priscila carmona papel da resposta celular antígeno-específica na

Priscila Carmona

Papel da resposta celular antgeno-especfica na

tolerncia operacional

Dissertao apresentada Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Mestre em Cincias

Programa Alergia e Imunopatologia Orientadora: Vernica Porto Carreiro de Vasconcellos Coelho

So Paulo 2016

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

reproduo autorizada pelo autor

Carmona, Priscila Papel da resposta celular antgeno-especfica na tolerncia operacional / Priscila

Carmona. -- So Paulo, 2016.

Dissertao(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Programa de Alergia e Imunopatologia.

Orientadora: Vernica Porto Carneiro de Vasconcelos Coelho. Descritores: 1.Transplante de rim 2.Tolerncia ao transplante 3.Rejeio de

enxerto 4.Linfcitos T 5.Citocinas 6.Antgenos 7.Citomegalovrus 8.Chaperonina 60

USP/FM/DBD-282/16

Agradecimentos Deus, por tudo!!!!!

Este trabalho foi realizado com muito amor e dedicao, portanto,

agradeo imensamente pela considerao e confiana que me foi dada,

obrigada pela colaborao e apoio das pessoas envolvidas como os

profissionais (pesquisadores, doutores, mestres e tcnicos), pacientes, amigos

e famlia.

Agradeo as pessoas mais importantes da minha vida, os meus pais,

Carme e Roberto, pelo incentivo, compreenso, cuidado, ajuda, auxlio

(financeiro, psicolgico e sentimental), amor, enfim, por estarem ao meu lado

em todos os momentos. Aos meus irmos Binho e Paulinho e minhas cunhas

Jenny e Tami, por serem to especiais, cuidarem de mim e por me darem fora

em todos os momentos, tambm perfeita princesa mais linda do universo, a

Alicia, por trazer mais brilho s nossas vidas. melhor amiga, minha linda e

querida irm, Pati no tenho palavras para dizer o quanto voc especial e o

quanto sou grata por tudo o que voc , fez e faz por mim. Obrigada pelos

choros e risos, tambm por ir ao lab comigo no Natal, Ano Novo, buscar

amostras no Aeroporto tarde da noite me acompanhando at de madrugada,

obrigada por me ouvir, me ajudar de todas as formas, tanto monetariamente,

quanto psicologicamente, voc sensacional. Minha famlia, a mais linda e

especial do universo, meu porto seguro, amo muito vocs, com todas as

minhas foras e de todo meu corao!!!!

Meu amor, lindo Edu, obrigada por ser to companheiro, amigo e

incentivador, estando sempre ao meu lado me amando e cuidando de mim, Te

amo muito!!!!

A minha famlia em geral, os Carmonas, Souzas, Miyamotos e Higashis,

especialmente V Nilza, D. Wanda, Karla, Yuki, Eli e Su pelas oraes,

estudos, companheirismo e amizade.

Enfim, so tantas pessoas especiais em minha vida, que cometeria

grave erro por no colocar todos os nomes aqui, alm disso, os

agradecimentos seriam poucos para o tanto que vocs merecem.

Muito obrigada Veronica, minha orientadora querida, que me inseriu e

me guiou no complexo universo da cincia e pesquisa, me fazendo pensar (ir

alm do que os olhos possam ver), ter vontade de prosseguir, dando

tranquilidade nos momentos de desespero, pela motivao, pacincia e

disponibilidade. Sem voc nada disso aconteceria.

Ao Prof. Kalil por me receber to bem no laboratrio, pela oportunidade,

dicas, discusses cientficas e ensinamentos muito construtivos.

Aos pesquisadores Prof. Edcio Cunha-Neto e Dra Luiza Guilherme,

pela disponibilidade, sugestes e discusses intelectuais.

A Yordanka, por estar ao meu lado, pelo paper e auxlio quando

estvamos sem a Ve.

Ao grupo TX, pela amizade, compreenso e auxilio, sem dvida nos

tornamos uma famlia: San (forte e guerreira), Janinha (paciente, encorajadora,

obrigada pelas mensagens de incentivo, pelos whats de preocupao, por me

ajudar nas correes, pelo carinho), Madacita (alegre e prestativa, chegar de

manhazinha e te ver sempre me dava alegria), Amandinha (minha amiga

verdadeira e companheira dentro e fora do lab, voc foi sempre sensacional

para comigo, sua linda), Dani (sempre preocupada e empolgada, a doceira

mais talentosa), Jamile (nova amiga, forte e guerreira), Maluzinha, Marici,

Gege, Dashnna, todos vcs moram em meu corao, obrigada pelas

discusses, por me ouvirem e cuidarem de mim nos momentos difceis.

Tambm, agradeo a amizade e carinho das pessoas especiais que passaram

pelo grupo: Ana C., Ana P., Andy, Helen, Pri Tedesco, Marcus e Gabizinha, vcs

deixaram a marquinha, so muito especiais para mim.

Aos meus amigos queridos: Moni, Fezinha (pela disponibilidade em

ajudar sempre), Van, Karla, Isa, Li, Carlo, Darlan. A Rose pelos conselhos,

experincias vividas, berinjelas no dueto, amizade, toques e aos nossos

momentos de choros e risos que nos fizeram to bem.

Ao pessoal dos grupos do lab bioqumica (Dia Kuramoto (sempre que

precisava vc estava disposta a ajudar), Maris, Ludy, Hamendra, Amanda), FR

(Samar, Selminha, Simoninha, Karen, Raquel, Edil, Luis, Washington, Fred). Ao

pessoal animado do HLA (Dr. Helcio, Dr. Nicholas, Carlos S., Gis e R

(obrigada por me acudirem nos momentos de desespero e sempre me darem

fora), K, Lilian, Mario, Olguinha, San, Fe, Cami, Fi, Carol, Celinha, Marcelo,

Ger, Dia, Clod, Clau, Su).

A todos os alunos e amigos da ps, nossas reunies de quinta sempre

muito produtivas, obrigada tambm pela disponibilidade em apresentarem nas

reunies.

Aos fofos e companheiros Rainha, Laininha e Clecl, pelos nossos

almoos, conversas, amizade, palavras de conforto, docinhos, mimos, risadas

e carinho.A turma da diretoria Soninha, Sr. Jair, Fe Alegria e Paulo, essa

equipe forte, por serem sempre prestativos e compreensivos.

As meninas da limpeza por deixarem tudo sempre cheiroso e limpinho.

A equipe da ps, como o Prof. Esper e a Eleni (muito fofa e prestativa,

obrigada por toda ajuda), por sempre nos darem suporte. A toda a galera do

LIM60 e a Carol (do luminex, pela disponibilidade e compreenso sempre),

pelos socorros quando precisvamos.

Ao pessoal do Projeto Imunologia nas Escolas (Paulo, Silvia, Sandra,

Dani, Monica) pela fora, discusses, aulas e idas na escola, foi muito bom

trabalhar com vocs.

Com muito carinho, ao Dr. Pedro por cuidar dos meus olhinhos, a Dra

Dbora por cuidar das minhas dores e a Gabi, por me chamar nos concursos.

Vocs foram e so bnos para mim.

Agradeo tambm Faculdade de Medicina da USP (pela abertura das

portas, pela educao de qualidade) Capes (pelos dois anos de bolsa), a

equipe dos outros centros de estudo por sempre fornecerem as amostras,

especialmente Amanda (da UEL), Dr. David S., e as meninas da UTR, pelo

recrutamento e telefonema aos indivduos participantes do estudo. E um super

obrigado a todos os indivduos que participaram deste projeto, nos quais

utilizamos as suas clulas, que Deus cuide de cada um, dando foras e sade,

sem estas pessoas, nosso trabalho no seria possvel.

Desculpe-me se esqueci algum, mas agradeo de todo corao a todos

do lab, e aqueles que estiveram em minha vida nestes momentos de luta,

alegrias, tristeza e desespero, sofrimentos, novidades, sabendo que, apesar de

tudo isso, estamos firmes e fortes prontos para o prximo desafio, com muita f

e amor!

Sumrio Lista de Figuras................................................................................................................i

Lista de Tabelas...............................................................................................................ii

Resumo...........................................................................................................................iii

Abstract...........................................................................................................................iv

1. Introduo................................................................................................................1

2. Objetivo..................................................................................................................25

2.1 Objetivo geral...................................................................................................25

2.2 Objetivos especficos........................................................................................25

3. Material e Mtodos.................................................................................................26

3,1 Delineamento experimental..............................................................................26

3.2 Sujeitos de pesquisa........................................................................................27

3.3 Material coletado..............................................................................................28

3,4 Obteno de clulas mononucleadas do sangue perifrico.............................29

3.5 Congelamento e descongelamento de clulas.................................................30

3.6 Marcao celular com CFSE............................................................................31

3.7 Seleo de peptdeos.......................................................................................32

3.8 Cultura celular com antgenos para coleta de sobrenadante para citocinas e ensaio de proliferao............................................................................................35

3.9 Ensaio de proliferao celular de subpopulaes CD4+ T regs, efetoras e de memria efetora frente aos antgenos....................................................................36

3.10 Marcao intracelular para Foxp3..................................................................38

3.11 Aquisio de estratgia de anlise das diferentes subpopulaes CD4+ T reg, efetora e de memria efetora..........................................................................39

3.12 Extrao de DNA e tipificao HLA................................................................42

3.13 determinao da produo de citocinas nos sobrenadantes de cultura frente aos diferentes antgenos, por Luminex................................................................44

3.14 Anlise dos resultados considerando respostas do tipo REGULA ou INFLAMA................................................................................................................45

3.15 Testes estatsticos..........................................................................................47

4. Resultados..............................................................................................................49

4.1 Produo de citocinas REGULA e INFLAMA frente a estmulos com antgenos de diferentes origens: alogeneicos, derivados de um microrganismo patognico, e autlogo..................................................................................................................49

4.1.1 Produo espontnea de citocinas (REGULA e INFLAMA), nos diferentes grupos clnicos................................................................................50

4.1.2 Aloantgenos: produo de citocinas REGULA e INFLAMA frente a peptdeos derivados de molculas HLA-DR alogeneicas, nos diferentes grupos clnicos.................................................................................................58

4.1.3 Antgenos de microrganismo patognico: produo de citocinas REGULA e INFLAMA frentea peptdeos do CMV, nos diferentes grupos clnicos.............................................................................................................66

4.1.4 Autoantgenos: produo de citocinas REGULA e INFLAMA frente a peptdeos da Hsp60, nos diferentes grupos clnicos.......................................71

4.2 Resposta celular proliferativa de diferentes subpopulaes de linfcitos T REGULA e INFLAMA, dirigida a antgenos alogeneicos, antgenos derivados de um microrganismo patognico e antgenos autlogos.........................................89

4.2.1 Proliferao espontnea de diferentes subpopulaes de linfcitos T CD4+ REGULA e INFLAMA nos diferentes grupos clnicos.........................92

