PROBEMA 2

1. Objetivo 1: Descrever todas as etapas do ciclo celular da mitose, enfatizando seu processo de regulação e controle (duplicação); 1053-1114

O CICLO CELULAR COMPREENDE DUAS ETAPAS COORDENADAS: UMA DE CRESCIMENTO E OUTRA DE DIVISÃO EM DUAS CÉLULAS-FILHAS

O ciclo pode ser dividido em duas etapas: uma de crescimento e preparação para a divisão (chamada de intérfase) e outra a divisão propriamente dita (cariocinese- divisão do núcleo- e citocinese – divisão do citoplasma).

O crescimento deve ser regulado para que o tempo de crescimento e preparação celular sejam adequados ao tempo de divisão, para que a célula não se torne cada vez menor, mas sim que conserve suas características originais. Esse controle é feito por diversos produtos gênicos, que são regulados por fatores extracelulares como nutrientes ou fatores de crescimento.

FASE DO CICLO CELULAR: A SINTESE DE DNA OCORRE NA FASE S DA INTÉRFASE

A intérfase é o período em que ocorre a duplicação dos componentes da célula-mãe, como o DNA. Foi demonstrado através de experimentos que a duplicação do DNA ocorre 2 horas antes da mitose. Com essa descoberta, foi possível dividir a intérfase em 4 períodos distintos, G1, S, G2 e M. No período S ocorre a síntese do DNA, em G1 é o período do fim da mitose até o início da síntese de DNA (S), em G2 é o período desde a síntese de DNA e a próxima mitose.

DURAÇÃO DOS PERÍODOS DO CICLO

Aproximadamente 95% do ciclo são gastos em intérfase, mas o tempo médio total dessa fase é variável conforme o tipo celular, as condições fisiológicas da célula, idade celular, disponibilidade de hormônios e fatores de crescimento, temperatura, pressão osmótica, pressão hidrostática, pressão de oxigênio e ritmo circadiano.

Os ciclos em células de mamíferos duram de 12 a 24 horas. A fase G1 é a mais variável, pois é a fase em que há maior influência de fatores extracelulares. Também é o período em que vários inibidores e mutações são capazes de bloquear a proliferação.

Assim que as células entram em fase S, os fatores extracelulares não podem mais influenciar, e os fatores internos passam a controlar os disparos. Por isso, os demais tempos da divisão celular, tem duração mais constante. A mitose dura cerca de 1 hora, G2 dura cerca de 2-4 horas e o período S dura de 7 a 8 horas.

Em função das variações no tempo de proliferação, as células animais podem ser classificadas em três categorias:

o Células que se dividem continuamente (células embrionárias, epitélio de revestimento do intestino delgado, folículos capilares, e sistema linfático – por isso são as mais afetadas em tratamentos de quimioterapia);

o Células que não se dividem, mas que podem fazê-lo em resposta a estímulos: são células desprovidas de fatores de crescimento e por isso mantém um baixo metabolismo, com baixa velocidade de síntese de macromoléculas e possuem o DNA não duplicado. Alguns tipos celulares estão em G0 e podem entrar na fase proliferativa mediante a um estímulo, o retorno ao ciclo celular se dá na fase G1 num ponto chamado ponto de restrição (ponto R) que seria um ponto crítico a ser vencido pela célula para que a fase S possa ser iniciada;

o Células terminalmente diferenciadas: células que perderam terminantemente a capacidade de se dividir. Ex.: neurônios, estão indefinidamente em fase G0.

EVENTOS BIOQUÍMICOS DA INTÉRFASE

É um período de intensa atividade metabólica onde há crescimento contínuo da célula e mecanismos de controle cruciais para o desenvolvimento coordenado dos ciclos de crescimento, replicação e divisão celular.

A síntese de DNA ocorre periodicamente na intérfase, enquanto a síntese de RNA ocorre de maneira contínua. O pico de produção de RNA ocorre em G1e no começo da fase S, principalmente RNA ribossômico (rRNA). Já os RNA’s extranucleolares são sintetizados em picos em G1 e G2. A síntese de proteínas durante a intérfase também se dá em forma de picos.

• Período G1

É um período de reinício da síntese de RNA e de proteínas que havia sido interrompida durante a mitose. Com essa síntese há o crescimento contínuo da célula durante essa etapa, que continua nas fases S e G2.

Como nesse período há a preparação para a duplicação do DNA da fase S, há também a síntese de enzimas que são usadas nesse processo, como enzimas catalisadoras de

síntese de trifosfatos de desoxirribonucleosídios, enzima de síntese das DNA-polimerases e enzima ativadoras dos genes que codificam as proteínas histonas.

Em G1 também há um importante papel controlador, se a proliferação irá continuar ou se a célula entrará em estado de quiescencia (G0). Essa decisão é determinada primariamente por sinais extracelulares, como fatores de crescimento e nutrientes, que desencadeiam várias respostas intracelulares. Essas respostas são monitoradas por controladores internos do ciclo, constituídos por diversos componentes proteicos, que agem induzindo ou impedindo a progressão do ciclo. Um dos pontos críticos de controle está no final de G1 e recebeu o no me start, em animais, ponto de restrição (ponto R), esse ponto seria transposto apenas quando proteínas sintetizadas em G1 fossem acumuladas até que alcançassem uma quantidade crítica, permitindo então à célula transpor o ponto R e iniciar S. Assim que passou pelo ponto R não há mais volta e a célula deve estrar em fase S e ir até o fim do ciclo.

Outro mecanismo de controle de G1 é a interrupção temporária do ciclo nessa fase em casos de danos no DNA para mecanismos de reparo antes da replicação do DNA. Esse sinal de parada em G1 é dado por uma proteína conhecida como p53, que quando aumenta sua concentração intracelular indica danos no DNA, impedindo que a célula replique esse material danificado.

• Período S

É o período de duplicação do DNA. Toda célula eucarionte diploide inicia seu ciclo em G1 com uma quantidade de DNA igual a 2C. Durante o período S, essa quantidade duplica, passando a 4C, e assim permanece até a fase do ciclo em que é igualmente dividida em células-filhas, as quais voltam a G1 com 2C.

