presença de acanthamoeba na conjuntiva de nadadores...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

Presença de Acanthamoeba na conjuntiva de

nadadores hígidos

LUIS ANTONIO GORLA MARCOMINI

RIBEIRÃO PRETO 2009

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LUIS ANTONIO GORLA MARCOMINI Presença de Acanthamoeba na conjuntiva de

nadadores hígidos

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Ciências Médicas. Área de Concentração: Mecanismos Fisiopatológicos nos Sistemas Visual e Audio-Vestibular.

Orientador: Prof. Dr. Sidney Júlio de Faria e Sousa

RIBEIRÃO PRETO 2009

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,

POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E

PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Marcomini, Luis Antonio Gorla Presença de Acanthamoeba na conjuntiva de nadadores hígidos. Ribeirão Preto, 2009. 97p.: il.; 30 cm Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de Concentração: Mecanismos Fisiopatológicos nos Sistemas Visual e Audio-Vestibular. Orientador: Sousa, Sidney Júlio de Faria e 1. Acanthamoeba; 2. nadadores hígidos; 3. conjuntiva.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por ter permitido que eu chegasse até aqui.

Agradeço aos meus pais, Cecília Gorla Marcomini e Natal Marcomini por terem

provido todos os meios para que eu chegasse até aqui.

Agradeço à minha esposa Elina, e aos meus filhos André e Natália, pelo apoio e

incentivo durante a execução deste trabalho.

Agradeço ao Prof. Dr. João Aristeu da Rosa, por ter permitido que utilizássemos

as instalações do Laboratório de Parasitologia da UNESP - Araraquara.

Agradeço à Profª Dra. Isabel Martinez, por ter me acompanhado e muito me

ajudado nas atividades práticas para identificação das amoebas, personagens

principais destes escritos.

Agradeço ao Prof. Dalton Geraldo Guaglianoni da UNESP - Araraquara, pela

ajuda nas análises estatísticas iniciais deste trabalho.

Agradeço à Srª. Luciana Martins de Alencar Provinzano, por ter participado das

atividades laboratoriais deste trabalho.

Agradeço a todos os participantes deste estudo, que sempre me surpreenderam

com sua generosidade e paciência.

Finalmente, quero registrar aqui três agradecimentos especiais:

À Srª. Eloísa Marcela Rueda Furlan, que esteve presente durante a realização de

praticamente todas as atividades laboratoriais deste estudo, e manteve-se

sempre disposta a colaborar ativamente até a conclusão do mesmo.

Ao Prof. Maurício Tadeu Frajácomo, amigo de longa data, que demonstrando

enorme generosidade e extrema coragem, tranquilamente abriu-me as portas de

sua casa e permitiu a realização deste trabalho. Quando agimos com

generosidade nos tornamos pessoas melhores. Quando agimos com coragem

construímos um mundo melhor. Generosidade e coragem têm norteado suas

atitudes, o que faz de você uma pessoa imprescindível.

Ao meu Orientador, Prof. Dr. Sidney Júlio de Faria e Sousa, que esteve presente

na minha formação Oftalmológica, desde os tempos de minha Residência

Médica nos idos de 1985 e 1986, e mais recentemente, recebeu-me no Setor de

Doenças Oculares Externas do Hospital das Clínicas da FMRP-USP, aceitando-

me como seu pós-graduando. Além de indicar o caminho, que me trouxe até

aqui, o Prof. Sidney esteve comigo durante todo o percurso. Sua presença

constante facilitou a travessia dos trechos pedregosos que não puderam ser

evitados.

LISTA DE FIGURAS

Lista de Figuras

Figura 1: Escova e aplicador em envelope estéril....................................46 Figura 2: Escova e aplicador..................................................................46 Figura 3: Escova e aplicador sem a capa de proteção.............................47 Figura 4: Escova e aplicador desmontado ..............................................47 Figura 5: Escova e aplicador - montagem ..............................................48 Figura 6: Demonstração de uso da escova - I .........................................48 Figura 7: Demonstração de uso da escova - II........................................49 Figura 8: Coleta de amostra de material conjuntival ..............................50 Figura 9: Tubo com thioglicolato - I .......................................................50 Figura 10: Tubo com thioglicolato – II....................................................51 Figura 11: Inserção da escova no tubo após coleta do material conjuntival.............................................................................................51 Figura 12: Tubo contendo thioglicolato e escova carregada de material conjuntival.............................................................................................52 Figura 13: Trofozoítos ...........................................................................54 Figura 14: Trofozoítos e cistos recém formados......................................54 Figura 15: Cistos maduros ....................................................................55

LISTA DE TABELAS

Lista de Tabelas

Tabela 1: Dados demográficos dos nadadores.............................................57 Tabela 2: Frequência de resultados de culturas de Acanthamoeba de conjuntivas de esportistas hígidos da academia “A” (maio de 2007) ........57 Tabela 3: Frequência dos resultados de culturas de Acanthamoeba de conjuntivas de nadadores das piscinas “A” e “B” (maio de 2007).............57 Tabela 4: Resultados de culturas de Acanthamoeba da água de duas piscinas cobertas, em função do dia e do período da colheita (maio de 2007)............................................................................................................ 58 Tabela 5: Frequência dos resultados de culturas de Acanthamoeba da água das piscinas “A” e “B” (maio de 2007).............................................58 Tabela 6: Resultados de culturas de Acanthamoeba da água de duas piscinas cobertas, em função do dia e do período da colheita (maio de 2008)............................................................................................................ 58 Tabela 7: Frequência dos resultados de culturas de Acanthamoeba da água das piscinas “A” e “B” (maio de 2008)................................................ 58 Tabela 8: Cotejo de dois resultados consecutivos de culturas de Acanthamoeba da água da piscina “A”....................................................59 Tabela 9: Cotejo de dois resultados consecutivos de culturas de Acanthamoeba da água da piscina “B”....................................................59 Tabela 10: Frequência dos resultados de culturas de Acanthamoeba de conjuntivas de nadadores das piscinas “A” e “B” (maio de 2008).............59 Tabela 11: Frequência dos resultados de culturas de Acanthamoeba de conjuntivas de dois grupos independentes, de nadadores da piscina “A”, segundo a data do exame.......................................................................60 Tabela 12: Cotejo de dois resultados consecutivos de culturas de Acanthamoeba de um mesmo grupo de nadadores da piscina “A”. ..........60

RESUMO

Resumo

Marcomini, L.A.G. Presença de Acanthamoeba na conjuntiva de nadadores hígidos. 97f. Tese de Doutorado – Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009.

Introdução. A Acanthamoeba é uma amoeba de vida livre, que pode

causar ceratite de difícil diagnóstico e tratamento, particularmente em

usuários de lentes de contato. Como esses protozoários já foram

isolados de águas de piscinas, o objetivo deste estudo foi o de observar

se a conjuntiva de nadadores hígidos pode albergar Acanthamoeba.

Material e Método. Noventa e dois indivíduos hígidos de duas

academias de esportes dotadas de piscinas cobertas e aquecidas,

pertencentes a uma mesma companhia, foram estudados entre 2007 e

2008, após assinarem termo de consentimento. Os critérios de exclusão

foram: uso de lentes de contato, uso de qualquer medicação ocular ou

qualquer antibiótico sistêmico, idade inferior a 18 anos, e a utilização

de ambas as piscinas durante o experimento. O estado de higidez dos

participantes foi atestado pela equipe médica das academias. O estudo

foi dividido em duas fases. Uma das academias, identificada como “A”

tinha em torno de 33 anos de construção. A outra, identificada como

“B”, tinha cinco anos. Primeira fase: Foram coletados raspados

conjuntivais de 30 nadadores e 13 não-nadadores da academia “A” e de

11 nadadores da academia “B”. Ao mesmo tempo, foram coletadas duas

amostras de água (uma pela manhã e outra à noite) de cada uma das

piscinas, durante sete dias consecutivos. Então, a piscina “A” foi

esvaziada e submetida a uma limpeza diferenciada. Os procedimentos

de limpeza e manutenção de ambas as piscinas passaram a ser feitos

Resumo

três vezes por semana ao invés de uma vez como era até então. Segunda

fase: seis meses mais tarde, amostras de água de ambas as piscinas

foram coletadas novamente, segundo o mesmo esquema da primeira

fase. Raspados conjuntivais de nadadores da piscina “A” foram

coletados e separados em dois grupos: um grupo constituído por 18

nadadores que ainda não haviam sido testados, e o outro constituído

por 16 nadadores que já haviam sido testados na primeira fase. Na

piscina “B” foram coletados raspados conjuntivais de 20 nadadores que

não haviam sido testados na primeira fase. O material foi coletado com

uma escova de cerdas de nylon, especialmente desenhada para este

estudo; cultivado em Agar não nutriente com cobertura de Escherichia

coli; e, observado diariamente ao microscópio óptico, para pesquisa de

cistos e trofozoítos de Acanthamoeba, durante 14 dias. Resultados.

Primeira fase: A porcentagem de contaminação da conjuntiva tarsal

superior de nadadores da piscina “A” foi de 76,7% (23/30); nenhum dos

13 não-nadadores da academia “A” e nenhum dos 11 nadadores da “B”

foram positivos. A taxa de contaminação dos nadadores da academia

“A” foi significativamente maior que as taxas de contaminação dos não-

nadadores (Teste Exato de Fisher p<0,0001) e dos nadadores da

academia “B” (Teste Exato de Fisher p=0,0001). A porcentagem de

contaminação das amostras de água das piscinas “A” e “B” foi,

respectivamente, 85,7% (12/14) e 35,7% (5/14). Essa diferença foi

estatisticamente significativa (Teste exato de Fisher p=0,0183). Segunda

Fase: em ambas as piscinas a porcentagem de contaminação das

Resumo

amostras de água passou a ser de 14,3 % (2/14). A mudança na taxa de

contaminação na piscina “A” de 85,7% para 14,3% foi estatisticamente

significante (Teste de McNemar p=0,0094). A mudança na taxa de

contaminação da piscina “B” de 35,7% para 14,3% não foi

estatisticamente significante (Teste de McNemar p=0,3711). A

porcentagem de contaminação da conjuntiva tarsal dos 18 nadadores

da piscina “A” foi de 5,5% (1/18). Nenhum dos 20 nadadores da piscina

“B” estava contaminado. A diferença na proporção de contaminação dos

nadadores de ambas as piscinas não foi estatisticamente significante

(Teste Exato de Fisher p=0,4737).

A diferença entre as taxas de contaminação dos 14 nadadores da

primeira fase (78,6%) e dos 18 nadadores da segunda fase (5,5%) da

piscina “A” foi estatisticamente significante (Teste Exato de Fisher

p<0,0001). A mudança na taxa de contaminação de 75% para 18,7%

entre os 16 nadadores da piscina “A”, que foram testados em ambas as

fases, foi estatisticamente significante (McNemar p=0,0077).

Conclusões: pudemos concluir que: 1) a conjuntiva de nadadores

hígidos pode albergar Acanthamoeba; 2) a chance de se encontrar

Acanthamoeba na conjuntiva de nadadores hígidos está provavelmente

relacionada com o grau de contaminação da água da piscina por esse

protozoário. 3) nadadores com resultado positivo para Acanthamoeba

podem tornar-se negativos com a redução da contaminação da piscina.

Palavras-chave: Acanthamoeba, nadadores hígidos, conjuntiva

ABSTRACT

Abstract

Marcomini, L.A.G. Presence of Acanthamoeba in the conjunctiva of

healthy swimmers. 97f. Thesis (Doctoral) - Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009.

Introduction: Acanthamoeba is a free-living amoeba that can cause a

keratitis of difficult diagnosis and treatment, particularly in wearers of

contact lenses. As these protozoans have already been isolated from the

water of swimming pools, the purpose of this study was to know if the

conjunctiva of healthy swimmers can carry Acanthamoeba. Material

and Method: Ninety two healthy individuals of two athletic facilities

with indoor heated swimming pools, belonging to a same company, were

studied between 2007 and 2008 after full informed consent. The

exclusion criteria were: the wear of contact lenses, use of any topical

medication in the eye or any systemic antibiotic, age under 18 and the

use to both swimming pools during the period of the experiment. The

health state of the participants was attested by the medical staff of the

facility. The study was divided in two stages. One of the facilities,

identified as “A”, was about 33-years-old. The other, identified as “B”,

was 5-years-old. First stage: it was collected conjunctival scrapings of

30 swimmers and 13 non-swimmers of the facility “A” and of 11

swimmers from the facility “B”. At the same time, two daily water

samples (morning and evening) were collected from both swimming

pools, during seven consecutive days. Then the swimming pool “A” was

emptied and submitted to thorough cleaning. The standard cleaning

Abstract

procedure of both swimming pools started to be done 3 times a week

rather than the original once a week schedule. Second stage: Six

months later, water samples from each swimming pool were collected

again the same way as before. Conjunctival scrapings from the

swimmers of the facility “A” were collected and separated in two groups:

one group formed by 18 swimmers who had not been tested yet and

another including 16 swimmers who had already been tested in the first

stage. In the swimming pool “B”, scrapings from 20 swimmers who had

not been tested in the first stage were collected. The materials were

collected with sterile nylon brushes, specially designed for this purpose,

and cultured into non nutrient Agar with an Escherichia coli overlay and

daily probed for cysts of Acanthoameba during 14 days. Results: First

stage: the percentage of contamination of the tarsal conjunctiva of 30

swimmers of the facility “A” was 76.7% (23/30); none of the 13 non-

swimmers of this facility “A” and none of the 11 swimmers of the facility

“B” was positive. The rate of contamination of the swimmers of the

facility “A” was significantly higher than the rates of contamination of

the non-swimmers (Fisher’s exact p<0.0001) and the swimmers of

facility “B” (Fisher’s exact p=0.0001). The percentage of contamination

of the water of the swimming pool “A” and “B” were respectively 85.7%

(12/14) and 35.7% (5/14). This difference was statistically significant

(Fisher´s exact p=0.0183). Second stage: in both swimming pools the

percentage of contamination of the water turned to be 14.3% (2/14).

Abstract

The change in the rate of contamination of the swimming poll “A” from

85.7% to 14.3% was statistically significant (McNemar p=0.0094). The

change in the rate of contamination of the swimming poll “B” from

35.7% to 14.3% was not statistically significant (McNemar p=0.3711).