4.2.2 Alorreatividade: resposta proliferativa de diferentes subpopulaes de linfcitos T REGULA e INFLAMA, dirigida a peptdeos HLA-DR, nos diferentes grupos clnicos..............................................................................96

4.2.3 Antgeno d microrganismo patognico: resposta proliferativa de diferentes subpopulaes de linfcitos T (REGULA e INFLAMA) dirigida a peptdeos do CMV, nos diferentes grupos clnicas.....................................103

4.2.4 Autorreatividade: resposta proliferativa de diferentes subpopulaes de linfcitos T (REGULA e INFLAMA, dirigida a peptdeos da Hsp60, nos diferentes grupos clnicos............................................................................112

5. Discusses............................................................................................................126

6. Concluses...........................................................................................................150

7. Referncias bibliogrficas.....................................................................................154

ANEXO 1. Tabelas dos dados clnicos e demogrficos dos sujeitos de pesquisa...172

ANEXO 2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.........................................180

ANEXO 3. Aprovao do Comit de tica para Anlise de Projetos de Pesquisa CAPPesq..............................................................................................................185

Lista de Figuras Figura 1: Delineamento experimental...........................................................................26 Figura 2: Clulas em proliferao.................................................................................39 Figura 3: Estratgia de anlise para a subpopulao de clulas T reguladoras

(CD4+CD25+CD127-Foxp3+)..........................................................................41 Figura 4: Estratgia de anlise para a subpopulao de clulas T efetoras

(CD4+CD28+CD127+CD45RA-CD27-)...........................................................41 Figura 5: Estratgia de anlise para a subpopulao de clulas T de memria efetora

(CD4+CCR7-CD27-CD45RA-)........................................................................42 Figura 6: Produo Espontnea de citocinas TOxRC e TOxSAU.............................53 Figura 7: Produo Espontnea de citocinas REGULA IL-4, IL-5, IL-7 e IL-10...........55 Figura 8: Produo Espontnea de citocinas predominantemente REGULA (em azul)

IL-13, sem perfil predominantemente Regula, nem Inflama, a IL-2 e citocinas predominantemente INFLAMA (vermelho) IL-1B, IL-6, IL-8 e IL-12................................................................................................................56

Figura 9: Produo Espontnea de citocinas predominantemente INFLAMA IL-17, G-CSF, GM-CSF, IFN-y, TNF, MCP-1 e MIP-1B............................................57

Figura 10: Peptdeos HLA-DR alo do doador. Citocinas Regula e Citocinas Inflama TOxRC e TOxSAU......................................................................................61

Figura 11: Efeitos de peptideos HLA-DR-alo na produo de citocinas IL-4 e IL-10 - TOxRC........................................................................................................63

Figura 12: Efeitos de peptideos HLA-DR-alo na produo de citocinas IL-4, G-CSF e IFN-y - TOxRC............................................................................................64

Figura 13: Efeitos de peptideos HLA-DR-alo na produo de citocinas IL-4 e IL-10 - TOxSAU......................................................................................................65

Figura 14: Peptdeos CMV. Citocinas Regula e Citocinas Inflama TO, RC, SAU.....69 Figura 15: Efeitos de peptideos CMV na produo de citocina IFN-y TOxRC..........70 Figura 16: Peptdeo auto N6. Citocinas Regula e Citocinas Inflama TO, RC, SAU..74 Figura 17: Peptdeos auto N7. Citocinas Inflama TOxSAU e RCxSAU.....................81 Figura 18: Peptdeo auto C9. Citocinas Inflama - TO, RC, SAU.................................85 Figura 19: Produo citocinas IL-10 e MCP-1 frente ao estmulo com o peptdeo C9 -

TOxRC........................................................................................................87 Figura 20: Produo de citocina IL-2 frente ao estmulo com o peptdeo C9

TOxSAU.....................................................................................................88 Figura 21: Clulas T reguladoras (CD4+ CD25+ CD127- FOXP3+)...............................89 Figura 22: Clulas T efetoras (CD4+CD27- CD28+ CD45RA- CD127+).........................90 Figura 23: Clulas T de memria efetora (CD4+ CCR7- CD27- CD45RA-)...................90 Figura 24: Proliferao de linfcitos T CD4+, e as condies com estmulo e

estimulada com anti-CD3............................................................................91 Figura 25: Proliferao Espontnea TOxRC e TOxSAU...........................................94 Figura 26: Proliferao Espontnea das diferentes subpopulaes celulares de clulas

T CD4+........................................................................................................95 Figura 27: Porcentagem de clulas CD4+ T reguladora (CD25+CD127-Foxp3+). Pep

DR...............................................................................................................99 Figura 28: Porcentagem de clulas CD4+ T Efetora (CD28+CD27-CD45RA-CD127+).

Pep DR.....................................................................................................101 Figura 29: Porcentagem de clulas CD4+ T Memria Efetora (CD27-CCR7-CD45RA-).

Pep DR.....................................................................................................102 Figura 30: Peptdeo CMV. Populao Reguladora TO, RC, SAU...........................106 Figura 31: Peptdeos CMV. Populao Efetora TOxRC e TOxSAU........................107

Figura 32: Porcentagem de clulas CD4+ T reguladora (CD25+CD127-Foxp3+). Pep CMV..........................................................................................................109

Figura 33: Porcentagem de clulas CD4+ T Efetora (CD28+CD27-CD45RA-CD127+). Pep CMV...................................................................................................110

Figura 34: Porcentagem de clulas CD4+ T Memria Efetora (CD27-CCR7-CD45RA-). Pep CMV...................................................................................................111

Figura 35: Porcentagem de clulas CD4+ T reguladora (CD25+CD127-Foxp3+). Pep N6.............................................................................................................115

Figura 36: Porcentagem de clulas CD4+ T Efetora (CD28+CD27-CD45RA-CD127+). Pep N6......................................................................................................116

Figura 37: Porcentagem de clulas CD4+ T Memria Efetora (CD27-CCR7-CD45RA-). Pep N6......................................................................................................117

Figura 38: Peptdeo auto N7. Populaes Reguladora e Efetora TO, RC, SAU.....120 Figura 39: Porcentagem de clulas CD4+ de diferentes subpopulaes em

proliferao, ou que sofreram inibio de proliferao espontnea na presena de peptdeo N7..........................................................................121

Figura 40: Peptdeo alo C9. Populaes Efetoras TO, RC, SAU............................124 Figura 41: Porcentagem de clulas CD4+ de diferentes subpopulaes em

proliferao, ou que sofreram inibio de proliferao espontnea na presena de peptdeo C9..........................................................................125

Lista de Tabelas Tabela 1: Dados clnicos nos diferentes grupos de estudo..........................................29 Tabela 2: Seleo dos peptdeos HLA-DR alo dos sujeitos de pesquisa dos diferentes

grupos de estudo........................................................................................33 Tabela 3: Sequncias dos peptdeos HLA-DR sintticos utilizados.............................34 Tabela 4: Sequncias dos peptdeos da protena Hsp60 humana selecionados.........35 Tabela 5: Anticorpos utilizados (o respectivo fluorforo e a sua titulao)...................37 Tabela 6: Fentipo das diferentes subpopulaes celulares CD4+..............................38 Tabela 7: Citocinas analisadas potencialmente reguladoras e inflamatrias...............45 Tabela 8: Produo espontnea de citocinas nos diferentes grupos clnicos.........51-52 Tabela 9: Efeito do aloantgeno - HLA-DR -alo na induo e/ou inibio da produo

de citocinas............................................................................................59-60 Tabela 10: (Continuao): Efeito do peptdeo de microrganismo patognico - CMV - na

induo e/ou inibio da produo de citocinas...................................67-68 Tabela 11: Efeito do autoantgeno - Pep-N6 (Hsp60) - na induo e/ou inibio da

produo de citocinas...........................................................................72-73 Tabela 12: Efeito do autoantgeno - Pep-N7 (Hsp60) - na induo e/ou inibio da

produo de citocinas............................................................................78-79 Tabela 13: Efeito do autoantgeno - Pep-C9 (Hsp60) - na induo e/ou inibio da

produo de citocinas............................................................................83-84 Tabela 14: Porcentagem de Proliferao Espontnea de clulas CD4 de diferentes

fentipos nos diferentes grupos clnicos de estudo...............................92-93 Tabela 15: Porcentagem de proliferao de clulas CD4 com diferentes fentipos

frente ao estmulo com o peptdeo HLA-DR nos diferentes grupos clnicos de estudo...............................................................................................97-98

Tabela 16: Porcentagem de proliferao de clulas CD4 com diferentes fentipos frente ao estmulo com o peptdeo CMV nos diferentes grupos clnicos de estudo..............................................................................................104-105

Tabela 17: Porcentagem de proliferao de clulas CD4 com diferentes fentipos frente ao estmulo com o peptdeo N6 da HSP60 nos diferentes grupos clnicos de estudo..............................................................................113-114

Tabela 18: Porcentagem de proliferao de clulas CD4 com diferentes fentipos frente ao estmulo com o peptdeo N7 da HSP60 nos diferentes grupos clnicos de estudo..............................................................................118-119

Tabela 19: Porcentagem de proliferao de clulas CD4 com diferentes fentipos frente ao estmulo com o peptdeo C9 da Hsp60 nos diferentes grupos clnicos de estudo..............................................................................122-123

Tabela 20: Dados clnicos e demogrficos dos indivduos do grupo TO...................175 Tabela 21: Histrico clnico dos indivduos do grupo TO (IS/ Infeces e

Comorbidades).........................................................................................176 Tabela 22: Dados clnicos e demogrficos dos indivduos do grupo RC....................177 Tabela 23: Histrico clnico dos indivduos do grupo RC (IS/ Infeces e

Comorbidades)..................................................................................178-179 Tabela 24: Dados clnicos e demogrficos dos indivduos do grupo EST..................180 Tabela 25. Histrico clnico dos indivduos do grupo EST (IS/ Infeces e

Comorbidades).................................................................................181-182

Resumo

Carmona, P. Papel da resposta celular antgeno-especfica na tolerncia operacional. [Dissertao]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2016.

