FUNDAÇÃO TÉCNICO EDUCACIONAL FUNDAÇÃO TÉCNICO EDUCACIONAL SOUZA MARQUESSOUZA MARQUES

FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS

CURSO de QUÍMICA

ProteínasReações de Caracterização e Precipitação

(parte I e II)Determinação da Concentração de Proteínas pelo Método

do Biureto

Trabalho referente à disciplina de Bioquímica Experimental I de 2011/1º do Curso de Química da Fundação Técnico Educacional Souza Marques

ALUNOS: Ana Paula Devescovi Anna Carolina Lopes Claudia Rodrigues Edivanilson Oliveira Elton Rodrigues Fernanda Rangel Mariane Costa Nicola Alessandro Paula Roberta Martins Victor Augusto Ferreira

PROFESSOR: Thiago Novotny DISCIPLINA: Bioquímica Experimental I

Introdução

Proteína (do grego πρωτεϊνη, primeiro) é uma macromolécula encontrada em todas as partes de todas as células, uma vez que são fundamentais e vitais sob todos os aspectos da estrutura e função celulares e, para muitos organismos constituem quase 50% de suas massas. As proteínas são macromoléculas orgânicas formadas pela seqüência de vários aminoácidos, unidos por ligações peptídicas (cadeia polipeptídica). As ligações peptídicas se estabelecem entre o grupo amina de um aminoácido e o grupo carboxila de outro aminoácido, com a perda de uma molécula de água. Portanto, as proteínas são complexos constituídos por cadeias de aminoácido ligadas por ligações peptídicas. São polímeros que se originam de uma reação de polimerização de aminoácidos que são os monômeros.

São substâncias sólidas, de peso molecular extremamente elevado, incolores, coloidais, insolúveis em solventes orgânicos, outras com alguma solubilidade em água, e outras com alguma solubilidade em soluções aquosas diluídas de ácidos, bases ou sais.Todas as proteínas contêm carbono, hidrogênio, nitrogênio e oxigênio e, quase todas contêm enxofre. Algumas proteínas contêm outros elementos adicionais, como fósforo, ferro, zinco e cobre.

NÍVEIS DE ORGANIZAÇÃO: de acordo com o número de cadeias peptídicas, o tamanho destas cadeias e o modo como elas interagem entre si, as proteínas podem apresentar até 4 níveis de organização estrutural chamados estrutura primária, secundária, terciária e quaternária.

► Estrutura primária:

        

- Dada pela  seqüência de aminoácidos e ligações peptídicas da molécula. - É o nível estrutural mais simples e mais importante, pois dele deriva todo o arranjo espacial da molécula.    - A estrutura primária da proteína resulta em uma longa cadeia de aminoácidos semelhante a um "colar de contas", com uma extremidade "amino terminal" e uma extremidade "carboxi terminal". - A estrutura primária de uma proteína é destruída por hidrólise química ou enzimática das ligações peptídicas, com liberação de peptídeos menores e aminoácidos livres

- Sua estrutura é somente a seqüência dos aminoácidos, sem se preocupar com a orientação espacial da molécula.

► Estrutura secundária:         

- É dada pelo arranjo espacial de aminoácidos próximos entre si na seqüência primária da proteína. - É o último nível de organização das proteínas fibrosas, mais simples estruturalmente. - Ocorre graças à possibilidade de rotação das ligações entre os carbonos a dos aminoácidos e seus grupamentos amina e carboxila.      - O arranjo secundário de um polipeptídeo pode ocorrer de forma regular; isso acontece quando os ângulos das ligações entre carbonos a e seus ligantes são iguais e se repetem ao longo de um segmento da molécula.

.

► Estrutura terciária:

- Dada pelo arranjo espacial de aminoácidos distantes entre si na seqüência polipeptídica.  - É a forma tridimensional como a proteína se "enrola". - Ocorre nas proteínas globulares, mais complexas estrutural e funcionalmente. - Cadeias polipeptídicas muito longas podem se organizar em domínios, regiões com estruturas terciárias semi-independentes ligadas entre si por segmentos lineares da cadeia polipeptídica.

- Os domínios são considerados as unidades funcionais e de estrutura tridimensional de uma proteína.

 

► Estrutura quaternária:          

- Surge apenas nas proteínas oligoméricas.    - Dada pela distribuição espacial de mais de uma cadeia polipeptídica no espaço, as subunidades da molécula.  - Estas subunidades se mantêm unidas por forças covalentes, como pontes dissulfeto, e ligações não covalentes, como pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas, etc. - As subunidades podem atuar de forma independente ou cooperativamente no desempenho da função bioquímica da proteína. - A junção de cadeias polipeptídicas pode produzir diferentes funções para os compostos.