The percentage of contamination of the tarsal conjunctiva of 18

swimmers of the facility “A” was 5.5% (1/18). None of the 20 swimmers

of the facility “B” were contaminated. The difference in the proportion of

contamination of the swimmers of both facilities was not statistically

significant (Fisher´s exact p=0.4737). The difference in rates of

contamination of 14 swimmers of the first stage (78.6%) and of 18

swimmers of the second stage (5.5%) of the facility “A” was statistically

significant (Fisher´s exact p<0.0001). The change in the rate of

contamination from 75.0% to 18.7% of 16 swimmers of the facility “A”,

that were tested in both stages, was statistically significant (McNemar

p=0.0077). Conclusions: the following conclusions could be reached: 1)

the conjunctiva of healthy swimmers can carry Acanthamoeba; 2) the

chance of finding Acanthamoeba in the conjunctiva of healthy

swimmers is probably related to the degree of contamination of the

water of the swimming pool by this protozoan. 3) swimmers with

positive results for Acanthamoeba can become negative with the

reduction of the contamination of the swimming pool.

Key words: Acanthameba, healthy swimmers, conjunctiva.

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO ..............................................................................18 2- REVISÃO DE LITERATURA ..........................................................29 3- OBJETIVOS .................................................................................39 4- MATERIAL E MÉTODOS...............................................................41 5- RESULTADOS ..............................................................................56 6- DISCUSSÃO .................................................................................61 7- CONCLUSÕES..............................................................................71 8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................73 9- ANEXOS ......................................................................................85 ANEXO DE PUBLICAÇÃO

1- INTRODUÇÃO

Introdução

19

A Ameba (do grego “amoibé” – que muda, que se deforma

constantemente) é um protozoário rizópode, que se move e se alimenta

por meio de pseudópodes (NEVES, 2000).

Existem mais de 50 gêneros de amebas conhecidos, e dentre as

dezenas de espécies, algumas são parasitas obrigatórios, e outras são

de vida livre, isto é, capazes de se desenvolver e se reproduzir no meio

ambiente (NEVES, 2000).

Dentre as espécies de amebas de parasitismo obrigatório, que

acometem o homem, algumas são: comensais, como a Entamoeba

hartmanni, que vive no intestino grosso; não patogênicas, como a

Entamoeba gingivalis, comum no tártaro dentário; patogênicas, como a

Entamoeba histolytica, que pode causar lesões intestinais, ulcerando

mucosa e submucosa e, por via sanguínea, pode alcançar o fígado, os

pulmões e o cérebro, causando os abscessos amebianos (NEVES, 2000).

As amebas de vida livre podem apresentar-se sob a forma de

trofozoítos ou de cistos, de acordo com as condições ambientais

(NEVES, 2000). No meio ambiente, os trofozoítos vivem em locais

úmidos e alimentam-se de bactérias (NEVES, 2000). Sempre que o

ambiente torna-se hostil, as amebas assumem a forma de cistos.

Os cistos não se alimentam, não se movem e não se reproduzem

(NEVES, 2000). Entretanto, são extremamente resistentes às condições

Introdução

20

desfavoráveis do meio ambiente: mantêm-se viáveis em ambientes secos

como, por exemplo, no solo e na poeira doméstica e de hospitais (SILVA;

ROSA, 2003); resistem ao tratamento químico das piscinas e ao

tratamento da água distribuída nas residências (cloração). São

resistentes ao congelamento (CULBERTSON, 1961) e a inúmeros

agentes antimicrobianos (NAGINGTON; RICHARDS, 1976).

Um meio líquido que contenha bactérias oferece condições ideais

para a vida desses protozoários. Nesse ambiente ocorre o

“desencistamento”, isto é, os cistos transformam-se em trofozoítos, que

passam a se locomover, se alimentar e se reproduzir (NEVES, 2000).

Culbertson, Smith e Minner (1958) demonstraram que as

linhagens de Acanthamoeba, que apresentavam atividade citolítica em

cultura de tecidos, eram capazes de provocar meningoencefalite em

animais de laboratório. A partir de então, passou-se a aceitar a hipótese

amebiana para a etiologia de casos de meningoencefalite, que até então

ficavam sem diagnóstico.

Hoje, sabe-se que algumas amebas de vida livre podem agir como

parasitas eventuais e causar infecções em humanos. Elas pertencem

aos gêneros Naegleria, Acanthamoeba, Balamuthia (NEVES, 2000).

Apesar de pouco frequentes, infecções por esses três gêneros de

amebas de vida livre parecem ocorrer no mundo todo, pois as mesmas

habitam as mais diversas altitudes, latitudes e longitudes. Existe uma

Introdução

21

única espécie do gênero Naegleria capaz de infectar humanos, a

Naegleria fowleri (NEVES, 2000).

A Naegleria fowleri apresenta três estágios: trofozoítos, forma

flagelada e forma cística. Os trofozoítos podem assumir a forma

flagelada temporariamente e então voltar à forma trofozoítica. Os

trofozoítos da Naegleria fowleri reproduzem-se por um mecanismo

conhecido por pró-mitose, no qual a membrana nuclear permanece

intacta durante a reprodução celular (NEVES, 2000).

A Naegleria fowleri pode ser encontrada em águas frescas (rios e

lagos), ou aquecidas (liberadas de usinas de energia elétrica, piscinas

aquecidas, aquários), no solo e em esgotos. Produz uma doença aguda,

geralmente fatal, que acomete o sistema nervoso central, denominada

meningoencefalite amebiana primária. As formas infectantes, que são os

trofozoítos e a forma flagelada, penetram através do bulbo olfatório de

nadadores ou banhistas hígidos e alcançam o cérebro. Após dois a três

dias do contato com a água contaminada, o doente apresenta cefaléia,

sinais meníngeos, náuseas, vômitos e deficiências neurológicas focais

que evoluem, em menos de 10 dias, para o coma e morte. Na necropsia

encontram-se os trofozoítos no tecido do sistema nervoso central (SNC)

e no liquor. A forma flagelada é encontrada apenas no liquor (NEVES,

2000).

A Acanthamoeba spp tem sido encontrada como constituinte da

flora normal das vias aéreas superiores de pessoas aparentemente

Introdução

22

hígidas, sugerindo que essa infecção possa ser comum e auto limitada

em indivíduos imunocompetentes (MA et al., 1990; SELL; RUPP;

ORRISON Jr., 1997; RODRIGUEZ et al., 1998; ARMSTRONG, 2000;

SEIJO-MARTINEZ et al., 2000; LEVINE et al., 2001; RIVERA; PADHYA,

2002).

A Acanthamoeba spp e a Balamuthia mandrillaris são infectantes

oportunistas capazes de causar encefalite amebiana granulomatosa em

indivíduos imunodeprimidos ou com doenças crônicas degenerativas de

longa data (NEVES, 2000).

A Balamuthia mandrillaris é morfologicamente similar à

Acanthamoeba, à microscopia óptica. A Acanthamoeba spp e a

Balamuthia mandrillaris têm apenas dois estágios em seu ciclo de vida:

trofozoíto e cisto. Os trofozoítos, que se multiplicam por divisão binária

pró-mitótica, são a forma infectante. Acredita-se que penetrem no

organismo pelo trato respiratório ou através de soluções de

continuidade da pele e atinjam o SNC por via hematogênica. Cistos e

trofozoítos de Acanthamoeba spp e de Balamuthia mandrillaris são

encontrados nos sítios de infecção (NEVES, 2000).

No gênero Acanthamoeba existem várias espécies implicadas em

enfermidades humanas, entre elas: Acanthamoeba culbertsoni,

Acanthamoeba polyphaga, Acanthamoeba castellanii, Acanthamoeba

astronyxis, Acanthamoeba rhysodes, Acanthamoeba hatchetti,

Acanthamoeba palestinensis, Acanthamoeba royreba (NEVES, 2000).

Introdução

23

A partir de 1973, a Acanthamoeba spp passou a figurar como

agente infeccioso ocular. Nesse ano foi descrito o primeiro caso de

ceratite por esse protozoário (JONES; ROBINSON; VISVESVARA, 1973).

A Acanthamoeba spp tem grande importância na Oftalmologia,

porque pode causar uma infecção na córnea que, a despeito do

tratamento, muitas vezes, leva à perda da visão e, algumas vezes, do

próprio olho (NEVES, 2000).

Quanto mais precocemente se diagnostica a enfermidade e se

inicia o tratamento, melhor o prognóstico. O problema reside no fato de

que, às vezes, a ceratite por Acanthamoeba simula outras enfermidades,

dificultando o diagnóstico.

A ceratite por Acanthamoeba apresenta-se de diferentes formas,

com fases de melhora e de piora do quadro clínico. Tem como

comemorativos: fotofobia, lacrimejamento, sensação de corpo estranho,

turvação visual e, por vezes, dor de intensidade desproporcional à

inflamação (SCULLY; MARK; McNEELY, 1985). Os sinais iniciais

também tendem a ser inespecíficos, constituindo-se de erosões, de

irregularidades e de opacidades epiteliais. Em muitos casos, a

aparência é de uma ceratite dendrítica, o que faz com que seja

confundida com o Herpes simplex (JOHNS et al., 1987; LINDQUIST;

SHER; DOUGHMAN, 1988). Infiltrados perineurais, dispostos

radialmente, associados aos sintomas acima parecem ser

patognomônicos da doença (MOORE et al., 1986). Um infiltrado central

Introdução

24

em anel é comumente encontrado em estágios avançados. A limbite é

comum, tanto nos estágios iniciais como nos avançados. A doença pode

ser acompanhada de hipópio e de uveíte, tendo sido relatados casos de

glaucoma e de catarata associados a ceratites prolongadas (LOTTI;

DART, 1992).

Uma vez estabelecido o diagnóstico, a próxima dificuldade passa a

ser a do tratamento. Testes “in vitro” mostram que algumas espécies de

trofozoítos são sensíveis a alguns agentes antimicrobianos; entretanto,

o parasita pode encistar-se no estroma da córnea, o que o torna

resistente aos mesmos (NAGINGTON; RICHARDS, 1976). O tratamento

é usualmente clínico. Utiliza-se topicamente colírios de isotianato de

propamidina, usada pela primeira vez para tratamento de ceratite por

Acanthamoeba por Wright, Wanhurst e Jones, em 1985, poli-

hexametileno de biguanida (LARKIN; KILVINGTON; DART, 1992) e

neomicina, que é ineficaz contra cistos, mas que tem eficácia variável

frente à trofozoítos de certas cepas de Acanthamoeba, (HAY et al.,

1994). Sistemicamente pode-se usar o cetoconazol ou itraconazol

(LINDQUIST; SHER; DOUGHMAN DJ, 1988). O uso de antiinflamatórios

e esteróides é controverso e tem sido reservado para controle da dor e

em casos de uveítes (FREITAS, 2000).

Inicialmente, a ceratite por Acanthamoeba foi associada a

traumas corneanos. A partir de 1981 começou a ocorrer um aumento

gradual nos casos de ceratite por Acanthamoeba, sendo o pico mais

Introdução

25

importante no início de 1985 (STEHR-GREEN; BAILEY; VISVESVARA,

1989). Em 1986 foram notificados 24 casos de pacientes com úlcera de

córnea por Acanthamoeba ao “Center of Diseases Control”, órgão da

Secretaria da Saúde dos Estados Unidos (MMWR, 1986). Esse

identificou como fatores de risco: o uso inadequado de lentes de contato

e o não cumprimento das normas de manutenção e assepsia das

mesmas (MMWR, 1987).

Confirmando essa conclusão, Wilhelmus correlacionou o aumento

gradual de casos de ceratite por Acanthamoeba com o aumento do

número de usuários de lentes de contato (WILHELMUS, 1991).

Sabe-se que cuidados inadequados na manipulação e na

manutenção das lentes de contato aumentam muito a chance de

infecção corneana. Usualmente, lentes de contato contaminadas

representam o primeiro passo da patogênese da ceratite por

Acanthamoeba (ONDRISKA et al., 2004). Em 1995 Radford et al. já

havia constatado que a ceratite por Acanthamoeba ocorre com uma

frequência 20 vezes maior entre os usuários de lentes de contato,

quando comparados aos não usuários. Na Grã-Bretanha, por exemplo,

a ocorrência de ceratite por Acanthamoeba era de 1,2 por milhão de

habitantes adultos não usuários de lentes de contato, e de cerca de 20

por milhão entre os usuários de lentes de contato (RADFORD et al.,

1995).

Introdução

26

O advento das descartáveis popularizou o uso de lentes de

contato, permitindo que pessoas com baixo nível sócio-econômico e

cultural tivessem acesso a esse tipo de correção óptica. A política de

distribuição e venda dessas lentes afastou o oftalmologista do processo

de indicação, adaptação e seguimento do usuário desse tipo de correção

óptica. No Brasil, muitos usuários recorrem às ópticas para repor suas

lentes de contato, ficando, às vezes, anos sem visitar o oftalmologista

que fez a primeira adaptação; outros têm a indicação e a primeira

adaptação feitas em ópticas sem avaliação oftalmológica (SOUSA; DIAS;

MARCOMINI, 2008). Todos esses fatores contribuíram para disseminar

a prática de maus hábitos na utilização, na manutenção, na

conservação e na assepsia das lentes. Stehr-Green, Bailey e Visvesvara,

no final da década de oitenta, já constatavam aumento acentuado no

número de usuários de lentes de contato, assim como na negligência

com a rotina de manutenção das mesmas. Nessa época eles estimavam

que 20 milhões de americanos fossem usuários de lentes de contato

(STEHR-GREEN; BAILEY; VISVESVARA, 1989).

Por vários motivos, inclusive econômicos e culturais, o usuário

tende a não descartar as lentes no tempo certo e a não usar os produtos

de assepsia adequados, chegando, às vezes, a usar água de torneira

para lavar as lentes. Tudo isso aumenta a possibilidade de infecção por

Acanthamoeba, uma vez que esse protozoário tem sido encontrado no ar

(RIVERA et al., 1991), no solo, em águas límpidas, na água tratada

Introdução

27

distribuída em residências de áreas urbanizadas (JADIN; WILLAERT;

COMPERE, 1972), em garrafas de água mineral no México (RIVERA et

al., 1981) e no Brasil (SALAZAR; MOURA; RAMOS, 1982), lagos

(WELLINGS et al., 1977), água do mar (SAWYER; VISVESVARA;

HARKE, 1977), piscinas (RIVERA et al., 1983; FORONDA et al., 1985;

MOURA, 1980), esgotos (PROCA; LUPASCU; STERYU, 1973), estojos de

lentes de contato (GRAY et al., 1995; LARKIN; KILVINGTON; EASTY,

1990), instrumental odontológico (MICHEL; BORNEFF, 1989), estações

de lavagem de olhos (TYNDALL; LYLE; IRONSIDE, 1987), culturas de

células de mamíferos (JAHNES; FULLMER; LI, 1957), narinas (DE

JONCKHEERE; MICHEL, 1988) e gargantas de humanos hígidos

(WANG; FELDMAN, 1967).

