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PROCEDIMENTO OPERACIONAL

PADRÃO

POP LAB MIC - 015

I - CONTROLE HISTÓRICO

REVISÃO DATA Nº PÁGINAS HISTÓRICO

ALTERAÇÃO ELABORAÇÃO VERIFICAÇÃO APROVAÇÃO

00 15/01/2018 Página 1 de 15 Emissão

inicial Shinfay M. Liu Lourdes Pereira

Ana Marina Campas de Faria

02 13/05/2021 Página 1 de 15 Revisão Shinfay M. Liu Lourdes Pereira Ana Marina

Campas de Faria

ASSINATURA E CARIMBO 1

TÍTULO: REALIZAR A PESQUISA DIRETA DE FUNGOS

1. Introdução

A observação de um fungo na amostra biológica tem grande valor diagnóstico, pois

demonstra a invasão do fungo no tecido e permite uma informação imediata ao médico, a

qual pode ser crucial para determinar a terapia apropriada ao paciente. No entanto, se a

quantidade da amostra biológica for insuficiente para o exame microscópico e cultura do

material, a cultura, na maioria das amostras, tem prioridade sobre o exame microscópico,

já que é método mais específico e em muitos casos, mais sensível. O exame microscópico

da amostra é realizado por várias técnicas, dependendo do tipo da amostra e suspeita

clínica.

A pesquisa direta para fungos é direcionada aos dermatófitos, implicados nas micoses

superficiais, bem como aos agentes causadores das micoses profundas.

2. Objetivo

Este procedimento Operacional Padrão foi elaborado pela Seção de Microbiologia e tem

como produto final a realização de pesquisas de fungos.

3. Campos de aplicação

Setor Microbiologia

4. Referências normativas

Resolução nº302, de 13 de outubro de 2005: Dispõe sobre Regulamento Técnico para

funcionamento de Laboratórios Clínicos.

5. Responsabilidade/ competência

Médico Patologista: orientar, avaliar, realizar a pesquisa de fungos e liberar os exames.

Bioquímico: orientar, avaliar, realizar a pesquisa de fungos e liberar os exames.


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Biomédico: orientar, avaliar, realizar a pesquisa de fungos e liberar os exames.

Técnico em Patologia Clínica: realizar a pesquisa de fungos.

6. Definições

Não se aplica.

7. Conteúdo do padrão

7.1 Recursos necessários

Microscópio de campo claro

Microscópio UV

Lâminas e lamínulas

Placas de petri estéreis

KOH a 20%

Corantes de Gram

Corantes de May-Grünwald e Giemsa

Tinta da China

Calcoflúor White 0,1%

7.2 Principais passos

A. Mnemônico(s): FUPB

B. Sinonímia: Pesquisa direta de fungos, exame direto.

C. Princípio: Identificação dos agentes etiológicos de micoses superficiais e profundas em

espécimes clínicos.

D. Fase pré-analítica:


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1. Amostra:

i. Coleta, transporte e armazenamento: vide Manual de Coleta Microbiológica.

ii. Tipos de amostras:

a. Pelos, cabelos, escamas de unha e pele: devem ser previamente aliquotadas

para exame microscópico e cultura. Para exame direto as amostras são

clarificadas com solução aquosa de KOH a 20%, enquanto a cultura requer

amostras sem nenhum tratamento prévio, sendo por isso, inoculadas

diretamente na superfície do meio de cultura.

b. Líquor, secreções e fluídos corporais (líquido pleural, líquido ascítico, líquido

sinovial, líquido pericárdico, aspirado traqueal, lavado gástrico e lavado

broncoalveolar [BAL e mini-BAL]): devem ser concentrados por centrifugação

(1500 a 2000 rpm por 10 minutos). Os materiais coletados com “swabs”

devem ser eluidos em solução salina estéril e centrifugados. O sedimento

obtido é o material adequado para o exame microscópico e semeadura em

meios de cultura.

c. Escarro: pode ser digerido com enzima (v/v) N-acetil-L-cisteina (250 mg de

enzima dissolvidas em 1 L de solução-tampão citrato ou solução fisiológica),

que fluidifica e facilita a manipulação da amostra e formação de sedimento

após centrifugação. Porém, não foi comprovado que esse tratamento melhore

a recuperação de fungos da amostra sendo, portanto, opcional. Pode-se

utilizar, como alternativa à digestão da amostra, a solução de KOH 20%. A

porção purulenta da amostra é preferível e porções liquefeitas não são

adequadas para isolamento do agente patogênico. A porção da amostra

tratada com KOH, porém, só pode ser usada para exame microscópico, pois

a potassa destrói, após algumas horas, as estruturas do fungo, inviabilizando


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seu isolamento em meio de cultura. Neste caso, outra porção da amostra

deve ser centrifugada e o sedimento usado para cultura.

d. Tecidos obtidos por biópsia: requerem fragmentação, com o auxílio de uma

lâmina de bisturi estéril ou maceração (gânglio) com pistilo em almofariz

estéreis; a fragmentação com lâmina de bisturi pode ser feito dentro de uma

placa de Petri estéril. Esse procedimento visa aumentar a área de superfície e

expor o microrganismo ligado ao tecido com o meio de cultura.