O estudo de aspectos importantes da bioquímica nos leva, invariavelmente, ao estudo de proteínas. Portanto, torna-se importante a existência de métodos adequados de purificação e quantificação destes compostos. A purificação e caracterização de uma proteína baseiam-se em suas características físico-químicas.

Reações de Coloração de Proteínas Devido às ligações peptídicas e à presença de diferentes aminoácidos, as proteínas reagem com uma variedade de reagentes, formando produtos coloridos. Algumas reações de coloração são específicas para aminoácidos encontrados na composição das proteínas, por exemplo: reação xantoproteíca (tirosina, triptofano e fenilalamina), reação de Millon (tirosina), reação de HopkinsCole (triptofano), reação de Sakaguchi (arginina), etc. Estas reações, são importantes tanto na detecção como na dosagem de aminoácidos e proteínas.

Outras reações, mais importantes, são aquelas chamadas de gerais, porque irão caracterizar grupamentos comuns a todas as proteínas, ou seja, grupo amino e ligações peptídicas.

Teste com a Ninhidrina A reação da ninhidrina é usada na detecção de aminoácidos por ser característica da função amina primária. O aquecimento da solução de proteínas desestabiliza a estrutura tridimensional do peptídeo. A ninhidrina, então, reage com o grupamento amina, sendo positiva para proteínas, peptídeo, aminoácidos, aminas primárias e amônia, presentes nos aminoácidos, formando como produto final um complexo de coloração azul-violeta, que nem sempre apresenta a mesma intensidade de coloração.A Ninhidrina é um poderoso agente oxidante que reage com -aminoácidos, entre pH 4 e 8. Os aminoácidos prolina e hidroxiprolina são exceções, pois apresentam coloração amarela.

Reação do Biureto A reação do biureto é devida às ligações peptídicas, dando positiva para proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos. A reação é também positiva para as substâncias que contém 2 grupos carbamínicos (-CO-NH2) ligados diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogênio. Este é o caso do biureto que dá reação positiva e de onde provém o nome da mesma. As proteínas ou peptídeos, quando tratados por uma solução de sulfato de cobre, em meio alcalino, dão uma coloração violeta característica.

Precipitação de Proteínas com Desnaturação As proteínas possuem uma estrutura tridimensional bem definida que está relacionada com suas propriedades físicas e biológicas. A modificação na estrutura tridimensional nativa de uma proteína, com a conseqüente alteração de suas propriedades é conhecida como desnaturação. A desnaturação envolve alterações nas estruturas quaternária, terciária e secundária de proteínas, mas não da primária. A desnaturação, usualmente decresce a solubilidade das proteínas. A diminuição da solubilidade pode ser explicada pela exposição de radicais hidrofóbicos e outros que prejudiquem a interação proteína-água e favoreçam a interação proteína-proteína. A desnaturação é o evento primário e importante. A floculação e a coagulação, que muitas vezes são confundidos com desnaturação de proteínas, são simplesmente manifestações visíveis das alterações estruturais causadas pelos agentes desnaturantes. Existem vários agentes desnaturantes de proteínas, tais como: calor, ácidos, álcalis, solventes orgânicos, soluções concentradas de uréia e guanidina, detergentes, sais de metais pesados, etc. Entre as alterações que se observam em decorrência da desnaturação protéica, pode-se citar:diminuição da solubilidade, perda de atividade biológica (por exemplo, da ação enzimática, da ação hormonal), aumento da reatividade de radicais da cadeia polipeptídica, alterações na viscosidade e coeficiente de sedimentação, etc.A precipitação com desnaturação, além de serem utilizadas para caracterizar a presença de proteínas em solução, também é útil para proceder a desprotenização de líquidos biológicos para análise de componentes não protéicos.

Precipitação por ação do calorA estrutura terciária de uma proteína é mantida por interações hidrofóbicas entre os radicais apolares que se abrigam no meio aquoso, procurando se agruparem no interior do glóbulo protéico, pelas atrações iônicas entre os radicais carregados com cargas opostas, pelas pontes dissulfeto, pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas ou ainda pelas Forças de Van der Waals. Ao fornecer energia a um meio aquoso contendo proteínas, atrações entre os radicais são desfeitas e a proteína é "desenrolada", expondo, ao meio aquoso seus radicais apolares que estavam contidos no seu interior. Isto é que leva à desnaturação.

Precipitação por reação com os reagentes para alcalóides Determinados agentes, como os reagentes para alcalóides podem ser usados na precipitação de proteínas, o que é útil na desproteinização de materiais biológicos, como o sangue: ânions de ácidos complexos (tricloroacético, tânico, fosfotúngstico) formam sais insolúveis onde a proteína funciona como cátion.

