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AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
PREPARO DO REAGENTE LIOFILIZADO
HYNIC-[Tyr']-OCTREOTATO E ESTUDO DE MARCAÇÃO
COM TECNÉCIO-99m
IVANI BORTOLETI MELO
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Mestre em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear -Aplicações.
Orientadora: Dra. Constancia Pagano Gonsalves da Silva
São Paulo 2008
,85
ipen INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES
"Autarquía associada à Universidade de São Paulo"
PREPARO DO REAGENTE LIOFILIZADO HYNIC-[Tyr^].OCTREOTATO E ESTUDO DE MARCAÇÃO COM TECNÉCIO-99m
IVANI BORTOLETI MELO
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Mestre em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear-Aplicações
Orientadora: Dra. Constancia Pagano Gonçalves da Silva
São Paulo 2008
C0.5Stó NACIÓN DE EH.^.UC:^A^SP-1P^^
A minha mãe,
sempre presente em minha vida
A meu pai,
com muita saudade...
A minha irmã Elaine,
exemplo de pessoa e profissional
Aos meus filhos Lucas e Daniel
AGRADECIMENTOS
*> A Deus, força superior, que me deu saúde e perseverança em mais essa
etapa de minina vida.
• Ao Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN/CNEN) na pessoa
do Superintendente Dr.Nilson Dias Vieira Júnior.
*> A Dra. Constancia Pagano Gonçalves da Silva, minha orientadora, pelos
ensinamentos, conselhos, apoio e confiança a mim depositada
proporcionando um grande crescimento pessoal e profissional.
• A Dra. Elaine Bortoleti de Araújo, Gerente adjunta para a Garantia da
Qualidade do CR e minha irmã, pelos ensinamentos, pela oportunidade de
compartilhar conhecimentos, pela força, paciência e carinho que sempre
obtive com sua presença.
• Ao Dr. Carlos Alberto Buchpiguel pela oportunidade e facilidades oferecidas
para a realização dessa dissertação.
*> Aos pesquisadores e técnicos do Centro de Radiofarmácia pela
oportunidade e facilidades concedidas.
*> A Dra. Emiko Muramoto, pelo apoio e colaboração fornecida na realização
da distribuição biológica em modelo animal.
• A farmacêutica Miriam Roseli Yoshie Okamoto do Centro de Medicina
Nuclear (FMUSP) pela colaboração fornecida na realização do reagente
liofilizado.
• A Dra. Sheila Siqueira da Divisão de Anatomia Patológica do Hospital das
Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo pela
realização das lâminas histológicas do tumor.
COMISSÃO HM-iO-VJ. Dc IH'.m', .VUCÜAR'SP- IP£«
• Aos demais pesquisadores, técnicos, bolsistas do IPEN que apoiaram
durante a realização deste trabalho.
• Aos colegas do Centro de Medicina Nuclear que apoiaram neste importante
momento profissional, em especial a meus amigos Leandro e Elci pela
força.
• Aos meus pais, pois sem eles em minha vida nada disso seria possível,
obrigado!
• Ao meu marido pela paciência, compreensão, apoio e estimulo, mesmo nos
momentos mais atribulados.
"Ü^ofim tudo dá certo, se não deu certo é porque ainda não cHegou ao fim." Ternando SaSino
PREPARO DO REAGENTE LIOFILIZADO HYNIC-[Tyr^l-OCTREOTATO E ESTUDO DE MARCAÇÃO COM TECNÉCIO-99m
Ivani Bortoleti Melo
RESUMO
O desenvolvimento de moléculas radiomarcadas com alta especificidade para um
órgão ou tumor tem contribuído para a obtenção de um diagnóstico de precisão
em medicina nuclear.Um caso particular são os peptídeos radiomarcados para a
localização de tumores neuroendócrinos como os derivados sintéticos da
somatostatina.Atualmente, o DTPA-octreotideo-" ^ In é o radiofármaco mais
utilizado com o propósito de visualizar tumores que expressem receptores para
somatostatina. Contudo, o uso do indio-111 como radionuclídeo oferece
limitações em relação a sua disponibilidade (produto de ciclotrón), suas
características físicas como meia-vida (67 horas) e emissor de fótons de média
energia (171 keV e 245 keV) que não favorecem a obtenção de imagens tipo
SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography). As propriedades físicas
favoráveis do tecnécio-99m (^^'"Tc) fazem dele o radioisótopo mais adequado
para substituir o indio-111 ("""in) na marcação desses peptídeos. Este trabalho
avaliou a preparação e marcação do reagente liofilizado HYNIC-Tyr^-octreotato
(HYNIC-octreotato) com ^^'"Tc, baseado em metodologia descrita na literatura,
utilizando tricina e EDDA (ácido etilenodiaminadiacetico) como coligantes. Foram
estudados os parâmetros de marcação (tempo de incubação, temperatura,
volume e atividade do pertecnetato de sódio) e estabilidade do liofilizado.
Adicionalmente, estudou-se a influência de pré-congelamento com nitrogênio (N2)
líquido na estabilidade do liofilizado, bem como a influência de manitol na pureza
radioquímica e biodistribuição do complexo. Os estudos de estabilidade revelaram
que o método de liofilização utilizado, empregando o pré-congelamento com
nitrogênio líquido possibilitou a obtenção de um reagente liofilizado com
estabilidade de 4 meses quando armazenado sob refrigeração. A estabilidade do
reagente liofilizado obtido sem pré-congelamento com nitrogênio líquido foi
semelhante à obtida com o pré-congelamento.Os estudos de marcações
determinaram as melhores condições de marcação, para as quais se obteve
pureza radioquímica maior que 90%.A presença de manitol na formulação não
influenciou na formação do complexo HYNIC-Octreotato-^^'^Tc, conforme
avaliação realizada por CLAE e estudos cintilográficos de distribuição do
composto em coelhos.Estudos de biodistribuição invasivos realizados em
camundongos Nude com tumor (células AR42J de tumor pancreático) e
camundongos Swiss normais, bem como estudos cintilográficos realizados em
coelhos e camundongos Nude revelaram cinética de distribuição rápida, acúmulo
renal e captação tumoral significativa do peptídeo radiomarcado. Os resultados
dos estudos de marcação com ^^""Tc, produção de reagente liofilizado e
biodistribuição sugerem que o radiofármaco HYNIC-octreotato-^^'^Tc apresenta
potencial para aplicação em diagnóstico de tumores neuroendócrinos em
medicina nuclear.
COMISSÃO ^iA.cinft^L DF E N . Ç , W \ NUCIJ ; / Í \ 'SP- ÍPÇ^
PREPARATION OF LYOPHILIZED KIT OF HYNIC-[Tyr^]-OCTREOTATE AND LABELING STUDIES WITH 99m-TECHNETIUM
Ivani Bortoleti Melo
ABSTRACT
The development of radiolabeled molecules with high specificity for an organ or
tumor has been contributed to the precise diagnostic in nuclear medicine.
Somatostatin labeled derivatives constitutes a particular example of labeled
peptide applied in the localization of neuroendocrine tumors. Nowadays, the " ^ In -
DTPA-octreotideo is the radiopharmaceutical applied in diagnostic procedures for
the visualization of tumors with high expression of somatostatin receptors.
However, the 111-indium is a radionuclide that presents some limitations related to
availability (cyclotron production), half-life (67 hours) and the emission of medium
energy photons (171 keV e 245 keV), not favorable to the acquisition of images in
SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography). The favorable physical
properties of the 99m-technetium (^^"^Tc) make this radionuclide the more
favorable to substitute the 111-indium on peptide labeling procedures. This work
studied the preparation and labeling of a lyophilized kit of HYNIC-Tyr^-octreotate
(HYNIC-octreotate) with ^^'"Tc, base on previously described procedures and
using tricine and EDDA (ethylendiaminediacetic acid) as coligands. It was studied
the labeling parameters (incubation time, temperature, volume and perthecnetate
activity) and the stability of the lyophilized preparation. Additionally, it was studied
the influence of the pre-freezing using liquid nitrogen in the stability of the
lyophilized preparation, as well as the influence of manitol in the labeling yield and
biological distribution of the complex. The stability studies showed that the
lyophilization using liquid nitrogen pre-freezing resulted in a lyophilized preparation
with stability over 4 month when stored under refrigeration. The stability of the
lyophilized preparation obtained without liquid nitrogen pre-freezing was
similar.The labeling studies determined the best labeling conditions, resulting in a
radiochemical yield superior than 90%. The use of manitol in the formulation did
not influence the formation of the complex ^^'"Tc-HYNIC-Octreotate, as evidenced
in HPLC and in tlie scintigraphic studies of the complex biodisthbution in rabbits.
Invasive biodisthbution studies using xenographed Nude mice (pancreatic tumor
cells AR42J) and healthy Swiss mice, and scintigraphic studies in rabbits showed
the fast kinetic disthbution, renal uptake and significative tumoral uptake of the
labeled peptide. The results of labeling studies with ^^""Tc, the production of the
lyophilized kit and the biodisthbution studies suggest that the ^^""Tc-HYNIC-
Octreotate is a potential radiopharmaceutical to be applied in the diagnostic of
neuroendocrine tumors in nuclear medicine.