e. Sangue e aspirado de medula óssea: não necessitam preparação, sendo que

o exame microscópico tem baixa sensibilidade e, portanto a cultura é

importante para identificação do agente. O sangue e os aspirados de medula

óssea não devem ser coletados em seringas ou tubos contendo EDTA, pois

esta substância se combina com elementos da parede dos fungos, diminuindo

a sensibilidade do exame. Os frascos de cultura automatizados geralmente

utilizam anticoagulantes a base de quelantes de íons, o que pode prejudicar o

crescimento de vários espécimes de fungos. O anticoagulante ideal é a

heparina.

E. Fase analítica:

1. Após conferência da amostra e recebimento do exame no sistema MV, colar uma

etiqueta no caderno de registro (dados brutos).

2. Procedimento das amostras:

i. Raspado de unhas, escamas epidérmicas e pelos:

a. Aplicar uma gota de KOH aquoso a 20% em uma lâmina de microscopia e

sobre esta, uma porção da amostra a ser examinada


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b. Cobrir a preparação com uma lamínula e examinar a preparação após 20

minutos em câmara úmida ao MO em campo claro, com objetiva de 10x e

40x, em busca de pseudohifas, hifas e leveduras.

ii. Amostras respiratórias (escarro, lavado broncoalveolar e aspirado traqueal ou

transtraqueal):

a. Dividir o material em alíquotas para exame direto, Gram e cultura;

b. Colocar uma porção da amostra em lâmina. Optar por porções do material

com aspecto purulento, caseoso, sanguinolento ou mucogelatinoso;

c. Para o lavado broncoalveolar, centrifugar 3 a 5 ml, em um tubo cônico,

graduado e com tampa. Centrifugar a 2000 rpm durante 10 minutos;

d. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento para homogeneizar o

material; usar esta parte do material para executar o exame. Colocar com a

alça de secreção (10 microlitros), uma porção da amostra em lâmina

e. Adicionar 1 a 2 gotas de KOH aquoso a 20%, misturar com a alça, cobrir com

lamínula. Examinar ao MO, em campo claro, com objetiva de 10x e 40x;

quando necessário, diminuir a luminosidade fechando o diafragma do

condensador;

f. Pesquisar a presença de pseudo-hifas e blastoconídeos (candidiase),

estruturas arredondas, gemulantes com cápsulas (criptococoses), hifas

septadas hialinas e conidióforo com vesícula e fiálides (aspergilose).

iii. Amostra de urina:

a. Centrifugar a urina por 10 min a 2000x rpm;


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b. Colocar uma alíquota do sedimento em um uma gota de KOH aquoso a 20%

c. Examinar ao MO em busca de principalmente pseudo-hifas e blastoconídeos

(candidiase) e outras estruturas fúngicas.

iv. Amostra de líquido cefalorraquidiano (LCR):

a. Centrifugar toda a amostra por 10 min a 2000x G em tubo cônico estéril;

b. Reservar o sobrenadante para exame sorológico em busca de antígenos ou

anticorpos, quando necessário;

c. Retirar uma gota do sedimento com uma alça descartável e corar com tinta da

China (nanquim);

d. Examinar entre lâmina e lamínula ao MO em busca de estruturas

arredondadas gemulantes com cápsulas (criptococoses), mas as outras

estruturas fúngicas devem ser anotadas se observadas;

e. Ressuspender o restante do sedimento e utiliza-lo para cultivo.

v. Amostra de biópsia:

A. Fragmentar inicialmente as amostras em pequenos fragmentos com ajuda de

uma lâmina de bisturi estéril, empregando uma pequena quantidade de

solução salina estéril;

B. Colocar entre lâmina e lamínula com KOH aquoso a 20% e Calcoflúo;

C. Acondicionar a lâmina dentro de uma placa de Petri com algodão umedecido

(câmara úmida);

D. Examinar o material após 15 ou 30 minutos;

E. Examinar entre lâmina e lamínula ao MO, em campo claro e fluorescência.


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vi. Amostra de medula óssea, sangue, aspirados, secreção cutânea e “inprints” de

tecidos obtidos por biópsia para coloração de Giemsa (ou ainda, de Leishman ou

Wright): usadas para pesquisa de Histoplasma capsulatum

a. Coletar a amostra por aspiração da medula óssea em um frasco estéril com

0,5 ml de heparina;

b. Realizar um esfregaço semelhante ao usado para coloração de Gram.

c. Fixar com metanol e corar segundo o método GIEMSA (vide POP LAB HEM

018 – Passo a passo no equipamento ABX Pentra 120 DF e DX-SPS, item 8

da Fase Analítica, subitem v. Módulo SPS – Corador de lâminas) da Seção de

Hematologia.

d. Examinar ao MO em busca de formas arredondadas leveduriformes

intracelulares (histoplasma).