Precipitação por Reação com Sais de Metais Pesados A adição de sais de metais pesados, tais como mercúrio, chumbo, cobre e zinco, levam à formação de sais denominados "quelatos" entre os aminoácidos ácidos e estes metais. A proteína precipita porque estes sais são insolúveis em água e também porque, com a quebra das ligações iônicas, os aminoácidos hidrofóbicos ficam mais expostos ao meio aquoso.

Precipitação por Ação de Solventes Orgânicos

A adição de solventes orgânicos, como o etanol, éter etílico e acetona, às soluções aquosas de proteínas pode levar à precipitação das mesmas. Isto pode ser explicado pelo fato destes solventes apresentarem uma constante dielétrica inferior à da água. Solventes orgânicos em baixas temperaturas (0º C ou menos) são úteis para a separação de misturas protéicas, porque as proteínas podem ser precipitadas sem sofrerem desnaturação.Entretanto, a temperatura mais elevada, os solventes orgânicos podem levar à desnaturação por romperem pontes de hidrogênio e interações apolares, importantes na manutenção da conformação protéica.A água tem uma alta constante dielétrica, assim a força de atração entre moléculas protéicas contendo radicais com cargas opostas é baixa, predominando a interação proteína-água em vez da interação proteína-proteína. A adição de solventes pode inverter esta situação, levando à agregação e precipitação das moléculas protéicas.

Solubilização (Salting In)

Efeito da Força Iônica sobre a Solubilidade das Proteínas A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das proteínas é uma função de sua força iônica, que tanto depende de sua concentração como na valência de cátions e ânions que formam o sal. Em concentração reduzida, os sais aumentam a solubilidade de muitas proteínas, um fenômeno denominado “salting-in”, provavelmente devido à interação da proteína com os sais causando diminuição da interação proteína-proteína e, portanto, aumentando a solubilidade.

Precipitação (Salting Out)

Reações de Precipitação sem Desnaturação

As proteínas podem ser precipitadas sem sofrer desnaturação por ação de solventes orgânicos, como foi explicado anteriormente, variação do pH e por alterações da força iônica do meio. A variação do pH pode ser usada para precipitar proteínas no seu ponto isoelétrico, pH no qual a repulsão eletrostática entre as moléculas é mínima. Este efeito é denominado de “salting- out”.As proteínas podem ser ressolubilizadas mantendo as suas características estruturais nativas por uma variação de pH acima ou abaixo do ponto isoelétrico.

CASEÍNA

A caseína (do latim "caseus", queijo) é uma proteína do tipo fosfoproteína encontrada no leite fresco. Representa cerca de 80% do total de proteínas do leite. Quando coagulada com renina é chamada de "paracaseína" (caseína de coalho) e, quando coagulada através da redução de pH (utilização de ácidos) é chamada "caseína ácida". A terminologia britânica usa o termo "caseinogênio" quando a proteína não está coagulada e "caseína" quando a proteína está coagulada. Como existe no leite é um sal de cálcio.

A caseína não coagula com o calor. É precipitada pelos ácidos ou pela renina, uma enzima proteolítica produzida no estômago dos vitelos (bezerros) recém-nascidos (também é produzida por alguns tipos de plantas e micróbios). A enzima tripsina hidrolisa a peptona retirando o fosfato.

A caseína contém um número razoavelmente alto de peptídeos de prolina que não interagem. Não apresenta nenhuma ponte dissulfeto. Como conseqüência apresenta relativamente pouca estrutura secundária ou estrutura terciária, não formando estruturas globulares. Por isso não pode desnaturar. É relativamente hidrofóbica, tornando-se pouco solúvel em água. Encontra-se no leite como uma emulsão de partículas de caseína (micelas de caseína), de modo que a região hidrófoba (apolar) fica no interior e a região hidrófila (polar) na superfície exposto a água. As caseínas das micelas se prendem juntas por íons de cálcio e interações hidrofóbicas.

Além de ser consumido no leite, produção de derivados do leite (como queijo), a caseína é usada na produção de adesivos, plásticos (para punhos de facas, cabos de guarda-chuvas, botões, etc), como aditivo de alimentos e para a produção de vários produtos alimentícios e farmacêuticos.

O ponto isoelétrico da caseína é 4.6. É o ponto de pH em que ela precipita (coagulação ácida). A proteína purificada é insolúvel em água. Enquanto é insolúvel em soluções salinas neutras, prontamente se dispersa em meio alcalino diluído e em soluções salinas tais como oxalato de sódio e acetato de sódio. Além disso, a caseína faz muito bem à saúde.