A tolerncia operacional (TO) um raro fenmeno que ocorre em

indivduos transplantados, que permanecem com funo estvel do aloenxerto,

sem rejeio, aps a suspenso de drogas imunossupressoras, por pelo

menos um ano. A compreenso de mecanismos envolvidos na tolerncia

operacional poder contribuir para a elaborao de novas terapias

imunorreguladoras, na clnica do transplante. Investigamos se, no estado de

tolerncia operacional, h um perfil funcional diferencial de resposta imune

celular antgeno-especfica, dirigida a trs grupos de antgenos relevantes no

alotransplante: aloantgenos do doador (peptdeos HLA-DR), antgenos de

patgenos (peptdeos do CMV citomegalovrus) e autoantgenos (peptdeos

da Hsp60 Protena de choque trmico 60, com funes imunolgicas,

imunorreguladora (REGULA) e pr-inflamatria (INFLAMA). Analisamos a

produo de citocinas (por Luminex) e a proliferao de diferentes

subpopulaes de clulas T CD4+ (por FACS), com funes,

predominantemente, REGULA ou INFLAMA, frente aos trs tipos de antgenos,

comparativamente entre TO (n=6) e Rejeio Crnica (RC: n=8), indivduos

com funo estvel do enxerto, usando imunossupressores (EST: n=8) e

indivduos saudveis (SAU: n=7). Em concordncia com nossa hiptese, a

resposta celular modulada, de forma diferencial, na tolerncia operacional,

ocorrendo um desvio funcional da resposta a peptdeos HLA-DR do doador

para um perfil REGULA, enquanto preservado o perfil INFLAMA na resposta

a peptdeos do patgeno (CMV). Apesar das diferenas nas respostas aos

peptdeos do CMV entre TO e RC (p=0,02 e p=0,02 para citocinas e

subpopulaes regula e p=0,008 e p=0,003 para citocinas e subpopulaes

inflama), houve preservao do perfil INFLAMA na TO, em relao ao estado

fisiolgico, com induo/aumento das citocinas inflamatrias IL-1B, IL-17, IFN-

y, MCP-1 e MIP-1B, com algum grau de inibio de citocinas

imunorreguladoras, e inibio da proliferao de clulas Tregs, sugerindo

serem importantes mecanismos na preservao da imunocompetncia, na

tolerncia operacional. Na resposta celular a autoantgenos, destacamos o

peptdeo N6 que induziu um perfil significativamente diferente na TO (mais

REGULA), em relao RC (mais INFLAMA) (p=0,001 para citocinas regula;

p=0,04 para citocinas inflama), principalmente pelo aumento/induo da

produo de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, na TO, sugerindo que o peptdeo N6

possa ter uma contribuio nos mecanismos na TO, favorecendo a produo

dessas citocinas com atividade imunorreguladora. Considerando a diferena

significativa do perfil funcional de resposta aos aloantgenos do doador entre

TO (REGULA) e RC (INFLAMA) (p=0,0007 para citocinas regula e p

Abstract

Carmona, P. The role of antigen-specific cellular response in operational tolerance. [Dissertation]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2016

Operational tolerance (OT) is a rare phenomenon, taking place in

transplanted individual who do not reject, following the complete withdrawal of

immunosuppressive drugs for at least one year. Understanding the mechanisms

involved in operational tolerance will contribute to opening new pathways for the

development of novel immunoregulatory therapies, in transplantation. We

investigated whether the state of operational tolerance displays a functionally

differential profile of the antigen-specific cellular response, directed to three

groups of antigens, relevant in the context of allotransplantation: donor

alloantigens (HLA-DR peptides), pathogen-derived antigens (cytomegalovirus

peptides - CMV) and autoantigens (peptides derived from the Hsp60 self-

antigen displaying immunoregularory (REG) and proinflammatory (INFLAMMA)

properties). We determined cytokine production (by Luminex) and the

proliferative response of different CD4+ T cell subsets (by FACS), displaying

predominantly REG or INFLAMMA activities, in response to the three types of

antigens, comparing OT (n=6) with Chronic Rejection (CR: n=8), individual with

stable graft function, taking conventional immunosuppression (Sta: n=8), and

healthy individuals (HI: n=7). In concordance with our hypothesis, the cellular

immune response is differentially modulated in operational tolerance, giving rise

to an immunoregulatory deviation in the response to HLA-DR donor peptides,

preserving the proinflammatory response to pathogen peptides (CMV). Despite

significant differences in the responses to CMV peptides, between OT and CR

(p=0.02 and p=0.02 for REG cytokines and CD4+ subsets; p=0.008 and

p=0.003 for INFLAMMA cytokines and CD4+ subsets), OT is able to preserve

the INFLAMMA response in relation to the physiologic state (HI). This

INFLAMMA profile of the response to CMV peptides is maintained by the

induction/increase of the proinflammatory cytokines, IL-1B, IL-17, IFN-, MCP-1

and MIP-1B, some inhibition of REG cytokines and inhibition of Treg

proliferation, suggesting that these are important mechanisms in the

preservation of immunocompetence to deal with pathogens, in OT. In the

cellular response to autoantigens, we highlight the N6 peptide that induced a

differential profile in OT (REG profile) compared to CR (INFLAMMA profile)

(p=0.001 for REG cytokines; p=0.04 for INFLAMMA cytokines), due to the

induction/increase of IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, in OT, suggesting that N6 may

contribute to the underlying mechanisms in OT, favoring the production of these

immunoregulatory cytokines. Taken the marked differences in the response to

donor alloantigens, between OT (predominantly REG) and CR (predominantly

INFLAMMA) (p=0.0007 for REG cytokines and p

1

1. Introduo

Imunobiologia do Transplante

O transplante de rgo uma importante modalidade teraputica capaz

de substituir tecidos ou rgos com falncia irreversvel. Na clnica, dentre os

vrios transplantes de rgos, o mais frequente o transplante renal. No Brasil,

no perodo de 2005 a 2015, cerca de 90% dos transplantes realizados foram de

rim (ABTO, 2015).

Pode-se dizer que grande parte do conhecimento existente sobre a

imunobiologia dos transplantes, d-se pelos estudos envolvendo transplante

renal. Grandes avanos foram dados na clnica para manter a funo do

enxerto a longo prazo, mas a despeito disso muitos desafios clnicos persistem,

e um destes e a rejeio (Nankivell e Kuypers, 2011).

A rejeio do rgo consiste na deteriorao funcional e estrutural do

enxerto podendo culminar na perda completa de sua funo (Lechler et al.,

2003). Aps o transplante, o processo cirrgico j promove um microambiente

inflamatrio, logo aps uma intensa atividade inflamatria estabelecida

decorrente da interao do linfcito T e seu receptor (TCR, do ingls, T cell

receptor) com as molculas de MHC (complexo principal de

histocompatibilidade, do ingls, major histocompatibility complex) (Watts,

1997).

Em humanos, as molculas MHC so chamadas de antgenos

leucocitrios humanos (HLA do ingls, Human Leukocyte Antigens) que so os

principais antgenos polimrficos contra os quais est dirigida, a resposta

alogeneica. Os genes que fazem parte do sistema HLA em humanos localizam-

2

se no cromossomo 6, tendo, assim, uma variabilidade muito grande entre

indivduos. As molculas do sistema HLA so classificadas em classe I (HLA-A,

B e C) que so expressas por clulas nucleadas, e molculas de classe II que

so expressas, principalmente, em clulas apresentadoras de antgeno (APCs,

do ingls, Antigen Presenting Cells), (HLA-DR, DP e DQ) (Krensky et al., 1990;

Mandelbrot, 2010) ou em clulas ativadas que expressam MHC classe II, aps

expostas a citocinas como o IFN-y, como por exemplo, as clulas endoteliais e

linfcitos T (Mandelbrot, 2010).

As molculas HLA so os principais alvos de reconhecimento antignico

pelos linfcitos T. Assim, quando doador e receptor no apresentarem as

mesmas molculas HLA, o receptor reconhece as molculas do doador,

culminando na ativao do sistema imune, o que desencadeia respostas

inflamatrias dirigidas ao enxerto (Rapaport et al., 1965, Muller et al., 2011),

levando rejeio do rgo transplantado, se o sistema imune no for

suprimido (Klein J. et al., 2000; Almoguera, B. et al., 2014).

Apesar das molculas HLA do doador, expressas na superfcie celular do

aloenxerto, serem os principais alvos de reconhecimento pelos linfcitos T

importante destacar que a alorreatividade tambm pode induzir uma resposta

imune com perfil imunorregulador, como descrito para a via indireta de

alorreconhecimento, por nosso grupo (Spadafora-Ferreira et. al., 2001) e por

outros (Waaga et. al., 2001).

3

Mecanismos da rejeio

A rejeio no transplante renal mediada por diversos mecanismos e

componentes imunolgicos. Ela classificada de acordo com critrios

adotados em Banff, em funo de alteraes histopatolgicas e fatores

imunolgicos envolvidos (Solez et al., 2007). A rejeio pode ser classificada

como aguda ou crnica, mediada por clulas T ou por anticorpos (Solez et al.,

2007; Haas et al., 2013).

A rejeio aguda mediada por anticorpos ocorre quando h anticorpos na

circulao de receptores, com especificidade para antgenos expressos nas

clulas do enxerto. A ligao desses anticorpos s clulas-alvo desencadeia a

ativao do sistema complemento, cascata de coagulao, das cininas que

levam trombose e necrose do tecido (Magee, C. C., 2006; Wahrmann et al.,

2006). H relatos de indivduos que possuem anticorpos dirigidos ao

aloenxerto, no fixadores de complemento, possuem um prognstico

semelhante aos indivduos sem anticorpos dirigidos ao aloenxerto (Cornell et

al., 2008), sugerindo que a ativao do sistema complemento determina um

pior prognostico do transplante. A rejeio aguda mediada por clulas T,

caracterizada por clulas infiltrantes no rgo, inflamao monoctica e

linfocitria, ativao e proliferao de clulas T auxiliares o que leva leso

tecidual e necrose (Kindt, 2007). Esse tipo de rejeio, em geral, responde bem

s terapias imunossupressoras.

Mesmo com avanos laboratoriais e o desenvolvimento de novas terapias

imunossupressoras, a rejeio crnica (RC) a maior limitao para o sucesso

do transplante alogeneico de rgos (Nankivell et al., 2003). Ademais, como

4

citado anteriormente, em pacientes transplantados com rejeio crnica,

tumores e as infeces so mais frequentes devido ao uso de

imunossupressores (Toungouz et al., 2003).

No transplante renal a rejeio crnica mediada por anticorpos, pode

apresentar depsitos de C4d (um produto da degradao do componente C4

da via clssica do complemento), nos capilares peritubulares e nas alas dos

capilares do glomrulo, podendo ocorrer tambm a presena de anticorpos

doador especficos no soro. Na rejeio crnica mediada por clulas T, h

presena de fibrose intersticial, infiltrado mononuclear e atrofia tubular,

infiltrao com clulas mononucleares, inflamao intersticial, fibrose e

glomerulonefrite (Solez et al., 2007).

O que diferencia a fase aguda da crnica, a formao de fibrose

levando perda da funo do rgo ou tecido (Ibrahim et al., 1995). Alm

disso, ambos os mecanismos celulares e humorais podem existir, ao mesmo

tempo, no processo de agresso do enxerto. Os mecanismos efetores da

rejeio incluem, principalmente, a citotoxicidade mediada por linfcitos T ou

dependentes de anticorpos, produo de citocinas e sua ao ltica devido ao

recrutamento de clulas inflamatrias, ativao do complemento, e reao de

hipersensibilidade tardia (Cai e Terasaki, 2005; Coelho & Kalil, 2009), entre

outros.

importante lembrar que, diante de intensas respostas inflamatrias ao

longo da vida, o sistema imune possui mecanismos reguladores essenciais na

manuteno da homeostase do organismo (Monk et al., 2006; Rowe et al.,

2006). Na alorreatividade devido ao intenso estmulo inflamatrio

desencadeado pelo enxerto h um desequilbrio dessas respostas reguladoras,

5

sendo necessrio o uso de drogas imunossupressoras para manuteno da

sobrevida enxerto.