SUMÁRIO Página
2 y Radiofármacosbaseados em peptídeos análogos da somatostatina
3.7.1 Somatostatina endógenas e análogos sintéticos 44
3.7.2 Análogos da somatostatina radiomarcados 46
3.7.3 Receptores para somatostatina 52
3.7.4 Tratamento de tumores neuroendócrinos com análogos da somatostatina radiomarcados
4 . MATERIAIS E MÉTODOS 56
4.1 Infra-estrutura e equipamento 56
1 . INTRODUÇÃO 21
2 . OBJETIVO 25
3 . REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 26
3.1 Medicina Nuclear e Radiofarmácia 26
3.2 Radiofármacos 26
3.3 O elemento tecnécio-99m 28
3.4 Determinação da pureza radioquímica de radiofármacos 32
3.5 Radiofármacos peptídicos 35
3.6 Marcação de peptídeo com ^^""Tc 39
SUMÁRIO Página
. „ o Fracionamento do peptídeo HYNIC-Tyr^-octreotato ( HYNIC- C Q "^•2-^ octreotato)
4.3 Métodos 60
4.3.1 Marcação do peptídeo HYNIC-octreotato com ^^""Tc 60
4.3.2 Determinação da pureza radioquímica 61
4.3.3 Estudo de variação do pH 63
. o /I Estudo da influência do manitol na marcação do HYNIC-octreotato
com^^nc
4.1.1 Reagentes e Soluções
4.1.2 Equipamentos
4.1.3 Outros 58
4.1.4 Animais 58
4.2 Preparo de Soluções 58
4.2.1 Tampão fosfato 0,2M pH6,2 58
4.2.2 Tampão citrato 0,1 M pH 5,0 59
4.2.3 Solução de NaOH 0,1 N 59
4.2.4 Solução de acetato de amónia 0,1 N 59
4.2.5 Solução de ácido clorídrico (HCI) 0,1 N 59
SUMARIO Página
4.3.5 Elaboração do reagente liofilizado de HYNIC- octreotato 64
4.3.6 Estabilidade do reagente liofilizado HYNIC- octreotato 66
4.3.7 Estudo das variáveis de marcação do reagente liofilizado HYNIC-octreotato 66
4.3.8 Obtenção de modelo tumoral animal 67
4.3.9 Estudo da distribuição biológica do HYNIC- octreotato-^^'^Tc em animais de laboratório 67
4.3.10 Estudo cintilográfico do HYNIC-octreotato-^^""10 69
5 . RESULTADOS 70
5.1 Marcação do peptídeo HYNIC-octreotato com ^^"^Tc - estudo da influência do pH 70
5.2 Marcação do peptídeo HYNIC-Octreotato com ^^""Tc - estudo da influência do manitol 71
5.3 Avaliação da estabilidade do reagente liofilizado HYNIC-octreotato
5.3.1 Estabilidade do reagente liofilizado HYNIC-octreotato (1° lote) com pré-congelamento em nitrogênio líquido
5.3.2 Estabilidade do reagente liofilizado de HYNIC-octreotato (2°lote) sem pré-congelamento em nitrogênio liquido 80
5.4 Estudo das variáveis de marcação do reagente liofilizado de HYNIC-octreotato 80
COMJSSÃO ^-IKmM DE '¿>iE'i^ NUO-EA.R.'SP-íPtíii
i
SUMÁRIO Página
5.4.1 Avaliação da atividade do pertecnetato de sódio (Na^ '"Tc04) 81
5.4.2 Avaliação do volume do pertecnetato de sódio (Na^^'^Tc04) 81
5.4.3 Avaliação do tempo de reação 82
5.5 Modelo tumoral de células AR-42J em camundongos Nude 83
5.6 Estudo da distribuição biológica do HYNIC-octreotato-^^'^Tc em animais de laboratório 85
5.7 Cintilografia utilizando o reagente liofilizado de HYNIC-octreotato para pronta marcação com tecnécio-99m em camundongos Nude com tumor de células AR42J (Tumor pancreático de ratos) 89
6. DISCUSSÃO 91
7. CONCLUSÃO 97
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 98
LISTA DE TABELAS Página
1 Especificações do eluído de gerador de ^^IVIo-^ ' Tc 32
2 Características de diferentes radionuclídeos utilizados na
marcação de peptídeos em diagnóstico 36
3 Sistemas Peptídeos-Receptor específicos 37
4 Acurada do Octreotídeo-DTPA-''"In em estudo multicêntrico 48
5 Biodistribuição em camundongos Nude do HYNIC-Octreotídeo
marcado com ^^""Tc, utilizando diferentes coligantes em
comparação com o "^In-Octreotídeo 51
6 Resumo das características de radiofármacos análogos da
somatostatina utilizados em terapia 55
7 CCD em ITC-SG: Rf* das espécies radioquímicas para as
diferentes fases móveis utilizadas no controle radioquímico da
marcação de HYNIC-octreotato com ^^""Tc 62
8 Condições do gradiente empregado na CLAE utilizada na
avaliação da pureza radioquímica da marcação de HYNIC-
octreotato com ^^'"Tc 63
LISTA DE TABELAS Página
Pureza radioquímica da marcação do HYNIC-octreotato com
^^""Tc utilizando-se CCD em ITLC-SG: influência do pH 70
10 Determinação das impurezas radioquímicas identificadas na
marcação do HYNIC-octreotato com ^^"^Tc 1 hora após marcação
utilizando CCD em ITLC-SG 70
ii Determinação das impurezas radioquímicas identificadas na
marcação do HYNIC-octreotato com ^^""Tc 3 horas após marcação
utilizando CCD em ITLC-SG 71
12 Pureza radioquímica da marcação do Octreotato-HYNIC com
^^""Tc utilizando-se CCD em ITLC-SG 1 e 3 horas após a
marcação: influência do manitol 71
13 Demostração dos tempos de retenção obtidos no perfil CLAE
(Figura 14) para o composto HYNIC-octreotato-^®"^Tc sem adição
de manitol 1 hora após marcação 72
14 Demostração dos tempos de retenção obtidos no perfil CLAE
(Figura 15) para o composto HYNIC-octreotato-^^'^Tc com adição
de manitol 1 hora após marcação 73
15 Demostração dos tempos de retenção obtidos no perfil CLAE
(Figura 16) para o composto HYNIC-octreotato-^^'^Tc sem adição
de manitol 3 horas após marcação 74
LISTA DE TABELAS Página
16 Demostração dos tempos de retenção obtidos no perfil CLAE
(Figura 17) para o composto HYNIC-octreotato-^^'^Tc com adição
de manitol 3 horas após marcação 75
17 Demostração dos tempos de retenção obtidos no perfil CLAE
(Figura 18) para o pertecnetato de sódio 76
18 Avaliação da estabilidade do regente liofilizado HYNIC-octreotato
com pré-congelamento em nitrogênio líquido armazenado em
temperatura 4/5°C. Avaliação da pureza radioquímica utilizando
CCD (ITLC-SG) 78
19 Demostração dos tempos de retenção obtidos no perfil CLAE
(Figura 21) para o composto HYNIC-octreotato-^^^'Tc 79
20 Determinação da estabilidade do reagente liofilizado de HYNIC-
octreotato sem pré-congelamento em nitrogênio líquido
armazenado em temperatura 4/5''C. Avaliação da pureza
radioquímica utilizando CCD (ITLC-SG) 80
21 Estudo da variação da atividade do Pertecnetato de sódio
(Na^^"'Tc04) na marcação do reagente liofilizado HYNIC-
octreotato 81
22 Estudo da variação do volume final do pertecnetato de sódio
(Na^^"'Tc04) na marcação do reagente liofilizado HYNIC-
octreotato 82
LISTA DE TABELAS Página
23 Estudo das condições de reação do reagente liofilizado HYNIC-
octreotato 83
24 Porcentagem de distribuição dose/órgão-tecido do peptídeo
radiomarcado HYNIC-octreotato-^^""Tc em camundongos Nude
com adenocarcinoma pancreático 86
25 Porcentagem de distribuição dose/grama órgão-tecido do
peptídeo radiomarcado HYNIC-octreotato-^^'^Tc em camundongos
nude com adenocarcinoma pancreático 87
26 Porcentagem de distribuição dose/órgão ou tecido do peptídeo
radiomarcado HYNIC-octreotato-^^'^Tc em camundongos Swiss
normais 88
27 Porcentagem de distribuição dose/grama de órgão ou tecido do
peptídeo radiomarcado HYNIC-octreotato-^^^^Tc em camundongos
Swiss normais 89
LISTA DE FIGURAS Página
(A) Gerador de molibdênio-99/tecnécio-99m (produzido pelo IPEN-CNEN/SP (B) Esquema simplificado de um gerador molibdênio-99/tecnécio-99m 30
Radiomarcação direta do peptídeo com ^^""Tc 40
Marcação do peptídeo com ^^""Tc via quelante pré-marcado 41
Marcação indireta do peptldeo com ^^'"Tc via agente quelante bifuncional 41
(A) Esquema da estrutura Peptídeo-HYNIC-^^'^Tc (B) Esquema estrutura Peptídeo-HYNIC-tricina-^^'^Tc; (0) Esquema Peptídeo-HYNIC-EDDA-^^'^Tc 42
Três possibilidades de ligação do coligante EDDA ao complexo Peptídeo-HYNIC^'^Tc
Imagens cintilográficas em ratos Wistar normais (posição supina), 4 horas após a injeção de ROÍ 60-^^""Tc utilizando diferentes tipos de coligantes: EDDA,
i * * * EtzEDDA*, EDTA, BzEDTA**, tricina, e tricina/NA* (da direita para esquerda) Diferenças na biodistribuição do complexo radiomarcado 44
8 Composição de aminoácidos da Somatostatina-14 e 28 45
9 Composição de aminoácidos do Octreotídeo 45
10 Análogos sintéticos da somatostatina. De cima para baixo: lanreotídeo, RC-160, octreotato-Tyr^ e depreotide (P829) 46
11 Representação da estrutura do octreotídeo-Tyr^-^^^l 47
LISTA DE FIGURAS Página
12 Representação da estrutura do análogo octreotídeo-DTPA 47
13 Esquema de Internallzação do sistema receptor-peptídeo radiomarcado ( Kaitsas et al.20O1) 53
14 Perfil de CLAE para o composto HYNIC-octreotato-^^""Tc sem adição de manitol 1 hora após marcação 72
15 Perfil de CLAE para o composto HYNIC-octreotato-^^^^Tc com adição de manitol 1 hora após marcação 73
16 Perfil de CLAE para o composto HYNIC-octreotato-^^'^Tc sem adição de manitol 3 horas após marcação -^^
17 Perfil de CLAE para o composto HYNIC-octreotato-^^'^Tc com adição de manitol 3 horas após marcação 75
18 Perfil de CLAE para o pertecnetato de sódio 76
19 Imagem cintilográfica de coelhos em posição decúbito ventral 1, 3 e 4 horas pós injeção intra-venosa do HYNIC-octreotato-^^'^Tc com manitol em sua composição final 77
20 Imagem cintilográfica de coelhos em posição decúbito-ventral 30 minutos, lhora, 3horas e 4 horas pós injeção intra-venosa do HYNIC-octreotato-^^'^Tc sem manitol em sua composição final 77
21 Perfil de CLAE da marcação do reagente liofilizado de HYNIC-octreotato após período de armazenamento de 5 meses da preparação liofilizada 79
LISTA DE FIGURAS Página
24 Neoplasia indiferenciada, com alta celularidade, composta por células epitelióides e fusiformes, sem arranjo característico e com estroma escasso, formando blocos sólidos e ocupando o tecido celular subcutâneo (lâmina 100x) 84
25 Neoplasia indiferenciada composta por células predominantemente epitelióides, coesas, com núcleos grandes, pleomórficos, com nucléolos evidentes e citoplasma amplo, eosinofílíco (lâmina 400x) 85
26 Imagens cintilográficas de camundongo Nude com massa tumoral implantada em dorso.Imagens realizadas 3 horas após a injeção do HYNIC-octreotato-^^'^Tc 90
22 Linhagem utilizada de camundongos Nude mantidos em bioterio provido de barreiras isoladoras (controle de contaminação de agentes patógenos e condições adequadas para o desenvolvimento do modelo tumoral); (B) Inoculação de células tumorais AR42J em dorso do camundongo nude 83
23 Camundongo Nude com tumor em região dorsal de aproximadamente 1 centímetro após 20 dias com retirada da massa tumoral para análise histológica 84
21
1. INTRODUÇÃO
Atualmente a medicina dispõe de métodos que permitem que determinadas
doenças sejam diagnosticadas antes que se manifestem fisicamente no homem.
O sucesso do diagnóstico de precisão teve como contribuição o desenvolvimento
na Medicina Nuclear de biomoléculas marcadas com alta especificidade para um
órgão. Por meio de cintilografias, são realizadas imagens dos sítios que
expressam receptores específicos para as biomoléculas em questão, minimizando
por outra parte, a exposição a outros órgãos (Obenaus et al. 1999).
Um caso particular são os peptídeos radiomarcados, utilizados em diversas
áreas de interesse, como oncologia, neurologia, cardiologia, na pesquisa de focos
de infecção/inflamação e na pesquisa de trombose/aterosclerose. A aplicação em
oncologia, para diagnóstico e tratamento de tumores específicos, representa, sem
dúvida, a área mais estudada, com maior número de radiofármacos
desenvolvidos, alguns dos quais comercialmente disponíveis (Signore et al. 2001).
As células tumorais, apesar de seu aparente metabolismo e crescimento
descontrolados, são na verdade moduladas por vários peptídeos endógenos,
incluindo inúmeros hormônios e fatores de crescimento que interagem com
receptores na superfície do tumor. Entre esses peptídeos estão a somatostatina
(SM), peptídeo intestinal vasoativo (VIP), fator de necrose tumoral e fator de
angiogênese (Thrall e Ziessman, 2001).