Células eucariontes têm um genoma enorme, que deve ser duplicado com alta fidelidade uma única vez a cada ciclo celular, e isso deve ser feito dentro de pouco tempo, nas poucas horas ocupadas pelo período S. Soma-se a isso o fato de que, em células eucariontes, o DNA nuclear apresenta-se na forma de fibras de cromatina, formando um complexo com proteínas histonas. Portanto, é a cromatina que deve sofrer duplicação no período S, o que exige que não só o conteúdo de DNA seja duplicado, mas também a quantidade de histonas.

É neste período, também, que os primórdios de novos centríolos (chamados pró-centríolos).

A REPLICAÇÃO DO DNA É SEMICONSERVATIVA

Durante a replicação, as duas fitas do DNA original, também chamadas de parentais, são copiadas, originando duas moléculas-filhas, cada qual com somente uma das fitas recém-sintetizada. Diz-se, portanto, que a replicação é semiconservativa. Assim, cada nova molécula de DNA é cópia perfeita de uma molécula preexistente.

CARACTERÍSTICAS GERAIS DA REPLICAÇÃO DO DNA • A replicação é assincrônica

Dentro de um dado tipo celular, regiões específicas do material genético, ou genes individuais, começam e terminam sua duplicação em momentos definidos na fase S. A eucromatina, que constitui a cromatina geneticamente ativa, começa a replicar primeiro, fazendo-o desde o início da fase S, enquanto a heterocromatina geralmente é a última a replicar, no final do período S, sendo considerada, portanto, de replicação tardia.

• Existem origens de replicação

Se o processo começasse por um extremo da molécula de DNA e terminasse no outro, o genoma dos vertebrados gastaria um tempo muito longo para sua replicação. Calcula-se que seria necessário 1 mês para um cromossomo humano replicar. Isso realmente não acontece existem locais de origem de replicação, em células eucariontes existem múltiplas origens.

O número de origens de replicação depende do organismo, do tipo celular e é regulado ao longo do desenvolvimento. Como exemplo, em um cromossomo humano médio existem, pelo menos, 200 pontos de origem.

Células eucariontes, ao iniciarem a replicação em várias origens, apresentam então muitas unidades de replicação distribuídas ao longo do genoma, as quais se denominam réplicons. Cabe ressaltar que, a cada fase replicativa, todas as unidades de replicação do genoma nuclear são replicadas e que cada réplicon replica somente uma vez, dentro de um único período S. Um complexo enzimático isolado de leveduras, chamado complexo de reconhecimento da origem (ORC, em inglês), liga-se às origens de replicação e sinaliza para que outras proteínas reguladoras venham a se ligar também. Entre estas proteínas, está um grande complexo proteico, o complexo pré-replicativo ou pré-RC. Quando o complexo pré-RC liga-se a uma origem de replicação, o complexo ORC é fosforilado e o processo de replicação é iniciado. Depois de ocorrida a replicação, o complexo pré-RC se desliga daquela origem de replicação, impedindo outra leitura da mesma origem.

• A replicação é bidirecional

Uma vez iniciada a replicação em cada ponto de origem, ela se propaga para os dois lados da molécula de DNA, ou seja, em ambas as direções, até encontrar, em qualquer ponto, os extremos das cadeias em formação dos réplicons adjacentes.

• A replicação é semidescontínua

Como veremos mais adiante, a enzima responsável pela polimerização dos desoxirribonucleotídios na síntese do DNA, a DNApolimerase, polimeriza somente na direção 5 '~ 3', e, então, ambas as cadeias-filhas devem ser sintetizadas na direção 5 '~ 3'. Mas os dois filamentos de DNA da hélice dupla são antiparalelos, isto é, um deles tem a direção 5’~ 3' e o outro a direção contrária, 3'-- 5'. Se as duas cadeias são antiparalelas, surge a pergunta: como elas podem ser polimerizadas simultaneamente e a forquilha de replicação avançar em um único sentido? Parece claro que as maneiras de sintetizar as duas cadeias-filhas são diferentes, seguindo um padrão de replicação semidescontínua. Ocorre que, tomando como referência o sentido do movimento da forquilha de replicação, a cópia da cadeia parental 3 ' -- 5' pode ser sintetizada continuamente. Essa cadeia-filha, que avança na direção 5 '~ 3', recebe o nome de cadeia líder ou cadeia contínua (em inglês, leading strand). A outra cadeia parental, 5 '~ 3' tem de ser copiada de um modo intermitente, descontínuo, por meio da síntese de uma série de fragmentos, que, depois de unidos, dão origem a uma cadeia denominada cadeia retardatária ou cadeia descontínua. Os fragmentos formados da cadeia descontínua (fragmentos de Okazaki) são cadeias curtas.

• A replicação do DNA é realizada por enzimas

Tanto as células procariontes como as eucariontes têm enzimas denominadas DNA-polimerases (DNApol), capazes de sintetizar DNA a partir de seus precursores. Para catalisarem essa síntese, os precursores de DNA devem estar presentes sob a forma de trifosfatos de desoxirribonucleosídios ou desoxirribonucleotídios trifosfatados. Os quatro desoxirribonucleotídios trifosfatados necessários para a síntese de DNA são dATP, dCTP, dTTP e dGTP, contendo as bases adenina (A), citosina (C), timina (T) e guanina (G), respectivamente.

Propriedades das DNA-polimerases:

o Cada desoxirribonucleotídio a ser incorporado é selecionado de modo que sua base nitrogenada seja complementar e possa então parear com bases da cadeia molde, sempre fazendo pareamentos AT e GC. Por isso, depende exclusivamente da molécula antiga.

o O crescimento da cadeia sempre se dá na direção 5 '~ 3 ', ou seja, a enzima sempre adiciona um monofosfato de desoxirribonucleosídio a um C3' livre de um nucleotídio preexistente;

o DNA-polimerases não conseguem iniciar a síntese de novo, todas requerem um segmento inicial de nucleotídios (chamado primer) para dar continuidade à cadeia. Para a formação do segmento primer é usada a enzima primase.

o A enzima usada pela DNA-polimerase para a formação dos novos nucleotídeos usa energia do fosfato tirado do próprio nucleotídeo.

Células eucariontes apresentam, pelo menos, quatro DNApolimerases localizadas no núcleo. As DNA-polimerases alfa e delta são as responsáveis pela replicação do DNA nuclear. Em função de suas características particulares, presumivelmente, a pol delta replica a cadeia contínua, enquanto a pol alfa replica de maneira descontínua a outra cadeia, a retardatária. A polimerase epsílon parece estar relacionada com os mecanismos de reparo, embora sua função precisa permaneça incerta. A quarta enzima de localização nuclear, a DNA-polimerase beta, é pequena e funciona no processo de reparo. Ainda existe a DNA-polimerase gama, que é responsável pela replicação do DNA presente nas mitocôndrias.