As drogas imunossupressoras disponveis, atualmente, so capazes de

inibir a rejeio aguda, suprimindo a resposta mune inflamatria, entretanto,

pouco controlam o desenvolvimento da rejeio crnica, alm de causarem

efeitos colaterais significativos como, desordens metablicas, mielossupresso

e nefro e cardiotoxicidade (Demirkiran et al., 2008), alta suscetibilidade a

infeces (Fishman & Rubin, 1998), malignidades (Dantal et al., 1998; Hojo et

al., 1999).

Entre as principais drogas imunossupressoras esto: a ciclosporina A e o

tacrolimus que, alm de agir inibindo a atividade da calcineurina, podem causar

efeitos adversos como nefrotoxicidade e hipertenso arterial (Nankivell et al.,

2004). O mofetil micofenolato e a azatioprina que tm ao inibidora de IMPDH

(enzima inosinomonofosfato-desidrogenase), mas apresentam efeitos como

mielossupresso. Os corticosterides afetam a concentrao e funo de

leuccitos; a rapamicina inibe a transcrio de RNA mensageiro, mas pode

causar problemas de cicatrizao, hiperlipidemia (Borie et al., 2004), alm de

afetar a qualidade de vida do indivduo transplantado. Tambm so usados no

transplante renal, imunobiolgicos, como o ATG (globulina anti-timocitria) e o

anticorpo monoclonal anti-CD3 (Mota et al., 2009). Permanece o desafio de

minimizar os efeitos colaterais das drogas imunossupressoras (Danger et al.,

2008) e proporcionar esquemas com menores doses (Page et al., 2012).

6

Imunorregulao no Transplante

Aps o estmulo dos linfcitos pelos antgenos do doador, as clulas

estimuladas polarizam seu perfil para atividades pr-inflamatria ou

imunorreguladora. Com a polarizao do perfil celular ocorre maior ou menor

produo de citocinas associadas ao perfil celular adotado. importante

destacar que os linfcitos Th diferenciam-se em subpopulaes que so

capazes de produzir diferentes citocinas e, exercerem funes auxiliares

distintas. importante destacar que linfcitos T com outras especificidades

antignicas, inclusive dirigida a autoantgenos, como as Hsps, so recrutados e

podem participar da resposta imune ao alotransplante (Caldas et al., 2006).

As citocinas so protenas de baixo peso molecular produzidas por

diferentes tipos de clulas e que agem de maneira autcrina, parcrina e

endcrina, sendo frequentemente envolvidas na propagao e controle da

resposta imunolgica (Tonet e Nobrega, 2008). Elas so peas chave no

processo de comunicao celular, e no transplante possuem papel, por vezes,

predominantemente inflamatrio. Na presena das citocinas IL-2, IL-18 e TNF-

, as APCs, os linfcitos T ativados e clulas NK levam ao aumento de clulas

Th1 que so clulas envolvidas com respostas inflamatrias exacerbadas

(Cardoni et al., 2005)

Citocinas pr-inflamatrias, como por exemplo: interleucina-1 (IL-1),

interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8), fator de necrose tumoral (TNF-),

interferon- (IFN-), interleucina-2 (IL-2) e quimiocinas so descritas como

indutoras do aumento do processo inflamatrio (Belotto, 2011) estando

7

relacionadas rejeio aguda, fibrose intersticial, atrofia celular e infeces

(Cardoni et al., 2005).

Foi observado em enxertos renais com rejeies agudas, maior

expresso de citocinas com perfil predominantemente Inflama MCP-1/CCL2 e

CCR5 (receptor celular de RANTES, MIP-1 e MIP-1) na regio tbulo

intersticial justacortical (Robertson, 2000; Ruster et al, em 2004), tambm,

maior expresso de IL-6 (Oliveira, 1997) e MCP-1/CCL2 (Robertson, 2000).

Em contrapartida s pro-inflamatrias, as citocinas anti-inflamatrias so

caracterizadas por atuarem na diminuio do processo inflamatrio, pela

inibio de citocinas pr-inflamatrias, dentre elas destacam-se: a interleucina-

4 (IL-4), interleucina-10 (IL-10), interleucina-13 (IL-13), assim como, o receptor

antagonista da IL-1 (IL-1ra) (Belotto, 2011).

As citocinas podem apresentar diversos papeis biolgicos na biologia do

transplante renal, tais como, comunicao celular, recrutamento, diferenciao

e ativao de diversos subtipos celulares (Hu e Knetchle, 2006).

As clulas T CD4+ so um grupo heterogneo, funcionalmente, que

apresentam diversas populaes distintas (Mosmann et al., 1986). Em estudos

iniciais, foi descrito que clulas T naives no produziam IL-4, no entanto, ao

serem estimuladas pelo receptor de clula T (TCR, do ingls Tcell receptor) na

presena de IL-4, podiam torna-se produtoras dessa citocina (Killar et al., 1987;

Le Gros et al., 1990). A diferenciao de clulas T CD4+ auxiliares (Th, do

ingls T helper cells), para um perfil Th2, pela ao de IL-4, e diferenciao de

clulas Th1 pela ao de IL-12, parecia bem estabelecida. No entanto,

observou-se que a citocina IL-12 induzia uma produo de IFN-y, mediada pela

expresso de T-bet (um fator de transcrio), levando ao aumento na produo

8

de IFN-y, cuja neutralizao diminui a diferenciao de clulas para um perfil

Th1 (Szabo et al., 2000; Lighvani et al., 2001).

As clulas T CD4+ so importantes na rejeio de enxertos alogeneico

(Krieger et al., 1996; Zhao et al., 2000). A participao de clulas T CD4+

intensificada quando h disparidade no MHC de classe II entre o receptor e o

doador, assim como as clulas T CD8+ participam da rejeio mediada por

disparidades no MHC classe I, em relao a alorreatividade pela via direta

(Rosenberg et al.,1987; Christianson et al., 1993).

As populaes de clulas T podem ser caracterizadas em subpopulaes

com diferentes funes, como clulas T reguladoras (CD25+CD127-Foxp3+),

efetoras (CD28+CD127+CD45RA-CD27-), clulas T naive (CD45RA+CD62L+) e

de memria: memria central (CCR7+CD27+CD45RA-); memria efetora

(CCR7-CD27-CD45RA-) e memria efetora altamente diferenciada - TEMRA

(CD45RA+CD62L-) (Hamann et al., 1997; Sallustro et al., 1999, Fukada et al.,

2002).

As clulas T naive, ao encontrar o antgeno em rgos linfoides, podem

se ativar, proliferar e gerar clones, diferenciando-se em clulas T efetoras

(Estgio de Expanso). Aps a eliminao do antgeno, h morte de

aproximadamente 90% das clulas efetoras (Estgio de Contrao ou Morte)

(Kaech et al., 2002). Nesta etapa, ocorre tambm, diminuio dos mediadores

inflamatrios, e, ocorre a transio de clulas T CD4 efetoras, para clulas T

CD4 de memria (McKinstry et al., 2008).

As clulas restantes sero aquelas que sobreviveram a este processo

(estgio de memria), de forma que, quanto maior o nmero de clulas

efetoras entrando em apoptose ou morte, menor a quantidade de clulas T de

9

memria (Kaech et al., 2002). As clulas T de memria podem ser ativadas por

baixas quantidades do antgeno (Lanzavecchia e Sallustro, 2001).

As clulas T CD4+ efetoras tm funes especficas como secreo de

citocinas e induo da diferenciao de clulas T CD8+ (capazes de eliminar

clulas que apresentam antgeno que estimulou a expanso clonal). Sendo

tambm responsveis pela ativao e modulao da produo de

imunoglobulinas em clulas B.

As clulas T de memria podem ser definidas como qualquer clula T

que tenha entrado em contato com um antgeno estando em uma fase ps

efetora (McKinstry et al., 2008), sendo normalmente encontradas por longos

perodos aps a exposio ao antgeno, permanecendo presentes na

circulao sangunea e no bao (Dutton et al.,1998). As clulas T CD4+ de

memria, so capazes de estimular APCs, linfcitos B e clulas T CD8, tendo a

capacidade de reconhecer um antgeno especfico, iniciar uma resposta rpida

e secretar citocinas pr-inflamatrias (McKinstry et al., 2008).

As subpopulaes de clulas T de memria central, so caracterizadas

por expressar CCR7 e produzir a citocina IL-12 aps a reativao, atuando nos

rgos linfoides secundrios, o que auxilia na gerao de clulas efetoras. As

clulas T de memria efetora expressam baixos nveis de CCR7 (McLeod et

al., 2009), as quais estudamos neste trabalho. Portanto, as clulas T de

memria so funcionais e fenotipicamente heterogneas (Berard e Tough,

2002).

Alm dos linfcitos com atividade inflamatria, clulas T reguladoras

tambm possuem um papel importante na imunobiologia do transplante. As

Treg fazem parte dos mecanismos de tolerncia, e atuam suprimindo ou

10

controlando respostas inflamatrias, sendo assim, importantes na manuteno

da homeostase imunolgica (Josefowicz e Rudensky, 2012).

As Tregs so classificadas como Treg tmicas (Abbas et. al., 2008), que

adquirem capacidade imunorreguladora durante o seu desenvolvimento no timo

foram chamadas, inicialmente, de Treg naturais (Kyewski e Klein, 2006). No

entanto, a nomenclatura tem sido rediscutida, argumentando-se ser mais

adequado no usar o termo natural e sim usar o termo em relao sua

origem tmica (Abbas, et. al., 2008), ou Treg induzidas perifricas (iTregs),

quando adquirem atividade supressora na periferia, em diferentes contextos de

respostas imunes, in vivo.

As Tregs tmicas so CD4+, tm capacidade imunossupressora,

expressam a cadeia (alfa) do receptor de IL-2 (CD25), e o fator de transcrio

Foxp3 (do ingls, forkhead box P3) (Kyewski e Klein, 2006; Chen et al., 2003),

so, geralmente, autorreativas e so selecionadas positivamente, no timo, a

despeito de apresentarem alta avidez a antgenos prprios (Sakaguchi et al.,

1995; Muller et al., 2011; Hsieh et al., 2012). A expanso de Tregs tmicas in

vivo, parece ser importante na regulao da inflamao em diferentes

contextos, inclusive no transplante (Nishimura et al., 2004). relatado que o

maior nmero de clulas Tregs e da expresso de mRNA do gene de Foxp3

esto, associados ao momento de diminuio da imunossupresso em

indivduos com funo estvel do enxerto, mas no em indivduos com

rejeio, sugerindo que as Tregs favorecem a induo de um perfil

imunorregulador e o controle da inflamao no enxerto (Pons et al., 2008).