Dentre os peptídeos endógenos investigados a SM é o mais amplamente
estudado. A SM é um hormônio peptídico cíclico que consiste de 14 ou 28
aminoácidos e com uma meia-vida plasmática muito curta, aproximadamente 3
minutos. Receptores para SM (sstr) são encontrados em diversos tecidos normais
e em tumores neuroendócrinos (NETs), tais como os tumores
gastroenteropancreáticos (GEP) e carcinóides. Os tumores neuroendócrinos
podem apresentar uma concentração de sstr até 1000 vezes maior do que as
células normais (Obenaus et al 1999).
Estudos moleculares revelaram a existência de 5 diferentes subtipos de
receptores para SM que estão estruturalmente relacionados à glicoproteínas de
23
membrana (proteína G). (Gottschall<; et al. 1996, Breeman et al. 2001, Seregnl et al.
1998). Dos cinco subtipos de receptores, o sstr2 e sstr5 são os mais expressos
nos NETs, contudo devemos considerar que os receptores variam em diferentes
tipos de tumores ( Kaitsas e Papadogias et al.2005).
A SM natural tem afinidade por todos os cinco tipos de receptores, porém
os análogos artificiais têm mais afinidade por alguns subtipos do que por outros
(Decristoforo and Stephen, 1999).
Tumores neuroendócrinos são raros. A incidência estimada é de 1,5 a cada
100.000 habitantes e representam 2% de todos os tumores malignos do sistema
gastrointestinal. Geralmente possuem um crescimento lento (Gnanasegaran et al.
2005). O diagnóstico precoce de tais tumores é de extrema importância para
condução e sucesso do tratamento.
A utilização da SM marcada em medicina nuclear, com o objetivo de
localizar e tratar esses tumores levou à síntese e utilização, a partir dos anos 80,
de análogos sintéticos que apresentassem uma meia-vida plasmática maior,
superando a degradação enzimática sofrida pela SM natural (Breeman et al. 2001
e Decristoforo et al, (a) 1999).
O primeiro análogo conhecido foi o octreotídeo, que possui 8 aminoácidos e
uma meia-vida plasmática de 2 a 3 horas. Outros análogos com meia-vida ainda
maior também foram desenvolvidos, como o Tyr^-octreotato, lanreotideo, Tyr^-
octreotideo e RC160 (Decristoforo et al (a) 1999).
O primeiro estudo clínico utilizando um análogo da SM foi realizado com
Tyr^-octreotídeo-^^^l. Após alguns resultados iniciais, o traçador revelou alguns
problemas que influenciaram em sua aplicabilidade na prática clínica. Os maiores
obstáculos foram a marcação complicada do radiofármaco, a disponibilidade
limitada , o alto custo do radionuclídeo e a atividade intestinal alta do
radiotraçador que se deve ao seu clareamento hepato-biliar (Kreening et al.1992).
Consequentemente, um novo traçador foi desenvolvido ligando-se o agente
quelante bifuncional, ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA), ao octreotídeo,
resultando no DTPA-octreotídeo marcado com indio-111 (Octreoscan-''"ln ®)
(Seregni et al. 1998). Hoje, a cintilografia com Octreoscan-^^ln é considerada
uma poderosa técnica não invasiva na localização e estadiamento dos tumores
COMISSÃO MAaOHM OE E N E » íUCLE. ^S?-iPE^^
23
neuroendócrinos. Contudo, sua aplicação ampla no diagnóstico oncológico é
restrita pelo seu custo alto e disponibilidade limitada. O "^In é produto de ciclotrón
e esse isótopo apresenta características físicas não favoráveis para a aplicação
clínica, ou seja, meia-vida física de 67 horas e emissão de fótons de média
energia (171 keV e 247 keV), resultando em imagens com pouca resolução e uma
alta dose de radiação ao paciente (Maina et al. 2002).
Por outro lado, estudos recentes mostram que a utilização do ^^'"Tc como
radionuclídeo ligado às SM sintéticas promove melhor viabilidade de estudo, uma
vez que o ^^"^Tc pode ser obtido diariamente por meio da eluição dos geradores
de ^^Mo-^^'^Tc. O radionuclíedo possui meia-vida física relativamente curta (6
horas) e uma emissão gama principal de 140 keV, ideal para reproduzir imagens
cintilográficas em Medicina Nuclear (Maina et al. 2002 e Guggenberg et al. 2003).
A alta sensibilidade das SM marcadas com ^^"^Tc em detectar tumores
receptor-positivos, combinada com uma radiação de fundo baixa e difusa no trato
gastrointestinal e vascular, resulta na obtenção de imagens de melhor qualidade
quando comparadas com as imagens que utilizam "^ In . Contudo, a alta atividade
renal pode impedir que tumores sejam localizados em imagens imediatas dessa
área, mas leva-se em consideração que raramente a região renal é sitio de
metástases dos tumores avaliados (Gabriel et al. 2003).
Vários análogos sintéticos de SM foram radiomarcados utilizando-se
diferentes radionuclídeos e agentes quelantes bifuncionais. A afinidade destes
radiofármacos pelos tumores mostraram-se dependente da estrutura do próprio
peptídeo, mas também do tipo de agente quelante utilizado e do radionuclídeo
empregado (Obenaus et al.1999; Maina et al.2002; Decristoforo et al.2000). Uma
evidência recente assinala uma propriedade superior de localização do tumor com
o Tyr^-octreotato quando comparado ao Tyr^-octreotídeo, mesmo carregando
metais quelantes idênticos (Maina et al. 2002 e Breeman et al. 2001).
Atualmente, somente um análogo sintético da SM conhecido como P829 ou
depreotide-^^'^Tc (NeoTec®), tem sido comercializado e introduzido na prática
clínica no exterior. Contudo, este composto não tem propriedades de imagens
similares ao Octreoscan-"^ln, mostrando-se não eficiente no diagnóstico de
tumores endócrinos, mas suficiente para o diagnóstico de câncer de pulmão de
24
pequenas-células (Guggenberg et al. 2004).
A marcação de análogos de SM com tecnécio-99m utilizando-se o agente
quelante bifuncional HYNIC (hidrazinonicotinamida) ligado ao peptídeo no N-
terminal, já foi amplamente estudada. Tal grupo quelante não preenche todos os
sítios de ligação do ^^'^Tc (ocupa somente dois sítios de coordenação), sendo
necessário utilizar coligantes como glucoheptonato, tricina, ácido etilenodiamino
diacético (EDDA), sozinhos ou em combinação, tais como, tricina/fosfina ou
tricina/EDDA para satisfazer essas ligações (Liu et al., 2002 e Lui et al., 1998). A
escolha do coligante é importante, pois influencia na hidrofilicidade e estabilidade
do complexo (Hubalewska-Dydejczyk et al. 2006).
Dentre os análogos de SM marcados com tecnécio-99m utilizando-se o
grupamento quelante HYNIC, encontra-se o HYNIC-Tyr^-octreotato que mostrou
propriedades favoráveis para visualização de NETs com vantagens sobre outros
análogos, a saber: alta captação tumoral, rápido clareamento sanguíneo e baixa
captação residual na região abdominal,o que facilita a visualização dos tumores
(Maina et al. 2002; Dydejczyk et al.2006; Nikolopoulou et al.2005).
O desenvolvimento de uma formulação liofilizada HYNIC-Tyr^-octreotato,
que possibilite a comercialização para pronta marcação com tecnécio-99m no
próprio serviço de medicina nuclear, promoveria o desenvolvimento de novos
protocolos clínicos para diagnóstico de tumores neuroendócrinos. A aplicação
rotineira deste peptídeo radiomarcado representaria a viabilização do diagnóstico
de tumores neuroendócrinos em Medicina Nuclear, com custo reduzido e melhor
resolução de imagem quando comparado ao radiofármaco atualmente disponível
Octreoscan-"'' ln.
25
2. OBJETIVO
Desenvolver o reagente liofilizado HYNIC-Tyr^^-Octreotato para marcação
com tecnécio-99m, com estabilidade e pureza radioquímica para a aplicação
clínica rotineira no diagnóstico de tumores neuroendócrinos. Estabelecer as
melhores condições para essa marcação e estudar sua biodistribuição em modelo
animal.
26
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Medicina Nuclear e a radiofarmácia
A Medicina Nuclear é a especialidade médica que utiliza as propriedades
nucleares de compostos radioativos para realizar avaliações diagnosticas e
terapêuticas.
O processo de obtenção de imagens ou exames de cintilografia resume-se
em administrar ao paciente um radiofármaco específico, que se concentrará em
um órgão alvo e emitirá fótons que serão detectados por um equipamento
(Gama-câmara), fornecendo informações anatômicas e principalmente funcionais
através de imagens estáticas ou tomográficas (SPECT - Single Photon Emisson
Computed Tomography-Tomografia por Emissão de Fóton Único).
3.2 Radiofármacos
Radiofármacos são substâncias que por sua forma farmacêutica,
quantidade e qualidade de radiação, podem ser utilizadas no diagnóstico e
tratamento de enfermidades dos seres vivos, qualquer que seja a vía de
administração empregada (Carvalho, 2007).
Os radiofármacos são compostos sem ação farmacológica, que têm na sua
composição um radionuclídeo, e são utilizados em Medicina Nuclear para
diagnóstico e terapia de várias doenças. As características físico-químicas do
radiofármaco determinam a sua farmacocinética, isto é, a sua fixação no órgão
alvo, metabolização e eliminação do organismo, enquanto que as características
físicas do radionuclídeo determinam a aplicação do composto em diagnóstico ou
terapia (Oliveira et al. 2006).
Os radiofármacos utilizados para diagnóstico estão classificados em
radiofármacos de perfusão (ou V geração) e radiofármacos específicos (ou 2^
geração). Os radiofármacos de perfusão são transportados no sangue e atingem
o órgão alvo na proporção do fluxo sanguíneo. Não têm locais específicos de
ligação e pensa-se que são distribuídos de acordo com tamanho e carga do
27
composto. Os radiofármacos específicos são direcionados por moléculas
biologicamente ativas, como, por exemplo, anticorpos e peptídeos, que se ligam a
receptores celulares ou são transportados para o interior de determinadas células.
A capacidade da biomolécula reconhecer os receptores vai determinar a fixação
do radiofármaco no tecido pretendido e não deverá ser alterada com a
incorporação do radionuclídeo. Os radiofármacos específicos são classificados de
acordo com o receptor ou o alvo específico. Os radiofármacos desenvolvidos para
se ligarem a receptores têm como objetivo detectar alterações na concentração
dos mesmos em tecidos biológicos, especificamente em tecidos tumorais para os
quais a expressão dos receptores se encontra alterada significativamente pela
diferenciação celular (Oliveira et al. 2006).
São vários os fatores que influenciam na interação dos radiofármacos com
os receptores (Vallabhajosula, 2001):
o Depuração plasmática: os compostos para ligação aos receptores (peptídeos,
esferoides, neurotransmissores) são de baixo peso molecular e eliminados
rapidamente da corrente sangüínea;
• Atividade específica: é necessária elevada atividade específica
(atividade/massa do ligante), uma vez que os receptores apresentam baixa
concentração, de modo a evitar a sua saturação com moléculas do ligante não
marcadas;
• Afinidade e Especificidade: o radiofármaco deve ter elevada afinidade para
determinado receptor e muito pouca afinidade para os restantes. Este fato é
muito importante, pois as concentrações de radiofármaco e receptores são
baixas, devendo haver ligação suficientemente forte para a realização da
aplicação clínica;
• Estabilidade in vivo para que o radiofármaco alcance intacto o local alvo;
• Fluxo sanguíneo: a captação do radiofármaco depende do fluxo sanguíneo,
perfusão tecidual, permeabilidade capilar e capacidade de difusão.