Algumas pessoas com autismo e síndrome de Asperger são sensíveis a caseína e ao glúten. Antigamente pensava-se que autistas tinham incompatibilidade com lactose, mas descobriu-se que na verdade é com a caseína. A síndrome de Asperger é uma síndrome do espectro autista, diferenciando-se do autismo clássico por não apresentar nem retardamento no desenvolvimento cognitivo ou da linguagem do portador.

Curiosidade: A caseína, proteína presente no leite é uma proteína bastante completa, pois ela possui todos os aminoácidos essenciais, ou seja, os aminoácidos que são necessários para o corpo humano e não são produzidos pelo organismo.

ESPECTROFOTOMETRIA

É uma técnica analítica que utiliza o espectro eletromagnético para determinar a concentração de espécies químicas.Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ou emissão de radiação eletromagnética por muitas moléculas, quando seus elétrons se movimentam entre níveis energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de onda entre o ultra violeta e o infra vermelho.Inúmeras moléculas biológicas possuem a propriedade de absorver luz, o que possibilita a sua quantificação por essa técnica.Existem diversos métodos para dosagem de proteínas, neste experimento foi utilizado o método do biureto, que foi um dos primeiros ensaios colorimétricos a serem desenvolvidos.

DOSAGEM DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO

O biureto é um composto formado pelo aquecimento da uréia a 180ºC que, quando colocado em presença de uma solução de sulfato de cobre em meio fortemente alcalino, apresenta um composto de coloração azul. O método do biureto está baseado na absorbância das espécies formadas da reação dos corantes com as proteínas da solução e, consiste numa reação colorimétrica, gerando a espécie abaixo:

1

Tal reação dos íons Cu2+ em meio alcalino com os nitrogênios das proteínas produz uma coloração azulada (absorve em 540nm), o que possibilita o uso da fotometria para determinar a absorbância da amostra de proteínas simples, já que as soluções de proteínas conjugadas possuem coloração, impedindo o uso do método.

Pela lei de Lambert - Beer, a absorbância de uma amostra será dada por:A = a.b.c

Onde a é a absortividade molar do composto, b é o caminho ótico atravessada pela luz e c é a concentração molar.

Resultados e Discussões1

PARTE I – Prática 4

Experimento 01 – Reações de coloração de proteínas

Reação da ninhidrina

Observou-se a mudança de coloração da solução que antes era incolor e tornou-se violeta – azul escuro opaco.

Reação do biureto

Todos os tubos tiveram sua coloração inicial alterada após a adição de sulfato de cobre (CuSO4). O primeiro tubo adquiriu coloração púrpura e, o segundo, azul claro. Uma vez que a reação do biureto é caracterizada por identificar a presença de proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos, no qual uma substância adicionada, o sulfato de cobre, interage com as ligações peptídicas, pode-se concluir que a primeira amostra adquire coloração púrpura, devido à presença de proteínas. Já a segunda amostra, apresentou uma coloração azul-clara, indicando assim a ausência de ligações peptídicas.

Experimento 02 – Reações de precipitação de proteínas com desnaturação

Reação de precipitação por aquecimento Colocou-se 2 ml de solução de proteínas em um tubo de ensaio que foi aquecido diretamente na chama. Nesse experimento, a formação do coágulo branco ocorre graças ao calor que, ao provocar a agitação térmica da molécula protéica, rompe as interações entre os átomos, afetando sua estrutura tridimensional e consequentemente, diminui a solubilidade da proteína.

Reação de precipitação com reagentes para alcalóides Foi possível identificar a formação de um precipitado esbranquiçado e viscoso grudado na parede do tubo logo que se adicionou o ácido tricloroacético (TCA). Nesse experimento, o sal serve como ‘ponte’/interage entre a proteína e o meio, auxiliando assim, as interações proteína-água. O fato de se adicionar ácido tricloroacético solução de proteínas, reduz o ph do meio, tornando positiva a carga da proteína, o que contribui para a formação de umcomplexo insolúvel – o tricloroacetato de proteína. Além disso, vale ressaltar que o sal atua como uma ponte entre a proteína e o meio. Adicionando-se o ácido, diminui a concentração de sal e a interação proteína-água.