Assim, tanto na tolerncia ao prprio como no contexto de transplante, as

11

clulas Tregs tmicas e induzidas desempenham um papel importante no

controle da inflamao.

As clulas Treg induzidas podem ter diferentes especificidades

antignicas, inclusive dirigida protena de choque trmico 60 (Zanin-Zhorov et

al., 2006), e diferentes fentipos, com ou sem a expresso do fator de

transcrio FOXP3. Entre os diferentes fentipos, podemos citar as Treg

CD8+/CD28 negativas (Colovai et al., 2003), CD4+/LAP+ (do ingls latency-

associated peptide) (Hall, 2010), Tregs Th1 (Sakaguchi et al., 2008) e Tregs

Th2. Sabe-se que a citocina IL-2 contribui para a sobrevivncia das clulas T

efetoras na periferia, porm a utilizao de anticorpos bloqueadores

neutralizantes anti-IL-2, in vitro, anula a funo supressora das clulas Tregs,

indicando que a IL-2 tambm importante para as Tregs (Lafaille, et al., 2002;

Thornton et al., 2004).

As clulas Tregs tm a habilidade de suprimir inflamao tecido-

especfica, em resposta a antgenos expressos diretamente em tecidos

inflamados (Cohen, 2000), e sua ativao, gerao e induo podem ser

desencadeadas no incio da resposta imune celular (OGorman et al., 2009).

Estas clulas tambm exercem atividade imunorreguladora por diversos

mecanismos: inibem a proliferao de clulas T efetoras, principalmente pela

secreo de IL-10, mas podem tambm produzir TGF- (fator de crescimento

transformador , do ingls, Transforming growth factor ) (Chen et al., 1994;

Sakaguchii et al., 1995), por mecanismos de interaes clula-clula, entre

outros.

A participao de clulas Treg no contexto do transplante, na induo de

tolerncia, se restringem a modelos experimentais. Por exemplo, em

12

transplante de pele, foi observado que clulas Tregs antgeno-especficas in

vivo, podem mediar uma imunossupresso protegendo o enxerto (Nishimura et

al., 2004), por outro lado, podem ser induzidas, in vitro, por diferentes

protocolos experimentais, visando o seu uso em terapia celular em diversas

condies patolgicas, para o controle de inflamao.

Em estudos do nosso grupo, foram encontrados baixos nmeros da

populao de clulas Treg CD4+CD25hiFoxp3+ em indivduos transplantados

com rejeio crnica (Moraes-Vieira et al., 2010), sugerindo que a sua

deficincia esteja envolvida no processo de RC.

Clulas Tregs so essenciais para tolerncia ao prprio (Sakaguchi,

2004) e na tolerncia alogeneica (Braudeau et al., 2007; San Segundo et al.,

2010) no contexto do transplante, sendo inibidas pelas citocinas IFN-y, IL-2, IL-

4, IL-10 e IL-27, secretadas por clulas Th1 e Th2, atuando como mediadoras

do recrutamento de neutrfilos para locais da inflamao (Ivanov, et al., 2007;

MacGeachy e Cua, 2008).

Tolerncia Imunolgica

O sistema imune fundamental no equilbrio biolgico do organismo,

atuando como uma rede complexa integrada, capaz de interagir com

componentes celulares e moleculares prprios (autoantgenos), e antgenos

exgenos. Sua ao envolve a captao de sinais do microambiente que

modulam a resposta imune, mantendo o estado de tolerncia imunolgica ao

prprio, ao mesmo tempo em que capaz de eliminar microrganismos

13

patognicos e clulas tumorais prejudiciais ao organismo. (Kyewski e Klein,

2006).

A tolerncia ao prprio um estado de no agresso ao prprio

organismo e , atualmente, classificada de duas formas: central (que ocorre

nos rgos linfides primrios: no timo, para os linfcitos T, e na medula ssea,

para os linfcitos B), e a perifrica (que ocorre nos rgos linfides perifricos:

linfonodos e bao) (Kyewski e Klein, 2006; Kindt et al., 2007).

Os precursores de linfcitos T chegam ao timo, passam por um processo

de amadurecimento e sofrem seleo positiva ou negativa (Anderton et al.,

2001; Savage e Davis, 2001). Na seleo positiva, os timcitos se ligam com

intensidade intermediria a antgenos prprios apresentados pelas molculas

MHC, so selecionados positivamente, amadurecem e saem para a periferia

povoando os rgos linfoides perifricos (Liu, 2006). Na seleo negativa,

ocorre forte ligao aos antgenos prprios apresentados pela molcula MHC,

e os timcitos morrem por apoptose, ou por negligncia, quando no se ligam a

antgeno algum (Anderton et al., 2001; Savage e Davis, 2001; Hsieh et al.,

2012; Rouhani et al., 2014). A seleo tmica parece desempenhar um

importante papel na autotolerncia exercida pelos linfcitos T, tanto por

diminuir a possibilidade de maturao de timcitos autorreativos de alta avidez,

que podem ser ativados e se tornar agressivos na periferia, como pela seleo

de clulas Tregs (Cohen, 1992; Cohen, 2007; Muller et al., 2011).

O fator de transcrio AIRE (do ingls, autoimmune regulator ou

regulador autoimune), expresso nas clulas epiteliais da medula do timo,

determinante na expresso de antgenos prprios tecido-especficos no timo

(Ruan et al., 2007). Na tolerncia central, o fator de transcrio AIRE parece

14

desempenhar um papel importante na tolerncia ao prprio, e acredita-se que o

processo de tolerncia central seja importante para a manuteno da

homeostase e da tolerncia ao prprio.

Esta expresso parece ser fundamental para a manuteno da

homeostase, uma vez que mutaes que levam no expresso deste gene

(AIRE), induzem o desenvolvimento de doenas autoimunes (Liston e

Goodnow, 2005). Sua importncia parece ser devida tanto eliminao de

clones T e B fortemente autorreativos, e potencialmente patognicos, como

seleo positiva de clulas Tregs autorreativas (Anderson et al., 2002;

Anderson et al., 2005).

Acredita-se que a tolerncia perifrica seja mediada por um processo de

contnuo reconhecimento de antgenos prprios. Na periferia, a regulao da

atividade efetora de linfcitos pode ocorrer por diversos mecanismos como: (i)

incapacidade de proliferao e produo de IL-2 por linfcitos (Knoechel et al.,

2006); (ii) no ativao de linfcitos, pela falta de sinais coestimulatrios, aps

o encontro do linfcito com o antgeno, ou ativao do sinal supressor pela

molcula CTLA-4 (Anderton et al., 2001; Zheng et al., 2007); (iii) apoptose pela

repetida estimulao antignica dos linfcitos T (Anderson et al., 2005);

culminando na eliminao de clulas autorreativas efetoras (Wells et al., 2001);

(iv) ignorncia das clulas T pela no ligao do linfcito a qualquer antgeno

(Miller e Heath, 1993); (v) pela induo e atuao de clulas T reguladoras

(Tregs) (Chen et al., 2004; Carrier et al., 2007a; Carrier et al., 2007b; Li et

al.,2015), clulas T CD8+ de memria (Rao et al., 2010) e clulas B

reguladoras, cuja atividade parece estar relacionada com a produo de IL-10

(Iwata et al., 2011; Rosser et al., 2015); (vi) pela participao de clulas

15

dendriticas (DC) tolerognicas (Harryet al., 2010); (vii) pelo desvio da resposta

imune celular de Th1 para Th2 e, provavelmente tambm (Li., 2014), (viii) pela

participao de anticorpos com propriedades imunorreguladoras.

Outros contextos de regulao que se tornaram clssicos na imunologia,

mostram a importncia dos processos biolgicos que ocorrem na vida intra-

uterina para a tolerncia imunolgica alogeneica na relao materno-fetal.

Acredita-se que mltiplos caminhos da tolerncia alogeneica tenham

sido selecionadas ao longo da evoluo, sendo ela fundamental na

perpetuao da espcie em todos os animais com reproduo sexuada e

fecundao interna. Assim, a tolerncia imunolgica materno-fetal que

alognica, pode ser muito importante para se compreender a tolerncia

imunolgica no transplante alogeneico (Erlebache, 2013), pois, embora haja

uma resposta inflamatria dirigida ao feto, h predominncia de uma resposta

imunorreguladora (Caetano, 2009). Apesar de no se ter uma compreenso

dos mecanismos que protegem o feto, supe-se que o trofoblasto (que no

apresenta a molcula HLA-DR) e a expresso de HLA-G possuam funo

importante neste estado de tolerncia imunolgica, pois fazem interface entre

as clulas maternas e fetais (Hviid TV, 2006).

Acredita-se, hoje, que diferentes tipos celulares e vrios mecanismos

imunorreguladores ativados, individualmente ou em conjunto, frente s diversas

experincias imunolgicas vividas pelo indivduo, ao longo da vida, sejam

cruciais na manuteno do equilbrio biolgico. Diversos desses mecanismos

imunorreguladores tm sido descritos como atuantes na imunobiologia do

transplante.

16

Protena de Choque Trmico Hsp60

Na Teoria da Seleo Clonal, postulou-se que os clones de linfcitos T

autorreativos seriam eliminados no timo, sendo liberados para a periferia,

somente aqueles no reativos ao prprio (Burnet, 1959). Essa teoria trouxe

uma importante contribuio para a compreenso sobre o funcionamento do

sistema imune e durante vrias dcadas era a viso mais aceita do sistema

imune. Hoje, sabe-se que as clulas autorreativas fazem parte do repertrio

fisiolgico do sistema imune (Cohen, 2000, Luna et al., 2007; Lio e Hsieh,

2010), podendo resultar em respostas imunes tanto pr-inflamatrias como ter

atividade imunorreguladora. As Tregs tmicas so exemplos de clulas

autorreativas com atividade regula inflama. Esses dados tm dado suporte para

a o conceito de autoimunidade benfica e imunorreguladora, em contraposio

ao conceito dominante nos anos 50 de que a autoimunidade ocorria apenas na

doena.

As Hsps (do ingls, Heat Shock Proteins ou protenas de choque

trmico) (Wheeler et. al., 1995; Pockley et al., 2005; Zanin-Zhorov et al., 2003),

descobertas por Ferruccio Ritossa e colaboradores (Ritossa, 1962), so

protenas chaperonas amplamente distribudas na natureza, e compreendem

uma famlia de molculas altamente conservadas, presentes em todas as

clulas eucariticas e procariticas (Hightower e Guidon, 1989). As Hsps foram

descritas, primeiramente, em larvas de Drosophila melanogaster onde os

genes se alteravam durante a incubao em resposta ao aumento da

17

temperatura (Ritossa, 1964). So molculas conservadas evolutivamente,

apresentando importncia em todas as clulas vivas (Van Eden et al., 2005).