Dos radiofármacos utilizados para diagnóstico, os que contêm na sua
composição ^^'"Tc representam cerca de 90% da totalidade. Este fato deve-se às
características físicas do ^^"^Tc: meia-vida física de 6,01 horas, emissão gama
com energia adequada ao detector (140 keV) e disponível em gerador de baixo
28
custo. A meia-vida física do ^^^^Tc é suficientemente longa para a preparação dos
radiofármacos, administração e aquisição das imagens e suficientemente curta
para minimizar a dose de radiação para o paciente (Oliveira et al. 2006).
Os radiofármacos de tecnécio são preparados pela adição de pertecnetato
de sódio (Na^^"^Tc04) a um reagente liofilizado {kit), que contém os componentes
necessários para preparare composto radioativo (Saha 1998):
• Composto químico a ser ligado ao radionuclídeo (responsável pela
biodistribuição do radiofármaco após a sua administração);
• Agente redutor para reduzir o pertecnetato (comumente o SnCb);
• Aditivos e agentes conservantes (agentes antimicrobianos, antioxidantes,
estabilizantes, entre outros).
A mistura dos diferentes componentes é fornecida num recipiente
adequado, na forma de liofilizado e em atmosfera de nitrogênio , gás inerte como
argônio ou vácuo, para sua correta conservação.
A preparação radiofarmacêutica conservar-se-á, após a marcação nas
condições necessárias, segundo cada caso, durante o seu prazo de validade.
Este prazo de validade é variável e deve ser detenninado experimentalmente,
indo desde os 30 minutos até as 6 horas, que normalmente se aceitam para os
radiofármacos marcados com ^^""Tc. Durante este período podem se retirar doses
sucessivas dos frascos, cada uma delas adequada para a administração (Oliveira
et al. 2006).
Após a marcação e antes da administração do radiofármaco de tecnécio, é
necessário realizar os ensaios adequados de controle de qualidade para
comprovar os requisitos de qualidade impostos para sua administração.
3.3 O elemento tecnécio-99m
Dos radioisótopos atualmente disponíveis, o tecnécio-99m tem, sem
dúvida, as melhores propriedades nucleares para a detecção em câmara de
cintilação. A meia-vida de 6,02 horas e ausência de emissão beta produz uma
29
baixa dose de radiação ao paciente. A emissão gama de 140 l<eV tem uma
penetração satisfatória nos tecidos (50 % são absorvidos em 4,6 cm de tecido) e,
além disso, a energia é suficientemente baixa para permitir uma boa colimação.O
molibdênio-99 (^^Mo) é produzido indiretamente pela irradiação do molibdênio-98
(^^Mo) por nêutrons ou como produto da fissão de ^^^U (Rocha A.F.G. e Harbert
J.C., 1979)
' 'Mo (n, Y)
^^Mo ft- ^^"^Tc Y '"Tc • •
140keV
235 U (n, fissão)
O método de produção do ^®Mo por reação (n,Y) resulta em uma baixa
atividade específica. Usualmente o '^Mo é produzido pela fissão do ^^^U (Thrall
J.H. e Ziessman H.A., 2001).
Como o ^'"^Tc é um radioisótopo produzido a partir do decaimento do
elemento ^^Mo, diz-se que o radioisótopo "pai" ( IVIo) dá origem ao "filho" (®^^Tc).
Uma vez obtido o ^^Mo, ele é empregado na preparação de sistemas de
geradores. Um sistema de gerador, para ser considerado de grande utilidade, tem
que apresentar certas propriedades básicas (Rocha A.F.G. e Harbert J.C., 1979):
• Deve produzir um isótopo "filho" com alta pureza química, radioquímica e
radionuclídica.
• Deve ser seguro e simples de manipular.
• Deve ser estéril e livre de pirogênio.
• O produto deve ser adequado para a preparação de radiofármacos.
• Deve ser capaz de fornecer separações múltiplas.
30
O gerador comercial de molibdênio-99/tecnécio-99m (^^Mo/^ ' Tc) é um
sistema composto por uma coluna cromatografica de óxido de aluminio ( A I 2 O 3 ) ,
onde é depositado o molibdato {^^MoOi^) que, via decaimento (3.', forma o ^ ""Tc
(Figura 1). Estas duas espécies apresentam diferentes afinidades pelo A I 2 O 3 ,
possibilitando que o ^ ""Tc seja coletado como anión tetraoxitecnetato hidratado
(pertecnetato, ^^"'Tc04), por eluição com solução fisiológica estéril, juntamente
com seu isómero ou carreador ^^Tc04' (Banerjje et al. 2001).
Solução Fisiológica
Coluna
99Mo adsorvido
Filtro
Frasco de cotete (vacuo)
B l i n d a g e m de c h u m b o
(B)
Figura 1. (A) Gerador de molibdênio-99/tecnéclo-99m (produzido pelo iPEN-
CNEN/SP (B) Esquema simplificado de um gerador molibdênio-99/tecnécio-
99m (Fonte: Adaptado FCF/USP)
O ^ " Tc é um metal de transição (pertence ao grupo 7 da Tabela Periódica)
e pode existir em 9 estados de oxidação (-1 a +7), o que lhe dá a possibilidade de
formar complexos de coordenação com numerosos agentes quelantes. A
coordenação de agentes quelantes ao ^^'"Tc é feita quando o metal se encontra
em estados de oxidação inferiores ao +7. A redução do metal, do estado de
IISSÀO flAriO;iAL ^iFW.«JClfAiVS?-fPEW
31
oxidação +7 para outros estados de oxidação, é realizada normalmente com
cloreto estanoso (Oliveira et al. 2006).
Após a eluição com solução salina (NaCI 0,9%), uma solução de
pertecnetato de sódio (Na^''^Tc04") é obtida. A USP (United States
Pharmacopeia) padroniza que no mínimo 95% do ''""Tc presente no eluato seja
no estado de oxidação +7 (porcentagem de pureza radioquímica). Apesar de tal
solução poder ser utilizada para fins diagnósticos, na maioria das aplicações
médicas, contudo, o ® ' Tc (+7) é reduzido a estados de oxidação inferiores de
modo a formar um complexo com um ligante específico, cuja biodistribuição é
definida por sua própria natureza, constituindo os chamados radiofármacos
essenciais (Carvalho,2007 e Thrall e Ziessman , 2001).
O único radioisótopo desejado no eluato do gerador ^^Mo/'^'^Tc é o ^^"^Tc.
Qualquer outro radionuclídeo presente na amostra é considerado como impureza
radionuclídica e é indesejável, pois resultará em dose extra de irradiação para o
paciente, sem benefício clínico.
O radioisótopo contaminante mais comum é o ^^Mo. O '^Tc, radionuclídeo
filho proveniente da transição isomérica do ^^'^Tc, não é considerado como
contaminante ou impureza. O '^Tc pode ser um problema do ponto de vista
químico nos procedimentos de marcação radioativa, mas não constitui um
problema do ponto de vista de irradiação ou de saúde, e não precisa ser
analisado como impureza radionuclídica. A meia-vida do ^^Tc é de 2,1x10^ anos e
decai para rutênio-99 (^®Ru), que é estável.
Os geradores passam por um controle de qualidade rigoroso antes de
serem entregues ao consumidor final, entretanto cada laboratório deve fazer seu
controle de qualidade em cada eluição (Thrall e Ziessman , 2001).
Além da pureza radioquímica e da pureza radionuclídica, outros
parâmetros devem ser avaliados no eluído de um gerador de ^^Mo-^^'^Tc para
atestar sua qualidade (Tabela 1) (Marques et al.2001).
32
Tabela 1. Especificações do eluído de gerador de ^^Mo-^ ' Tc (Fonte:
adaptado de Marques et al.2001)
Parâmetro USP* EP** Al EA***
Eficiência da eluição > 90 % 90-100% -
Pureza radionuclídica <0,15ijCi/mCi < 1,0 pCi/mCi -(^^Mo)
Pureza radioquímica > 95 % > 95% > 95%
Pureza química (Al <10 ppm <20 ppm < 10 ppm
pH 4 - 7 4 - 8 4 ,5 -7 ,5
* United States Pharmacopeia - USP 2007 ** European Pharmacopeia (Farmacopeia Européia) - 5^ edição *** Agência Internacional de Energia Atômica
A eficiência da eluição está associada à atividade esperada do radioisótopo
em cada eluição, levando-se em conta o decaimento do radioisótopo "pai". A
pureza radionuclídica está associada à quantidade de '^Mo em relação a cada
milicurie (mCi) de ®®" Tc. O aumento de ^^Mo resulta em maior exposição ao
paciente em detrimento da qualidade da imagem. A pureza radioquímica avalia a
quantidade de tecnécio hidrolisado o que resulta na diminuição da qualidade de
imagem e da marcação e aumento da dose de radiação. A pureza química
detecta a concentração de AP* que pode resultar na diminuição da qualidade de
imagem devido a problemas na marcação do radiofármaco (Marques et al.2001).
3.4 Determinação da pureza radioquímica de radiofármacos
A ligação do ^^'"Tc a diferentes substratos depende de inúmeros fatores,
(como a natureza do ligante, o pH do meio de marcação, entre outros) que
determinam o estado de oxidação que o elemento radioativo irá apresentar e a
estrutura do complexo resultante. Na marcação com ^^""Tc, assim como com
outros elementos radioativos, é imperativo determinar-se a pureza radioquímica
do radiofármaco resultante. Se, por exemplo, 5% da atividade de ^^""Tc
permanece livre na forma de pertecnetato de sódio, podemos dizer que a pureza
radioquímica é de 95%, assumindo que não há outras impurezas. Cada
radiofármaco tem uma pureza radioquímica específica e, segundo os requisitos
33
da USP ou da FDA (Food and Drug Administration), tipicamente superior ou igual
90% (Thrall e Ziessman, 2001)
As impurezas radioquímicas têm origem na decomposição dos
radiofármacos, devido à ação do solvente, temperatura, pH, luz, presença de
agentes oxidantes ou redutores, radiólise. No caso dos radiofármacos de ^®" Tc,
as impurezas mais comuns são ^^"^JCOA O U formas hidrolisadas de ^^'^Tc. Estas
impurezas podem aumentar a dose de radiação e interferir nas imagens de
diagnóstico (Thrall e Ziessman, 2001).
Alguns sistemas foram desenvolvidos para determinar a pureza
radioquímica. Existem várias técnicas cromatográficas que vão da mais simples
como a cromatografía em coluna e a cromatografía em camada delgada até as
mais sofisticadas e computadorizadas, como a cromatografía líquida de alta
eficiência (CLAE). De modo geral, entre os métodos modernos de análise, as
técnicas cromatográficas ocupam um lugar de destaque na química e bioquímica,
na pesquisa e na indústria, devido a sua facilidade em efetuar a separação,
identificação e quantificação das espécies químicas presentes em uma amostra,
mesmo em misturas muito complexas (Degani et al. 1998).
O ponto comum entre as várias técnicas cromatográficas existentes e que
caracteriza o método é o fato de os componentes da mistura ou amostra serem
distribuídos entre duas fases. A cromatografía é, portanto, um método físico-
químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da
distribuição destes componentes entre duas fases, que estão em contato íntimo.
Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra se move através dela.
Durante a passagem da fase móvel pela fase estacionária, os componentes da
mistura são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos
componentes é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em
migrações diferenciais destes componentes (UnB, 2008)
A cromatografia de adsorção baseia-se no grau de partição relativa dos
compostos, entre uma dada fase líquida móvel (eluente) e uma determinada fase
sólida estacionária, geralmente sílica gel ou alumina (AI2O3).