Reação de precipitação com sais de metais pesados Observou-se pequenos precipitados semelhantes a fios brancos na solução. O acetato de chumbo, na solução protéica, dissocia-se, liberando seus cátions e torna o meio alcalino. Essa característica do meio – pH situado no lado alcalino do ponto isoelétrico das proteínas - é favorável à combinação de algumas proteínas com os cátions do sal, formando proteinatos insolúveis.Reação de precipitação por ação de solventes orgânicos

Formou-se uma mistura esbranquiçada, gelatinosa, devido a desidratação da proteína. A interação proteína-água é maior que a interação proteína-proteína devido à baixa força de atração entre as moléculas protéicas, fazendo com que a proteína se solubilize na água. Com a adição do álcool etílico (solvente orgânico) na água, ocorre sua solubilização, rompendo as interações proteína-água, proporcionando a interação proteína-proteína; o fato de a temperatura estar elevada (temperatura ambiente) leva à sua desnaturação devido à quebra das pontes de hidrogênio e interações apolares, importantes na manutenção da estrutura protéica.

Experimento 03 – Reações de precipitação sem desnaturação

Efeito da força iônica sobre a solubilidade amostra 2d. “Salting – in”: Com a adição de um volume muito pequeno de NaCl foi possível a redissolução do precipitado anteriormente formado. Em baixas concentrações de sais (baixa força iônica), a solubilidade em geral aumenta, pois os íons salinos tendem a se associar às proteínas contribuindo para uma hidratação e/ou repulsão entre as moléculas, aumentando a solubilidade “salting in”.

“Salting – out”: A solução com a adição de sulfato de amônio ficou esbranquiçada (turva) e, observou-se o precipitado de cor branca formado. Então, após o acréscimo de 4 a 6 ml de água destilada houve a redissolução desse precipitado. Tais fenômenos estão relacionados à precipitação da proteína sem que ocorra a sua desnaturação. O “salting – in” dá-se pela solubilização do precipitado elevando-se a concentraçãode sais no meio e também às interações proteína-água. Enquanto o “salting – out” corresponde à precipitação da proteína através da adição de sais com alta força iônica (sais higroscópicos) que se ligam a água, havendo a predominância da interação proteína-proteína. Nesse caso, analisando-seas duas fases formadas, a primeira – esbranquiçada – corresponde às primeiras proteínas a se precipitarem, as globulinas. Já a porção transparente refere-se à água. É importante ressaltar que a precipitação de proteínas pela alta concentração de sais é um processo muito importante para aseparação de misturas complexas de proteínas, uma vez que a concentração de sal necessária para precipitar diferentes proteínas é variável.

PARTE II – Prática 5

Precipitação isoelétrica da caseína

Com uma pipeta de 2 mL adicionou-se, gota a gota, HCl com agitação até coagular o leite (ponto isoelétrico). Com o auxilio de um potenciometro, mediu-se o pH e anotou-se o volume de HCl gasto.

Adicionou-se, gota a gota, NaOh com agitação até passar novamente pelo ponto isoelétrico e, total dissolução dos gumos de caseína, anotando-se o valor de pH.

pH V (mL)

4,67 11,00

2,45 27,00

3,22 4,00

4,64 6,60

Gráfico ??????????????

PARTE III – Prática 6

– Curva de Calibração e dosagem de proteína

Pipetou-se os valores estipulados de água, proteína padrão e reagente do

biureto em cada tubo de ensaio, conforme a Tabela 1. Para dar maior confiabilidade

nas diluições, utilizamos um agitador de tubos e os deixamos em repouso por 10

minutos. Após, fizemos a leitura no espectrofotômetro, lendo a absorbância em 540

nm.

Utilizou-se uma solução padrão com diferentes concentrações (Tabela 1) e foi

traçada a curva de calibração em que no eixo das abscissas estão às concentrações

e nas ordenadas às respectivas absorbâncias (Gráfico 01).

Assim, devido às concentrações de proteínas nos tubos e da reação destas

com o reagente do biureto, pode observar um gradiente de coloração em que:

O tubo 1 (branco), contendo apenas água e a solução do biureto, possuía

uma coloração azulada e foi utilizado para calibrar o espectrofotômetro,

Do tubo 2 ao 6, com o aumento da concentração de proteínas, observou um

gradiente da cor lilás.

Os tubos 7 e 8 apresentaram coloração lilás intermediaria as dos tubos 2 ao

6.

Tabela 1 – Composição dos tubos - determinação da curva de calibração.

Branco Curva de calibração Pf Pt

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8

Padrão de proteína (mL) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 0

Amostra (mL) 0 0 0 0 0 0 1,0 1,0

Água destilada (mL) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0

Reagente do biureto (mL) 5

Tabela 2 – Dados da análise dos tubos de ensaio no espectrofotômetro.

Branco Curva de calibração Pf Pt

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8

Absorbância 0 0,036 0,072 0,107 0,141 0,191 0,136 0,091

[ ] (mg/mL) 0 1 2 3 4 5 ? ?

Com esses dados foi possível construir a curva de calibração que está

representada no gráfico 1.

