial fracionado 2

5-1).

13

por Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização


ácido perílico foi maior com


. Este maior valor, obtido na


de células de 20 g/L e solução de nutrientes de 10% v/v, é cerca de 89% maior do que o

oncentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limoneno de acordo com

14

4.1.4) Análise estatística

A análise estatística indicou que a concentração de massa celular foi a variável que

apresentou o maior efeito sobre os rendimentos em ácido perílico, muito superior, nas

faixas estudadas, aos outros parâmetros avaliados, o que pode ter mascarado o efeito

desses últimos. É possível verificar os valores de significância de p através das figuras 7 e

8.

Figura 7 – Gráfico de Pareto indicando os valores de significância de p para as variáveis testadas em 24h.

15


4.2) Planejamento experimental II

4.2.1) Etapa de crescimento celular

Após 48h de crescimento da levedura foi realizado a quantificação da massa celular

do cultivo, que foi igual a 70,20 g/L.

4.2.2) Etapa de bioconversão

A tabela 4 apresenta os valores de pH referentes às amostras de bioconversão.

Foram observadas variações pequenas de pH em 24h e 48h com relação ao pH inicial, com

tendência ao aumento desse valor, em alguns experimentos. Com relação à quantificação

da glicose, apresentada na mesma tabela, pode-se observar que a concentração de glicose

diminuiu em relação ao valor inicial, indicando o consumo desta fonte de carbono pela

levedura.

16

Tabela 4. Valores de pH e glicose nas amostras iniciais e após 24 e 48 horas de

bioconversão do limoneno do planejamento experimental II.

Ensaio pH Glicose (g/L)

inicial 24 h 48 h Inicial 24 h 48 h 1 6,2 6,4 6,7 0,0 0,0 0,0 1' 6,2 6,6 7,0 0,0 0,0 0,0 2 6,2 6,3 6,4 1,0 0,1 0,0 2' 6,2 6,8 6,7 1,0 0,1 0,0 3 7,2 7,6 7,8 1,0 0,0 0,0 3' 7,2 7,6 7,7 1,0 0,0 0,0 4 7,2 7,6 7,1 0,0 0,0 0,0 4' 7,2 7,0 7,5 0,0 0,0 0,0 5 6,2 7,2 7,4 1,0 0,0 0,0 5' 6,2 6,8 7,3 1,0 0,0 0,0 6 6,2 6,9 7,0 0,0 0,0 0,0 6' 6,2 6,1 6,7 0,0 0,0 0,0 7 7,2 7,4 8,0 0,0 0,0 0,0 7' 7,2 8,1 7,9 0,0 0,0 0,0 8 7,2 7,3 7,9 1,0 0,0 0,0 8' 7,2 6,9 7,6 1,0 0,0 0,0 9 6,7 6,4 6,9 0,5 0,0 0,0 10 6,7 7,4 6,3 0,5 0,0 0,0 11 6,7 7,2 6,5 0,5 0,0 0,0

4.2.3) Análise de terpenos por Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização

de Chama (CG/DIC)

Os resultados de produção de ácido perílico são apresentados na tabela 5 e figura 9.

O ensaio 4 apresentou maior produção de ácido perílico seguido pela amostra 8. . Os

ensaios 1, 3 e 5 apresentaram concentração de ácido perílico abaixo de 200mg/L e por isso

não foram inseridos no gráfico da figura 9.

O ensaio que apresentou maior produção de ácido perílico (1104,4mg/L) foi

realizado na temperatura 20°C, pH 7,2, concentração de limoneno de 0,5% v/v e 48 h. Este

valor foi cerca de 162% maior do que o obtido nas condições do ponto central (409,25

mg/L).

17

Tabela 5. Concentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limoneno (delineamento fatorial fracionado 24-1).

Ensaio Condições do ensaio Ácido Perílico (mg/L)

Temperatura pH Limoneno

(% v/v)

Nutrientes

(% v/v) 24 h 48 h

1 - - - - <200 <200

2 - - + + 560,73 757,78

3 - + - + <200 <200

4 - + + - 639,76 1104,41

5 + - - + <200 <200

6 + - + - 599,58 816,79

7 + + - - 320,07 276,62

8 + + + + 818,73 885,36

9 0 0 0 0 393,27 408,64

10 0 0 0 0 410,16 436,47

11 0 0 0 0 405,87 382,65

18

Figura 9 – Gráfico da Concentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limoneno de acordo com análises de CG/DIC (delineamento fatorial fracionado 2

4-1).

4.2.4) Análise estatística

Os resultados da análise estatística (figuras 10 e 11) mostram que os parâmetros

relevantes são a concentração de limoneno (maior influência) e o pH. A temperatura

apresentou pequena relevância com 24 horas de bioconversão, porem não foi relevante no

tempo de 48 h. A concentração de nutrientes não influiu nos resultados, indicando que a

bioconversão pode ser realizada sem a adição de nutrientes.

Como próxima etapa, deverá ser realizado um delineamento composto central

rotacional -DCCR, para verificar a influência das duas variáveis independentes,

concentração de limoneno e pH, nos rendimentos da bioconversão. A temperatura de

bioconversão será mantida em 25°C, tendo em vista a pequena relevância deste parâmetro

e a economia energética.

0

200

400

600

800

1000

1200

2 4 6 7 8 9 10 11

Áci

do

Pe

rílic

o (

mg/

L)

Ensaios

24 h

48 h

19



20

5. CONCLUSÃO

Os resultados da análise estatística para o planejamento fatorial fracionado 25-1

(massa celular, pH, temperatura, concentração de limoneno e adição de nutrientes)

mostraram que a massa celular foi o parâmetro que apresentou o maior efeito sobre os

rendimentos em ácido perílico, muito superior, nas faixas estudadas, aos demais

parâmetros avaliados, o que pode ter mascarado o efeito desses últimos. Ou seja, pode-se

dizer que esta variável influencia diretamente a produção do ácido perílico a partir da

bioconversão de acordo com os níveis testados.

Os resultados da análise estatística para o planejamento fatorial fracionado 24-1

(variáveis: pH, temperatura, concentração de limoneno e adição de nutrientes; massa

celular fixa em 20 g/L) mostraram que os parâmetros relevantes são a concentração de

limoneno (maior influência) e o pH. A temperatura apresentou pequena relevância com 24

horas de bioconversão, porem não foi relevante no tempo de 48 h. A concentração de

nutrientes não influiu nos resultados, indicando que a bioconversão pode ser realizada sem

a adição de nutrientes.

Para verificar a influência das duas variáveis independentes, concentração de

limoneno e pH, nos rendimentos da bioconversão, deverá ser conduzido um delineamento

composto central rotacional -DCCR. A temperatura de bioconversão deverá ser mantida

em 25°C, tendo em vista a pequena relevância deste parâmetro e a economia energética.

Os resultados obtidos no experimento de bioconversão microbiana do limoneno

encorajam o prosseguimento desta pesquisa no sentido de estabelecer uma rota

biotecnológica para a obtenção desta importante molécula do ponto de vista farmacêutico,

tendo como agente de bioconversão um microrganismo seguro e de fácil cultivo. Ressalta-

se que o produto reacional é estável e majoritário.

21

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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produÇÃo de Ácido perÍlico por … trovao santos.pdf · rio de janeiro 2012 produÇÃo de...

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