34
A cromatografia em camada delgada (CCD), um caso particular da
cromatografia de adsorção, tem várias aplicações importantes em química
orgânica, a saber: estabelecer se dois compostos são idênticos, verificar a pureza
de um composto (complexidade e muitas vezes a natureza), determinar o número
de componentes em uma mistura, determinar o solvente apropriado para
separação em uma coluna cromatografica, monitorar a separação de uma mistura
em uma coluna cromatografica ou acompanhar o progresso de uma reação. É um
método extremamente conveniente, pois é uma técnica rápida, reproduzível e
necessita apenas de uma quantidade muito pequena de amostra (1-100|ig)
(UnB, 2008).
O grande avanço na cromatografia em coluna foi o desenvolvimento e a
utilização de suportes com partículas diminutas responsáveis pela alta eficiência,
as quais tornam necessário o uso de bombas de alta pressão para a eluição da
fase móvel, devido a sua baixa permeabilidade (CLAE).
As fases móveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e
estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e
desgaseificadas antes do uso. A bomba deve proporcionar ao sistema vazão
contínua sem pulsos com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluição da fase
móvel a um fluxo adequado. As colunas utilizadas em CLAE são geralmente de
aço inoxidável, com diâmetro interno de 0,45 cm para separações analíticas e na
faixa de 2,2 cm para preparativas. O comprimento é variável, sendo comuns
colunas analíticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas
colunas são reutilizáveis, sendo empacotadas com suportes de alta resolução,
não sendo necessária sua regeneração após cada separação (Degani,1998).
A coluna é a parte principal do equipamento. Podemos reconhecê-la como
o "rim" do cromatógrafo. À medida que a amostra passa pela coluna, os
componentes vão se separando e, quando passam pelo detetor, são identificados
na forma de pico em um gráfico.
35
Na fase reversa, invertemos a polaridade da fase estacionária, ou seja,
usamos um material apolar como fase estacionária, como por exemplo as fases
Octadeciisilano (G18) e octiisilano (08).
A composição da fase móvel pode se dar de forma isocrática, a
composição do solvente não muda durante a corrida, ou na forma gradiente, onde
a composição do solvente varia durante a corrida.
3.5 Radiofármacos peptídicos
Peptídeos são elementos necessários em muitos processos biológicos
fundamentais, bem mais do que outras classes de moléculas. Eles estão
presentes em controles de funções celulares, comunicação intercelular, resposta
imune, entre outras atividades. Por exemplo, peptídeos funcionam como
hormônios, neurotransmissores, como fatores de inibição e crescimento celular
em tecidos normais e tumorais. Muitos tumores expressam receptores para
diferentes peptídeos, freqüentemente em alta densidade (Ginj e Maecke, 2008).
Por esses motivos, pequenos peptídeos sintéticos utilizados na detecção
de receptores são os agentes escolhidos para diagnóstico por imagem e
radioterapia de determinados cánceres devido sua favorável farmacocinética.
Técnicas de modificação molecular permitem a síntese de uma variedade de
peptídeos bioativos com grupos quelantes (necessários para ligação ao elemento
radioativo), sem o comprometimento das propriedades biológicas. Várias técnicas
foram desenvolvidas para efetuar com eficiência a marcação de sítios específicos
utilizando radionuclídeos como ^'""Tc, ^^^1, """in e ^^F. Entre os radionuclídeos, o
' ' ' "Tc apresenta propriedades físicas que favorecem a aquisição de imagens
cintilográficas (Tabela 2) (Okarvi, 2004).
36
Tabela 2. Características de diferentes radionuclídeos utilizados na
marcação de peptídeos em diagnóstico
PROPRIEDADES LIMITAÇÕES
Tecnécio-99m • Fácil disponibilidade e baixo
custo • Fácil manuseio • Razoável meia-vida de 6,01
horas • Emissão Y de 140 keV • Excelentes características
para imagem • Ausência de radiação o e |3 • Dosimetria favorável
Não é apropriado para realização de imagens em estudos tardios
lodo-123 • Emissão Y de 159 keV • Meia-vida de 13 horas • Boas características
imagem para
Alto custo Disponibilidade limitada Radionuclídeo produzido ciclotrón
em
lndio-111 • Emissão Y de 171 e 245 keV • Meia-vida de 2,8dias • Utilizado em imagens tardias
Alto custo Disponibilidade limitada Radionuclídeo produzido em ciclotrón Radiação relativamente alta para o paciente Características nucleares sub-ótimas
Cobre-64 « Emissão (3" (573keV) e (3 ©
(655keV) • Apropriado para imagens e •
radioterapia • Meia-vida de 12,7 dias • Pode ser obtido por ciclotrón
Disponibilidade limitada Alto custo na produção e despacho Características sub-ótimas para imagens PET devido a baixa abundância de p^(19%)
COMISSÃO '.nCi.:
37
PROPRIEDADES LIMITAÇÕES
Gálio-66-67-68 • Adequado para y cintilografias
e imagens PET e Meia-vidas: ®^Ga (9,5horas);
^^Ga (78,3horas) e ^^Ga (68 minutos)
• Boas características físicas
Alto custo Disponibilidade limitada Radionuclídeos jaroduzidos em ciclotrón ( ^^Ga e ^'Ga)
Fluor-18 • Pode ser produzido em
grandes quantidades (ex. Ci) Baixa energia positron de 0,635 MeV Alta sensibilidade e resolução Baixa dose de radiação ao paciente Meia-vida de 110 minutos permite a produção do radiofármaco e aquisição de imagens
Alto custo Disponibilidade limitada Radionuclídeo produzido ciclotrón
em
Vários receptores são super expressos em determinados tipos de tumores
e isto têm sido explorados para desenvolvimento de radiofármacos. A marcação
de peptídeos receptor-específicos possibilita a visualização dos tumores por meio
de cintilografia (Tabela 3) (Reubi et al. 1998 ; Breeman et al. 1996).
Tabela 3. Sistemas Peptídeos-Receptor específicos
RECEPTOR PARA: TIPOS DE TUMORES
• Somatostatina Tumores neuroendócrinos, câncer de pequenas células pulmonar, câncer medular de tireóide, vários tumores do sistema nervoso e linfoma
Peptídeo Instestinal adenocarcinomas (estômago, colon, Vasoativo ÍVIP^ pancreas, pulmão, etc), cancer de pequenas
^ ' células pulmonares, tumores neuroendócrinos e linfoma
38
RECEPTOR PARA: TIPOS DE TUMORES
o Colecistoquinina-B (CCK-B)
Câncer medular de tireóide, de pequenas células pulmonares, ovariano estremai, astrocitoma (potencialmente adenocarcinoma gastrointestinal e cánceres de estômago, cólon, pâncreas)
Colecistoquinina-A Tumores gastroenterohepáticos, meningiomas (CCK-A) e neuroblastomas
• Substância P Câncer medular de tireóide, de pequenas células pulmonares, tumores de mama, vasos peri e intra-tumoral
• Bombesina Câncer de pequenas células pulmonares, colonice e glioblastoma
• Neurotensina Câncer pancreático, prostático e de pequenas células pulmonares
• Hormônio liberador de gonadotrofina Câncer de mama e próstata
(GnRH)
Insulinoma, câncer medular de tireóide
Os peptídeos possuem grandes vantagens sobre as proteínas e anticorpos
na utilização como radiofármacos. Essas incluem: peso molecular menor; fácil
preparação; fácil marcação; várias técnicas de radiomarcação; tolerância em
misturas e modificações químicas; capacidade de se ligar a agentes quelantes
bifuncionais no C ou N-terminal do peptídeo; possibilidade de modificar a taxa e a
rota de excreção; rápido clareamento sanguíneo e de tecidos não alvos; elevada
razão entre o tumor e o tecido adjacente; alta penetração no tecido tumoral; baixa
toxicidade e imunogeniticidade; alta afinidade e especificidade por receptores
39
(Okarvi, 2004). Em contra partida, os anticorpos possuem alto peso molecular,
limitada marcação e baixa captação no órgão ou tecido alvo. Apresenta, também,
lento clareamento sanguíneo e como resultado, uma modesta razão alvo/tecido
adjacente (Ginj e Maecke, 2008).
Uma importante consideração em relação a um radiofármaco peptídico é a
sua estabilidade in vivo. Isto tem sido mostrado nos análogos da somatostatina.
Peptídeos possuem uma meia-vida biológica multo curta. Sofrem rápida
degradação no plasma por proteínas endógenas, daí a necessidade desses
peptídeos sofrerem alterações moleculares para inibir essa degradação
enzimática. Uma das formas é a substituição de bandas de aminoácidos desses
peptídeos e a ciclização (Okarví, 2004).
A solubilidade, estrutura e função dos peptídeos são características da
seqüência e composição de seus aminoácidos. A via e a taxa de excreção dos
peptídeos podem ser modificadas pela introdução de aminoácidos hidrofílicos ou
lipofílicos na cadeia peptídica sem alterar as suas propriedades de ligação aos
receptores específicos. Peptídeos lipofílicos são geralmente eliminados do corpo
por via hepatobiliar e peptídeos hidrofílicos por via renal. A ciclização dos
peptídeos pode ser usada para restringir a mobilidade de conformação e ganhar
afinidade por receptores e atividade biológica. Para evitar interferência da
radiomarcação com a região de ligação aos receptores, um espaço funcional
pode ser incorporado entre o sítio de ligação e o quelante escolhido (Okarvi,
2004).
3.6 Marcação de peptídeos com ' Tc
A marcação de peptídeos com ^^"^Tc pode se realizar de três maneiras: (i)
marcação direta, (ii) marcação indireta utilizando quelante bifuncional pré-
marcado e (iii) marcação indireta, utilizando quelante bifuncional previamente
acoplado ao peptídeo. Esses métodos possuem vantagens e limitações,
requerendo uma seleção de acordo com o tipo de peptídeo ou a natureza do
complexo-^^'^Tc.
40
A marcação direta envolve a quelação direta do ^^""Tc com os grupos-
sulfídricos do peptídeo (Figura 2). Durante a marcação direta, o agente redutor
converte as pontes dissuifídricas da cisteína em grupos tiol livres para a ligação
do ^^""Tc. A falta de controle sobre a ligação não especifica metal-quelante, além
do fato de tal método somente poder ser aplicado a peptídeos que possuam
pontes dissuifídricas, limita sua aplicabilidade. Além disto, a marcação direta
resulta em peptídeos com baixa estabilidade in vivo e essas pontes dissuifídricas
da cisteína são essenciais para a manutenção das propriedades biológicas das
proteínas. Apesar de tais restnções, o método tem sido aplicado na preparação
de muitos radiofármacos baseados em peptídeos (Gandomkar et al. 2003; Okarvi,
2004; Reneen 2000).
i Agente redutor T C O 4 "
D-Fhe^-Cys--Phe-'-t.í-Trp''-L>^^-Thr*-Cys'-'11a'*-ol
Figura 2. Radiomarcação direta do peptídeo com ^ ""Tc (Fonte: Adaptado de
Okarvi, 2004)
No método do quelante pré-marcado, a marcação química é bem definida e
facilmente controlada. O radionúclideo se liga primeiramente ao quelante e este
se liga posteriormente ao peptídeo. As múltiplas fases desta marcação fazem com
que esta aplicação seja inviável na rotina clinica (Figura 3) (Okarvi, 2004).
COMISSÃO DE EN- N'JCLEAPv'SP-lPE^ .