Gráfico 01 – Curva de calibração - absorbância versus concentração de

proteínas

Com a análise do gráfico foi possível fazer algumas constatações:

Na curva de calibração obteve-se uma reta entre os limites de concentração

de cada uma das soluções padrão, portanto obedecem a Lei de Lambert-

Beer.

A curva padrão obtida está de acordo com o esperado, ou seja, apresentou

uma relação diretamente proporcional entre as absorbâncias e concentrações

das soluções padrão.

Esta porção linear englobou a maioria dos pontos, o que garante um limite

bom de sensibilidade do método. Desta forma, se os valores de concentração

encontrados para Pf e Pt, pela extrapolação dos dados de absorbância na

reta, estiver entre os pontos será um valor confiável, pois está dentro da

sensibilidade do método.

Como a curva de calibração foi obtida com êxito, então é possível determinar

de forma precisa as concentrações de Pf e Pt.

Para esta determinação fez uso do gráfico da Curva de calibração, ao incluir

os dados de absorbância de Pf e Pt e extrapolar esses valores na curva e por

conseguinte no eixo de concentração obteve-se o gráfico 2 e os valores de

concentração de Pt é 2,51 mg/ml e Pf é 3,7 mg/mL, aproximadamente

Gráfico 02 – Determinação da concentração de Pt e Pf

Para confirmar esses valores, ainda com o auxilio do gráfico, fez-se uso de

algumas relações:

Fator de conversão.

De acordo com a literatura, a partir dos valores de absorbância e

concentração de cada uma das soluções padrão, pode-se calcular um Fator de

Calibração e como são vários padrões determinou-se o Fator de Calibração Médio a

partir de:

FC = concentração padrão / absorbância padrão

FCM = Σ FC / nº de FC

Tubo 01 (branco) FC = 0,

C = 0, absorbância = 0

Tubo 02 FC = 1 / 0,036

FC = 27,778

Tubo 03 FC = 2 / 0,072

FC = 27,778

Tubo 04 FC = 3 / 0,107

FC = 28,037

Tubo 05 FC = 4 / 0,141

FC = 28,369

Tubo 06 FC = 5 / 0,191

FC = 26,178

Portanto,

FCM = 138,14 / 5

FCM = 27,628

Tabela 3 – Valores de FC e FCM

Branco Curva de calibração

Tubos 1 2 3 4 5 6

FC 0 27,778 27,778 28,037 28,369 26,178

FCM 27,628

E com esses valores, a determinação da concentração de Pf e Pt é feita pela relação:

[amostra] = Absorbância da amostra x FCM

Pf – Tubo 07 [ ] = 0,136 x 27,628

[ ] = 3,757 mg/mL

Pt – Tubo 08 [ ] = 0,091 x 27,628

[ ] = 2,514 mg/mL

Lei de Lambert-Beer

Ainda é possível determinar o valor da concentração por outra relação:

ABS = k . C

Lei de Lambert-Beer: absorbância é linearmente proporcional a concentração.

Está equação é associada ao gráfico obtido e corresponde a uma equação da

reta reduzida que passa pela origem, ou seja:

Equação da reta reduzida: y = ax + b

a = coeficiente angular

x = valor da concentração

y = valor da absorbância

b = coeficiente linear (valor que a curva toca no eixo y, neste caso é igual a 0,

pois o gráfico passa pela origem do plano cartesiano).

Voltando na lei de Lambert-Beer,

y = ax ABS = k [ ]

Em que k é corresponde a x (coeficiente angular) e este coeficiente é

determinado por:

y b – y a / x b – x a

ou ABS b – ABS a / [ ] b – [ ] a

Assim, pelo gráfico escolheram-se os valores que estavam precisamente em

cima da reta, ou seja, valores do tubo 2 e 4:

k = 0,107 – 0,036 / 3 – 1 - k = 0,0355

Finalmente, os valores da concentração de Pf e Pt são determinados:

ABS = k [ ] [ ] = ABS / k

Pf – Tubo 07 [ ] = 0,136 / 0,0355

[ ] = 3,831 mg/mL

Pt – Tubo 08 [ ] = 0,091 / 0,0355

[ ] = 2,563 mg/mL

Tabela 4 – Valores de concentração de Pt e Pf

Pela extrapolação

do gráfico

Pelo Fator de

Calibração Médio

Pela Lei de

Lambert-Beer

Pf 3,7 mg/ml 3,757 mg/mL 3,831 mg/mL

Pt 2,51 mg/ml 2,514 mg/mL 2,563 mg/mL

Observa-se que existem algumas divergências dos valores pelos diferentes

métodos de determinação da concentração, devido a erros de leitura, aproximações

entre outros indeterminados, mas todos se encontraram na mesma faixa e, portanto

são considerados confiáveis.