Uma lente de contato mal cuidada parece ser um importante fator

predisponente para a instalação de um processo infeccioso por

Acanthamoeba. A lógica dessa suspeita é a seguinte: a própria lente de

contato já coloca a córnea em situação desvantajosa, devido à sua

interferência com trocas gasosas e metabólicas da superfície ocular. Na

verdade, toda lente de contato provoca, em maior ou menor grau,

hipóxia nos tecidos da córnea. Isso tende a prejudicar a aderência entre

as células epiteliais, que normalmente atuam como barreira mecânica

às infecções. Por outro lado, os descuidos com a limpeza facilitam a

aderência dos germes à lente e, por conseguinte, o acesso destes à

superfície corneana debilitada.

Introdução

28

Diante de um usuário de lentes de contato com ceratite por

Acanthamoeba, podemos nos fazer as seguintes perguntas: a

Acanthamoeba chegou ao olho veiculada por uma lente mal cuidada? Já

havia no olho cistos de Acanthamoeba, que, devido ao uso de tal lente,

transformaram-se em trofozoítos e se reproduziram?

Desde as últimas décadas do século XX tem-se observado um

crescente interesse na população pela prática regular de exercícios

físicos, com a finalidade de preservar a saúde e manter a estética

corporal. O uso de lentes de contato também faz parte dessa tentativa

de aperfeiçoamento pessoal. Como consequência, é esperado que se

encontre grande número de usuários de lentes de contato entre os

esportistas.

Sabendo-se que as piscinas são propícias para o desenvolvimento

da Acanthamoeba, teoricamente, pessoas que as frequentam

regularmente estariam expostas a um risco maior de contaminação pelo

protozoário. Sendo isso verdadeiro, elas teriam maior chance de

infecção corneana caso viessem a usar lentes de contato. Então, os

critérios de indicação de lentes de contato e o trabalho de

conscientização para a aderência aos cuidados com as mesmas teriam

que ser muito mais rigorosos nesse grupo.

Cientes de que cistos de Acanthamoeba são resistentes aos

produtos químicos de tratamento de piscinas (DE JONCKHEERE,

1979), nos propusemos a realizar este estudo.

2. REVISÃO DE LITERATURA

Revisão de Literatura

30

Em 1755, Rosendorf observou pela primeira vez uma ameba ao

microscópio (ROSENDORF, 1755 – apud WILLAERT, 1976). Em 1841,

DuJardin descreveu a Amoeba limax, um protozoário encontrado na

água, que movia-se como uma lesma (DuJARDIN, 1841 - apud

LOCKEY, 1978). Em 1899, Schardinger isolou e descreveu a Amoeba

gruberi a partir de fezes humanas e iniciou os debates sobre a

patogenicidade das amebas (SCHARDINGER, 1899 - apud WILLAERT,

1976).

No início do Século XX, Schauddinn estabeleceu o conceito de que

a única espécie de ameba capaz de causar doença em humanos era a

Entamoeba histolytica (SCHAUDDINN, 1903 - apud CLAKINS, 1926).

Em conformidade com essas idéias, Alexeieff criou os gêneros

Hartmannella e Naegleria, separando-os das amebas parasitas dos

vertebrados (ALEXEIEFF, 1912). Craig notou que algumas amebas de

vida livre podiam parasitar o homem, pelo menos, por certo tempo,

alertando que as mesmas podiam atuar como parasitas eventuais.

Entretanto, não havia evidências de que fossem patogênicas (CRAIG,

1917).

Em 1912, Chatton e Lalung-Bonaire descreveram amebas que se

reproduziam por pró-mitose, mecanismo típico de amebas de vida livre,

isoladas a partir de fezes de indivíduos atacados por surtos de diarréia


31

(CHATTON; LALUNG-BONAIRE, 1912). Whitmore, em 1911, Hogue, em

1914 e Pinto, em 1922, descreveram amebas promitóticas isoladas a

partir de fezes humanas diarréicas e mesmo de abscessos hepáticos,

considerando-as agentes desses processos (WHITMORE, 1911; HOGUE,

1914; PINTO, 1922). Entretanto, prevaleceram as idéias de Schauddinn,

segundo as quais, apenas amebas de parasitismo obrigatório causavam

doenças em humanos, sendo que essas se disseminavam pelo

organismo a partir do intestino. Não se cogitava a possibilidade de que

outros órgãos ou tecidos pudessem ser sítios primários de infecção por

amebas (SCHAUDDINN, 1903 - apud CLAKINS, 1926).

Até 1926, a classificação das amebas era baseada apenas em

características morfológicas. Schaeffer foi o primeiro a apresentar uma

classificação detalhada das amebas, baseada, não somente na

morfologia, mas também em características como: locomoção, formação

de pseudópodes e tipo de divisão celular (SCHAEFFER, 1926).

Winogradowa (1927), Cutler e Crump (1927) e Servertzone (1928)

cultivaram o protozoário em placas de Agar com bactérias e

descreveram a destruição sofrida pelas últimas (WINOGRADOWA, 1927;

CUTLER; CRUMP, 1927; SERVERTZONE, 1928 - apud CLAKINS, 1926).

Castellani publicou em 1930 uma série de quatro trabalhos em

que descrevia uma ameba, isolada em culturas de Cryptococcus

pararoseus, que crescia em meios sólidos contendo leite e peptonas,

tanto a 26ºC como a 35ºC. Conseguiu, ainda, obter crescimento desse


32

protozoário em culturas de bactérias Gram-negativas (CASTELLANI,

1930a; CASTELLANI, 1930b; CASTELLANI 1930c; CASTELLANI 1930d).

Nesse mesmo ano, Douglas classificou essa ameba como sendo uma

nova espécie, à qual deu o nome de Hartmannella castellani (DOUGLAS,

1930 - apud HEWITT, 1937). Descobriu-se que a mesma fagocitava

bactérias presentes no meio de cultura. Seu crescimento era mais difícil

em meios contendo bactérias Gram-positivas. Não era patogênica

quando inoculada por via oral ou parenteral em ratos, camundongos,

cobaias e coelhos. Em 1936, Shinn e Hadley isolaram ameba

semelhante a partir de culturas do bacilo de Friedlander (SHINN;

HADLEY, 1936).

Em 1937, Hewitt isolou H. castellani a partir de culturas de

bactérias e salientou o fato de esses protozoários nunca terem sido

encontrados em estado realmente livre, mas sempre em consórcio com

fungos ou bactérias (HEWITT, 1937). Em 1941, Negroni e Fischer

isolaram Vahlkampfia debilis, associada a uma levedura de maçã em

decomposição. Notaram que o crescimento da ameba acontecia em

concomitância com a lise celular, semelhante ao que ocorre quando o

vírus bacteriófago parasita uma bactéria (NEGRONI; FISCHER, 1941).

Singh (1952) propôs uma classificação baseada na morfologia do

núcleo durante a fase de repouso e no comportamento desse durante a

fase de reprodução celular. Criou duas famílias de amebas de vida livre:


33

Schizopyrenidae e Hartmannellidae, separando-a da família

Endamoebidae, na qual reuniu as amebas parasitas (SINGH, 1952).

Em 1953, Chatton propôs outra classificação que se baseava em

outras características que não o núcleo e chamou a atenção para o fato

de que algumas amebas apresentavam flagelos em algum estágio de

vida (CHATTON, 1953). Nesse mesmo ano, Bovee relatou a necessidade

de se criar uma chave de classificação das amebas que levasse em

conta métodos de identificação mais precisos, observando

características morfológicas, fisiológicas e do ciclo de vida (BOVEE,

1953).

Jahnes, Fullmer e Li (1957) observaram que as amebas eram

capazes de destruir e ingerir células de mamíferos. Tal observação se

deu quando uma cepa de Acanthamoeba sp contaminou culturas de

células de rim de macaco (JAHNES; FULLMER; LI, 1957).

Durante o desenvolvimento da vacina contra a poliomielite eram

feitos testes de segurança injetando-se vírus em animais de

experimentação (ratos e macacos), via hematogênica, intranasal e

intracerebral. Em 1958, houve um incidente em que todos os animais

de um dos grupos de estudo morreram. Exames histopatológicos e de

cultura de tecidos cerebrais desses animais revelaram como causa

mortis infecção por amebas de vida livre. Tais amebas foram

classificadas como pertencentes ao gênero Acanthamoeba

(CULBERTSON; SMITH; MINNER, 1958). A partir de então ficou provado


34

que amoebas ditas de vida livre podiam comportar-se como parasitas

eventuais, causando infecção e mesmo a morte do hospedeiro.

Culbertson sugeriu que algumas amebas de vida livre eram

capazes de alcançar o cérebro através da mucosa olfatória e produzir

meningoencefalite fatal, após simples instilação nasal (CULBERTSON,

1964 e 1971).

Em 1965 publicou-se na Austrália um relato dos quatro primeiros

casos de meningoencefalite aguda fatal em humanos, tendo como

agente etiológico amebas de vida livre. O primeiro desses casos havia

ocorrido em 1961 e permanecera, até então, sem diagnóstico etiológico

(FOWLER; CARTER, 1965). Em 1966, BUTT denomina a doença de

Meningoencefalite Amebiana Primária e aponta como agente causal

amebas de vida livre do gênero Naegléria (BUTT, 1966).

Jones (1973) apresentou em Dallas o primeiro caso de ceratite por

Acanthamoeba (JONES, 1973). Em 1974, Nagington publicou o primeiro

caso de infecção ocular por ameba do Reino Unido (NAGINGTON et al.,

1974).

Com o intuito de entender a fisiopatologia da infecção ocular por

Acanthamoeba, Schlaegel e Culbertson desenvolveram o primeiro

modelo experimental usando coelhos. Nesse estudo injetaram cistos e

trofozoítos de Acanthamoeba culbertsoni no estroma corneano, como

tentativa de produzir ceratite; na câmara anterior como tentativa de


35

produzir uveíte anterior e na cavidade vítrea, como tentativa de produzir

coriorretinite e/ou neurite óptica (SCHLAEGEL; CULBERTSON, 1972).

Entre 1981 e 1982, Font et al. desenvolveram um modelo

experimental para produzir ceratite em coelhos usando Acanthamoeba

polyphaga. Nesse modelo, durante quatro dias consecutivos eram

realizadas injeções subconjuntivais de corticoesteróides. No quinto dia

realizava-se injeção intraestromal do protozoário (FONT et al., 1981 e

1982).

Com o aumento do número de casos de ceratite por

Acanthamoeba relacionado ao aumento do número de usuários de

lentes de contato observado nos anos oitenta, Moore et al. propõem que

o micro trauma ao epitélio da córnea causado pela lente de contato,

somado à exposição do olho a soluções contaminadas, seriam os dois

principais fatores para instalação da ceratite por Acanthamoeba

naqueles pacientes (MOORE et al., 1985).

Atribui-se a Nosé et al. a descrição dos quatro primeiros casos

brasileiros de ceratite por Acanthamoeba (NOSÉ et al., 1988). Na

sequência, Bocaccio et al. relataram casos no Rio Grande do Sul

(BOCACCIO et al., 1997).

Em 1989, STHER-GREEN et al. publicaram um estudo

epidemiológico em que apontam o uso de lentes de contato como o

principal fator de risco para a ceratite por Acanthamoeba. Nesse


36

trabalho de 189 casos de ceratite por Acanthamoeba, 85% eram

usuários de lentes de contato (STHER-GREEN et al., 1989).

Em 1991, Wilhelmus correlacionou o aumento de casos de

ceratite por Acanthamoeba com o aumento do número de usuários de

lentes de contato (WILHELMUS, 1991). A partir de então foram

publicados vários trabalhos descrevendo modelos experimentais de

ceratite por Acanthamoeba em coelhos (LIN et al., 1989) e ratos

(LARKIN; EASTY, 1990; LARKIN; EASTY, 1991).

Em 1991, Stopak et al. demonstraram que o crescimento de

Acanthamoeba em culturas de células epiteliais e ceratócitos de córneas

humanas depende de componentes dessas células (STOPAK et al.,

1991). Em 1992, Panjwani et al., demonstraram que a Acanthamoeba

adere-se a glicopeptídeos de membranas celulares de coelhos

(PANJWANI et al., 1992).

Em 1992, He et al. desenvolveram um modelo experimental de

ceratite por Acanthamoeba em porcos, no qual usavam como veículo

lentes de contato contaminadas com Acanthamoeba (HE et al., 1992).

Em 1993, usando cobaias, van Klink et al. desenvolveram

modelos de ceratite em que utilizaram lentes de contato, traumas e

células de Langerhans para contaminar a córnea (van KLINK et al.,

1993).

Em 1993, Garner propôs, baseado em estudos histopatológicos de

trinta casos de ceratite por Acanthamoeba, uma sequência de eventos


37

para explicar a fisiopatologia da ceratite: 1) quebra da superfície

epitelial corneana (micro trauma, hipóxia) abrindo porta para

penetração dos protozoários no estroma; 2) destruição de ceratócitos

pelos trofozoítos invasores; 3) resposta inflamatória do hospedeiro,

mediada principalmente por neutrófilos; 4) necrose estromal por

enzimas proteolíticas liberadas no sítio da infecção pelos neutrófilos

(GARNER, 1993).

Em 2003, Hurt mostrou que diante de uma abrasão corneana,

um micro trauma ou uma condição de hipóxia, por exemplo, uso de

lentes de contato, ocorre um aumento na concentração de manoses

(hexose) no local da lesão corneana. Esses açucares ligam-se a

receptores presentes na membrana celular da Acanthamoeba e essa

passa a produzir uma proteína batizada de MIP-133, que apresenta

atividade citolítica para as células do epitélio da córnea e atividade

colagenolítica na matriz do estroma corneano (HURT, 2003).

Em sua tese apresentada à The University of Texas Southwestern

Medical Center of Dallas, Hurt demonstrou que a capacidade de

produzir ceratite está relacionada à produção de MIP-133. Nesse

estudo, o autor imunizou animais com MIP-133 por via oral e obteve

anticorpos das mucosas dos mesmos. Esses anticorpos (anti-MIP-133)

neutralizaram as atividades citolíticas e colagenolíticas da MIP-133 “in

vitro”, assim como inibiram a migração de trofozoítos através da matriz

extracelular. Ainda nesse estudo, os animais previamente imunizados


38

apresentaram uma importante redução na gravidade e na duração de

ceratite experimental por Acanthamoeba. Além disso, animais com

ceratite por Acanthamoeba já estabelecida, ao receber imunização oral

com MIP-133, apresentaram imediatamente melhora do quadro ocular

(HURT, 2003).