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Figura 3. Marcação do peptídeo com ^ " Tc via quelante N 2 S 2 pré-marcado
(Fonte: Adaptado de Okarvi,2004)
Na outra variante do método indireto, um agente quelante bifuncional é
ligado ao peptídeo durante sua síntese, para posteriormente ser marcado com
^^'"Tc (Figura 4) (Okarvi, 2004).
,0
o / ^ 0<v .N1Î I IN
1 C O
Tc
/ \
1 CO
S»mTc04-
N " o Otíefaçao S
CO-NH—(^ptideo) CO
.0
COO-NHS
I Peptiáeo-MHÍ |
Conjugação
,0
- C O - N H — ( p e p V i d e o )
Figura 4. Marcação indireta do peptídeo com ^ ""Tc via agente quelante N 2 S 2
bifuncional (Fonte: Adaptado de Okarvi, 2004)
42
Uma variedade de agentes quelantes bifuncionais (AQB) para marcação de
proteínas com tecnécio-99m foram desenvolvidos incluindo agentes do tipo
aminotiólicos (NnSn) ou tetraamínicos ( N 4 ) por exemplo: o mercaptoacetiltriglicina
(MAG3), mercaptoacetildiglicina (MAG2), diaminoditiol (DADT), etilenodicisteína
(EC), N 3 S e o grupamento hidrazinonicotinamida (HYNIC) (Okarvi,2004).
Desses AQB, o de maior interesse é o HYNIC devido a alta eficiência de
marcação a peptídeos e a formação de complexos hidrofílicos (Liu et al. 1998).
Outros AQB são utilizados para marcação de proteínas com radioisótopos
do tipo lantanídeos, por exemplo, o itrío-90 ('°Y) e lutécio-177 (^^''LU), sendo os
mais utilizados o anidrido cíclico do ácido etileno diamino pentacético (DTPA) e o
ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N"'-tetra acético (DOTA)
(Gnanasegaran et al. 2005).
Na marcação dos análogos da SM com ^^'"Tc os agentes quelantes
bifuncionais ligam-se ao peptídeo no N-terminal, servindo de sítio de marcação.
Como agente quelante, grupo HYNIC não pode sozinho, satisfazer todos os sítios
de ligação do ^^'"Tc, portanto são utilizados coligantes como glucoheptonato,
tricina, ácido etilenodiamino-N,N'-diacético (EDDA), sozinhos ou em combinação,
como por exemplo: tricina/fosfina ou tricina/EDDA, ácido
etilenodiamínotetraacético (EDTA) para satisfazer essas ligações (Figura 5)
(Decristoforo e Mather (b), 1999; Lui et al. 1998; Liu et al. 2002)
I NM
H NH N Si
CL
(A) (B) (C)
Figura 5. (A) Esquema da estrutura Peptídeo-HYNIC-^^'^Tc (B) Esquema
estrutura Peptídeo-HYNIC-tricina-^^NC; (C) Esquema Peptídeo-HYNIC-EDDA-
43
^ •"Tc (Fonte: adaptado de Liu et al. 1996; Liu et al. 1997)
O HYNIC mostrou-se promissor devido a sua característica monodentada
que favorece a utilização de vários coligantes levando a diferentes
biodistribuições dos peptídeos análogos (Storch et al. 2005).
A correta natureza da ligação do EDDA ao Peptídeo-HYNIC-'^'"Tc não é
muito clara. Existem algumas possibilidades descritas (Figura 6) (Liu et al.1997):
Peptídeo Peptídeo Peptídeo
H N ^ O M N ^ O H N ^ O
tftBis a-cl»
Figura 6. Três possibil idades de ligação do coligante EDDA ao complexo
Peptídeo-HYNIC-^^'^Tc (Fonte:Liu et al. 1996)
A localização do AQB e os diferentes tipos de coligantes na molécula do
peptídeo podem modificar sua farmacocinética (Figura 7). Para preservar a
afinidade de ligação do peptídeo, a ligação do AQB deve ser realizada em um
sítio distante da região de ligação do peptídeo com o receptor (Decristoforo e
Mather (b), 1999)
44
Figura 7. Imagens cintilográficas em ratos Wistar normais (posição supina),
4 horas após a injeção de RCIGO-^^'^Tc util izando diferentes t ipos de
coligantes: EDDA, EtaEDDA*, EDTA, BzEDTA**, tr icina, e tricina/NA*** (da
direita para esquerda) Diferenças na biodistribuição do complexo
radiomarcado. (Fonte: Decristoforo e Mather (b), 1999)
* ácido N,N'-dietiletilenodiaminodiacético
** ácido N-benziJetiienodiaminotriacético,
*** tricina - ácido nicotínico
Para uma imagem com ótima sensibilidade na detecção de tumores
receptor-positivos, deve-se combinar uma alta taxa de marcação desse tumor
com uma radiação de fundo baixa e para tumores localizados em região da pelvis
e abdome, espera-se uma baixa atividade no trato gastrointestinal e vascular
(Decristoforo e Mather (b), 1999).
3.7 Radiofármacos baseados em peptídeos análogos da somatostatina
3.7.1 Somatostatinas endógenas e análogos sintéticos
A Somatostatina é um neuropeptídeo cíclico de 14 ou 28 aminoácidos
(Figura 8) produzido pelo hipotálamo, hipófise, tronco cerebral, trato
gastrointestinal e pâncreas. Atua como neurotransmissor que inibe a formação de
peptídeos e a secreção de células neuroendócrinas. Fora do sistema nervoso
central sua atividade hormonal inclui a inibição da liberação de hormônio de
crescimento, insulina, glucagon, gastrina, serotonina e calcitonina. Tem também
efeito antiproliferativo em tumores e função moduladora da atividade imunológica
(Thrall e Ziessman, 2001).
45
Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH
Somatostatina-14
Ser-Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-l\/let-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys-Somatostatina-14
Somatostatina-28
Figura 8. Composição de aminoácidos da Somatostatina-14 e 28
A rápida degradação plasmática das somatostatinas endógenas constituía-
se num problema para sua utilização como fármacos. Para contornar este
problema, foram sintetizados vários análogos da somatostatina que passaram a
ter uma meia-vida plasmática maior. O primeiro análogo e até hoje utilizado foi o
octreotídeo, que apresenta uma cadeia com oito amino-ácidos (Figura 9).
D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol
Figura 9. Composição de aminoácidos do Octreotídeo
Na tentativa de desenvolver um análogo da somatostatina ideal, várias
modificações na estrutura desses peptídeos foram realizadas, indicando que
pequenas modificações na molécula podem acarretar em mudanças significativas
em sua biodistribuição (Figura 10) (Okarvi, 2004).
COMISSÃO i CiO ¡.*.L DE 5WE.««^, WLiCLÍA.R/if'-.'PEf"'
46
I I (i-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2
D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Trp-NH2
D-Phe-fcys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-(OH)
R-Tyr-(D-Trp)-Lys-Val-R-(-Dap)-Lys-Cys-Lys-amide.
Figura 10. Análogos sintéticos da somatostatina. De cima para baixo:
lanreotídeo, RC-160, Tyr^- octreotato e depreotide {P829)
3.7.2 Análogos da somatostatina radiomarcados
Na ultima década houve um espetacular crescimento no desenvolvimento
de pequenos peptídeos radiomarcados para uso em imagens cintilográficas com
alta afinidade por tumores receptor-associados. A evidente super-expressão de
receptores para somatostatina em tumores e metástases de origem
neuroendócrina e a rápida degradação plasmática tem promovido descobertas em
relação a esses análogos (Maina et al. 2002).
As imagens cintilográficas com análogos da somatostatina são indicadas
na localização de tumores primários e sítios metastáticos (estadiamento), detectar
progressão da doença, monitorar o desempenho cirúrgico, radio e químio terápico
e predizer a resposta terapêutica (selecionar pacientes receptor-positivos para
terapia com radionuclídeos) ( Bombardieri et al.2003).
O primeiro análogo da somatostatina utilizado na aquisição de imagens
cintilográficas foi Tyr^-octreotídeo. Por radiodação, o Phe^ do octreotídeo foi
substituído por um resíduo de Tyr. O Tyr^-octreotídeo-^"l (Figura 11) revelou
ótimas qualidades em imagens em vários tipos de tumores neuroendócrinos.
47
Contudo sua excreção hepato-biliar e o processo de radioiodação limitaram a sua
utilização (Okarvi, 2003).
I 1 D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol
123|l
Figura 11 - Representação da estrutura do octreotídeo-Tyr^-^^^l
Consequentemente, um novo radiofármaco foi desenvolvido ligando o
DTPA ao octreotídeo, resultando no DTPA-octreotídeo para marcação com ^^^In
(comercialmente conhecido como OctreoScan®) (Seregni et al. 1998).
Hoje, o uso do DTPA-octreotídeo-^^^In é considerado uma poderosa
técnica não invasiva na localização e estadiamento dos tumores neuroendócrinos
(Figura 12).
^^^In-DTPA-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol
Figura 12 - Representação da estrutura do análogo DTPA- octreotídeo-^In
O DTPA-octreotídeo-''"In é rapidamente clareado pelos rins. Apenas 2%
da atividade administrada sofre excreção hepatobiliar e 10% está presente na
circulação 4 horas após a administração. Este clareamento rápido aumenta a
relação de radioatividade alvo/não alvo. Captação fisiológica ocorre em glândula
tireóide, fígado, vesícula biliar, baço, rins e bexiga. Os rins retêm uma porção
considerável do composto e aparecem bastantes intensos mesmo em imagens
tardias (Thrall e Ziessman, 2001). A maior parte da captação renal se dá pela
reabsorção do peptídeo radiomarcado nas células tubulares após filtração
glomerular. No entanto, receptores para somatostatina são encontrados em célula
renal tubular e vasa recta (Kwekkeboom et al. 2000).
48
A acurácia do DTPA-Octreotídeo-^^ln para diferentes tumores
neuroendócrinos pode ser vista na tabela 4 (Thrall e Ziessman, 2001)
Tabela 4. Acurácia do Octreotídeo-DTPA-^^^ln em estudo multicêntrico
Tipo de tumor n° compatíveis de
diagnóstico/total de pacientes
Porcentagem
(%)
Carcinóide 190/237 80 Insulinoma 8/11 72 Gastrinoma 40/42 95
Glucagonoma 8/11 72 Carcinoma de Pequeñas células 2/2 100
Feocromocitomas 9/9 100 Paraganglioma 6/7 86
Carcinoma Medular da Tireóide 12/22 54 Vipoma 6/7 86
Adenoma de Hipófise 24/30 80
A ampia aplicação no diagnóstico oncológico do DTPA-octreotídeo-''"In é
restrita pelo seu alto custo e a limitada produção do "^In em ciclotrón, lembrando
também, das características físicas do "^In de ser um emissor de fótons de média
energia (171 keV, 247 keV), o que acarreta em imagens com pouca resolução e
uma alta dose de radiação ao paciente.
Como conseqüência, estudos recentes mostram que a utilização do ^^'"Tc
como radiotraçador ligado ás SM sintéticas promovem melhor viabilidade de
estudo, uma vez que o radioisótopo pode ser obtido diariamente por meio da
eluição dos geradores de ^^Mo-^^'^Tc, além de suas características físicas
favoráveis para reproduzir imagens de SPECT {Single Photon Ennission Computer
Tomography) em Medicina Nuclear (Maina et al. 2002; Guggenberg et al.2003).
Como resultado, nos últimos anos, vários análogos da somatostatina
surgiram carregando uma variedade de agentes quelantes em suas estruturas
para eficiente ligação ao ^^""Tc (Maina et al. 2002).