• Outras enzimas envolvidas na replicação

Inicialmente, é preciso desenrolar as voltas da dupla hélice de DNA para expor os moldes de cadeia simples à ação da polimerase. O desenrolamento da dupla hélice é feito pela enzima helicase, que trabalha em cada forquilha de replicação, à frente da polimerase, desenrolando progressivamente as cadeias em ambas as direções. A ligação da helicase só ocorre após a ação de uma proteína chamada DnaA, que, inicialmente, causa a separação das cadeias nas origens de replicação.

Como as duas cadeias de DNA da molécula original estão firmemente ligadas graças às numerosas pontes de hidrogênio entre suas bases, o processo de desenrolamento envolve também a quebra das pontes de hidrogênio, para separar as duas cadeias da dupla hélice que vão ser copiadas. Nesse processo atua também a helicase, consumindo energia fornecida pelo ATP.

A porção desenrolada de DNA deve ser então estabilizada, o que é feito com a participação de proteínas específicas, as proteínas SSP (single strand proteins ), que, ao se ligarem às regiões de cadeias simples do DNA, mantêm os filamentos separados, enquanto se processa a replicação. Essas proteínas impedem que as pontes de hidrogênio entre as bases se refaçam, depois de desfeitas pela helicase; evitam que essas regiões sofram torções, além de protegerem os filamentos simples da eventual degradação por nucleases.

Para impedir que esse superenovelamento ocorra, entram em ação enzimas denominadas DNA-topoisomerases, dentre as quais um dos tipos é conhecido como DNA-girase. Essas enzimas, para relaxarem o estresse contorcional imposto pelo desenrolamento, introduzem quebras, seguidas de reuniões das ligações fosfodiéster na molécula de DNA; suas ações também consomem energia fornecida pelo ATP.

A DNA-polimerase não consegue iniciar uma sequencia nova sem o primer. Esses primers são segmentos curtos de RNA cuja sequência é, naturalmente, complementar à do DNA molde. Os primers que fazem parte dos pequenos fragmentos de Okazaki da cadeia descontínua são produzidos pela ação de uma RNApolimerase especial, denominada primase. Nas células eucariontes, a atividade de primase está localizada em subunidades da própria DNA-polimerase a, mas o primer para a cadeia contínua de DNA é sintetizado pela RNA-polimerase que, em geral, sintetiza RNA na transcrição.

• A replicação e a reorganização da fibra de cromatina

Nas células eucariontes, como o DNA está ligado a proteínas, constituindo a cromatina, não é apenas o DNA que deve ser replicado na fase S, mas também as histonas, como já mencionado. O processo replicativo envolve então a passagem do conjunto de enzimas da replicação através da molécula de DNA, que se apresenta organizada em nucleossomos. A montagem do DNA recém-duplicado em nucleossomos parece ocorrer logo atrás da forquilha de replicação, de tal modo que, conforme esta avança, a fibra nucleossômica vai sendo imediatamente reestruturada nas duas novas moléculas de DNA nascentes. Essa montagem é mediada por proteínas específicas que se ligam às histonas nucleossômicas e as transferem ao DNA.

Esses nucleossomos são formados tanto a partir de histonas recém-sintetizadas em S como de histonas provenientes da desagregação de nucleossomos preexistentes, em uma combinação ao acaso.

AS CÉLULAS APRESENTAM MECANISMOS PARA MANTER A INTEGRIDADE DO SEU DNA

A precisão da replicação do DNA se deve principalmente a uma propriedade especial da DNA-polimerase: ela é capaz de conferir as bases, à medida que as adiciona ao novo filamento de DNA. Essa característica da enzima DNA-polimerase chama-se "leitura de prova" (do inglês, proofreading). A DNApolimerase confere as bases adicionadas e remove imediatamente uma base errada, antes que a síntese do filamento de DNA continue. Seria como uma correção tipográfica em que a letra errada fosse corrigida antes de terminada a palavra inteira.

O DNA sofre a ação de agentes físicos e de muitos agentes químicos, alguns produzidos normalmente na própria célula. As células apresentam vários sistemas gerais para proteger seu DNA e outras moléculas. Os íons superóxido, por exemplo, são destruídos pela enzima superóxido-desmutase. Os íons H+ são neutralizados pelos sistemas reguladores do equilíbrio ácido-básico, e as oxidações intracelulares são reduzidas por diversos sistemas redutores, como o NADPH2, a glutationa e a vitamina E.

Em função dessa importância, além de ter alta fidelidade no processo de sua síntese, o DNA é a única molécula que, se danificada, pode ser reparada pela célula.

O reparo do DNA danificado é feito em duas fases: a primeira, específica para cada tipo de defeito, e a segunda, de natureza geral, igual em todos os casos. A primeira fase é a identificação da alteração e a remoção da parte defeituosa da molécula. Essa fase vale-se de mecanismos diversos para identificar os diferentes defeitos e cortar, por meio de endonucleases, o segmento de DNA errôneo. Na segunda fase, o segmento removido é substituído por um segmento correto de DNA.

PERÍODO G2

No período G2 ocorrem os preparativos necessários para a próxima mitose. Um dos mais bem definidos pontos de checagem do ciclo celular ocorre, então, em G2, no qual a célula permanece até que todo o seu genoma seja completamente replicado e reparado antes de ser igualmente repartido e transmitido a cada célula-filha. Existem mecanismos sensores, de natureza molecular ainda desconhecida, que detectam qualquer

anormalidade na replicação e enviam sinais negativos para o sistema de controle do ciclo, bloqueando a ativação das moléculas que desencadeiam a entrada em mitose.

Ocorre a síntese de proteínas não histônicas, acúmulo do complexo proteico citoplasmático ciclina-cdk, que tem alta importância na regulação do ciclo. Ele é considerado o regulador geral da transição de G2 para M, induzindo a entrada em mitose e sendo responsável por quatro eventos típicos dessa fase: condensação cromossômica, ruptura do envoltório nuclear, montagem do fuso e degradação da proteína ciclina.