3. OBJETIVOS

Objetivos

40

O presente estudo objetiva determinar se a conjuntiva de

nadadores, com olhos saudáveis, pode albergar Acanthamoeba, e em

caso positivo, se a frequência desses achados se correlaciona com a

presença desse protozoário em amostras de água da piscina onde se

pratica a natação.

4. MATERIAL E MÉTODOS

Material e Métodos

42

O presente estudo foi desenvolvido em duas academias de esporte

de uma mesma companhia da cidade de Araraquara. Cada academia

possui sala de esportes para não-nadadores e uma piscina. Cada

academia está localizada em um bairro, aos quais daremos os nomes de

Bairro “A” e Bairro “B”. Daqui por diante identificaremos cada uma das

academias e suas respectivas piscinas também pelas letras “A” e “B”,

segundo o Bairro em que estão situadas. A piscina “A” é abastecida por

água de cisterna (poço caipira) e tem aproximadamente 33 anos de

construção. A piscina “B” é abastecida por água de poço artesiano, e

tem aproximadamente cinco anos de construção. Ambas são cobertas e

aquecidas.

Este estudo desdobrou-se em duas fases. Na primeira fase (maio

de 2007), a rotina de tratamento da água de ambas as piscinas era a

seguinte: diariamente eram realizados filtração, ajuste de pH e cloração.

Na quarta-feira à noite, após o término do período de uso das piscinas,

eram adicionados à água produtos para decantar partículas em

suspensão. Na quinta-feira pela manhã, antes do início das atividades

de natação, era feita a aspiração dos sedimentos que haviam se

depositado no fundo das piscinas. Esse esquema de manutenção

obedecia a um padrão fixo que se repetia semana pós semana.

Material e Métodos

43

Na segunda fase (maio de 2008), a rotina de manutenção de

ambas as piscinas mudou, passando a obedecer ao seguinte esquema:

a) filtração, ajuste de pH e cloração continuaram a ser realizados

diariamente nas duas piscinas; b) a decantação de sedimentos passou a

ser realizada em ambas as piscinas nas terças, quintas e nos sábados à

noite, e a aspiração nas quartas, sextas e nos domingos pela manhã.

Entre a primeira e a segunda fase deste estudo, a piscina “A”

passou por um processo de limpeza diferenciado, que não se fazia havia

mais de 20 anos: foi esvaziada, poliram-se os azulejos e os rejuntes do

fundo com máquina de polir granito. Os azulejos e rejuntes das paredes

laterais foram escovados à mão. Nessas tarefas usou-se ácido muriático

como produto de limpeza. A piscina “B” não passou por nenhum

processo especial de limpeza.

Inicialmente, na academia “A” foram colhidas 30 amostras de

esfregaço conjuntival dos frequentadores da piscina e 13 amostras

idênticas de pessoas que frequentavam a sala de esportes, mas não a

piscina. Na academia “B”, foram colhidas 11 amostras do esfregaço

conjuntival dos frequentadores da piscina, e não foram colhidas

amostras de material conjuntival de não-nadadores. Nessa primeira

fase do estudo, também foram colhidas 14 amostras de água de cada

uma das piscinas.

Informados dos resultados dos exames das amostras de material

conjuntival e das amostras de água das piscinas, os proprietários das

Material e Métodos

44

academias decidiram realizar a limpeza especial da piscina “A”, descrita

acima, o que ocorreu em novembro de 2007.

Seis meses após a limpeza da piscina “A”, novamente foram

colhidas 14 amostras de água de cada piscina. Dessa vez foram

colhidas 34 amostras de esfregaço conjuntival dos nadadores da piscina

“A” e 20 amostras idênticas dos nadadores da piscina “B”.

Todos os 54 nadadores participantes da segunda fase deste

estudo (34 da piscina “A” e 20 da “B”) frequentavam as respectivas

piscinas desde o início.

Na piscina “A” foram coletadas amostras de raspado conjuntival

de 48 nadadores. Desses, 16 participaram das duas fases, 14 apenas

na primeira e 18 apenas da segunda fase do experimento. Na piscina

“B” foram coletadas amostras de 31 nadadores. Desses, 11 participaram

na primeira fase e 20 na segunda. Nessa piscina, os participantes da

primeira fase não participaram da segunda e vice-versa.

Tanto na primeira fase, quanto na segunda, colheu-se uma única

amostra de material conjuntival de cada participante. Como

consequência, os 16 nadadores da piscina “A” que participaram das

duas fases deste estudo submeteram-se a duas coletas de material

conjuntival, uma em cada fase.

Todos os participantes eram pessoas hígidas frequentadores

regulares da academia. Todos os nadadores usavam óculos de natação.

Material e Métodos

45

Os frequentadores de uma piscina seguramente não frequentavam a

outra.

Tanto na primeira como na segunda fase deste estudo o processo de

cloração da água das piscinas não envolveu o uso de ozônio, salinização,

radiação ultravioleta ou artefatos de liberação contínua do cloro (Anexo 1).

Coleta do material da conjuntiva

Todas as pessoas submetidas a coletas de material conjuntival eram

adultas. Foram informadas sobre a finalidade do estudo e assinaram

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 1). Nenhum

participante era usuário de lentes de contato, encontrava-se em uso de

antibióticos sistêmicos ou medicações oculares de qualquer natureza.

As coletas foram feitas, por uma mesma pessoa, sempre após o

período da prática esportiva, na própria academia de esportes. A região

escolhida foi a conjuntiva tarsal superior do olho esquerdo.

Para a raspagem da conjuntiva utilizou-se uma mini-escova de fios

de nylon, estéril, montada em aplicador que evita a contaminação

inadvertida da mesma pelas mãos do operador. Tanto a escova como o

sistema de proteção de esterilidade foram criados pelo Setor de Doenças

Oculares Externas, do Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia

e Cirurgia de Cabeça e Pescoço da FMRP-USP, especialmente para o

presente trabalho. As Figuras de 1 a 7 mostram as características dessa

escova.

Material e Métodos

46

Figura 1: escova e aplicador em envelope estéril

Figura 2: escova e aplicador

Material e Métodos

47

Figura 3: escova e aplicador sem a capa de proteção

Figura 4: escova e aplicador desmontado

Material e Métodos

48

Figura 5: escova e aplicador - montagem

Figura 6: demonstração de uso da escova - I

Material e Métodos

49

Figura 7: demonstração de uso da escova - II

No ato da coleta, a superfície ocular era anestesiada com duas

gotas de colírio de cloridrato de proximetacaína a 0,5%. Em seguida, a

pálpebra superior esquerda era evertida e a escova friccionada, com

movimentos de vai-e-vem, contra a conjuntiva tarsal superior. A escova

era então ejetada do aplicador dentro de um tubo de vidro estéril,

contendo 3ml de caldo de Thioglicolato. Imediatamente aplicava-se a

tampa a esse tubo.

As Figuras de 8 a 12 ilustram esses procedimentos.

Material e Métodos

50

Figura 8: coleta de amostra de material conjuntival

Figura 9: tubo com thioglicolato - I

Material e Métodos

51

Figura 10: tubo com thioglicolato - II

Figura 11: inserção da escova no tubo após coleta do material conjuntival

Material e Métodos

52

Figura 12: tubo contendo thioglicolato e a escova carregada de material conjuntival

Coleta da água das piscinas

Em cada uma das piscinas, num período de sete dias

consecutivos - de segunda-feira a domingo - foram colhidas 14

amostras de água. Em cada dia eram colhidas duas amostras: uma pela

manhã, antes do uso da piscina pelos banhistas, e outra à noite, antes

do tratamento da água com produtos químicos. Cada amostra era

coletada em uma seringa estéril exclusiva de 10ml. Cerca de 3ml do

conteúdo da seringa eram injetados dentro de um tubo estéril com

tampa rosqueada contendo igual volume de Thioglicolato líquido. Esses

Material e Métodos

53

tubos eram enviados ao laboratório para a pesquisa de cistos e

trofozoítos de Acanthamoeba.

Os procedimentos foram idênticos em ambas as fases deste

estudo.

A análise laboratorial

O tubo de Thioglicolato, com a escova ou a água da piscina, era

encubado a 28ºC por 72 horas. Então, o material era semeado em

placas de Petri contendo Agar não nutriente com cobertura de

Escherischia coli. Essas placas eram colocadas em sacos plásticos para

evitar a dessecação e mantidas a 28°C. A leitura das placas era feita

diariamente ao microscópio óptico com aumentos de 100 e 400 vezes,

por um período de até 14 dias. Se após esse período a placa não

revelasse trofozoítos ou cistos de Acanthamoeba o resultado era

considerado negativo.

Identificação das Acanthamoebae

As Acanthamoebae isoladas foram classificadas por gênero, segundo

os critérios de Page (PAGE, 1976): os trofozoítos apresentavam movimentos

lentos e citoplasma com zona periférica hialina, e vacúolos pulsáteis; os

cistos apresentavam parede com membrana dupla e com aspecto poligonal.

Como os espécimes foram observados sempre em placas de Petri, em meio

Agar, não foi possível a visualização dos acantopódios.

Material e Métodos

54

Figura 13: trofozoítos

Figura 14: trofozoítos e cistos recém formados

Material e Métodos

55

Figura 15: cistos maduros

Análise estatística dos dados

Como o estudo envolveu comparações de médias e proporções, os

testes utilizados para amostras independentes foram: ANOVA, Exato de

Fisher e Qui-quadrado. Para amostras pareadas utilizou-se o Teste de

McNemar. Consideramos os resultados como estatisticamente

significantes quando p<0,05.

5. RESULTADOS

Resultados

57

Tabela 1. Dados demográficos dos nadadores.

Nadadores Fase 1 Fase 2 Ambas Fases p

Frequência 25 38 16

Idade (anos)* 45,5 ± 17,5 46,8 ±15,9 45,1 ± 13,6 0,9196

Faixa etária (anos) 19 - 75 18 - 75 20 - 68

Masculino 9 14 7 Sexo **

Feminino 16 24 9 0,8656

*ANOVA. **Qui-quadrado

Tabela 2: Frequência de resultados de culturas de Acanthamoeba de conjuntivas de esportistas hígidos da academia “A” (maio de 2007).

Esportista Acanthamoeba Total + -

Nadador 23 7 30 Não nadador 0 13 13

Total 23 20 43 Teste Exato de Fisher p<0,0001

Tabela 3: Frequência dos resultados de culturas de Acanthamoeba de conjuntivas de nadadores das piscinas “A” e “B” (maio de 2007).

Piscina Acanthamoeba Total + -

“A” 11 3 14 “B” 0 11 11

Total 11 14 25 Teste Exato de Fisher p=0,0001

Resultados

58

Tabela 4: Resultados de culturas de Acanthamoeba da água de duas piscinas cobertas, em função do dia e do período da colheita (maio de 2007).

M = manhã, N = noite

Tabela 5: Frequência dos resultados de culturas de Acanthamoeba da água das piscinas “A” e “B” (maio de 2007).

Piscina Acanthamoeba Total

+ - "A" 12 2 14 "B" 5 9 14






"A" 2 12 14 "B" 2 12 14


Dia da Semana SEG TER QUA QUI SEX SAB DOM Piscina

M N M N M N M N M N M N M N “A” + + + + + + - - + + + + + + “B” - + + + + + - - - - - - - -


M N M N M N M N M N M N M N “A” + - - - - - - + - - - - - - “B” - - + - - - - - - + - - - -

Resultados

59

Tabela 8: Cotejo de dois resultados consecutivos de culturas de Acanthamoeba da água da piscina “A”.

Teste de McNemar p=0,0094

Tabela 9: Cotejo de dois resultados consecutivos de culturas de Acanthamoeba da água da piscina “B”.




“A” 1 17 18 “B” 0 20 20


Acanthamoeba Maio 2008 Total

+ - + 1 11 12 Maio 2007 - 1 1 2

Total 2 12 14


+ - + 1 4 5 Maio 2007 - 1 8 9

Total 2 12 14

Resultados

60

Tabela 11: Frequência dos resultados de culturas de Acanthamoeba de conjuntivas de dois grupos independentes de nadadores da piscina “A”, segundo a data do exame.

Data Acanthamoeba Total + -

Maio 2007 11 3 14 Maio 2008 1 17 18


Tabela 12: Cotejo de dois resultados consecutivos de culturas de Acanthamoeba de um mesmo grupo de nadadores da piscina “A”.



+ - + 3 9 12 Maio 2007 - 0 4 4

Total 3 13 16

6. DISCUSSÃO

Discussão

62

A Acanthamoeba tem sido encontrada em vias aéreas de pessoas

aparentemente saudáveis (MA et al., 1990; SELL; RUPP; ORRISON Jr.,

1997; RODRIGUEZ et al. 1998; ARMSTRONG, 2000; SEIJO-MARTINEZ

et al., 2000; LEVINE et al., 2001; RIVERA; PADHYA, 2002). Entretanto,

Anisah et al. (2005) pesquisaram Acanthamoeba na conjuntiva de 286

crianças hígidas na Malásia e não encontraram nenhum caso positivo

(ANISAH et al., 2005). Classicamente é aceito que ambientes líquidos

que contenham bactérias, como piscinas, são ideais para o

desenvolvimento desse protozoário (NEVES, 2000). Assim, imaginamos

que nadadores, teoricamente, teriam alguma chance de apresentar

Acanthamoeba em suas conjuntivas. Frente a esses fatos, nos

propusemos a verificar se a conjuntiva de nadadores hígidos poderia

albergar Acanthamoeba.

A Tabela 1 apresenta os dados demográficos dos nadadores. Nela

é importante a observação de que a média das idades dos três grupos,

identificados na tabela, não difere estatisticamente pelo teste de análise

de variância. As proporções dos sexos, nos grupos em questão, também

não apresentaram diferenças estatisticamente significativas pelo teste

do Qui-quadrado. Embora não haja na literatura médica informações

sobre a influência dessas variáveis na contaminação do saco

Discussão

63

conjuntival, isso diminui a chance de que as mesmas se configurem

como variáveis de confusão.

Primeira fase do trabalho

O trabalho começou na piscina “A” com a observação de que

76,7% dos seus usuários apresentavam positividade para

Acanthamoeba no material colhido da conjuntiva tarsal superior. A

primeira pergunta que se impôs foi, se o problema se concentrava na

piscina ou no ambiente físico da academia. Colheu-se, então, material

de esportistas que a frequentavam, mas que seguramente não se

banhavam nessa ou noutra piscina. A Tabela 2 compara os resultados

de ambas as colheitas.