No inicio da década de 90, Maina e colaboradores (Maina et al. 1994)
estudaram um análogo da somatostatina marcado com ^^""Tc, o SDZ 219-387.
49
Este análogo é um derivado do octreotídeo e o sistema quelante bifuncional
utilizado foi o PnAO (propileno amina oxima tetradentado) acoplado no primeiro
aminoácido do octreotídeo (D-fenilalanina) vía ligação tiouréia. Este radiofámaco
apresentou rendimentos de marcação superiores a 90% e alta afinidade a
receptores de somatostatina, principalmente o sub-tipo 2. Entretanto, sua alta
lipofilicidade leva a urna maior porção de metabolização no fígado, o que
inviabiliza a análise de tumores e metástases da região abdominal.
Na seqüência, uma variedade de quelantes bifuncionais, já descritos
anteriormente, foram acoplados ao N-terminal do octapeptídeo servindo como
sitio de ligação ao ^^'"Tc. A utilização do HYNIC e de quelantes tetramínicos são
as mais identificadas em estudos publicados (Maina et al.2002; Gabriel et al.2004;
Storch et al.2005; Cwikia et al.2008).
Maina e colaboradores (Maina et al. 2002) avaliaram o N°4Tyr^ - octreotate
marcado com ^^"^Tc (Demotate-^^'^Tc), que difere do Tyr^-octreotate por carregar
no N-terminal uma cadeia tetraamínica aberta que serve como sitio de ligação do
^^'"Tc. Concluíram que o composto possuí várias vantagens combinadas, a saber:
alta afinidade pelos tumores e metástases, rápida marcação e clareamento
sanguíneo. Possui uma estabilidade pós marcado de 6 horas o que é importante
para a aplicabilidade clínica. O fato do Demotate-^^'^Tc resistir à degradação
enzimática é comprovado com a presença do composto intacto na urina de
animais injetados.
Outro estudo (Gabriel et al.2004) realizado em pacientes com tumores e
metástases de tumores neuroendócrinos já confirmados compara o Demotate-
^^'"Tc com o HYNIC-octreotídeo-^^'^Tc e identificou biodistribuição similar, com
clareamento sanguíneo mais rápido para o primeiro, o que pode inicialmente ser
considerada uma vantagem. Entretanto, o mesmo estudo identificou que lesões
hepáticas menores apresentaram visualização prejudicada com o Demotate-^^'^Tc,
em virtude, provavelmente, deste clareamento rápido.
50
O primeiro peptídeo radiomarcado com tecnécio registrado e
comercializado é o depreotideo-^^'"Tc (P829, NeoSpect®). Ele demonstrou bons
resultados na identificação de nodulos solitários em pacientes com cáncer de
pulmão de pequenas células. Em pacientes com tumores endocrinos, a taxa de
detecção foi baixa quando comparada com a utilização do Octreoscan-"^ln
(Storch et al. 2005).
Pesquisas estão sendo desenvolvidas sobre a formulação de um reagente
liofilizado para pronta marcação com tecnécio-99m utilizando o HYNIC-Try^"
octreotídeo. Estes estudos apresentam um reagente com grande qualidade e com
alta especificidade para identificar tecidos receptor-positivo para somatostatina.
Os coligantes escolhidos nestas formulações são o EDDA e a tricina (Guggenberg
et al.2004 e Vazquez-González et al.2006).
Estudos avaliaram o diagnóstico de tumores receptor-positivos para
somatostatina utilizando o Tyr^-octreotídeo-EDDA-HYNIC-^^'^Tc (HYNIC-
octreotídeo). Mostraram que o composto tem um rápido clareamento sanguíneo e
uma baixa captação em tecidos receptor-negativos. Mostraram ainda, que sua
excreção é predominantemente renal com pequeno acúmulo em região do trato
gastrointestinal (Decristoforo et al.2000; Maina et al.2002).
Estudo em modelo animal revela (Decristoforo et al.2000) que o HYNIC-
octreotídeo pode ser marcado com ^^'"Tc com alta atividade específica e com
pureza radioquímica superior a 90%. Apresenta rápido clareamento sanguíneo,
baixa captação em tecidos receptor-negativos e insignificante captação em região
gastrointestinal. A utilização de diferentes coligantes mostra importantes
diferenças em sua biodistribuição (Tabela 5 ) .
SI
Tabela 5. Biodistribuição em camundongos Nude do HYNIC-octreotídeo
marcado com ^^""Tc, uti l izando diferentes coligantes em comparação com o
"^In-Octreotídeo. Fonte: (Adaptado de: Decristoforo et al.2000).
Sitio HYNIC-
octreotídeo com EDDA
HYNIC-octreotídeo com
tricina
''^''tn-odreotídeo
Rins 4,71 ±1,38 14,57 ±3,42 22,12 ±6,53
Tumor 9,65 ±2,16 9,58 ±0,90 4,26 ± 1,00
Razão tumor/rins 2,05 0,66 0,19
Em outro estudo, também com modelo animal, comparou-se a
biodistribuição do EDDA-HYNIC-Try^-octreotato-^^'^Tc (HYNIC-octreotato) com o
EDDA-HYNIC-octreotídeo-^^nc (HYNIC-octretídeo) (Storch et al. 2005). Os
peptídeos marcados apresentaram um rápido clareamento sanguíneo com menos
de 0 ,1% da atividade injetada circulante após 4 horas de injeção em
camundongos Nude. Mostraram também uma significativa captação em tecidos
receptor-positivos (como pâncreas, adrenal e estômago) e excreção
predominantemente renal. Para confirmação da marcação em tecido receptor-
positivo, ensaios utilizando grandes doses bloqueadoras (Tyr-octreotideo) foram
realizados e comprovaram ausência de captação nos tecidos após o bloqueio
(Storch et al. 2005).
Realizando uma comparação direta do HYNIC-octreotídeo-^^""Tc com o
HYNIC-octreotato-^^'^Tc, podemos considerar maior afinidade do HYNIC-
octreotídeo-^^'^Tc para a marcação do receptor sstr2 quando comparado com
HYNIC-octreotato-^^'^Tc, mas este último apresenta uma maior taxa de
internallzação, comprovada em estudos com células AR42J de tumor pancreático
de ratos. As imagens com os dois radiopeptídeos apresentam uma razão
tumor/tecido não tumoral maior do que a encontrada nos peptídeos marcados
com "^ In . Estudo revela que ambos os agentes marcado com ^^"^Tc apresentam
concordância em 85% dos sítios tumorais e metastáticos avaliados, com uma
vantagem encontrada no HYNIC-octreotato-^^'^Tc na análise de linfonodos e
51
metástases hepáticas (isto devido à menor taxa de captação fisiológica hepática
apresentada pelo HYNIC-octreotato-^^^'Tc) (Cwikia et al. 2008).
A alta sensibilidade para detectar tumores receptor-positivos, combinada
com uma baixa e difusa radiação de fundo no trato gastrointestinal e vascular,
resulta na obtenção de imagens de melhor qualidade utilizando os derivados de
SM marcados com ^^""Tc quando comparada com as imagens que utilizam "^ In .
Contudo, a alta atividade renal pode impedir que tumores sejam localizados em
imagens imediatas dessa área, mas leva-se em consideração que raramente a
região renal é sitio de metástases dos tumores avaliados (Gabriel et al. 2003).
3.7.3 Receptores para somatostatina
Até o presente momento, são conhecidos cinco sub-tipos de receptores
para somatostatina (sstr): sstr1, sstr2, sstr3, sstr4 e sstr5. Para o sstr2, existem
ainda duas variantes identificadas, sstr2A e o sstr2B. Estudos farmacológicos
indicam que as somatostatina-14 e somatostatina-28 se ligam a todos os sub
tipos de receptores com grande afinidade (Breeman et al. 1996).
Receptores para somatostatina são expressos em vários tecidos normais e
em maior quantidade em tumores de origem neuroendócrina, como os tumores
gastroenteropancreáticos. Quando tecidos normais expressam receptores para
somatostatina na superfície de suas células, se por ventura desenvolverem um
processo neoplásico, expressarão uma quantidade muito maior desses receptores
(Bombardieri et al. 2003).
Os cinco sub-tipos de receptores para somatostatina são expressos em
maior quantidade em vários tecidos cancerosos. O sstr mais freqüente nesses
tecidos é o sstr2. Contudo, existem exceções, como o adenoma pituitário onde
predomina o sstr3, tumores em pulmões expressam uma maior quantidade de
sstrõ, mas também expressam o sstr2 e sstr3. Os sstr i , 2, 3 e 5 são mais
encontrados em tumores gastroenteropancreático, em câncer medular da tireóide
e câncer do epitelio ovariano (Gandomkar et al. 2007).
55
A internalização de análogos da somatostatina radiomarcados em células
de NETs é intermediada pela presença dos sstr na membrana plasmática. Após a
ligação ao sstr, o complexo peptídeo-receptor é internalizado por endocitose e
transportado para várias organelas celulares, por exemplo lisossomas e
nucléolos. O complexo peptídeo-receptor pode ser dissociado por acidificação
intracelularmente e os receptores podem ser reciclados para a membrana
plasmática (Figura 13). Todo esse processo demora aproximadamente 15
minutos (Oddstig et al.2006).
Vesículas hterrtaiiza^ão
Figura 13 - Esquema de internalização do sistema receptor-peptídeo
radiomarcado (Kaitsas et al.2001).
Embora o sstr2 seja considerado o receptor mais importante, não podemos
excluir a participação dos sstrS e sstrS. Estudo in vitro demonstrou que esses
receptores internalizam a somatostatina radiomarcada com mais eficiência quando
comparado ao sstr2 (Hofiand et al. 2003).
Reubi e colaboradores (Reubi et al. 1999), estudaram vários análogos
sintéticos da somatostatina e avaliaram a possibilidade de se ligarem aos
receptores sstr. Identificaram que pequenas diferenças na seqüência de
aminoácidos da proteína e o acoplamento de quelantes na estrutura desses
análogos alteram a forma de se ligarem aos receptores. Análogos como o
octreotídeo, lanreotídeo, vapreotídeo e o Tyr^-octreotídeo possuem uma alta
COMISSÃO KyrmA:
54
afinidade pelo receptor sstr2. Observou-se, também, uma maior afinidade do
DOTA-octreotídeo pelo sstr3 em relação ao DTPA-Tyr^-octreotídeo, fato atribuído
à substituição do Tyr^ pelo Phe e à susbstituição do quelante DTPA pelo DOTA. O
DOTA lanreotideo mostrou quinze vezes mais afinidade pelo receptor sstrS do
que o análogo comercial DTPA-octreotídeo -"""in. De modo geral, o octapeptídeo
octreotídeo, não apresenta afinidade pelos sstr 1 e 4 , uma intermediária afinidade
pelo sstrS, e uma moderada afinidade pelo sstrõ (Reubi et al.2000).
Embora o DTPA-octreotídeo-"^In seja conhecido por se ligar a outros
receptores, Virgolini e colaboradores (Virgolini et al. 1998) relatam que o DOTA-
lanreotídeo marcado com ou "^In pode ser considerado um "marcador
universal" para receptores de somatostatina, com alta afinidade pelos receptores
sstr2, sstr3, sstr4 e sstrõ e uma moderada afinidade ao sstr i . O DOTA-
vapreotídeo (RC-160) marcado com mostra igual afinidade os subtipos 2, 3 e
4.