Ainda durante G2, ocorre a síntese de RNA, principalmente daqueles extranucleolares, e continua a síntese geral de proteínas iniciada no período G1. Esses processos sintéticos só se interrompem no período seguinte, a mitose.

MITOSE: A DIVISÃO DO NÚCLEO É SEGUIDA PELA DIVISÃO CITOPLASMÁTICA

Esse período inclui essencialmente dois processos: a partilha exata do material nuclear, chamada, no sentido estrito, de mitose ou cariocinese, e a divisão citoplasmática ou citocinese.

• Prófase

Caracteriza-se pela condensação gradual das fibras de cromatina. O processo torna os cromossomos visivelmente individualizados e compostos por seus dois elementos longitudinais idênticos, as cromátides, as quais carregam o material genético duplicado na intérfase anterior. As duas cromátides de um cromossomo são mantidas unidas na região centromérica, desde a replicação até a anáfase, por pontes formadas por um complexo de proteínas denominadas coesinas.

Desse processo participam as proteínas condensinas que apresentam estrutura semelhante às coesinas e são responsáveis pelo estabelecimento das alças que compactam o cromossomo. A condensação é induzida pelo complexo ciclina-Cdk, que, quando ativado, fosforila as condensinas. As condensinas fosforiladas, por sua vez, ligam-se à cromatina e promovem a condensação progressiva das fibras, até formar os cromossomos.

A condensação do material leva à inativação da síntese de tRNA, mRNA, e rRNA. As proteínas já existentes (transcritos nascentes) vão progressivamente sendo completadas e vão se associando a elementos da região do componente fibrilar denso (CFD) do nucléolo. Enquanto fatores de transcrição permanecem ligados às regiões organizadoras do nucléolo (NOR) durante a mitose, algumas subunidades da RNA pol I dissociam-se temporariamente das NOR e deixam o centro fibrilar (CF) do nucléolo.

Os centrossomos agem na formação do fuso como centros nucleadores da polimerização de tubulina em microtúbulos. Os centrossomos são estruturas que, nas células animais, são constituídas por um par de centríolos (denominado diplossomo) e um material pericentriolar amorfo e eletrondenso, a partir do qual emanam fibras de microtúbulos radiais.

Nesta fase existem dois centrossomos no citoplasma, em função de já terem sido duplicados na intérfase, os quais migram para polos opostos da célula. À medida que se afastam, entre eles são polimerizados microtúbulos, usando moléculas de tubulina

liberadas na desmontagem do citoesqueleto da célula interfásica. Feixes de microtúbulos irão constituir as fibras do fuso.

Então, física e temporalmente coordenada com outros eventos do ciclo, quando os cromossomos estão quase em fase final de condensação e os centrossomos ocupam posições opostas, ocorre a desmontagem do envoltório nuclear, que envolve modificações de todos os seus componentes. As membranas nucleares se rompem em vários pontos simultaneamente, originando vesículas membranosas, morfologicamente semelhantes às vesículas do retículo endoplasmático, que se dispersam no citoplasma; os complexos de poro se dissociam e a lâmina nuclear se despolimeriza. Teorias da desmontagem do envoltório nuclear: alteração da permeabilidade dos poros, nucleoporinas que atraem o complexo COP 1 que faz a formação das vesículas, interação de microtúbulos gerando forças mecânicas, fosforilação de proteínas intrínsecas da membranaa nuclear, como a gp210 e das diferentes proteínas laminas.

Com a ruptura do envoltório nuclear, alguns microtúbulos se prendem aos cinetócoros, que, na altura dos centrômeros dos cromossomos, agora se apresentam maduros. Estes passam a ser chamados de microtúbulos cinetocóricos

• Metáfase

Na metáfase (meta, metade), os cromossomos atingem um avançado estado de condensação e, portanto, é o momento em que as duas cromátides se tornam realmente visíveis ao microscópio óptico. Os cromossomos estão alinhados no centro da célula, as forças estão igualmente distribuídas entre os dois polos.

O fuso, assim, é constituído de dois hemifusos. Estes se compõem de três tipos de fibras: as polares, que partem dos centrossomos localizados nos dois polos opostos e que se interdigitam na região central da célula, sem alcançar o polo oposto; as cinetocóricas, que ligam cada cromossomo aos dois polos opostos; e as fibras livres, mais curtas e não ligadas aos polos ou aos cinetócoros, de origem e função desconhecidas.

Do antigo envoltório nuclear, acredita-se que a maioria dos complexos de nucleoporinas solúveis e as laminas estejam distribuídas no citoplasma e que todas as proteínas transmembranosas tenham sido deslocadas para os túbulos do retículo endoplasmático (RE).

• Anáfase

Final da migração das cromátides irmãs. Essa liberação das cromátides-irmãs, que permite sua segregação, decorre da degradação da coesina centromérica por uma protease chamada separase.

Ainda que o mecanismo da migração seja objeto de muita especulação, não há dúvida de que seu deslocamento depende dos microtúbulos. Quanto aos elementos do antigo nucléolo (proteínas de processamento inicial e tardio do rRNA, snoRNA, pré-rRNA parcialmente processados), tanto permanecem associados aos cromossomos na região pericromossômica, como, os que passaram ao citoplasma.

Ainda, como uma consequência do fato de a mitose ser aberta, cada célula em divisão tem de refazer o envoltório nuclear e restabelecer a identidade do núcleo, o que se inicia no final da anáfase.

• Telófase

A telófase (telas, fim) inicia-se quando os cromossomos filhos alcançam os respectivos polos, o que se caracteriza pelo total desaparecimento dos microtúbulos cinetocóricos. Há reconstituição dos núcleos e a divisão citoplasmática.

A descondensação da cromatina, acompanhada da reaquisição da capacidade de transcrição, a reorganização dos nucléolos e a reconstituição do envoltório nuclear são os principais eventos da reconstrução nuclear, que se processam em sentido essencialmente inverso ao ocorrido na prófase. Esses eventos ocorrem pela inativação do complexo ciclina-Cdk, que foi responsável por iniciar a mitose fosforilando determinadas proteínas celulares. Sua inativação permite que as fosfatases entrem em atividade, desfosforilando essas proteínas, e resultando no término da mitose.