Entre os 30 nadadores encontraram-se 23 casos positivos. Entre

os 13 não nadadores, não houve nenhum caso positivo. A diferença

entre os dois grupos revelou-se altamente significante pelo teste Exato

de Fisher (p<0,0001). Concluiu-se, então, que o achado se devia a

utilização da piscina. A primeira pergunta do trabalho estava

respondida: a conjuntiva de nadadores hígidos podia albergar

Acanthamoeba, mesmo que o fenômeno fosse transitório, resultante de

contaminação pela água.

Como a empresa proprietária da academia “A” possuía outra

unidade, que chamamos de “B”, também dotada de piscina coberta e

aquecida, decidimos estudar os esfregaços conjuntivais de uma amostra

Discussão

64

de nadadores da piscina, denominada “B”. Nela, dos 11 nadadores

estudados, nenhum apresentou positividade para a Acanthamoeba.

A Tabela 3 compara os resultados dessa piscina com os da “A”.

Nela, observa-se que a proporção dos casos positivos da piscina “A” foi

significativamente maior que da “B” pelo Teste Exato de Fisher

(p<0,0001). Isso sugeria que algum fator intrínseco das piscinas deveria

estar respondendo por esse resultado.

De Jonckheere (De JONCKHEERE, 1979) já havia mostrado que

as amoebas mais prevalentes na superfície da água de piscinas são as

Acanthamoebae pelo fato dos seus cistos serem resistentes ao cloro.

Outros tipos de amoeba de vida livre, cujos cistos são mais sensíveis,

devem ser procurados, não na superfície da água, mas nos sedimentos

das paredes e do fundo das piscinas onde eles ficam protegidos da ação

do cloro. Esse autor encontrou Acanthamoeba em amostras de apenas

1,0ml de água da superfície de piscinas cloradas. Baseados nessa

experiência foi que idealizamos nosso método de coleta da água das

piscinas. Como todos os dias, à noite, era feito filtração, cloração e

ajuste do pH das piscinas, concluímos que para termos informação

mais completa sobre a eventual contaminação das mesmas pela

Acanthamoeba, seria interessante a feitura de duas coletas diárias de

água. A primeira, pela manhã, quando elas estariam teoricamente mais

limpas e a segunda à noite, antes do tratamento, quando elas estariam

teoricamente mais sujas.

Discussão

65

A Tabela 4 mostra os resultados das culturas das amostras de

água das piscinas “A” e “B” e indica o momento da coleta de cada

amostra (dia da semana e período). Nela observa-se que a porcentagem

de contaminação da piscina “A” era de 85,7% (12/14) e que a da piscina

“B” era de 35,7% (5/14). A Tabela 5 compara a frequência dos

resultados de culturas de Acanthamoeba da água das piscinas “A” e “B”.

Nela observa-se que a proporção de casos positivos de “A” era

significativamente maior que a de “B”, pelo Teste Exato de Fisher

(p=0,0183). O fato de a piscina “A” estar muito mais contaminada que a

“B” sugere uma possível relação causa-efeito entre o grau de

contaminação da piscina e dos seus usuários. O fato de a piscina “B”

também estar contaminada, sem que nenhum dos seus nadadores

apresentasse o protozoário na conjuntiva, sugere que tal fenômeno só

se manifeste acima de um nível crítico de contaminação da água. Afinal,

a contaminação de piscinas por amebas de vida livre não parece ser fato

infrequente: De Jonckheere, estudando 16 piscinas da Bélgica, das

quais 15 cobertas e uma descoberta, encontrou 10 delas com esses

protozoários, sendo que 43,6% deles eram Acanthamoebae (De

JONCKHEERE, 1979); Moura, estudando 10 piscinas na Cidade do Rio

de Janeiro, encontrou 15 gêneros de amoebas de vida livre, sendo que a

Acanthamoeba estava presente em todas as piscinas. Nesse estudo, o

autor repetiu a coleta de água após seis meses e dessa vez encontrou

Acanthamoeba em oito piscinas, nas outras duas encontrou outros

Discussão

66

gêneros de amoebas de vida livre (MOURA, 1980); Rivera et al.,

estudando 11 piscinas selecionadas ao acaso na cidade do México,

encontraram oito delas contaminadas com 29 cepas de amoebas

pertencentes a oito generos; cerca de 32% dos casos eram de

Acanthamoebae (RIVERA et al., 1993).

O tratamento da água era idêntico nas duas piscinas. As únicas

diferenças entre elas eram: o tempo de construção e a fonte de

suprimento da água. A piscina “A” tinha 33 anos de construção e a “B”

aproximadamente cinco anos. A água da primeira era obtida de poço

raso, cisterna, e da segunda de poço artesiano.

Outra conclusão importante de De Jonckheere é que a maior

concentração do protozoário se encontrava no chão ao redor da piscina

e, principalmente sob o chuveiro onde os usuários se banhavam antes

de entrar na piscina. Conjeturou, então, que as amoebas de vida livre

seriam introduzidas continuamente na água das piscinas pelos próprios

usuários (De JONCKHEERE, 1979). Sendo correta essa conjectura,

podemos supor que quanto mais velha a piscina maior a chance de

estar contaminada. Entretanto, ainda existia a possibilidade de que a

fonte de água das piscinas tivesse alguma influência na diferença de

contaminação entre elas.

Informamos aos proprietários das academias os resultados

obtidos. Diante disso, eles resolveram realizar a limpeza especial da

piscina “A”, citada previamente.

Discussão

67

Segunda fase do trabalho

Seis meses após a limpeza da piscina “A”, e um ano após as

coletas da primeira fase, colheram-se novamente amostras de água das

duas piscinas. A Tabela 6 mostra os resultados dessas colheitas. A

porcentagem de contaminação de ambas as piscinas passou a ser

idêntica, ou seja, 14,3% (2/14). A Tabela 7 compara esses resultados

pelo Teste Exato de Fisher, que não revelou diferença estatística

significante entre os mesmos (p=1,0000). Esses resultados nos

mostravam que agora não havia mais diferença aparente entre as

piscinas “A” e “B” quanto à contaminação por Acanthamoeba.

Como a piscina “A” continuava a ser abastecida por água de

cisterna e a “B” por água de poço artesiano, concluímos que,

provavelmente a fonte de abastecimento não era o fator responsável

pela diferença de contaminação que existia entre as piscinas na

primeira fase.

A Tabela 8 compara os resultados de culturas de Acanthamoeba

da água da piscina “A” nas Fases 1 e 2. Nela observa-se, pelo Teste de

McNemar, que houve uma descontaminação estatisticamente

significante da piscina “A” (p=0,0094) com a passagem para a Fase 2. A

Tabela 9 compara os resultados de culturas de Acanthamoeba da água

da piscina “B” nas Fases 1 e 2. Nela observa-se, pelo Teste de McNemar,

que não houve mudança aparente, estatisticamente significante, na

Discussão

68

porcentagem de contaminação da piscina “B” (p=0,3711) com a

passagem para a Fase 2.

Entre a primeira e a segunda fase deste estudo, três fatos

importantes ocorreram: 1) a água da piscina “A” foi trocada e as paredes

e o fundo da mesma foram exaustivamente limpos; 2) o esquema de

manutenção de ambas as piscinas mudou. Era feito uma vez por

semana e passou a ser feito três vezes por semana; 3) passou um ano

entre as colheitas.

Todos esses três fatos podem ter contribuído para a

descontaminação da piscina “A”. Rivera et al. mostraram que o

isolamento de Acanthamoeba nas piscinas tende a ser influencidado

pela sazonalidade. Nas épocas quentes tende a aumentar e nas frias a

diminuir (RIVERA et al., 1993). Como as colheitas nas duas fases foram

feitas na mesma época do ano (maio) e como a porcentagem de

contaminação se manteve constante na piscina “B” , é provável que esse

fator não tenha sido crítico na descontaminação da piscina “A”. O fato

de a porcentagem de contaminação da piscina “B” ter se mantido

constante também sugere que a mudança do regime de manutenção

das piscinas na Fase 2 não tenha sido o principal fator da

descontaminação da piscina “A”. Sobrou, portanto, como principal fator

de explicação desse fenômeno, a troca da água e a limpeza diferenciada

da piscina “A”. Restava, então, saber se essa descontaminação poderia

Discussão

69

influenciar na porcentagem de contaminação das conjuntivas dos

usuários dessa piscina.

A Tabela 10 compara as frequências dos resultados de culturas

de Acanthamoeba de conjuntivas dos nadadores das piscinas “A” e “B”

na segunda fase deste estudo (maio de 2008). Nela, a porcentagem de

positividade dos nadadores de “A” caiu para 5,5% e a de “B” manteve-se

nula. Pelo Teste Exato de Fisher já não era mais possível detectar

diferença estatisticamente significante entre os nadadores das duas

piscinas (p=0,4737).

Da análise da tabela anterior, concluiu-se que, como os

nadadores da piscina “B” continuaram negativos, a igualdade estatística

entre os nadadores das duas piscinas, agora vigente, provavelmente se

deveu à descontaminação das conjuntivas dos nadadores da piscina

“A”.

A Tabela 11 compara as frequências dos resultados de culturas

de Acanthamoeba de conjuntivas de dois grupos de nadadores da

piscina “A”; um grupo testado só na primeira fase com porcentagem de

contaminação de 78,6% com outro, testado só na segunda fase, com

porcentagem de contaminação de 5,5%. O Teste Exato de Fisher revelou

diferença estatisticamente significante entre eles (p<0,0001). Isso

mostrava a existência de efetiva descontaminação dos nadadores da

piscina “A”. Para reforçar essa conclusão, tomamos uma amostra de 16

nadadores, que haviam sido testados nas duas fases, e estudamos, com

o Teste de McNemar, a variação de positividade dentro do grupo. A

Discussão

70

Tabela 12 mostra os resultados. O teste foi altamente significante

(p=0,0077). Isso confirmava cabalmente que na passagem da Fase 1

para a Fase 2 houve descontaminação das conjuntivas dos usuários da

piscina “A”.

Quando a piscina “A” estava inquestionavelmente mais

contaminada que a piscina “B” os nadadores da primeira apresentavam

alta taxa de contaminação na conjuntiva tarsal e os da segunda

nenhuma contaminação. Quando a taxa de contaminação da água da

piscina “A” caiu a ponto de não diferir estatisticamente da “B”, a

porcentagem de contaminação dos seus nadadores caiu

vertiginosamente de 78,6% para 5,5%. Isso sugere possível relação

causal entre a taxa de contaminação da água e a taxa de contaminação

dos nadadores. Culturas conjuntivais positivas seriam, portanto, mais

frequentes à medida que a água se tornasse mais contaminada.

Entretanto, o fato de a piscina “B” estar contaminada e mesmo assim

não apresentar nenhum nadador contaminado também suscita outra

conjectura: que a contaminação conjuntival só ocorreria após a

ultrapassagem de um limiar critico de contaminação água. Não haveria,

pois, uma linearidade entre as duas variáveis. De qualquer forma,

ambas as hipóteses levam à conclusão de que a chance de se encontrar

Acanthamoeba na conjuntiva de nadadores sadios esteja provavelmente

relacionada com o grau de contaminação da água da piscina.

7. CONCLUSÕES

Conclusões

72

Pelos resultados obtidos neste estudo podemos concluir que:

1) a conjuntiva de nadadores hígidos pode albergar

Acanthamoeba;

2) a chance de se encontrar Acanthamoeba na conjuntiva de

nadadores hígidos está provavelmente relacionada com o grau

de contaminação da água da piscina por este protozoário;

3) nadadores com resultado positivo para Acanthamoeba podem

tornar-se negativos com a redução da contaminação da piscina.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Referências Bibliográficas

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84

Fontes consultadas

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NASCENTES A: Dicionário Etimológico da Língua Portuguesa. Impresso nas Oficinas do Jornal do Comércio, Av. Rio Branco, 117 Rio de Janeiro, 1955.

9. ANEXOS

Anexos

86

ANEXO 1

LIMPEZA E TRATAMENTO DE PISCINAS

A natação é uma das principais modalidades esportivas da atualidade.

Isto pode ser facilmente comprovado pelo enorme espaço que a mesma ocupa

nas principais competições esportivas realizadas por todo o mundo. Além de

nadadores de alto nível, muitos atletas amadores dedicam-se à natação como

forma de exercitar-se. Natação e hidroginástica fazem parte do arsenal

terapêutico da medicina e da fisioterapia, e têm sido recomendadas no

tratamento de inúmeras patologias. Em países de clima quente, como o Brasil,

as piscinas abertas são muito utilizadas para o lazer e atraem milhares e

milhares de indivíduos de praticamente todas as faixas etárias, principalmente

nos meses de primavera e verão. Em países de climas frios predominam as

piscinas cobertas e aquecidas, que também são comuns nas Regiões Sul e

Sudeste do nosso País. Pelo exposto podemos concluir que a utilização de

piscinas é um hábito presente em todo o mundo civilizado, e largamente

difundido na população.

Utilizar uma piscina de água cristalina pode ser muito prazeroso.

Entretanto, a água da piscina pode representar um risco para saúde dos

usuários. Várias doenças como conjuntivites, ceratites, otites, faringites,

dermatomicoses, gastrenterites, etc podem ser adquiridas ao se utilizar uma

piscina contaminada.

Fatores climáticos (chuva e vento) nas piscinas abertas, e os próprios

usuários tanto nas abertas como nas cobertas, podem carrear para a água da

piscina material inorgânico (como areia e terra), e orgânico (como folhas de

vegetais, insetos, excrementos de pássaros, células de descamação,

secreções de vias aéreas, gordura, suor, urina). Estes materiais podem estar

contaminados com diversos tipos de bactérias, fungos, vírus ou protozoários,

que precisam ser eliminados ou pelo menos neutralizados, para que tenhamos

Anexos

87

uma piscina em condições adequadas para o uso. Portanto é necessário que

se realize regularmente a limpeza da piscina e o tratamento da água.

Existem vários métodos de limpeza e tratamento de piscinas. Todos

visam manter a qualidade estética e sanitária da água, que deve apresentar-se

cristalina, sem odores e livre de microrganismos.

Didaticamente podemos dividir o tratamento da água em duas fases. A

primeira fase consiste no tratamento físico e a segunda no tratamento químico.