3. Coloração de Gram:

i. Coloração ao método de Gram:

a. Todos os fungos são Gram- positivos, assim a utilização da coloração não

visa a diferenciação dos microrganismos, mas possibilita discriminar

elementos fúngicos de artefatos existentes em urina, secreções e fezes e

indicar a necessidade de outros métodos de coloração mais eficientes. O

Gram pode ser útil, ainda, para o exame de esfregaços contendo Candida sp.,

Malassezia sp. e Sporothrix spp. Além disso, ele pode demonstrar a presença

de filamentos de Nocardia e Actinomyces spp., agentes que produzem sinais


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clínicos que lembram infecções micóticas. Vide no “POP LAB MIC 005 –

Processar, Semear e Incubar as Amostras Biológicas” como preparar os

esfregaços e no “POP LAB MIC 012 – Realizar Bacterioscopia pelo Método

de Gram” como corar as lâminas.

b. Espalhar a amostra de forma homogênea em uma lâmina de microscopia

aplicando movimentos circulares, deixar secar e submeter à coloração de

Gram.

ii. Reportando os resultados:

c. Reportar como NEGATIVO ou POSITIVO. Nos casos positivos descrever os

principais aspectos morfológicos das estruturas fúngicas observadas ao

exame microscópico (figura 1) e os possíveis agentes etiológicos de acordo

com a amostra biológica (figuras 2 e 3).

Figura 1 – Estruturas microscópicas básicas de fungos


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Figura 2 - Interpretação de aspectos morfológicos encontrados em exames microscópicos de amostras biológicas


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Figura 3 - Sumário das micoses


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G. Controle da Qualidade (CIQ)

1. Controle Interno da Qualidade (CIQ)

Análise quinzenal realizada por Interobservadores (não cego).

Uma amostra é avaliada por 2 examinadores. Os resultados são comparados e a

análise crítica da reprodutibilidade, para validação dos testes, é realizada por um

profissional habilitado para tal. O resultado é anotado em planilha (vide anexo 2).

2. Controle Externo da Qualidade (CEQ)

O Controle Externo da Qualidade é realizado por meio do PELM (Proficiência em

Ensaios Laboratoriais) que é um programa de comparação interlaboratorial. São

realizadas análises em materiais desconhecidos, fornecidos pela empresa

Controllab, que simulam casos clínicos. As avaliações fornecidas pela Controllab

resultam de estudos estatísticos realizados entre os laboratórios participantes.

Anualmente são realizadas quatro rodadas de CEQ para o exame.


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7.3 Cuidados especiais

Uso de EPI.

8. Siglas

EPI: Equipamento de Proteção Individual

MO: Microscópio Óptico.

Rpm: rotação por mínuto

9. Indicadores

Desempenho no controle externo da qualidade (CEQ).

Recoleta (geral, por material impróprio, para confirmação, por acidente e diversas).

10. Gerenciamento de riscos

Categoria de risco

Falhas potenciais geradoras de

riscos Evento

Ações de prevenção

Ações frente ao evento

Assistencial Desatenção Identificação

manual do

paciente/sequenci

a incorreta no

caderno de

registro (fase pré-

analítica)

Treinamento Verificar se exame já

liberado;

Refazer exame;

SNA


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Ocupacional Desatenção;

Falta de estrutura

adequada para

armazenamento

(recipiente

inadequado)

Transporte

inadequado das

amostras

biológicas

Treinamento de

pessoal/

adequação do

meio de

transporte

SNA;

Processamento com

ressalva

Assistencial Desatenção Controle de

Qualidade

vencido/atrasado

Conferir

semanalmente

planilha de

registro de

controle de

Qualidade (CG)

Refazer exame após

CQ

Assistencial Falha técnica

Identificação

errada de lâminas

Treinamento

SNA (se necessário);

Refazer exame

Assistencial Desatenção Digitação do

resultado do

paciente

(mnemônicos)

incorreta no MV

Treinamento Verificar se exame já

liberado/comunicar

médico e/ou paciente;

Gerar registro da

intercorrência na

retificação de laudos /

MV

Assistencial Desatenção Não avaliação

crítica do

resultado

Treinamento

Verificar se exame já

liberado/comunicar

médico e/ou paciente


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11. Referências

HENRY, J.B. Diagnósticos Clínicos e Tratamento por Métodos Laboratoriais. 21ª

edição, São Paulo: Manole, 2013.

KONEMAN, E. W. et al. Diagnóstico Microbiológico: texto e atlas colorido. 6ª edição,

Rio de Janeiro: Medsi, 2008.

OPLUSTIL, C. P. et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. 3ª edição,

São Paulo: Sarvier, 2010.

Manual de Micologia Médica, Paulo Murillo Neufeld,1999;

Micologia Médica, Marcio Biasoli Control-lab 1ª EDIÇÃO – 1996.

Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Relacionada à Assistência à Saúde.

Módulo 8: Detecção e identificação de fungos de importância médica /Agência

Nacional de Vigilância Sanitária. Brasília: Anvisa, 2013.

12. Anexos

Não se aplica.

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