Descobertas recentes têm apoiado a ideia de que os cromossomos-filhos se descondensam porque uma ATPase hexamérica (Cdc48/p97) remove e inativa a quinase Aurora B, permitindo a abertura da estrutura cromatínica e sua descondensação, o que parece ser um requisito para que os envoltórios nucleares sejam refeitos.

As etapas consideradas chaves para a reconstituição do envoltório nuclear são: a destinação de membranas para a superfície da cromatina, a fusão de membranas e a incorporação de complexos de poro. Uma pequena GTPase, a proteína Ran, tem papel importante no recrutamento e deposição de proteínas (tais como nucleoporinas e proteínas da membrana nuclear interna) sobre os cromossomos, preparando a remontagem do envoltório nuclear. A Ran controla também a fusão de membranas. Para que se dê a reconstituição do envoltório nuclear, estudos muito recentes têm mostrado que túbulos mitóticos do retículo endoplasmático começam a se reorganizar em lâminas achatadas depois que as extremidades desses túbulos se associam diretamente com a cromatina. Essa associação se dá por intermédio da ligação de proteínas integrais transmembrana, específicas do envoltório nuclear e distribuídas pelo RE, ao DNA. Estes novos achados contrastam com o modelo anterior de reformulação do envoltório nuclear, que propunha a fusão de vesículas do RE, como principal origem das membranas nucleares interna e externa.

A nucleoporina POM121, em ação combinada com o complexo Nupl07, é uma proteína-chave para integrar a fusão de membranas com a montagem dos complexos de poro. Uma vez que a cromatina esteja completamente encerrada pelas membranas contínuas contendo os complexos de poros, as várias proteínas nucleares anteriormente dispersadas são reimportadas por meio dos complexos de poros, levando à expansão do envoltório e ao crescimento do núcleo. Entre essas proteínas estão as laminas solúveis que, ao serem desfosforiladas, voltam a se polimerizar e a reorganizar a lâmina nuclear.

Os componentes que transcrevem as moléculas de rRNA são desfosforilados, e a transcrição é reativada com a queda dos níveis de ciclina-cdk. Então, ocorre a reorganização do(s) nucléolo(s). Esta resulta de dois processos: (a) retomada da transcrição de moléculas precursoras dos rRNA, a partir do DNA das regiões

organizadoras de nucléolos, que, durante a condensação, estavam presentes nas constrições secundárias dos cromossomos; e (b) reagrupamento dos componentes imaturos do antigo nucléolo, que se haviam dispersado pelo citoplasma e constituído, na anáfase, os NDF.

AS CARACTERÍSTICAS DA DIVISÃO CITOPLASMÁTICA NAS CÉLULAS ANIMAIS

Na célula animal, forma-se uma constrição, na altura da região equatorial da célula-mãe, que vai progredindo e termina por dividir o citoplasma, levando à separação das duas células-filhas, cada uma delas recebendo partes iguais do conteúdo citoplasmático. Pela técnica de imunocitoquímica foi demonstrada a presença de miosina e actina na região do estrangulamento que ocorre entre as duas células-filhas na telófase

CONTROLE GENÉTICO DO CICLO CELULAR

Com função determinante no controle do ciclo celular foi isolada e caracterizada uma família de enzimas quinases de proteínas, denominadas quinases dependentes de ciclina ou, da sigla em inglês, Cdk. Uma quinase de proteína tem como atividade básica a fosforilação de proteínas-substrato, o que consiste em transferir um grupo fosfato do doador ATP, ou GTP, para aminoácidos aceptores desse fosfato, como serinas ou treoninas. As Cdk são ativadas e inativadas ao longo do ciclo, promovendo, em consequência, padrões cíclicos de fosforilação de proteínas que desencadeiam ou regulam o ciclo.

As ciclinas foram assim denominadas porque apresentam um padrão cíclico de acúmulo e degradação durante o ciclo celular. Elas são periodicamente sintetizadas, ao longo de todo o período interfásico, e degradadas rapidamente no final da mitose. Os níveis de Cdk, por sua vez, mantêm-se constantes ao longo de todo o ciclo celular.

Nas células humanas, até o momento, foram caracterizadas cerca de 10 ciclinas diferentes (denominadas A, B, C, D, E e assim por diante) e pelo menos 11 Cdk ( Cdk 1 a Cdk 11). Elas atuam em diferentes combinações, em pontos específicos do ciclo.

As Cdk desempenham sua função quinase apenas quando estão associadas às ciclinas, constituindo dimeros; são os complexos ciclina-Cdk. Na ausência de ciclinas, as Cdk são inativas. No dímero, a Cdk é a subunidade enzimática com atividade quinase de proteínas e a ciclina, uma proteína regulatória que ativa a capacidade quinase da Cdk para fosforilar proteínas alvo específicas. Assim, a atividade do complexo ciclina-Cdk é controlada pelo padrão cíclico de acúmulo e degradação da ciclina. A montagem cíclica do dímero ciclina-Cdk, sua ativação e posterior desmontagem são processos centrais que dirigem o ciclo celular.

As ciclinas de G1/S ( ciclinas E em vertebrados), formam complexos com Cdk no final do G1 e comprometem a célula com a duplicação de seu DNA; as ciclinas de S (ciclinas A em vertebrados), que se ligam a Cdk no início da fase Se são necessárias para iniciar a duplicação do DNA; as ciclinas de M (ciclinas B em vertebrados), que se complexam com Cdk e promovem os eventos da mitose.

Os diferentes complexos ciclina-Cdk permanecem inativos até que, atingido o estágio do ciclo pelo qual são responsáveis, são ativados. A ativação resulta da fosforilação de

um aminoácido específico próximo ao sítio ativo da Cdk, por ação de uma proteína conhecida como Cak, quinase ativadora de Cdk. Esta fosforilação causa uma pequena alteração conformacional da Cdk, que aumenta sua eficiência em fosforilar proteínas-alvo importantes no ciclo.

Outro modo de controle da atividade do complexo ciclinaCdk ocorre pela ação de uma proteinoquinase denominada Wee 1, que fosforila dois aminoácidos presentes no sítio ativo da Cdk, inibindo sua atividade, com consequente inativação do complexo. A atividade do complexo é restaurada pela desfosforilação desses dois aminoácidos por uma fosfatase conhecida como Cdc25. Esta, por sua vez, é ativada quando outra proteína, a polo-quinase (PLK, polo-like kinase), fosforila alguns de seus sítios ativos. Além disso, o próprio complexo ciclina-Cdk, que sofreu ativação, também contribui para a fosforilação da Cdc25. O complexo ciclina-Cdk também fosforila e inibe a Wee 1. Assim, por um mecanismo de retroalimentação positivo, o complexo ciclina-Cdk é capaz de ativar seu próprio ativador, ao mesmo tempo em que inibe seu próprio inibidor. Esse processo atua no final do G2, fazendo com que todos os complexos M-Cdk da célula sejam rapidamente ativados e possam desencadear os eventos que dão início à mitose.