O tratamento físico consiste em: 1- remover mecanicamente os

elementos, que estejam flutuando na superfície (como folhas, insetos, etc)

utilizando-se para isto uma peneira de nylon montada na ponta de uma haste

de alumínio, 2 – sempre que necessário promover a decantação de partículas

que estejam em suspensão através do uso de floculantes (sulfato de alumínio),

3 - aspirar dos resíduos depositados no fundo da piscina, 4 – filtrar a água

diariamente por 4 a 8 horas, dependendo do tamanho da piscina e da

intensidade de uso, 5 – limpar as bordas e as paredes até o nível da superfície

da água com escova e produtos biodegradáveis, que não alterem o pH.

Quanto ao tratamento químico, trata-se de equilibrar a ação de produtos

para o tratamento da água. Os elementos básicos para o cuidado químico de

uma piscina são a alcalinidade, o pH e o cloro livre. A alcalinidade mede a

concentração de substâncias capazes de seqüestrar íons H+, que deve estar

entre 80 e 120 ppm. O pH deve estar entre 7,4 e 7,6, pois caso contrário a

eficácia dos outros produtos estará comprometida. Para ajuste do pH existem

produtos que promovem elevação, como a barrilha (carbonato de sódio) e

produtos diminuem o pH liberando íons H+. Ainda que a piscina esteja limpa,

com as paredes e bordas escovadas, a água pode estar contaminada com

diversos microrganismos (vírus, bactérias, fungos e protozoários) causadores

de doenças. Então, torna-se necessário utilizar um desinfetante. Comumente

utiliza-se o cloro.

Chamamos genericamente de “Cloro” vários produtos desinfetantes, que

contêm este elemento químico. Entre os mais usados temos: cloro gás, cloro

líquido (hipoclorito de sódio), cloro granulado (hipoclorito de cálcio) e os

Anexos

88

isocianuratos clorados, que são chamados de “cloro orgânico” e são

encontrados no mercado sob a forma de pastilhas ou granulado. Todos estes

compostos, em contato com a água, liberam o “ácido hipocloroso” (fórmula

química – HClO) que é o agente sanitizante ativo. As moléculas do ácido

hipocloroso atravessam a membrana celular dos microrganismos, reagem com

estruturas celulares provocando danos que acabam levando à morte dos

mesmos.

O cloro começou a ser utilizado em larga escala, para tratamento da

água distribuída à população, em 1908, na cidade de Jersey City, nos Estados

Unidos, com a finalidade de diminuir os casos de febre tifóide. Com esta

medida o número de dessa doença em Jersey City caiu de 25.000 em 1900

para 20 em 1960. No Brasil a cloração de águas públicas iniciou-se em 1925,

por iniciativa do Professor Geraldo Horácio de Paula Souza, importante

sanitarista paulista.

Ainda hoje produtos à base de cloro são os mais utilizados para tratar a

água distribuída à população e a de piscinas, pois além de terem ação efetiva

contra a maioria dos microrganismos encontrados na água, são de baixo custo,

uma vez que o cloro é o 11º elemento químico mais abundante no planeta.

Para o tratamento de piscinas preconiza-se que a quantidade de cloro

deva estar entre 1,0 e 3,0 ppm. No Estado de São Paulo existe uma lei que

regulamenta a quantidade de cloro em piscinas públicas, que deve estar entre

0,5 e 0,8 g para cada mil litros de água.

Embora o tratamento de piscinas com cloro apresente grande eficácia e

baixo custo, existem dois problemas principais:

1 - O cloro sofre evaporação o que faz com que as concentrações

diminuam com o passar do tempo, obrigando a reposição constante,

geralmente diárias, do produto. Para minimizar este problema, já há

algum tempo, tem-se utilizado pastilhas de cloro de baixa

solubilidade, que acondicionadas em artefatos flutuantes liberam

cloro continuamente em doses ideais conforme o volume de água de

cada piscina.

Anexos

89

2 - O cloro pode causar irritação nos olhos e nas vias aéreas,

ressecamento da pele e dos cabelos e maior desgaste das roupas

utilizadas durante a natação. A única maneira de minimizar estes

efeitos é diminuir a concentração de cloro na água. Ultimamente têm

sido desenvolvidos tecnologias e equipamentos para limpeza e

tratamento de piscinas que, embora, não dispensem a utilização do

cloro aumentam sua eficiência, permitindo que o mesmo seja

utilizado em concentrações bem menores. Atualmente estão

disponíveis no mercado brasileiro a salinização de piscinas, o uso do

ozônio e da radiação ultravioleta “C”.

No sistema de salinização são utilizados 5 a 6 gramas de sal para cada

litro de água. No circuito de circulação de água da piscina é adaptado um

aparelho que promove a eletrólise do cloreto de sódio gerando íons livres, que

se difundem por toda a água da piscina. Como o cloro é liberado

continuamente não ocorrem flutuações na concentração deste elemento.

Segundo o fabricante, funcionando continuamente, este aparelho mantém a

piscina com a concentração ideal de cloro durante as 24 horas, fazendo com

que a maioria dos microrganismos seja eliminada. Estima-se que existam em

torno de 10.000 piscinas salinizadas no Brasil. Segundo o fabricante este

sistema diminui em 80% a utilização do cloro convencional.

No sistema que utiliza ozônio, este gás é injetado na tubulação de água

na casa de máquinas. Segundo o fabricante o ozônio mata bactérias até três

mil vezes mais rápido que o cloro. Entretanto ainda assim é necessário que se

adicione cloro à água, porém a quantidade necessária é muito menor que nos

sistemas que não utilizam o ozônio.

O sistema que utiliza luz ultravioleta promove a destruição dos

microrganismos através de danos provocados no DNA pela radiação UVC, que

é emitida no interior de um tubo por onde circula a água da piscina. Segundo o

fabricante o equipamento permite uma redução de 75% no uso do cloro nas

piscinas públicas e este tratamento é capaz de destruir até mesmo alguns

protozoários como a giárdia.

Anexos

90

Fonte consultada:

- Clorosur – Associação Latino-Americana da Indústria de Cloro, Álcalis e Derivados

- Abiclor - Associação Brasileira da Indústria de Álcalis, Cloro e

Derivados www.abiclor.com.br

Anexos

91

ANEXO 2

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Grupo de estudo: usuários de piscinas

Projeto de pesquisa: “Presença de Acanthamoeba na conjuntiva de esportistas hígidos: comparação entre usuários e não usuários de piscinas” Responsável pela pesquisa (orientado): Luís Antonio Gorla Marcomini Orientador: Prof Dr Sidney Julio de Faria e Sousa I – Identificação do Participante Nome:_________________________________Idade:_________sexo_____ Endereço:_____________________________________RG:_____________ Telefone:_______________________E-mail:_________________________ II – Responsável legal pelo Participante Nome:_________________________________Idade:_________sexo_____ Endereço:_____________________________________RG:_____________ Telefone:_______________________E-mail:_________________________ Utilize o tempo que for necessário para ler e entender este termo de consentimento informado. Havendo qualquer duvida em qualquer tempo, por favor, sinta-se completamente à vontade para nos perguntar. III – Objetivos e esclarecimentos a respeito deste projeto de pesquisa A – Esta pesquisa tem por objetivo determinar se a conjuntiva (membrana transparente que recobre a parte branca dos olhos, e a porção interna das pálpebras) de esportistas sem doença ocular pode conter um microrganismo, chamado de Acanthamoeba. O presente estudo também pretende verificar se a ocorrência da Acanthamoeba é diferente entre usuários e não usuários de piscinas. Devido à biologia da Acanthamoeba presume-se que talvez seja mais prevalente em usuários de piscinas. B – Pelo exposto no item “A” fica claro que haverá dois grupos de voluntários participantes deste estudo: um grupo formado por usuários de piscinas, e outro grupo constituído por esportistas que não utilizam piscinas nas suas práticas esportivas. O grupo de usuários de piscinas será chamado grupo de estudo e o grupo de não usuários será denominado grupo controle. C – Para realização do presente estudo, será realizada coleta de material conjuntival dos voluntários, da seguinte maneira: serão instiladas duas gotas de colírio anestésico no olho esquerdo, para que não haja desconforto durante a coleta do material. Após a anestesia com o referido colírio, uma micro-escova de cerdas de nylon esterilizada será aplicada à região da conjuntiva que se localiza sob a pálpebra superior do olho

Anexos

92

esquerdo. O contato desta escova com a conjuntiva promoverá a liberação de material em quantidade suficiente para o estudo. A coleta do material será realizada pelo oftalmologista responsável pelo estudo: Luis Antonio Gorla Marcomini D – A presença da Acanthamoeba na conjuntiva, assim como em outros tecidos do corpo humano, sem outros sinais de inflamação (dor, febre, vermelhidão ou edema), não caracteriza doença e, portanto, não requer tratamento. E – Embora a presença da Acanthamoeba na conjuntiva, por si só, não caracterize doença, torna-se importante se a pessoa tiver intenção de usar lentes de contato. Acanthamoeba presente na conjuntiva, associada ao uso de lente de contato mal cuidada, pode causar doença ocular grave. F – Se esta pesquisa confirmar o pré-suposto que usuários de piscinas têm maior chance de ter Acanthamoeba em seus olhos, este trabalho servirá para alertar estas pessoas que elas correm maior risco de contrair doença ocular por Acanthamoeba, se resolverem usar lentes de contato. IV – Situação dos Participantes Sendo usuário regular de piscinas, serei incluído no grupo de estudo. Devido ao esquema desta pesquisa, os participantes do grupo de estudo estarão sujeitos às mesmas condições dos participantes do grupo controle, uma vez que o que define o grupo é o tipo de esporte que a pessoa pratica, e não o que será feito no desenvolvimento do estudo. Compreendi também que aceitando participar: A – Estou dando meu consentimento (permissão) para que seja coletado material de meu olho esquerdo, conforme técnica descrita na letra “C” do item III. Entendi que a coleta do material conjuntival não costuma trazer nenhum tipo de risco, uma vez que serão removidas apenas células superficiais que se desprendem e caem continuamente. B – A coleta do material dos meus olhos será realizada na academia de esportes, logo após o término de minhas atividades físicas. Se eu sentir qualquer tipo de desconforto, ou alguma preocupação quanto à saúde dos meus olhos após o referido procedimento, serei prontamente atendido pelo responsável pela pesquisa o oftalmologista Luis Antonio Gorla Marcomini, que poderá ser acionado pelo telefones listados no final deste documento. Mesmo que não haja nenhum tipo de desconforto, serei re-avaliado no dia seguinte à coleta do material, pelo profissional citado acima. C – Qualquer problema oftalmológico que eu apresente, poderá impedir que eu participe do presente estudo, entretanto, mesmo que eu não possa ser incluído entre os participantes, me será garantido o tratamento e/ou seguimento do problema oftalmológico detectado. Entendi também que me será assegurado o tratamento e/ou seguimento de qualquer problema decorrente da minha participação neste estudo. D – Entendi que o participante tem total liberdade de retirar seu consentimento, a qualquer momento, em qualquer fase da pesquisa, sem que haja prejuízo aos cuidados, que o mesmo esteja eventualmente recebendo. E – A qualquer momento, o participante poderá solicitar informações sobre a pesquisa.

Anexos

93

F - Cada participante será informado em caráter particular sobre o resultado do exame do material colhido do seu olho. G – Os resultados dos exames do material coletado dos olhos de todos os participantes comporão o presente estudo, e jamais será feita identificação entre o resultado do exame de uma determinada amostra de material e o participante do qual foi colhida tal amostra. Nem mesmo o pessoal do laboratório onde serão realizados tais exames poderá identificar de quem é uma determinada amostra de material, uma vez que o material encaminhado ao laboratório, será identificado apenas por um número. Isso garante sigilo e assegura a privacidade dos participantes. H – Havendo necessidade de utilização de medicamentos para tratamento de eventuais desconfortos causados pela participação neste estudo, os mesmos serão fornecidos gratuitamente ao participante pelo pesquisador responsável por este estudo. I – Eventuais danos sofridos devido a minha participação neste estudo, serão indenizados pelo responsável pela pesquisa, o oftalmologista Luis Antonio Gorla Marcomini, na forma da Lei. J – Para qualquer esclarecimento: Dr Luis Antonio Gorla Marcomini 16 – 3336-8225 (clinica) ou 16 -3336-6575 (residência) ou 16 - 9156 – 5149 [email protected] Após ter lido e entendido todas as informações contidas neste documento, como objetivos, metodologia, possíveis riscos e benefícios, eu______________________________________________, consinto, por vontade própria, em participar deste estudo. Afirmo ainda que todas as minhas dúvidas foram sanada pelo pesquisador, o qual estará a minha disposição para eventuais sanar eventuais duvidas que surjam no futuro, com relação à pesquisa, ou com relação a qualquer sintoma ou sinal que apareça nos meus olhos e que eu eventualmente relacione à minha participação neste estudo. ______________________________________ Participante ou responsável legal ______________________________ _________________________________ Prof Dr Sidney Júlio de Faria e Sousa Luis Antonio Gorla Marcomini CRM 5185 Orientador Pesquisador responsável Araraquara,_______de _______________________de_____________ .