As Hsps so classificadas de acordo com o peso molecular (Hsp10,

Hsp40, Hsp60, Hsp65, Hsp70, Hsp90, alm das Hsps pequenas). Expressas,

constitutivamente, em todos os seres vivos, so molculas conservadas

filogeneticamente e tm sido apontadas como alvo de reconhecimento cruzado

aps a resposta a antgenos de microrganismos nas infeces, induzindo

autoimunidade patolgica (Lamb et. al., 1989).

As Hsps aumentam em diversas situaes de estresse metablico, como

em clulas com deficincia nutricional, estresse oxidativo, aumento da

temperatura, tratamento com drogas anti-inflamatrias, exposio a

mediadores de inflamao e infeco viral (Morimoto e Santoro, 1998). Alm

disso, respostas Hsp-especficas favorecem a proteo contra infeces

microbianas (Zgel e Kaufmann, 1999).

Na Teoria do perigo, proposta por Matzinger e Fuchs, destacam-se

tambm respostas imunes dirigidas a antgenos no necessariamente

infecciosos, mas sinalizadores de perigo como as protenas de estresse, que

desencadeiam respostas imunes inflamatrias (Fuchs e Matzinger, 1996;

Matzinger et. al., 2002). Esta teoria foi objeto de intenso debate na comunidade

cientfica. Sabe-se, porm, que as protenas de estresse nem sempre

desencadeiam uma resposta imune inflamatria e podem tambm estar

envolvidas na imunorregulao (Cohen, 2007).

H dados na literatura apontando que as Hsps podem ativar linfcitos T

via receptor TLR2 (do ingls, Toll-like receptor 2), portanto, na presena de alta

concentrao de Hsp60, o TLR2 aumenta a adeso celular de clulas T (Zanin-

18

Zhorov et al., 2003). Em experimentos com camundongos transplantados, foi

mostrado que a alta expresso de Hsp60 no camundongo receptor selvagem

leva a um retardo na rejeio do aloenxerto de pele e o desvio de resposta Th1

para Th2, podendo regular a resposta imune ao aloenxerto (Birk et al., 1999).

H trabalhos mostrando que indivduos apresentando casos graves de

esclerose mltipla apresentam altos nveis de autoanticorpos contra a hsp60,

em comparao a indivduos saudveis (Quintana et al., 2008).

A interao da Hsp60 com clulas do sistema imune pode induzir

respostas pr inflamatrias e imunorreguladoras (REGULA/INFLAMA), nosso

grupo tem investigado a resposta imune Hsp60 no contexto do transplante.

Temos dados mostrando ocorrer uma resposta imune celular dirigida protena

Hsp, em condies inflamatrias, na resposta ao aloenxerto (Caldas et al.,

2004), e no perodo tardio ps alotransplante em momentos de estabilidade do

enxerto (Caldas et al., 2006).

Tambm, foi observado que indivduos sadios tm resposta proliferativa

de linfcitos T Hsp60 (Granja, 2000), e que PBMCS estimuladas com HSP60,

em humanos, produzem citocinas IL-10 (Caldas, 2005). Dados do nosso grupo,

mostram tambm que autoanticorpos anti-Hsp60 humana esto distribudos na

populao (Victora et al., 2007) indicando uma resposta humoral fisiolgica,

relacionada com a manuteno da homeostase.

As Hsps podem estar envolvidas na tolerncia ao aloenxerto, em

modelos experimentas, sendo alvo de reconhecimento pelos linfcitos T

presentes no enxerto, alm das molculas MHC (Pockley, 2001). No contexto

do transplante renal humano, nosso grupo sugeriu um papel imunorregulador

para a Hsp60, com base nas observaes de que populaes de linfcitos T

19

perifricos e infiltrantes do enxerto podem produzir IL-10, in vitro, em resposta

ao estmulo com a protena Hsp60 (Caldas et al., 2006). Alm disso, tambm

foi observado um perfil Th2 com produo de IL-4, associado a perodos

tardios do ps transplante, sem rejeio, sugerindo como o repertrio T reativo

Hsp60 estaria envolvido na regulao da resposta imune, no transplante

humano (Granja et al., 2004).

Considerando que o equilbrio REGULA/INFLAMA essencial na

manuteno do equilbrio biolgico, favorecendo uma resposta efetora ou

controlando a inflamao (Coelho e Faria, 2011), em diferentes contextos,

analisaremos se os peptdeos da Hsp60 podem tambm participar da

imunobiologia da tolerncia operacional, resultando em autorreatividade celular

com um perfil diferencial imunorregulador.

Tolerncia operacional

A induo de tolerncia ao aloenxerto, tem sido bem sucedida com uso

de diversas estratgias experimentais. Mas ainda um desafio na clnica. Nos

modelos experimentais j foram utilizadas diferentes estratgias, como: injeo

intratmica de antgenos do doador (Turvey et al, 1999; Jones et al,

1998), inibio da ativao de clulas T pelo bloqueio da coestimulao por

meio de protenas de fuso (Vogel et al., 2013), transplante de medula ssea

(Sharabi et al., 1989; Pilat et al, 2015). Alguns destes protocolos j foram

testados em humanos, como o transplante de medula ssea (van Rood et al.,

2002). Atualmente, existem ensaios clnicos em andamento testando-se terapia

celular no transplante (Jeroen et al., 2015).

20

No entanto, h hoje na clnica, um grupo especial de indivduos chamados

de tolerantes operacionais, que apresentam funo estvel do enxerto, mesmo

aps a suspenso de imunossupressores por um perodo maior ou igual h um

ano. Portanto, o estado de tolerncia operacional (TO) definido como um

estado de estabilidade do rgo transplantado no qual o indivduo apresenta

um sistema imunolgico imunocompetente, com caractersticas funcionais

normais, sem haver sinais de rejeio (Ashton-Chess et al., 2006; Brouard et

al.,2008; Hernandez-Fuentes e Lechler, 2010; Brouard et al, 2012).

Apesar de parecer mais frequente nos transplantes hepticos (Thomson

et al., 2001; Mazariegos et al., 2005; Demetris et al., 2009), a tolerncia

operacional, tem sido descrita no transplante renal (Strober et al., 2000;

Brouard et al., 2005; revisado por Ashton-Chess et al., 2006).

As experincias imunolgicas vivenciadas por cada indivduo levam

formao de um repertrio de clulas reativas que podem favorecer o

desenvolvimento do estado de tolerncia. importante uma viso global dos

diversos caminhos imunolgicos que possa envolver este estado de tolerncia.

Apesar de um nmero crescente de publicaes sobre pacientes

tolerantes operacionais, ainda no so bem conhecidos os mecanismos

envolvidos neste estado, e muito tem sido investigado por diferentes grupos

(Hernandez-Fuentes e Lechler, 2010; Roedder et al, 2012, Brouard et al, 2012;

Chowdhury et al, 2013). Determinar os principais mecanismos envolvidos no

estado de TO, assim como biomarcadores confiveis para o seu diagnstico,

pode trazer uma contribuio importante para a identificao de pacientes que

podem, eventualmente, evoluir de forma favorvel, como os TO, e mesmo para

o desenvolvimento de novas estratgias teraputicas imunorreguladoras.

21

Na anlise de clulas T, observou-se baixo acmulo de transcritos de

citocinas tanto Th1, quanto Th2, podendo ser sugerido um estado de

hiporresponsividade (Brouard et al., 2005). Tambm, na anlise de clulas T

perifricas, com o fentipo CD4+CD25+FOXP3+, observou-se semelhana entre

tolerantes operacionais e saudveis, diferentemente dos indivduos com

rejeio crnica, que apresentaram nmeros inferiores (Braudeau et al., 2007),

a anlise da resposta inata no sangue perifrico e no enxerto, observou que

indivduos tolerantes apresentavam baixa expresso de TLR4 em comparao

com rejeio crnica (Braudeau et al., 2008).

No contexto do transplante renal, alguns perfis diferencias foram

relatados na literatura, como o aumento da expresso gnica de molculas

relacionadas via TGF- (Brouard et al., 2007), o repertrio diferencial de TCR

(Miqueu et al., 2010), ausncia de anticorpos anti-doador HLA especficos

(Sagoo et al., 2010) e nmeros de clulas T reguladoras Foxp3 preservados

(Louis et al, 2006; Pons et al, 2008).

Na anlise de clulas B em TO, no transplante renal, verificou-se a

expresso diferencial de genes especficos de clulas B (Sagoo et al., 2010;

Newell et al., 2010; Lozano et al., 2011), com maiores porcentagens e nmeros

absolutos de clulas B da periferia (Newell et al., 2010; Louis et al, 2006; Pallier

et al., 2010) e ausncia de anticorpos anti-HLA doador-especfico no soro

(Sagoo et al., 2010). Tambm foi observado que, em indivduos tolerantes, as

clulas B estimuladas apresentaram maior razo TGF-/IFN- (Sagoo et al.,

2010).

Nosso grupo tambm tem estudado potenciais mecanismos envolvidos na

tolerncia operacional no transplante renal. Nossos principais dados mostram

22

que o grupo tolerante operacional apresenta diversas similaridades aos

indivduos saudveis, em relao aos nmeros de clulas B reguladoras

(Bregs) (Silva et al., 2012) e Treg (Moraes-Vieira et al., 2012) , enquanto os

grupos de rejeio crnica e estvel, apresentam menores nmeros dessas

subpopulaes imunorreguladoras, sugerindo que a sua preservao

importante nos mecanismos de TO.

Os dados do nosso grupo tambm apontam que o fator GATA3

desempenha um papel importante na induo/manuteno do estado de

tolerncia operacional, sugerindo que um desvio para a resposta imune do tipo

Th2 possa ter uma importncia na manuteno de um estado com

caractersticas imunorreguladoras nos TO (Moraes-Vieira, 2012). A respeito do

papel das clulas Th2 no transplante, h trabalhos que falam desse subtipo

celular como tendo papel imunorregulador (Waaga et al., 2001), outros,

destacam seu papel no processo de rejeio (Pirenne et al., 2005). Entretanto,

de acordo com estudos do nosso grupo, os indivduos TO, com funo estvel

do enxerto e TO, parecem possuir um perfil diferenciado com aumento

significativo da expresso de GATA-3 (Moraes-Vieira, 2012).

Diversos pesquisadores tm comparado parmetros imunolgicos

relacionados com a atividade das clulas T na tolerncia operacional (Louis et

al, 2006; Braudeau et al, 2007; Pons et al, 2008), no transplante renal e de

transplante de fgado (Martnez-Llordella et al, 2007; Snchez-Fueyo, 2010), e

tm apontado diferenas imunolgicas especficas de cada rgo em estado de

tolerncia operacional (Heidt e Wood, 2012). Foi visto que, pacientes em

estado de tolerncia operacional, podem apresentar aumento da produo de

citocinas potencialmente reguladoras, como IL-10 e TGF- (Alber et al., 2004),

23

mas no foi observada diferena no nmero absoluto de clulas T regs entre

indivduos transplantados hepticos em estado de tolerncia operacional e

indivduos saudveis (Li et al., 2004).