Uma família de proteínas, denominadas proteínas inibidoras de Cdk, do inglês CKI, também inativam complexos ciclinas-Cdk. Essas proteínas ligam-se à Cdk, provocando um rearranjo no seu sítio ativo, inativando-a.

O CONTROLE QUE OS COMPLEXOS G1-CDK E G1/S-CDK EXERCEM

O complexo G1-Cdk é responsável pela decisão da célula de entrar ou não em divisão e é ativado por fatores extracelulares.

Na transição de G1 para S, por outro lado, é ativado o complexo G1/S-Cdk, que estimula a duplicação do centrossomo e desencadeia a fosforilação de outras proteínas celulares, incluindo as várias enzimas e polimerases que são necessárias para a síntese do DNA, comprometendo a célula a iniciar a fase S.

A AÇÃO DO COMPLEXO S-CDK

O complexo S-Cdk, ativado no final do G1, fosforila o complexo ORC (de reconhecimento da origem). A fosforilação e consequente ativação desse complexo desencadeiam a replicação do DNA. A atividade do S-Cdk permanece alta durante todo o período G2 e início da mitose.

COMO O COPLEXO M-CDK CONTROLA A MITOSE

A síntese da ciclina de M aumenta durante todo o período G2 e início de M, o que causa um rápido aumento dos níveis do complexo M-Cdk. Este complexo permanece inativo até o final do G2, quando é ativado pela fosfatase Cdc25, tornando-se apto para atuar como proteinoquinase e desencadear os eventos da mitose.

No entanto, a própria fosfatase Cdc25 só atua quando é ativada pela quinase PLK, a qual, por sua vez, ainda que se acumule no início da fase G2, só é fosforilada e, portanto, ativada no final de G2, imediatamente antes da mitose.

O complexo M-Cdk ativo induz a condensação cromossômica, a fragmentação do envoltório nuclear e a reorganização do citoesqueleto, para a montagem do fuso. No início

da mitose, o M-Cdk fosforila proteínas presentes no complexo das condensinas, bem como as histonas Hl e H3, ativando essas proteínas e fazendo com que atuem na condensação cromossômica.

A desmontagem do envoltório nuclear, por sua vez, ainda que envolva mudanças em todos os seus componentes, resulta principalmente da fosforilação de resíduos específicos de serina presentes nas laminas da lâmina nuclear, o que provoca a separação dos filamentos de laminas em dímeros individuais. O M-Cdk fosforila todos os tipos de laminas, levando à desorganização da lâmina nuclear. Em consequência, as membranas nucleares se fragmentam em vesículas, que se dispersam. As laminas, no entanto, não são as únicas proteínas-alvo do M-Cdk nesse processo. A fosforilação de uma ou mais proteínas intrínsecas da membrana nuclear interna tem papel primordial na dissociação de seus componentes.

Os filamentos de actina e os microtúbulos, são alvos potenciais das enzimas quinases. A desmontagem dos microtúbulos do citoesqueleto ocorre quando o M-Cdk fosforila as MAP (proteínas associadas aos microtúbulos), reduzindo a estabilidade dos microtúbulos. Ao mesmo tempo, fosforila e ativa as catastrofinas, que são proteínas motoras que fazem o desmonte dos microtúbulos.

Outro evento que envolve a atividade quinase do M-Cdk ocorre na transição da metáfase para a anáfase, quando se dá a separação das cromátides-irmãs, com consequente migração dos cromossomos-filhos. Essa transição é desencadeada quando o M-Cdk ativa uma ligase de proteína-ubiquitina, o complexo promotor de anáfase (em inglês, anaphase-promoting complex, APC) ou ciclossomo, responsável por ubiquitinar várias proteínas regulatórias, ou seja, ligar várias moléculas de ubiquitina a proteínas-alvo e, assim, marcá-las para serem degradadas por proteólise nos proteossomos 26S. Uma das principais proteínas-alvo do APC é a securina, que inibia inicialmente a proteína separase. Com a destruição da securina, a separase degrada o complexo coesina, que unia as duas cromátides pelos centrômerosirmãos, causando a sua separação em cromossomos-filhos, os quais migram agora para os polos opostos da célula.

A consequente degradação da ciclina M inativa o complexo M-Cdk e permite que as fosfatases desfosforilem os muitos substratos das Cdk que haviam sido fosforilados no início da mitose. Isso leva à desmontagem do fuso, à descondensação cromossômica e à restauração do envoltório nuclear e, portanto, leva a célula a sair da mitose e a progredir para a intérfase do próximo ciclo. Assim, os estágios finais da mitose são governados por dois principais mecanismos regulatórios: desfosforilação dos substratos das quinases Cdk e ligação de ubiquitinas aos substratos do APC.

O CICLO CELULAR É INFLUENCIADO POR FATORES DE CRESCIMENTO E OUTROS SINAIS EXTRACELULARES

O primeiro desses fatores descoberto foi um peptídio que estimula o crescimento de nervos, mais especificamente produz uma hiperplasia de gânglios simpáticos de embriões de galinha. Esse fator, denominado de fator de crescimento do nervo (NGF - nerve growth factor). Outros fatores de crescimento: epidérmico (EGF), fibroblastico (FGF), derivado de plaquetas (PDGF) e o semelhante à insulina (IGF). Em células animais em proliferação, os fatores de crescimento agem fundamentalmente controlando a progressão de G1 -S, impulsionando-as a atravessar o ponto R no final de G1 e a continuar, então, o ciclo de divisão.

Os fatores PDGF e FGF tornam as células em G0 "competentes" para deixar esse estágio. Na presença de EGF, as células progridem nas primeiras etapas de G1, e, na presença de IGF, conseguem transpor o ponto de restrição, no final de G1, tornando-se comprometidas com a divisão.