Anexos

94

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Grupo Controle: não usuários de piscinas

Projeto de pesquisa: “Presença de Acanthamoeba na conjuntiva de esportistas hígidos: comparação entre usuários e não usuários de piscinas” Responsável pela pesquisa (orientado): Luís Antonio Gorla Marcomini Orientador: Prof Dr Sidney Julio de Faria e Sousa I – Identificação do Participante Nome:_________________________________Idade:_________sexo_____ Endereço:_____________________________________RG:_____________ Telefone:_______________________E-mail:_________________________ II – Responsável legal pelo Participante Nome:_________________________________Idade:_________sexo_____ Endereço:_____________________________________RG:_____________ Telefone:_______________________E-mail:_________________________ Utilize o tempo que for necessário para ler e entender este termo de consentimento informado. Havendo qualquer duvida em qualquer tempo, por favor sinta-se completamente à vontade para nos perguntar. III – Objetivos e esclarecimentos a respeito deste projeto de pesquisa A – Esta pesquisa tem por objetivo determinar se a conjuntiva (membrana transparente que recobre a parte branca dos olhos, e a porção interna das pálpebras) de esportistas sem doença ocular pode conter um microrganismo, chamado de Acanthamoeba. O presente estudo também pretende verificar se a ocorrência da Acanthamoeba é diferente entre usuários e não usuários de piscinas. Devido à biologia da Acanthamoeba presume-se que talvez seja mais prevalente em usuários de piscinas. B – Pelo exposto no item “A” fica claro que haverá dois grupos de voluntários participantes deste estudo: um grupo formado por usuários de piscinas, e outro grupo constituído por esportistas que não utilizam piscinas nas suas práticas esportivas. O grupo de usuários de piscinas será chamado grupo de estudo e o grupo de não usuários será denominado grupo controle. C – Para realização do presente estudo, será realizada coleta de material conjuntival dos voluntários, da seguinte maneira: serão instiladas duas gotas de colírio anestésico no olho esquerdo, para que não haja desconforto durante a coleta do material. Após a anestesia com o referido colírio, uma micro-escova de cerdas de nylon esterilizada será aplicada à região da conjuntiva que se localiza sob a pálpebra superior do olho esquerdo. O contato desta escova com a conjuntiva promoverá a liberação de material em quantidade suficiente para o estudo. A coleta do material será realizada pelo oftalmologista responsável pelo estudo: Luis Antonio Gorla Marcomini

Anexos

95

D – A presença da Acanthamoeba na conjuntiva, assim como em outros locais do corpo humano, sem outros sinais de inflamação (dor, febre, vermelhidão ou inchaço), não caracteriza doença e, portanto, não requer tratamento. E – Embora a presença da Acanthamoeba na conjuntiva, por si só, não caracterize doença, torna-se importante se a pessoa tiver intenção de usar lentes de contato. Acanthamoeba presente na conjuntiva, associada ao uso de lente de contato mal cuidada, pode causar doença ocular grave. F – Se esta pesquisa confirmar o pré-suposto que usuários de piscinas têm maior chance de ter Acanthamoeba em seus olhos, este trabalho servirá para alertar estas pessoas que elas correm maior risco de contrair doença ocular por Acanthamoeba, se resolverem usar lentes de contato. IV – Situação dos Participantes Sendo esportista não usuário de piscinas, serei incluído no grupo controle. Devido ao esquema desta pesquisa, os participantes do grupo controle estarão sujeitos às mesmas condições dos participantes do grupo de estudo, uma vez que o que define o grupo é o tipo de esporte que a pessoa pratica, e não o que será feito no desenvolvimento do estudo. Compreendi também que aceitando participar: A – Estou dando meu consentimento (permissão) para que seja coletado material de meu olho esquerdo, conforme técnica descrita na letra “C” do item III. Entendi que a coleta do material conjuntival não costuma trazer nenhum tipo de risco, uma vez que serão removidas apenas células superficiais que se desprendem e caem continuamente. B – A coleta do material dos meus olhos será realizada na academia de esportes, logo após o término de minhas atividades físicas. Se eu sentir qualquer tipo de desconforto, ou alguma preocupação quanto à saúde dos meus olhos após o referido procedimento, serei prontamente atendido pelo responsável pela pesquisa o oftalmologista Luis Antonio Gorla Marcomini, que poderá ser acionado pelo telefones listados no final deste documento. Mesmo que não haja nenhum tipo de desconforto, serei re-avaliado no dia seguinte à coleta do material, pelo profissional citado acima. C – Qualquer problema oftalmológico que eu apresente, poderá impedir que eu participe do presente estudo, entretanto, mesmo que eu não possa ser incluído entre os participantes, me será garantido o tratamento e/ou seguimento do problema oftalmológico detectado. Entendi também que me será assegurado o tratamento e/ou seguimento de qualquer problema decorrente da minha participação neste estudo. D – Entendi que o participante tem total liberdade de retirar seu consentimento, a qualquer momento, em qualquer fase da pesquisa, sem que haja prejuízo aos cuidados, que o mesmo esteja eventualmente recebendo. E – A qualquer momento, o participante poderá solicitar informações sobre a pesquisa. F - Cada participante será informado em caráter particular sobre o resultado do exame do material colhido do seu olho.

Anexos

96

G – Os resultados dos exames do material coletado dos olhos de todos os participantes comporão o presente estudo, e jamais será feita identificação entre o resultado do exame de uma determinada amostra de material e o participante do qual foi colhida tal amostra. Nem mesmo o pessoal do laboratório onde serão realizados tais exames poderá identificar de quem é uma determinada amostra de material, uma vez que o material encaminhado ao laboratório, será identificado apenas por um número. Isso garante sigilo e assegura a privacidade dos participantes. H – Havendo necessidade de utilização de medicamentos para tratamento de eventuais desconfortos causados pela participação neste estudo, os mesmos serão fornecidos gratuitamente ao participante pelo pesquisador responsável por este estudo. I – Eventuais danos sofridos devido a minha participação neste estudo, serão indenizados pelo responsável pela pesquisa, o oftalmologista Luis Antonio Gorla Marcomini, na forma da Lei. J – Para qualquer esclarecimento: Dr Luis Antonio Gorla Marcomini 16 – 3336-8225 (clinica) ou 16 -3336-6575 (residência) ou 16 - 9156 – 5149 [email protected] Após ter lido e entendido todas as informações contidas neste documento, como objetivos, metodologia, possíveis riscos e benefícios, eu______________________________________________, consinto, por vontade própria, em participar deste estudo. Afirmo ainda que todas as minhas dúvidas foram sanada pelo pesquisador, o qual estará a minha disposição para eventuais sanar eventuais duvidas que surjam no futuro, com relação à pesquisa, ou com relação a qualquer sintoma ou sinal que apareça nos meus olhos e que eu eventualmente relacione à minha participação neste estudo. ______________________________________ Participante ou responsável legal ______________________________ _________________________________ Prof Dr Sidney Júlio de Faria e Sousa Luis Antonio Gorla Marcomini CRM 5185 Orientador Pesquisador responsável Araraquara,_______de _______________________de_____________

Anexos

97

ANEXO 3

APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA

ANEXO DE PUBLICAÇÃO

Presença de Acanthamoeba na conjuntiva de nadadores hígidos

Luis Antonio Gorla Marcomini, Sidney Júlio de Faria e Sousa

Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

Endereço para Correspondência:

Prof. Dr. Sidney Júlio de Faria e Sousa - Av. Bandeirantes, 3900 – Monte Alegre –

CEP: 14049-900 – Ribeirão Preto – SP – Fone: 16-3602-2862 – Fax: 16-3602-2860 – e-

mail: [email protected]

Anexo de Publicação

2

RESUMO

Objetivo:Determinar se a conjuntiva de nadadores hígidos pode albergar

Acanthamoeba. Método: O presente trabalho desdobrou-se em duas fases e foi

desenvolvido em duas academias de esportes de propriedade de uma mesma

empresa. Ambas possuem piscina coberta e aquecida e sala de musculação. A

academia mais velha identificada como “A” tem 33 anos de construção. A

outra identificada como “B”, tem cinco anos de construção. Primeira fase. Na

academia “A” colheram-se esfregaços conjuntivais de 30 nadadores e de 13

não nadadores. Na academia “B” colheram-se esfregaços conjuntivais de 11

nadadores. Concomitantemente, foram colhidas 14 amostras de água de cada

uma das piscinas. A piscina “A” passou por um processo diferenciado de

limpeza, e a “B” não. Segunda fase. Seis meses após essa limpeza diferenciada

colheram-se novamente esfregaços conjuntivais de 34 nadadores da piscina

“A”, divididos em 2 grupos: 18 que estavam participando do estudo pela

primeira vez e 16 que já haviam sido testados na primeira fase. Foram

colhidas amostras de 20 nadadores da piscina “B”, que ainda não haviam sido

testados. Novamente colheram-se 14 amostras de água de cada uma das

piscinas. Pesquisou-se a presença de Acanthamoeba nas amostras de material

conjuntival e nas amostras de água. Resultados: Primeira fase. Dos 30

nadadores testados na academia “A”, 23 (76,6%) foram positivos para

Acanthamoeba. Entre os 13 participantes do grupo controle não houve

positivos. Entre os 11 nadadores da piscina “B” não houve positivos. Das 14

amostras de água da piscina “A”, 12 (85,7%) foram positivas e apenas duas

negativas. Das 14 amostras da piscina “B”, cinco (35,7%) foram positivas e


3

nove negativas. Segunda fase. Dos 18 nadadores testados na piscina “A” que

estavam participando do estudo pela primeira vez, apenas um (5,5%) foi

positivo. Entre os 16 nadadores da piscina “A” que já haviam sido testados na

primeira fase tivemos: nove eram positivos e tornaram-se negativos, quatro

eram negativos e continuaram assim, três eram positivos e continuaram

assim. Entre os 20 nadadores da piscina “B” não houve positivos. Entre as

amostras de água tivemos, tanto na piscina “A” quanto na “B”, apenas duas

(14,3 %) positivas e 12 (85,7%) negativas. Conclusões: A conjuntiva de

nadadores hígidos pode albergar Acanthamoeba. A chance de se encontrar

Acanthamoeba na conjuntiva de nadadores hígidos está provavelmente

relacionada com o grau de contaminação da piscina por esse protozoário.

Nadadores com resultado positivo para Acanthamoeba podem tornar-se

negativos com a redução da contaminação da piscina.


4

INTRODUÇÃO

Apesar de pouco frequente, a ceratite por Acanthamoeba sempre teve um papel

importante em oftalmologia devido ao caráter potencialmente devastador dessa

patologia. O quadro clínico pode variar consideravelmente, o que, às vezes, dificulta o

diagnóstico e retarda o tratamento.

Inicialmente, os casos de ceratite por Acanthamoeba foram relacionados a

traumas oculares, sendo que o primeiro caso fora descrito em 19731. Na década de 1980

houve grande aumento no número de casos de ceratite por Acanthamoeba. Em 1991,

Wilhelmus2 correlacionou o aumento gradual de casos de ceratite por Acanthamoeba

com o aumento do número de usuários de lentes de contato2.

Esses fatos sugerem que para que se estabeleça uma ceratite por Acanthamoeba,

talvez seja necessária, além da presença do protozoário, a quebra das barreiras naturais

que protegem a superfície ocular (traumas ou uso de lentes de contatos). Se isso for

verdadeiro, teoricamente poderíamos encontrar Acanthamoeba em olhos hígidos.

Como a Acanthamoeba já fora, inúmeras vezes, isolada de piscinas3,4,5,6, o

objetivo deste estudo foi: determinar se a conjuntiva de nadadores hígidos pode albergar

Acanthamoeba.

MATERIAL E MÉTODO

O presente estudo desdobrou-se em duas fases, que serão descritas na sequência

cronológica em que ocorreram.


5

Primeira fase (maio de 2007)

Estudaram-se duas academias de esportes, geograficamente distintas, de uma

mesma companhia de esportes. Cada academia era dotada de sala de musculação e

piscina coberta e aquecida. A piscina de ambas as academias era de alvenaria, revestida

com azulejos. A academia mais velha, identificada como ”A”, tinha aproximadamente

33 anos de construção. A academia mais nova, identificada como “B”, tinha cerca de

cinco anos de construção. O regime de manutenção era idêntico em ambas as piscinas.

A filtração, o ajuste de pH e a cloração eram procedimentos diários. Decantação e

aspiração de sedimentos eram realizadas uma vez por semana. Em ambas as piscinas a

decantação era realizada nas quartas-feiras à noite e a aspiração nas quintas-feiras pela

manhã.

Inicialmente, pesquisou-se a presença de Acanthamoeba em raspados

conjuntivais numa amostra de esportistas da academia “A” composta por 30 nadadores e

13 não-nadadores. Na sequência, colheu-se material conjuntival de 11 nadadores da

piscina “B”. Também foram colhidas duas amostras diárias de água (uma diurna e outra

noturna) de ambas as piscinas, durante sete dias consecutivos.

Em novembro de 2007, a piscina “A” foi submetida a uma limpeza exaustiva: a

mesma foi esvaziada, os azulejos e os rejuntes das paredes foram escovados a mão e os

azulejos e rejuntes do fundo foram escovados com máquina de polir granito. Usou-se

ácido muriático para a realização dessas tarefas. A piscina “B” não passou por nenhum

processo especial de limpeza.

A partir de então, em ambas as piscinas, a decantação e a aspiração passaram a

ser feitas três vezes por semana, sendo: decantação nas terças, quintas e aos sábados à


6

noite e aspiração nas quartas, sextas e aos domingos pela manhã. Cloração, filtração e

ajuste de pH continuaram a ser procedimentos diários em ambas.

Segunda fase (maio de 2008)

Seis meses após a limpeza especial realizada na piscina “A”, novamente foram

colhidas amostras de água de cada uma das piscinas. Concomitantemente, colheram-se

também raspados conjuntivais dos nadadores de cada piscina. Na piscina “A”, os

participantes foram separados em dois grupos: 18 nadadores que ainda não haviam sido

testados e 16 nadadores que já haviam sido testados na primeira fase. Na piscina “B”

foram colhidos raspados de 20 nadadores que não tinham sido testados na primeira fase.

Em cada fase deste estudo colheu-se uma única amostra de material conjuntival

de cada participante. Como consequência, os 16 nadadores da piscina “A” foram

submetidos a duas coletas de material conjuntival, uma em cada fase deste estudo.

Independentemente de terem sido testados apenas na primeira, apenas na segunda, ou

em ambas as fases, todos os nadadores frequentaram as piscinas durante todo o período

em que este estudo foi realizado. Todos os nadadores sempre utilizaram óculos de

natação durante a prática esportiva. Os nadadores da piscina “A” nunca frequentaram a

“B” e vice-versa.

Coleta do material da conjuntiva

Todos os participantes deste estudo eram adultos, foram informados sobre os

objetivos do estudo e assinaram termo de consentimento. Nenhum participante estava

em uso de antibiótico sistêmico ou medicações oculares de qualquer natureza. Todas as

coletas foram feitas por uma mesma pessoa, sempre após o término da atividade


7

esportiva, na própria academia de esportes. A região escolhida foi a conjuntiva tarsal

superior do olho esquerdo. Para a coleta do material utilizou-se uma mini-escova de

cerda de nylon, estéril, montada sobre aplicador que evita contaminação da escova pelas

mãos do operador. Tanto a escova como o aplicador foram desenvolvidos pelo Setor de

Doenças Oculares Externas do Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e

Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP,

especialmente para este trabalho. Tal escova tem formato cilíndrico e mede 5mm de

extensão por 1,5mm de diâmetro. No ato da coleta, a conjuntiva era anestesiada com

duas gotas de colírio de proximetacaína a 0,5%. Em seguida, a pálpebra superior

esquerda era evertida e a escova friccionada contra a conjuntiva tarsal superior. A

escova era ejetada do aplicador diretamente no interior de um tubo de vidro estéril,

dotado de tampa rosqueada, contendo 3ml de caldo de Thioglicolato. Imediatamente,

aplicava-se a tampa a este tubo.