Sabendo que os indivduos tolerantes operacionais alcanaram um

estado de equilbrio com o enxerto, nos perguntamos se, neste estado

imunorregulador, a resposta celular antgeno-especifica dirigida a trs grupos

de antgenos: aloantgenos relevantes no transplante (peptdeos da molcula

HLA-DR), autoantgenos da Hsp60 que podem ter atividade pr-inflamatria e

imunorreguladora, e antgenos do CMV, importantes microrganismos nas

infeces no transplante ocorreu de forma diferencial. Apesar de os pacientes

em TO no apresentarem maior prevalncia de infeces do que a populao

em geral, h poucas informaes sobre a resposta imune celular antgeno-

especfica na TO, tanto em relao via indireta de alorreconhecimento, como

em relao autorreatividade pr-inflamatria e imunorreguladora (Shiu et al.,

2015).

Este estudo contribuir para o avano do conhecimento sobre a

imunobiologia da TO no transplante renal e a modulao da resposta celular

antgeno especfica. Partimos da hiptese de que o indivduo tolerante

operacional tenha ativado mecanismos imunorreguladores e desenvolvido um

perfil imunolgico diferencial em relao resposta imune celular antgeno-

especfica.

Dada a importncia funcional de citocinas e de algumas subpopulaes

na resposta imune no desfecho do rgo transplantado, analisamos diferentes

subpopulaes de clulas T (linfcitos TCD4+ de memria efetora, efetoras e

reguladoras), frente os citados estmulos antignicos, em indivduos

24

transplantados renais em TO, comparativamente com indivduos em diferentes

estados clnicos e indivduos saudveis. Com essas anlises esperamos

identificar parmetros diferenciais com relao resposta celular em indivduos

tolerantes operacionais. Podendo contribuir para maior compreenso deste

estado imunolgico com relao evoluo clnica do rgo transplantado,

principalmente em relao s condies contrastantes: a tolerncia operacional

e a rejeio crnica.

25

2. Objetivos

2.1 Objetivo geral

Determinar se o estado de tolerncia operacional envolve a modulao

funcional diferencial da resposta celular antgeno-especfica em relao a trs

grupos de antgenos relevantes no transplante: antgenos do doador, antgenos

de patgenos e autoantgenos.

2.2 Objetivos especficos

Determinar no estado de tolerncia operacional, comparativamente a

diferentes grupos clnicos e indivduos saudveis,

1. O perfil de produo de citocinas predominantemente

imunorreguladoras (REGULA) ou pr-inflamatrias (INFLAMA) na

resposta de clulas mononucleadas do sangue perifrico dirigida

aos trs grupos antignicos.

2. A resposta proliferativa de diferentes subpopulaes de linfcitos

T predominantemente REGULA ou INFLAMA dirigida aos trs

grupos antignicos.

26

3. Material e Mtodos

3.1 Delineamento Experimental

Figura 1. Delineamento experimental. TO: Tolerante operacional; RC: Rejeio Crnica; EST: Estvel; SAU: Saudvel; PBMC: Clulas Mononucleadas do Sangue Perifrico; CMV: Citomegalovrus; CFSE: do ingls, Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester; HSP: Protena do choque trmico. REGULA: aumento da expresso de citocinas ou de subpopulao celular predominantemente reguladoras ou diminuio da expresso de citocinas ou de subpopulao celular pr-inflamatria; INFLAMA: aumento da expresso de citocinas ou de subpopulao celular predominantemente inflamatrias ou diminuio da expresso de citocinas ou de subpopulao celular reguladora.

27

3.2 Sujeitos de pesquisa

Este projeto faz parte do Estudo Multicntrico em tolerncia operacional

no Brasil, dentro do projeto coordenado pela Dra. Vernica Coelho: Estudo do

perfil imunolgico regulador em pacientes com longo tempo de transplante de

rgos slidos, em estado de tolerncia operacional: bases para novas

estratgias teraputicas imunomoduladoras na clnica, vinculado ao Instituto

de Investigao Imunolgica (iii) Instituto do Milnio, CNPq (573879/2008-7),

coordenado pelo Prof. Dr. Jorge Kalil.

Neste estudo, os sujeitos de pesquisa so provenientes dos seguintes

centros brasileiros integrantes: Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina

da Universidade de So Paulo, do Hospital So Lucas (Rio Grande do Sul,

PUC-RS), Hospital Beneficncia Portuguesa (SP) e Hospital de Londrina (PR).

O Estudo Multicntrico est em andamento desde 2005, e o material biolgico

foi coletado de todos os grupos aps assinatura do termo de consentimento

livre e esclarecido (TCLE) (Anexo 2), tambm para os novos pacientes

recrutados. Este projeto especfico foi aprovado pela Comisso de tica do

Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

HCFMUSP (CAPPesq no 0476/08).

A anlise foi realizada em trs grupos clnicos diferentes, seguindo o

desenho experimental representado na figura 1:

Grupo TO- tolerante operacional: pacientes estveis, com mais de um ano de

transplante sem o uso de drogas imunossupressoras (1 ano).

Grupo RC- rejeio crnica: indivduos com mais de um ano de transplante

com diagnstico de rejeio crnica, diagnosticado por bipsia.

28

Grupo EST- funo estvel do enxerto: transplantados com mais de um ano de

transplante, com doses habituais de imunossupressores.

Grupo SAU- indivduos saudveis. Doadores ou no de rgos.

A seleo dos pacientes feita pelos seguintes critrios: Funo estvel:

Limite de clearance de creatinina >45ml/min, no apresentando variao

negativa de clearance > 10% nos ltimos 6 meses. Rejeio crnica: medida

clinicamente pelo aumento do nvel de creatinina (superior a 2,0 mg/dl) no

perodo de 4 a 6 meses, na ausncia de fatores como nefrotoxicidade por

drogas ou doenas e comprovada por bipsia renal, sendo verificada

histologicamente por alteraes vasculares caracterizadas por fibrose intimal e

intersticial, atrofia difusa dos glomrulos, tubular, avanando para insuficincia

renal crnica. Tolerncia operacional: no utilizao de imunossupressores por

um perodo igual ou maior a 1 ano.

Neste estudo, analisamos ao todo, 6 indivduos tolerantes operacionais

(TO), 8 com rejeio crnica (RC), 8 estveis com doses habituais de

imunossupressores (EST) e 7 indivduos saudveis SAU), em um total de 29

sujeitos de pesquisa. Todos os indivduos estudados possuem dados clnicos

(Tabela 1) e demogrficos (ANEXO 1). Para alguns ensaios, nem todos os

indivduos puderam ser estudados, por limitao de material, apontamos esta

informao nos resultados.

3.3 Material coletado: Para a realizao dos experimentos, foram feitas

coletas de 40 ml de sangue em tubos com heparina.

29

Tabela 1. Dados clnicos nos diferentes grupos de estudo

Grupo Clnico Sujeito de Pesquisa Origem do

enxerto N Total

Disparidades HLA

Tipificao HLA-DR Infeces (ps TX ou ps TO ou ps IE) Sorologia CMV Receptor Doador

TO N=6

Ltx03 Fal 3 DR-1, DR-7 DR-1, DR-4 No CMV+

Ltx10 VA (irm) 1 DR-3, DR-17 DR-4, DR-17 No CMV+

Ltx16 VA (irm) 0 DR-13, DR-16 DR-13, DR-16 No CMV+

Ltx62 VA 3 DR-4, DR-0 DR-4, DR-0 No CMV+



RC N=8

Ltx04 Fal 6 DR-3, DR-13 DR-12, DR-8 HZ CMV+ Ltx05 Fal 6 DR-4, DR-0 DR-17, DR-9 HCV; HS; CDD; AMID, rCMV; PNMN CMV+ Ltx13 VA (pai) 2 DR-4, DR-13 DR-15, DR-13 rCMV; HPV; PNMN; HS; IU; TBC; ERI CMV+ Ltx24 Fal 5 DR-10, DR-16 DR-4, DR-10 rCMV; H1N1 CMV+

Ltx26 VNA 5 DR-14, DR-8 DR-7, DR-17 HZ; PANCag; PNMN CMV+

Ltx79 VNA 3 DR-4, DR-0 DR-15, DR-0 POLIv, TBC, HZ CMV+

Ltx80 VA (me) 0 DR-7, DR-0 DR-7, DR-0 PNMN; CS; POLIV; HZ CMV+

Ltx87 VA (me) 0 DR-7, DR-0 DR-7, DR-0 CMV; EBV; RUB, HAV; PNMN; IU CMV+

EST N=8

Ltx11 Fal 6 DR-15, DR-3 DR-1, DR-7 rCMV; HbsAg CMV+ Ltx12 Fal 6 DR-11, DR-13 DR-1, DR-7 CDD; rCMV CMV+

Ltx14 Fal 3 DR-8, DR-14 DR-14, DR-17 Sem intercorrncias CMV+

Ltx19 Fal 3 DR-0, DR-13 DR-13, DR-4 HS CMV+

Ltx22 Fal 3 DR-13, DR-15 DR-4, DR-13 Nd CMV+

Ltx31 VA (irm) 3 DR-3, DR-11 DR-11, DR-18 CDD CMV+

Ltx33 Fal 5 DR-11, DR-14 DR-1, DR-14 Nd CMV+

Ltx71 Fal 2 DR-4, DR-13 DR-13, DR-13 rCMV CMV+

SAU N=7

Ltx18 ------- ------- DR-14, DR-17 ------- No CMV+

Ltx36 ------- ------- DR-1, DR-14 ------- No CMV+

Ltx37 ------- ------- DR-12, DR-8 ------- No CMV+

Ltx40 ------- ------- DR-4, DR-13 ------- No CMV+

Ltx41 ------- ------- DR-17, DR-11 ------- No CMV+

Ltx44 ------- ------- DR-4, DR-13 ------- No CMV+

Ltx84 ------- ------- DR-4, DR-0 ------- No CMV+

TO: tolerncia operacional. RC: rejeio crnica. EST: estvel. SAU: saudvel. Fal: falecido. VA: vivo aparentado. VNA: vivo no aparentado. HLA: human leukocyte antigen (angeno leucocitrio humano). CMV: citomegalovrus. IE: incluso no estudo. HCV: vrus da hepatite C. HS: herpes simples. HZ: herpes zoster. CDD: candidase. rCMV: recidiva de CMV. PNMN: pneumonia. HPV: vrus do papiloma humano. IU: infeco urinria. TBC: tuberculose. ERI: erisipela. PANCag: pancreatite aguda. POLIV: polioma vrus. HBs: hepatite B. HAV: vrus da hepatite A. CS: choque sptico. AMID: amidalite. RUB: rubola.

30

3.4 Obteno de clulas mononucleadas do sangue perifrico: Na

separao de clulas mononucleadas do sangue perifrico (PBMC, do ingls,

peripheral blood mononuclear cells), as amostras de sangue foram diludas em

soluo salina isotnica e separadas em gradiente de Ficoll-Hypaque

(densidade 1.077 g/l, Ficoll: Pharmacia Biotech, Sweden e Hypaque: Urografina

370, Schering, Brasil). Aps centrifugao por 30 minutos (min) a 800xg, a

interface que contm clulas mononucleadas foi coletada, ressuspendida em

salina, e centrifugada por mais 10 min a 700xg.