Muitos outros fatores, além dos fatores de crescimento, estão envolvidos na regulação do ciclo celular, agindo como sinais inibitórios de proliferação. Estes incluem agentes que danificam o DNA, fatores ambientais adversos ou mesmo contatos celulares. Esses sinais antiproliferativos agem, em geral, pela indução de proteínas que se ligam ao

complexo ciclina-Cdk, as já mencionadas inibidoras de Cdk, o que resulta na inatividade do complexo e, portanto, no bloqueio do ciclo.

Outros reguladores do ciclo celular incluem as proteínas codificadas pelos chamados genes supressores de tumor que agem, como os próprios inibidores de Cdk, interrompendo a progressão do ciclo e cuja inativação leva ao desenvolvimento de tumores.

2. Objetivo 2: Descrever os processos de tradução e transcrição do DNA; 3. Objetivo 3: Conceituar as células totipotentes, multipotentes e pluripotentes;

Essas células têm grau de diferenciação zero e, portanto, apresentam 100% de potencialidade, sendo denominadas totipotentes.

Já as células-tronco do epitélio intestinal estão preparadas para originar as células absortivas e caliciformes desse epitélio. Por terem um potencial de diferenciação mais restrito que as células-tronco embrionárias, essas células são classificadas como multipotentes.

As células-tronco embrionárias derivam da massa celular interna do blastocisto. Nesta fase do desenvolvimento embrionário, as células da massa celular interna têm o potencial de se diferenciarem em todos os tipos celulares do organismo. Contudo, não são capazes de gerar as células da porção fetal da placenta (trofo-ectoderma), portanto são ditas pluripotentes, e não totipotentes, como os blastômeros.

4. Objetivo 4: Descrever o mecanismo da apoptose. (ROBBINS pgs. 25-30). APOPTOSE

A apoptose é uma via de morte celular induzida por um programa de suicídio estritamente regulado no qual as células destinadas a morrer ativam enzimas que degradam seu próprio DNA e as proteínas nucleares e citoplasmáticas.

As membranas plasmáticas da célula apoptótica e seus corpos apoptóticos permanecem intactos, mas sua estrutura é alterada de tal maneira que a célula e seus fragmentos tornam-se alvos “atraentes” para os fagócitos. As células mortas e seus fragmentos são rapidamente devorados, antes que seus conteúdos extravasem, e desse modo a morte celular por esta via não inicia uma resposta inflamatória no hospedeiro.

• Causas da apoptose Apoptose em situação fisiológica

A morte por apoptose é um fenômeno normal que funciona para eliminar as células que não são mais necessárias e para manter, nos tecidos, um número constante das várias populações celulares. É importante nas seguintes situações fisiológicas:

o Destruição programada de células durante a embriogênese. o Involução de tecidos hormônios-dependentes sob privação de

hormônio, tal como a célula endometrial que se desprende durante o ciclo menstrual.

o Perda celular em populações celulares proliferativas, como os linfócitos imaturos na medula óssea e no timo que não expressam os receptores antigênicos utilizáveis.

o Eliminação de linfócitos autorreativos potencialmente nocivos. o Morte de células que já tenham cumprido seu papel, tais como

os neutrófilos na resposta inflamatória aguda e os linfócitos ao término da resposta imune.

Apoptose em situações patológicas

A apoptose elimina células que são lesadas de modo irreparável, sem produzir reação do hospedeiro, limitando, assim, lesão tecidual paralela. Podem ser por:

o Lesão de DNA. A radiação, as drogas citotóxicas anticâncer e a hipoxia, podem lesar o DNA diretamente ou através da produção de radicais livres.

o Acúmulo de proteínas anormalmente dobradas. As proteínas impropriamente dobradas podem surgir de mutações nos genes que codificam estas proteínas ou devido a fatores extrínsecos, como a lesão causada por radicais livres.

o Morte celular em certas infecções, particularmente as infecções virais, nas quais a perda de células infectadas é devida em grande parte à apoptose que pode ser induzida pelo vírus.

o Atrofia patológica no parênquima de órgãos após obstrução de ducto, como ocorre no pâncreas, na parótida e no rim.

• Alterações bioquímicas e morfológicas na apoptose

Morfologia:

o Retração celular: célula é menor em tamanho, o citoplasma é denso, as organelas estão compactadas;

o Condensação de cromatina: a cromatina se agrega perifericamente, sob a membrana nuclear, em massas densas de várias formas e tamanhos;

o Formação de bolhas citoplasmáticas e corpos apoptóticos: primeiramente mostra bolhas superficiais extensas, sofrendo então fragmentação em corpos apoptóticos envoltos por membrana compostos de citoplasma;

o Fagocitose das células apoptóticas ou corpos apoptóticos, geralmente pelos macrófagos.

Bioquímica:

As células apoptóticas geralmente exibem uma constelação distintiva de mudanças bioquímicas que são a base das alterações estruturais já descritas.

o Ativação de caspases: o termo caspase é baseado em duas propriedades desta família de enzimas: o “c” refere-se à cisteína protease e “aspase” refere-se à habilidade dessas enzimas em clivar, depois, os resíduos de ácido aspártico. Podem ter função de desencadeador e executor. A presença de caspases ativas, clivadas, constitui um marcador para células que estão sofrendo apoptose;

o Quebra do DNA e proteína: há clivagem do DNA por endonucleases dependentes de Ca2+ e Mg2+ em fragmentos que são múltiplos de 180 a 200 pares de bases, refletindo clivagem entre subunidades nucleossômicas

o Alterações da Membrana e Reconhecimento pelos Fagócitos: uma dessas alterações é o movimento de alguns fosfolipídios (notavelmente a fosfatidilserina) do folheto interno para o folheto externo da membrana, onde são reconhecidos por um número de receptores nos fagócitos. Esses lipídios são também detectáveis pela ligação de uma proteína chamada anexina V; desse modo, a coloração para anexina V é usada comumente para identificar células apoptóticas.

• Mecanismos da apoptose

Todas as células contêm mecanismos intrínsecos que sinalizam morte ou sobrevivência, e a apoptose resulta de um desequilíbrio nesses sinais.

O processo de apoptose pode ser dividido em fase de iniciação, durante a qual algumas caspases se tornam cataliticamente ativas, e fase de execução, durante a qual outras caspases iniciam a degradação de componentes celulares críticos. O início da apoptose ocorre principalmente por sinais originados de duas vias distintas: a via intrínseca ou mitocondrial, e a via extrínseca ou morte iniciada por receptor.