Coleta das amostras de água

Em cada uma das fases deste trabalho foram colhidas 14 amostras de água de

cada piscina. Essas amostras foram colhidas durante sete dias consecutivos, sendo uma

pela manhã antes do início das atividades de natação e outra à noite, após o término das

mesmas. Cada amostra era colhida da superfície da piscina com uma seringa estéril

exclusiva de 10ml. Cerca de 3ml do conteúdo da seringa era injetado dentro de um tubo

de vidro estéril com tampa rosqueada, contendo igual volume de Thioglicolato líquido.


8

A análise laboratorial

Cada tubo de Thioglicolato com a escova ou com a amostra de água da piscina

era encubado em estufa a 28ºC por 72 horas. Então, o material era semeado em placas

de Agar não nutriente com cobertura de Escherischia coli mortas. Essas placas eram

colocadas em sacos plásticos para evitar a dessecação e mantidas a 28°C. A leitura das

placas era feita diariamente ao microscópio óptico com aumentos de 100 e 400 vezes,

por um período de até 14 dias. Se após esse período a placa não revelasse trofozoítos ou

cistos de Acanthamoeba o resultado era considerado negativo.

Análise estatística

Como o estudo envolveu comparações de médias e proporções, os testes

utilizados para amostras independentes foram: ANOVA, Exato de Fisher e Qui-

quadrado. Para amostras pareadas utilizou-se o Teste de McNemar. Consideramos os

resultados como estatisticamente significantes quando p < 0,05.

RESULTADOS

Neste trabalho colheu-se raspados conjuntivais de 92 indivíduos sadios: 79

nadadores e 13 não nadadores. A Tabela 1 apresenta os dados demográficos dos

nadadores, que participaram deste estudo: 25 participaram apenas na primeira fase, 38

apenas na segunda e 16 em ambas as fases. Os 13 não nadadores participaram apenas na

primeira fase.


9

Primeira Fase (maio de 2007)

Inicialmente, foram colhidas 30 amostras de material conjuntival de nadadores

da piscina “A”. Dessas amostras, 23 (76,7%) mostraram-se positivas para

Acanthamoeba. Para o grupo controle foram selecionados os esportistas dessa academia

que não praticavam natação. Nesse grupo foram colhidas 13 amostras e todas resultaram

negativas. A Tabela 2 mostra esses resultados.

A Tabela 3 compara os resultados obtidos de 14 nadadores da piscina “A” que

participaram apenas na primeira fase deste estudo com os resultados obtidos de 11

nadadores da piscina “B”.

Concomitantemente à coleta das amostras de material conjuntival dos nadadores,

colhemos as amostras de água, conforme já relatado em material e método. A Tabela 4

mostra esses resultados.

A Tabela 5 compara as frequências dos resultados de culturas de Acanthamoeba

da água das piscinas “A” e “B”, na primeira fase (maio de 2007)

Segunda Fase (maio de 2008)

Seis meses após a limpeza especial realizada somente na piscina ”A”, e um ano

após as primeiras coletas de amostras de água, novamente foram colhidas amostras de

água das piscinas de ambas as academias. A Tabela 6 mostra os resultados obtidos das

amostras de água e a Tabela 7 a frequência desses resultados.

A Tabela 8 compara as frequências dos resultados obtidos das amostras de água

da piscina “A” nas duas fases deste estudo.

A Tabela 9 compara as frequências dos resultados obtidos das amostras de água

da piscina “B” nas duas fases deste estudo.


10

A Tabela 10 compara as frequências dos resultados de culturas de

Acanthamoeba de conjuntivas de nadadores das piscinas “A” e “B” obtidos na segunda

fase deste estudo (maio de 2008).

A Tabela 11 compara as frequências dos resultados de culturas de

Acanthamoeba de conjuntivas de dois grupos independentes de nadadores da piscina

“A”, segundo a data do exame.

A Tabela 12 compara as frequências dos resultados obtidos entre os nadadores

da piscina “A” que participaram nas duas fases deste estudo.

DISCUSSÃO

A Acantahmoeba já em sido encontrada em vias aéreas de pessoas

aparentemente hígidas7,8,9,10,11,12,13. Entretanto, Anisah et al14 pesquisaram

Acanthamoeba em conjuntiva de 286 crianças na Malásia e não encontraram nenhum

caso positivo. Classicamente é aceito que ambientes líquidos que contenham bactérias

são ideais para o desenvolvimento de Acanthamoeba15. Assim, imaginamos que

nadadores, teoricamente, teriam alguma chance de apresentar Acanthamoeba em suas

conjuntivas. Frente a esses fatos, nos propusemos a verificar se a conjuntiva de

nadadores hígidos poderia albergar Acanthamoeba.

Neste trabalho estudou-se a presença de Acanthamoeba na conjuntiva de

noventa e dois indivíduos sadios, sendo 79 nadadores (grupo de estudo) e 13 não-

nadadores (grupo controle).

A Tabela 1 mostra os dados demográficos dos nadadores. Nela observa-se que a

média das idades dos três grupos, identificados na tabela, não difere estatisticamente

pelo teste de análise de variância. As proporções dos sexos, nos grupos em questão,


11

também não apresentaram diferenças estatisticamente significativas, pelo teste do Qui-

quadrado. Embora não haja na literatura médica informações sobre a influência dessas

variáveis na contaminação do saco conjuntival, isso diminui a chance de que as mesmas

se configurem como variáveis de confusão.

Primeira fase (maio de 2007)

Na primeira fase deste estudo comparamos a presença de Acanthamoeba na

conjuntiva de nadadores com não nadadores (Tabela 2). Encontramos diferença

altamente significativa (Fisher p < 0,0001) entre esses dois grupos e assim, pudemos

concluir que a conjuntiva de nadadores hígidos pode albergar Acanthamoeba, enquanto

que a probabilidade de se encontrar este protozoário em não nadadores é muito pequena.

Como a empresa proprietária da academia “A” possuía outra unidade, “B”,

também dotada de piscina coberta e aquecida, decidimos estudar os esfregaços

conjuntivais de uma amostra de nadadores da piscina “B”. A Tabela 3 mostra a

comparação dos resultados obtidos entre os nadadores da piscina “A” (que participaram

apenas na primeira fase) com os obtidos entre os nadadores da “B”. Nela observa-se que

a proporção de positivos na “A” é significativamente maior que na “B” (Fisher p =

0,0001).

Aventou-se a hipótese de que algum fator intrínseco das piscinas fosse

responsável pela diferença de contaminação dos usuários. Então, foram colhidas 14

amostras de água de cada uma das piscinas (conforme Tabela 4); e comparou-se a

frequência desses resultados (Tabela 5). A Tabela 5 mostra que a proporção de positivos

nas amostras de água da piscina “A” foi de 85,7% (12/14) e na “B” foi de 35,7% (5/14).

A diferença entre essas proporções foi estatisticamente significante (Fisher p=0,0183).


12

Isso mostra que a piscina “A” apresentava um nível de contaminação maior que a “B”.

O tratamento da água era idêntico nas duas piscinas. As únicas diferenças eram o tempo

de construção (“A” 33 anos e “B” cinco anos) e a fonte de abastecimento de água (“A”

cisterna e “B” poço artesiano).

De Jonckheere estudou a prevalência de Acanthamoeba em 16 piscinas da Bélgica

(15 cobertas e aquecidas e uma aberta) e encontrou o protozoário nas piscinas,

propriamente ditas, nos lava-pés, nas áreas ao redor das piscinas e, principalmente no

chão sob os chuveiros. Conjecturou, então, que as Acanthamoebae são introduzidas

continuamente nas piscinas, principalmente pelos próprios usuários3. Se isso for

verdadeiro, podemos supor que, quanto mais velha a piscina maior a chance de estar

contaminada por Acanthamoeba. E isso explicaria a maior contaminação da piscina

“A”. Entretanto, ainda podíamos supor que a fonte de água pudesse influir na

contaminação das piscinas.

Segunda fase (maio de 2008)

Após a limpeza especial, novamente foram colhidas amostras de água de ambas as

piscinas (Tabela 6). A proporção de positivos nas amostras de água passou a ser a igual

em ambas as piscinas. Tivemos, tanto entre as amostras de “A” como entre as de “B”,

14,3% (2/14) de positividade (Tabela 7 Fisher p=1,0000). A Tabela 8 compara os

resultados das amostras de água da piscina “A” obtidos nas duas fases deste estudo.

Nela verificamos que a taxa de positividade passou de 85,7% (12/14) na primeira fase

para 14,3% (2/14) na segunda fase. Esse resultado mostra que houve diferença

estatisticamente significante entre as taxas de positividade dessa piscina em cada fase

deste estudo (McNemar p=0,0094). Assim podemos dizer que houve uma


13

descontaminação dessa piscina. A Tabela 9 compara os resultados das amostras de água

da piscina “B” obtidos nas duas fases deste estudo. Nela verificamos que a taxa de

positividade passou de 35,7% (5/14) na primeira fase, para 14,3% (2/14) na segunda

fase. Esse resultado mostra que não houve diferença estatisticamente significante entre

as taxas de positividade dessa piscina em cada fase deste estudo (McNemar p = 0,3711).

Como a piscina “A” continuava a ser abastecida por cisterna e a “B” por água de poço

artesiano, concluímos que, provavelmente a fonte de abastecimento não era o fator

responsável pela diferença de contaminação das piscinas obtida nas amostras da

primeira fase deste estudo.

Como nessa fase do estudo não foi possível detectar diferença na taxas de

positividade para Acanthamoeba entre as piscinas “A” e “B” (Tabela 7), resolvemos

colher novamente raspados conjuntivais dos nadadores de ambas as piscinas. A Tabela

10 compara as frequências de positivos entre as culturas de raspados conjuntivais dos

nadadores de ambas as piscinas na segunda fase deste estudo. Nela observamos 5,5% de

positivos entre os nadadores de “A” e ausência de positivos entre os de “B”. Essa

diferença não foi estatisticamente significante (Fisher p=0,4737). Embora nas duas fases

do estudo a piscina “B” se apresentasse contaminada, não houve positivos entre seus

usuários em nenhuma das duas fases. Isso sugere que, para que haja contaminação dos

nadadores é necessário um nível mínimo de contaminação da piscina, e que

provavelmente a piscina “B” tenha estado sempre abaixo desse nível. A piscina “A” era

mais contaminada que a “B” na primeira fase. Após a limpeza diferenciada a piscina

“A” passou a não diferir estatisticamente da “B” quanto ao grau de contaminação por

Acanthamoeba. A Tabela 11 compara a frequência de positividade para Acantahmoeba

na conjuntiva de nadadores da piscina “A” que participaram apenas na primeira fase do


14

estudo com a frequência de positividade para Acantahmoeba na conjuntiva de

nadadores que participaram apenas na segunda fase. Nessa tabela observa-se que a

porcentagem de positivos entre os nadadores de “A” que participaram apenas na

primeira fase era de 78,6% (11/14) e entre os nadadores dessa piscina que participaram

apenas na segunda fase era de 5,5% (1/18). A diferença entre estas taxas de positividade

foi estatisticamente significante (Fisher p<0,0001). Assim, observamos que

concomitantemente à diminuição de positividade nas amostras de água da piscina “A”,

houve uma diminuição na positividade entre as culturas de Acanthamoeba da conjuntiva

dos nadadores dessa piscina. Isso sugere uma relação de causa-efeito entre o grau de

contaminação da piscina e a contaminação da conjuntiva do nadador por

Acanthamoeba.

A Tabela 12 compara as taxas de positividade de um mesmo grupo de nadadores

da piscina “A” testados em ambas as fases deste estudo. Nela observa-se que a taxa de

positividade na primeira fase era de 75% (12/16) e passou a ser de 18,7% (3/16) na

segunda fase deste estudo. A diferença entre essas proporções foi estatisticamente

significante (McNemar p = 0,0077). Esse resultado vem reforçar a hipótese de que haja

uma relação positiva entre o grau de contaminação da piscina e a contaminação

conjuntival do nadador, e nos permite concluir que a descontaminação da piscina pode

levar à descontaminação dos nadadores.

CONCLUSÕES

Pelos resultados obtidos neste estudo podemos concluir que:

1) a conjuntiva de nadadores hígidos pode albergar Acanthamoeba;


15

2) a chance de se encontrar Acanthamoeba na conjuntiva de nadadores

hígidos está provavelmente relacionada com o grau de contaminação

da água da piscina por esse protozoário;

3) nadadores com resultado positivo para Acanthamoeba podem tornar-

se negativos com a redução da contaminação da piscina.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Acanthamoeba uveitis associated with fatal meningoencephalitis. Transactions of the

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16

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Cutis, 67: 377-380, 2001.

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15. Neves DP. Parasitologia Humana – 10 a Ed. Editora Atheneu, 16: 125-127, 2000.


17

Tabela 1. Dados demográficos dos nadadores.

Nadadores Fase 1 Fase 2 Ambas Fases p

Frequência 25 38 16

Idade (anos)* 45,5 ± 17,5 46,8 ±15,9 45,1 ± 13,6 0,9196

Faixa etária (anos) 19 - 75 18 - 75 20 - 68

Masculino 9 14 7 Sexo **

Feminino 16 24 9 0,8656

*ANOVA. **Qui-quadrado

Tabela 2: Frequência de resultados de culturas de Acanthamoeba de conjuntivas de esportistas hígidos da academia “A” (maio de 2007).

Esportista Acanthamoeba Total + -

Nadador 23 7 30 Não nadador 0 13 13




“A” 11 3 14 “B” 0 11 11



18





"A" 12 2 14 "B" 5 9 14






"A" 2 12 14 "B" 2 12 14



M N M N M N M N M N M N M N “A” + + + + + + - - + + + + + + “B” - + + + + + - - - - - - - -


M N M N M N M N M N M N M N “A” + - - - - - - + - - - - - - “B” - - + - - - - - - + - - - -


19

Tabela 8: Cotejo de dois resultados consecutivos de culturas de Acanthamoeba da água da piscina “A”.


Tabela 9: Cotejo de dois resultados consecutivos de culturas de Acanthamoeba da água da piscina “B”.




“A” 1 17 18 “B” 0 20 20



+ - + 1 11 12 Maio 2007 - 1 1 2

Total 2 12 14


+ - + 1 4 5 Maio 2007 - 1 8 9

Total 2 12 14


20

Tabela 11: Frequência dos resultados de culturas de Acanthamoeba de conjuntivas de dois grupos independentes de nadadores da piscina “A”, segundo a data do exame.

Data Acanthamoeba Total + -

Maio 2007 11 3 14 Maio 2008 1 17 18


Tabela 12: Cotejo de dois resultados consecutivos de culturas de Acanthamoeba de um mesmo grupo de nadadores da piscina “A”.



+ - + 3 9 12 Maio 2007 - 0 4 4

Total 3 13 16

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