Determinação da porcentagem de caseína

Os valores da concentração utilizados para Pf e Pt foram os obtidos pelo

FCM, por ser um valor intermediário aos outros dois métodos utilizados.

Entretanto esse valor de concentração não é o real, pois foram feitas

diluições, assim é necessário fazer as correções:

Pf diluído em 1:2 (C real = C calculado x 2)

C real = 3,757 x 2

C real = 7,514 mg/ml

PT diluído em 1:20 (C real = C calculado x 20)

C real = 2,514 x 20

C real = 50,28 mg/ml

E, para a determinação da concentração de caseína,

C caseína = C real Pt – C real Pf

C caseína = 50,28 – 7,514

C caseína = 42,766 mg/mL

E para a determinação da % de caseína,

% caseína = (C caseína / C real Pt) x 100

% caseína = (42,766 / 50,28) x 100

% caseína = 85,06%

QUESTIONÁRIOS

*PARTE I – Prática 4

1- Em que se fundamenta a reação da ninhidrina e que classes de substâncias reagem positivamente?

Por ser um agente oxidante muito poderoso, a ninhidrina reage com o aminoácido da cadeia. A classe do grupo ionizável que determina suas propriedades anfóteras.A ninhidrina caracteriza proteínas, peptídeos, aminoácidos, aminas primárias e amônia. Eles são detectados por ela devido à formação da cor azul

2- Em que se fundamenta a reação do biureto e que grupos de proteínas são responsáveis por esta reação?

O cobre, em meio alcalino, reage com proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica(íons cúpricos com os elétrons desemparelhados do nitrogênio da ligação peptídica). A intensidade da cor depende exclusivamente da concentração da proteína.

Substâncias que contenham duas carbonilas ligadas diretamente ou através de um átomo de nitrogênio ou carbono. Peptídeos que contenham no mínimo duas ligações peptídicas e proteínas em geral.

As proteínas apresentam muitas ligações peptídicas, quando tratadas com o Reagente de Biureto, produzem uma coloração cuja intensidade obedece a Lei de Lambert-Beer.

3- Qual a importância da reação do biureto?Essa reação pode ser utilizada para verificar a presença de proteínas em

materiais biológicos, como também para quantificá-las, já que as ligações peptídicas estão presentes na mesma freqüência por grama do material a ser analisado. Ela está menos sujeita a erros devido à presença de contaminantes nas amostras biológicas.

4- Qual a importância das reações de precipitação de proteínas por sais de metais pesados? Explique o mecanismo da precipitação.

Porque esses precipitados são insolúveis em água. Esses processos são utilizados para trabalhar com material biológico que envolve uma desproteinação para evitar interferências no processo de dosagem.

No nosso experimento foi usado acetato de chumbo. Ele dissocia-se na solução prótica, liberando cátions e deixando a solução alcalina, assim proteínas reagem com o cátion do sal, formando moléculas insolúveis.

5- Explique o mecanismo que leva uma proteína a dissolver-se em um pequeno aumento de força iônica da solução e, o que leva a precipitar-se em um grande aumento da força iônica.

Quando sais neutros são adicionados ao sistema ocorre um aumento da força iônica do sistema. Os íons carregados provenientes da dissociação dos sais passam a interagir com as moléculas protéicas, diminuindo a interação entre as próprias moléculas da proteína. Deste modo, temos um aumento na solubilidade da proteína em meio aquoso. A esse fenômeno dá-se o nome de salting-in.

Em condições de elevada força iônica, as moléculas de água apresentam maior tendência de solvatação de partículas (nesse caso, íons). As moléculas de água, desse modo, interagem mais com os íons, desfazendo suas interações com a estrutura protéica. Como conseqüência, temos: maiores interações proteína-proteina, resultando na diminuição da solubilidade em meio aquoso. A esse fenômeno dá-se o nome se salting-out.

6- Que mudanças ocorrem com uma proteína quando em contato com o etanol?

A adição de álcool numa solução protéica faz com que as proteínas precipitem, por causa do abaixamento da constante dielétrica da solução.

Constante dielétrica é a capacidade que um solvente tem de se intrometer entre dois íons de cargas opostas, separando-os e solvatando-os.

No caso do álcool, a constante dielétrica é baixa, portanto, ele não consegue se intrometer entre os íons e, com isso as proteínas se aglomeram e precipitam.

7- Observar o diagrama da apostila e responder: Como é possível separar as proteínas A e B?

Diminuindo-se a concentração de sulfato de amônio, porque apenas a proteína A, em 3mol/L iria precipitar e a proteína B continuaria em solução.