O sedimento celular foi lavado por duas vezes, e as clulas ressuspendidas

em meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute - Gibco-BRL, Grand

Island, NY, USA), suplementado com 2 mM de L-glutamina (Sigma-Aldrich, St.

Louis, MO, EUA), 40 g/ml de gentamicina (HC-USP, SP, Brasil), 1% de

ciprofloxacina (HC-USP,SP, Brasil) e, posteriormente, centrifugadas por 8 min

a 600xg. Logo aps, ressuspendemos as clulas em 3 ml de meio RPMI. A

concentrao celular foi determinada por contagem em cmara de Neubauer e

a viabilidade foi verificada com o corante vital Azul de Tripan (MCB

Manufacturing Chemists Inc., Cincinnati, OH, EUA). Posteriormente, as clulas

foram congeladas (conforme descrito abaixo).

3.5 Congelamento e descongelamento de clulas: Para o congelamento,

a suspenso de clulas mononucleadas que estava em 3ml de meio RPMI, foi

centrifugada a 600xg por 8 min e ressuspendidas em meio de congelamento

contendo 90% de soro fetal bovino inativado (Hyclone,South,Logan,UT,USA), e

10% de DMSO (dimetilsulfxido, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA).

31

Utilizamos alquotas de 1ml de soluo de congelamento para cada criotubo

(10 a 15x106 clulas/ml). As clulas foram levadas para o freezer 80C e,

posteriormente, armazenadas em nitrognio lquido at o momento da

utilizao. Para o descongelamento, aps serem retirados do nitrognio lquido,

os criotubos foram colocados rapidamente em banho-maria a 37C por 1 min. A

suspenso de clulas foi transferida para um tubo contendo 10 ml de meio

RPMI (Gibco, Rockville, MD, USA), suplementado com 2 mM de L-glutamina

(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), 40g/ml de gentamicina (HC-USP, SP,

Brasil), 1% de ciprofloxacina (HC-USP,SP, Brasil) e 10% de soro fetal bovino

inativado (SBFi, Hyclone, South, Logan, UT, USA) e centrifugada por 8 min a

600xg por duas vezes. Logo aps, foi verificada a viabilidade celular com o

corante vital Azul de Tripan.

3.6 Marcao celular com CFSE: para o ensaio de proliferao, as PBMCs

sero inicialmente marcadas com CFSE (do ingls, Carboxyfluorescein

Diacetate Succinimidyl Ester) (Molecular Probes, Eugene, OR). O CFSE (Life

Technologies) difunde-se para dentro da clula e emite a fluorescncia que

permanece nas clulas, e, a cada ciclo de diviso celular, a intensidade da

fluorescncia diminui. Aps descongelamento das PBMCs, elas foram

mantidas em estufa de CO2 a 37C, overnight a fim de estabilizar as funes

celulares. Aps este tempo, deixamos as clulas em temperatura ambiente

(TA) por 1h. Procedemos a centrifugao por 8 min a 600xg, ressuspedemos

as clulas em 3ml de meio RPMI e realizamos a contagem das clulas em

cmara de Neubauer, coradas com azul de tripan, para calcular a viabilidade

32

celular. Separamos uma alquota como controle negativo (de clulas sem

marcao), e partimos para a marcao com o CFSE. Apagamos as luzes,

devido ao fato do CFSE ser sensvel a luz. Para a marcao, partimos da

concentrao de 20x106 clulas diludas em 2ml de PBS (do ingls, Phosphate

Buffered Saline Life Technologies) contendo 2% de FCS inativado (SBFi,

Hyclone, South, Logan, UT, USA). Portanto, utilizamos a concentrao final de

3,5M de CFSE, as clulas foram incubadas em banho-maria a 37C por 10

min, sendo, o falcon agitado a cada 3min, garantindo assim, a homogeneizao

do CFSE e sua mistura s clulas. Em seguida, o processo de marcao foi

interrompido adicionando-se RPMI (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) gelado

contendo 10% de FCS, e as clulas ficaram por 3min em gelo. Centrifugamos

as clulas por 6min a 500xg, descartamos o sobrenadante e acrescentamos

5ml de meio RPMI, e assim, repetimos a centrifugao por 3 vezes.

Procedemos a contagem das clulas em cmara de Neubauer com corante

vital Azul de Tripan. As clulas marcadas foram cultivadas com os antgenos

previamente titulados e para ensaios funcionais de proliferao para posterior

avaliao de proliferao por citometria de fluxo.

3.7 Seleo dos peptdeos: para selecionar os alopeptdeos,

escolhemos uma das molculas HLA-DR baseada na disparidade do doador

com seu respectivo receptor (Tabela 2). Todos os sujeitos de pesquisa foram

devidamente tipificados para HLA-DR de acordo com o protocolo (descrito em

3.12). Os peptdeos HLA-DR utilizados encontram-se na Tabela 3.

33

Tabela 2. Seleo dos peptdeos HLA-DR alo dos sujeitos de pesquisa dos diferentes grupos de estudo.

Grupo Clnico

Sujeito de Pesquisa Receptor Doador

HLA-DR Selecionado

TO N=6

Ltx03 DR-1, DR-7 DR-1, DR-4 DR-4 Ltx10 DR-3, DR-17 DR-4, DR-17 DR-4 Ltx16 DR-13, DR-16 DR-13, DR-16 DR-13 Ltx62 DR-4, DR-0 DR-4, DR-0 DR-4 Ltx90 DR-1, DR-3 DR-1, DR-3 DR-1 Ltx91 DR-3, DR-13 DR-3, DR-13 DR-13

RC N=8

Ltx04 DR-3, DR-13 DR-12, DR-8 DR-8 Ltx05 DR-4, DR-0 DR-17, DR-9 DR-17 Ltx13 DR-4, DR-13 DR-15, DR-13 DR-15 Ltx24 DR-10, DR-16 DR-4, DR-10 DR-4 Ltx26 DR-14, DR-8 DR-7, DR-17 DR-17 Ltx79 DR-4, DR-0 DR-15, DR-0 DR-15 Ltx80 DR-7, DR-0 DR-7, DR-0 DR-7 Ltx87 DR-7, DR-0 DR-7, DR-0 DR-7

EST N=8

Ltx11 DR-15, DR-3 DR-1, DR-7 DR-7 Ltx12 DR-11, DR-13 DR-1, DR-7 DR-7 Ltx14 DR-8, DR-14 DR-14, DR-17 DR-17 Ltx19 DR-0, DR-13 DR-13, DR-4 DR-4 Ltx22 DR-13, DR-15 DR-4, DR-13 DR-4 Ltx31 DR-3, DR-11 DR-11, DR-18 DR-18 Ltx33 DR-11, DR-14 DR-1, DR-14 DR-1 Ltx71 DR-4, DR-13 DR-13, DR-13 DR-13

SAU N=7

Ltx18 DR-14, DR-17 ------- DR-4 Ltx36 DR-1, DR-14 ------- DR-16 Ltx37 DR-12, DR-8 ------- DR-16 Ltx40 DR-4, DR-13 ------- DR-7 Ltx41 DR-17, DR-11 ------- DR-8 Ltx44 DR-4, DR-13 ------- DR-16 Ltx84 DR-4, DR-0 ------- DR-7

Os peptdeos sintticos alogeneicos foram derivados de molculas HLA-

DR alogeneicas, correspondentes a uma disparidade presente no doador (para

os indivduos transplantados) ou, simplesmente, derivados de uma molcula

HLA-DR no presente no sujeito de pesquisa estudado (para os indivduos

saudveis). Deste modo, utilizamos diferentes peptdeos HLA-DR para os

diferentes sujeitos de pesquisa (Tabela 2).

Os alopeptdeos HLA-DR foram selecionados baseados nas

disparidades doador/receptor e analisando a sua potencial antigenicidade

34

usando-se o programa de predio IEDB (Immund Epitope Database And

Analysis Resource - http://www.iedb.org/#). Estes peptdeos, foram sintetizados

pela empresa GLS Ltd (GL Biochem (Shanghai) Ltd) com uma pureza de 90%.

Os peptdeos foram preparados a uma concentrao de 1mg/ml, em DMSO

(dimetilsulfxido, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Fizemos alquotas de

100l e armazenamos no freezer -20C at o momento de uso. Utilizamos a

concentrao de 2,5 g/ml do peptdeo HLA-DR.

Tabela 3. Sequncias dos peptdeos HLA-DR sintticos utilizados Nomenclatura Sequncia do Peptdeo sinttico Molcula HLA-DR

SHLA-1 DWTFQTLVMLETVPRSGEVYT DR-1, DR-4[1], DR-8, DR15[1] SHLA-2 GLLFLGAGLFIYFRNQKGHSG DR-16 SHLA-3 LFLGAGLFIYFRNQKGHSGLQPTGF DR-4[2], DR-17[1] SHLA-5 FNGTERVRFLDRYFHNQEENV DR-17[2] SHLA-6 FNGTERVQFLERLFYNQEEFV DR-7[1] SHLA-7 ALTVTLMVLSSPLALAGDTQPR DR-4[3], DR-7[2] SHLA-8 VLTVTLMVLSSPLALAGDTRPRFLEYSTSECH DR-15[2] SHLA-9 ECHFFNGTERVRFLDRYFHNQ DR-13[1] SHLA-10 ALTVTLMVLSSPLALAGDTRPRFLEQV DR-8 SHLA-11 KHECHFFNGTERVRFLDRYFYHQE DR-4[4] SHLA-12 WTFQTLVMLETVPRSGEVYTC DR-13[2], DR-18

Para os peptdeos do antgeno CMV, utilizamos um pool de peptdeos

PepTivator CMVpp65 (Miltenyi Biotec), constitudo de 15 peptdeos com 11

aminocidos sobrepostos, abrangendo a sequncia completa da protena pp65

do citomegalovrus humano, sendo um alvo imunodominante de clulas T. Foi

preparada uma soluo estoque de 30nmol/ml correspondente a 0,6g/ml,

alquota em volume de 100l e armazenada a -800C.

Como autoantigenos, utilizamos os peptdeos de Hsp60 denominados (N6,

N7 e C9) (Tabela 4) que foram selecionados baseados no perfil

REGULA/INFLAMA, de dados anteriores do nosso grupo mostrando que os

peptdeos N6 e N7, localizados na regio N-terminal da HSP60, foram os

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peptdeos que mostraram predomnio de modificaes do perfil REGULA, e o

peptdeo C9 da regio C-terminal da HSP60, o que apresentou as maiores

frequncias de efeitos INFLAMA.

Tabela 4. Sequncias dos peptdeos da protena Hsp60 humana selecionados

Assim como os p

priscila carmona papel da resposta celular antígeno-específica na

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