Via intrínseca (mitocondrial) da apoptose

Essa via de apoptose é o resultado do aumento de permeabilidade mitocondrial e liberação de moléculas pró-apoptóticas dentro do citoplasma. As mitocôndrias são organelas notáveis por conterem proteínas como o citocromo c, essenciais para a vida, mas quando liberadas dentro do citoplasma (uma indicação de que a célula não está

saudável), iniciam o programa de suicídio da apoptose. A liberação dessas proteínas mitocondriais é controlada por equilíbrio finamente orquestrado entre membros pró e antiapoptóticos da família Bcl de proteínas.

Existem mais de 20 membros da família Bcl e a maioria deles regula a apoptose. Fatores de crescimento e outros sinais de sobrevivência estimulam a produção de proteínas antiapoptóticas, principalmente Bcl-2, Bcl-x e Mcl-1. Essas proteínas residem normalmente no citoplasma e nas membranas mitocondriais, onde controlam a permeabilidade mitocondrial e impedem o extravasamento de proteínas mitocondriais que possuam capacidade de disparar a morte celular.

Quando a célula é submetida a uma situação de estresse induzem ao estresse do retículo endoplasmático, os sensores de lesão ou estresse são ativados. Esses sensores também são membros da família Bcl e incluem as proteínas denominadas Bim, Bid e Bad, que contêm um único “domínio de homologia Bcl-2” e são chamadas de “proteínas apenas BH3”. Os sensores, por sua vez, ativam dois efetores críticos (pró-apoptóticos), Bax e Bak, que formam oligômeros que se inserem na membrana mitocondrial e criam canais permitindo que as proteínas da membrana mitocondrial interna extravasem para o citoplasma. As proteínas apenas BH3 podem também se ligar a Bcl-2 e Bcl-x e bloquear suas funções, declinando, ao mesmo tempo, a síntese de ambas. O resultado fi nal da ativação Bax-Bak, em conjunto com a perda das funções protetoras dos membros antiapoptóticos da família Bcl, é a liberação para o citoplasma de várias proteínas mitocondriais que podem ativar a cascata de caspases.

Uma vez liberado no citosol, o citocromo c liga-se a uma proteína chamada Apaf-1 (fator-1 de ativação de apoptose, homólogo ao Ced-4 do C. elegans), que forma um hexâmero semelhante a uma roda e que tem sido chamado de apoptossoma. Esse complexo é capaz de se ligar à caspase-9, a caspase desencadeante crítica da via mitocondrial, e a enzima cliva moléculas adjacentes de caspase-9, iniciando, assim, um processo de auto-amplificação. Outras proteínas mitocondriais, com nomes misteriosos como Smac/DIABLO, entram no citoplasma, onde se ligam e neutralizam as proteínas citoplasmáticas que funcionam como inibidores fisiológicos da apoptose (denominadas IAPs). A função normal das IAPs é bloquear a ativação das caspases, incluindo executoras como a caspase-3, e manter as células vivas. Portanto, a neutralização dessas IAPs permite o início da cascata de caspases.

Via Extrínseca da Apoptose (Morte Iniciada por Receptor)

Esta via é iniciada pelo envolvimento dos receptores de morte da membrana plasmática em uma variedade de células. Os receptores de morte são membros da família do receptor TNF que contêm um domínio citoplasmático envolvido nas interações proteína-proteína, chamado de domínio de morte porque ele é essencial para a entrega de sinais apoptóticos.

Os receptores de morte mais bem conhecidos são o receptor TNF tipo 1 (TNFR1) e uma proteína relacionada denominada Fas (CD95), mas muitos outros foram descritos. O mecanismo de apoptose induzido por esses receptores de morte é bem ilustrado pelo Fas, um receptor de morte expresso em muitos tipos celulares. O ligante para Fas é chamado de Fas ligante (FasL). O FasL é expressado nas células T que reconhecem antígenos próprios.

Quando o FasL se liga ao Fas, três ou mais moléculas de Fas se reúnem e seus domínios de morte citoplasmáticos formam um sítio de ligação para uma proteína adaptadora que também contém um domínio de morte e é denominada FADD. A FADD, que é aderida aos receptores de morte, por sua vez, ligase a uma forma inativa da caspase-10 novamente através de um domínio de morte. Múltiplas moléculas de pró-caspase-8 são então trazidas para a proximidade e se clivam entre si para gerar caspase-8 ativa. A enzima então inicia a cascata de ativação de caspases através de clivagem, ativando, desse modo, outras pró-caspases; as enzimas ativas medeiam a fase de execução da apoptose.

Fase de execução da apoptose

Como já vimos, a via mitocondrial leva à ativação de caspase-9 desencadeante e a via de receptor de morte, às caspases 8 e 10 desencadeantes. Depois que uma caspase desencadeante é clivada para gerar sua forma ativa, o programa enzimático de morte é posto em movimento por ativação rápida e sequencial das caspases executoras. As caspases executoras, como as caspases-3 e -6, atuam em muitos componentes celulares.

Essas caspases clivam um inibidor de uma DNase citoplasmática, tornando-a enzimaticamente ativa; esta enzima induz a clivagem típica do DNA em fragmentos do tamanho de nucleossomas, descrito anteriormente. As caspases também degradam os componentes estruturais da matriz nuclear, promovendo, assim, a fragmentação do núcleo.

Remoção de células mortas

A formação de corpos apoptóticos quebra as células em fragmentos “minúsculos” que são comestíveis para os fagócitos. As células apoptóticas e seus fragmentos sofrem também várias alterações em suas membranas que promovem ativamente sua fagocitose de tal modo que são removidos antes de sofrer necrose e liberar seus conteúdos.

Exemplo: células saudáveis, a fosfatidilserina está presente no folheto interno da membrana plasmática, mas nas células apoptóticas este fosfolipídio move-se para fora e é expresso na camada externa da membrana, onde é reconhecido por vários receptores dos macrófagos.

As células que estão morrendo por apoptose secretam fatores solúveis que recrutam os fagócitos. Alguns corpos apoptóticos expressam trombospondina, uma glicoproteína adesiva que é reconhecida pelos fagócito, e os próprios macrófagos podem

produzir proteínas que se ligam às células apoptóticas (mas não às células vivas) e direcionam, assim, as células mortas para o engolfamento.