*PARTE II – Prática 5

1- Qual o ponto isoelétrico da caseína?O ponto isoelétrico da caseína é 4.7.2- O que é ponto isoelétrico? Como ele determina o comportamento eletroforético das proteínas?

Ponto isoelétrico (PI) de uma proteína é o pH no qual a proteína apresenta cargas positivas e negativas com mesmo número sendo, portanto, a soma de todas as cargas igual a zero.

É o valor de pH onde as cargas elétricas dos aminoácidos se igualam e se anulam e então ela precipita (coagulação ácida). A proteína purificada é insolúvel em água. Enquanto é insolúvel em soluções salinas neutras, prontamente se dispersa em meio alcalino diluído e em soluções salinas.

A carga elétrica de uma molécula protéica varia em função da diferença entre o pH do meio no qual ela se encontra e, o seu ponto isoelétrico.

Se temos uma proteína em pH igual ao ponto isoelétrico a sua carga é nula. Para baixarmos o pH adicionamos um ácido que carreia prótons H+, isso fará com que a proteína assuma uma carga positiva e, por outro lado quando elevamos o pH adicionando uma base que capta prótons fazendo com que a proteína perca-os e assuma carga negativa. Portanto, qualquer proteína apresenta carga positiva em pH abaixo do ponto isoelétrico, nula em PI e negativa acima dele.

*PARTE III – Prática 6

1- Qual a finalidade e o fundamento da técnica espectrofotométrica?

O método espectfométrico foi desenvolvido com a finalidade de dosar substâncias biológicas. Neste método são utilizadas reações que resultam em soluções coloridas. A intensidade da cor produzida é proporcional à concentração da substância que está sendo dosada. Em conseqüência desta proporcionalidade, é possível dosar substâncias em soluções de concentração desconhecida (amostra), ao comparar a intensidade da cor produzida por esta substância à intensidade da cor produzida pela mesma substância em outra solução onde a concentração é previamente determinada (padrão).

2- Conceitue: faixa de sensibilidade do método espectrofotométrico.Conceitua-se faixa de sensibilidade como sendo a concentração do

elemento em microgramas por mililitros ugl , que é necessária para produzir 1% de absorção , ou 0,0044 unidades de absorbância para a mesma concentração.

3- Determine a composição e defina a importância dos tubos branco e padrão na determinação da concentração de um composto pelo método espectrométrico.

Tubo branco: irá conter todos os reagentes do ensaio, menos a amostra. È, utilizado para zerar o instrumento, descontando a cor dos reagentes utilizados no ensaio.

Tubo padrão: irá conter a mesma classe de substâncias presentes na amostra, porém de concentração conhecida e será utilizada para a confecção da curva de calibração. Através da análise da curva de calibração e, das medidas aferidas, torna-se possível calcular a concentração da amostra desconhecida.

4-   Ca=Cp x Aa/Ap Ca = 0,75 x 0,85/0,4 = 1,59mmol/mL.

5-

CONCLUSÃO

As reações de coloração e precipitação (com ou sem desnaturação) de proteínas permitem a caracterização dessas pela análise de suas propriedades químicas e físicas, entre elas, a presença de ligações peptídicas, estrutura molecular, solubilidade, força iônica e concentração molar. A detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reações especificas com determinados reativos, os quais originam substâncias coloridas que absorvem luz na região visível, permitindo a sua quantificação.

No entanto, as reações de coloração não alteram a estrutura tridimensional da proteína, ao contrário das reações de precipitação que podem alterar as estruturas quaternárias, terciárias e secundárias das proteínas como as reações por ação térmica, presença de alcalóides, sais de metais pesados e solventes orgânicos. Já as reações denominadas “ Salting-in” e “Salting-out” precipitam o material sem a desnaturação.

Na prática da dosagem por biureto, pode-se observar que com o aumento da concentração de proteínas, há, também, um aumento no valor da absorbância medida no espectrofotômetro na faixa de 540 nm.

Através dos resultados obtidos através do espectrofotômetro, foi possível calcular as curvas de calibração. Em toda leitura deve haver um tubo considerado o branco, onde não há o material de estudo, e nos demais tubos a concentração do material aumenta gradativamente, gerando um gradiente.

Os cálculos apresentados têm como objetivo mostrar a concentração de caseína presente no material estudado, que foi retirada através da ação do ácido clorídrico. Uma relação pode ser descrita para para mostrar a concentração da caseína: Tubo 8 – Tubo 7 (PT – PF). Notamos que a porcentagem de caseína encontrada está de acordo com a literatura, o que indica que, apesar de erros laboratoriais, o experimento mostrou boa confiabilidade.

O valor de % de caseína encontrado está de acordo com o encontrado na literatura

BIBLIOGRAFIA

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