O depreotídeo-^^'^Tc, por sua vez, mostrou uma baixa afinidade pelo
receptor sstr2 (mais encontrados em tumores neuroendócrinos) e alta afinidade
pelo sstr3, resultando em uma pobre qualidade em imagens cintilográficas (Cwikia
et al. 2008).
A substituição do treoninol pela treonina no carbono terminal do octreotídeo
é a diferença entre esse análogo e o outro análogo octreotato. Estudos revelaram
que tal substituição acarreta ao octreotato propriedades superiores de ligação a
receptores, com maior afinidade de ligação ao sstr2, com aumento na
internalização e rápido clareamento sanguíneo (Nikolopoulou et al. 200õ; Maina
et al. 2002).
Recentemente, novos análogos da somatostatina com alta afinidade para
todos os receptores estão sendo desenvolvidos pela indústria farmacêutica para
utilização em tratamentos de tumores endócrinos digestivos. Entre eles o
SOM230 e KE108 são os mais promissores. Contudo, testes clínicos devem ser
realizados para demonstrar que esses análogos são igualmente seguros e viáveis
55
comercialmente como os análogos já existentes na rotina clínica (Panzuto et al.
2003).
3.7.4 Tratamento de tumores neuroendócrinos com análogos da
Somatostatina radiomarcados
A base da terapia com análogos da somatostatina radiomarcada é a super-
expressão de receptores sstrs nas células tumorais. Vários tipos de análogos
como o octreotídeo, lanreotídeo e o octreotato são utilizados para este tipo de
terapia. O octreotídeo foi o primeiro análogo a ser utilizado marcado com "^In e
atualmente também é marcado com e ^^^Lu. A recente introdução do quelante
DOTA aumentou a estabilidade dos radioconjugados e possibilitou o uso de vários
radionuclídeos como o ^°Y. A taxa de resposta desse radioisótopo em terapia
depende de alguns fatores: tipo de análogo e radionuclídeo, tipo e tamanho do
tumor (Tabela 6) ( Gnanasegaran et al.2005).
Tabela 6. Resumo das características de radiofármacos análogos da
somatostatina utilizados em terapia
Radioférmacos Octeeotídeo-
DTPA-'^^ln
Octreotfdeo-
DTPA-^Y
lanreotkíeo-
DOTA-^Y
Octreotato-
DOTA-^^Lu
Tipo de radiação Elétrons auger Alta Energia íí'
(>1mm)
Alta Energia
il" (>1mm)
Baixa Energia
í l e Y
(<200Mm)
Meia-vida 67 horas 64 horas 64 horas 160,8horas
Quelante DTPA DOTA DOTA DOTA
•ose Maior 5GBq/ciclo 1 a 4,4GBq/ciclo 1,2 GBq/ciclo 3,7-
7,4GBq/ciclo
Imagens sim não não sim
Afinidade por
receptor
Alta para sstr 2 e
5, moderada para
3 e sem afinidade
para sstr 1 e 4
Alta para sstr2 e
5, moderada para
3 e sem afinidade
para sstr 1 e 4
Alta para sstr
2,3,4e5e
baixa para
sstri
Nove vezes
mais afinidade
pelo sstr2
56
4. Materiais e Métodos
4.1 Infra-estrutura e equipamentos
Os experimentos foram realizados nos Laboratórios do Centro de
Radiofarmácia (CR) da Diretoria de Radiofarmácia (DIRF) do Instituto de Pesquisas
Energéticas e Nucleares (IPEN) e no Laboratório de Radiofarmácia do Centro de
Medicina Nuclear da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP)
que proporcionaram toda infra-estrutura necessária para manipulação de fontes
radioativas não seladas.
Os reagentes utilizados neste trabalho foram adquiridos pelo CR. O
radioisótopo ^^""Tc foi obtido a partir da eluição de geradores molibdênio-tecnécio
^99|^Q_99myçj produzidos no IPEN.
4.1.1 Reagentes e Soluções
> Acetato de amônia - Merck;
> Acetona, p.a. - Grupo Química;
> Acetonitrila, grau pureza HPLC - Cario Erba;
> Ácido cítrico (CeHsO?) p.a - Merck;
> Ácido Clorídrico, p.a. - Merck;
> Ácido trifluoracético (TFA), grau de pureza p.a.- Merck;
> Água purificada (Purificador Milli-RX 45 - Millipore);
> Citrato de Sódio hidratado - Merck;
> Cloreto de Sódio 0,9% - Farmace;
> Cloreto estanoso dihidratado (SnCl2.2H20) - Q.M.
> EDDA - ácido etilenodiamino-N,N"-diacético - Sigma AIdrich;
> Etanol, p.a. - Merck;
> Fosfato de sódio dibásico, p.a. - Merck;
> Fosfato de sódio monohidratado, p.a. - Merck ;
> Hidróxido de sódio p.a. - Vetee Química fina;
> Manitol p.a. - Nuclear;
57
> Metanol p.a. - Merck;
> Metiletilcetona (MEC) - Merck;
> Nitrogênio gasoso - White Martins;
> Nitrogênio líquido - White Martins;
> Peptídeo - HYNIC- Tyr3-Octreotato , AnaSpec INC Custon Peptide Synthesis,
EUA;
> Solução de Pertecnetato de sódio (Na^^'"Tc04) eluída do gerador ^^Mo-^^'^Tc -
IPEN-CNEN/SP (IPEN-TEC);
> Tricina 98 % - Sigma AIdrich.
4.1.2 - Equipamentos
> Agitador magnético - Fisaton mod. VB50R, Brasil;
> Balança Analítica, modelo M-220 - Denver Instruments, EUA;
> Calibrador de doses, modelo CRM^'^-35R - Capintec, EUA;
> Câmara de cintilação, modelo Nucline TH22 - Mediso (Medicai Imaging Systems)
EUA;
> Câmara de Cintilação SMV (Sophy Medical Vision), França;
> Contador automático tipo poço, com cristal de Nal(TI) , Gama Counter Automatic
1480, modelo Wizard 3" - Perkim Elmer, EUA;
> Contador automático tipo poço, com cristal de Nal(TI), modelo E5002 cobra II -
Packard-Camberra, EUA;
> Cromatógrafo líquido de alta eficiência - Shimadzu modelo RF-10AxL com detetor
de radiação gama Parkin Elmer Radiometic™ Modelo 600TR,EUA;
> Estufa - Fabbe, Brasil;
> Freezer, modelo Stock F-17; Prosdócimo, Brasil;
> Geladeira - Metalfrio Mod. VB50R, Brasil;
> Liofilizador - Edwards modelo Super Modoly, EUA.
> Manta aquecedora - Quimis Q-310, Brasil;
> Pipetas automáticas 10-100 e 100-1000 - Labmate e HTL;
> PHmetro MicroNal mod. B374, Brasil.
58
4.1.3 - Outros
> Célula de tumor de pâncreas de ratos (AR42J) - ATCC ®, EUA.
> Coluna para cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) - C^^, 5 pm, 4.6x250
mm - Waters.
> Frascos penicilina e rolhas de borracha;
> Fitas para cromatografia em camada delagada (ITLC-SG) - 5 cm x 20 cm
- Pali Corporation - Life Sciences
> Fitas para determinação do pH - Baker -pHIX ,pH O -14 , J.T.Baker.
> Seringas descartáveis de 1 e 3 mL;
> Vidraria e material de laboratório em geral;
4 . 1 . 4 -Animais
Foram seguidas as diretrizes, padrões, regulamentos e leis relativas aos
cuidados e manutenção dos animais em experimentação, de acordo com o
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
> Camundongo adulto da linhagem Nude, Biotério do IPEN/CNEN - SP;
> Camundongo adulto da linhagem Swiss, Biotério do IPEN/CNEN - SP;
> Coelho adulto, Biotério do CMN/FMUSP.
4.2 Preparo das soluções
4.2.1 Tampão fosfato 0,2M pH 6,2
Para preparo da solução (A), pesou-se 27,58 g de fosfato de sódio
monobásico (NaH2P04.H20) e dissolveu-se em 1000 mL de água purificada. Para a
solução (B), pesou-se 28,39 g de fosfato de sódio dibásico (Na2HP04) e dissolveu-
se em 1000 mL de água purificada. Para preparo do tampão pH 6,2, misturou-se
59
cerca de 80 mL de (A) e 18,5 mL de (B) e ajustou-se o pH utilizando-se solução de
HCI 0,1N.
4.2.2 Tampão citrato O.IIVI pH 5,0
Para preparo da solução (A), pesou-se 37,71 g de citrato de sódio e dissolveu-
se em 1000 mL de água purificada. Para a solução (B), pesou-se 21 g de ácido
cítrico em 1000 mL de água purificada. Para preparo do tampão pH 5,0, misturou-
se cerca de 29,5 mL de (A) e 20,5 mL de (B) e ajustou-se o pH utilizando-se
solução de HCI 0,1 N ou solução de NaOH 0,1 N.
4.2.3 Solução de NaOH 0,1N
Pesou-se 4g de NaOH e dissolveu-se em 1000 mL de água purificada.
4.2.4 Solução de acetato de amônia 0,1 N
Pesou-se 7,7 g de acetato de amônia e dissolveu-se em 1000 mL de água
purificada.
4.2.5 Solução de ácido clorídrico (HCI) 0,1 N
Pipetou-se 0,85 mL de HCI concentrado e díluiu-se para lOOmL com água
purificada.
4.2.6 Fracionamento do peptídeo HYNIC-Tyr^-octreotato (HYNIC-
octreotato)
A dissolução de 3,5 mg do peptídeo HYNIC-Tyr3-octreotato foi realizada em
3,5 mL de solução etanol 10% e realizado o fracionamento em alíquotas de 20 pL, 40
pL e 200 pL, mantidas sob temperatura inferior a 0°C. As alíquotas foram utilizadas
60
nas marcações iniciais e na elaboração do reagente liofilizado.
4.3 - Métodos
4.3.1 - Marcação do peptídeo HYNIC-octreotato com ^ ""Tc
A marcação inicial foi realizada utilizando-se parâmetros já descritos na
literatura (Guggenberg et al.2004 e Ciávaro et al, 2005). Como coligantes foram
escolhidos o EDDA e a tricina e como agente redutor o SnCl2.2H20. Para realizar a
marcação, inicialmente foram preparadas as soluções dos coligantes e do agente
redutor.
> Solução (A) - 30 mg EDDA dissolvidos em 1,5 mL de NaOH 0,1 N;
> Solução (B) - 60 mg tricina dissolvidos em 1,5 mL tampão fosfato 0,2N pH 6,2;
> Solução (C) - 1 mL da Solução (A) mais 1 mL da Solução (B);
> Solução SnCl2.2H20 - 10 mg de SnCl2.2H20 em 10 mL HCI 0,1 N previamente
nitrogenado;
A marcação ocorreu em um frasco penicilina branco, onde foi adicionado:
> 1 mL da Solução (C);
> 20 pL do peptídeo HYNIC-octreotato;
> mOMBq (30 mCi) de pertecnetato de sódio (^^"^1004") em 1 mL, obtido da
eluição do gerador de molibdênio-tecnécio;
> 15 pL da solução de SnCl2.2H20, imediatamente após o ^ ^ " " 1 0 0 4 " .
O frasco foi fechado com rolha de borracha e utilizado um lacre de alumínio. A
reação ocorreu em banho-maria (água em ebulição) por 10 minutos. O frasco foi
retirado do banho e aguardou-se 20 minutos para completar a reação e realização do
controle de qualidade.
Desta forma, a composição final do frasco antes da marcação com ^ ^ " ^ 1 0 0 4
61
era de:
• 20 fjg do peptídeo HYNIC-octreotato;
• 0,01 g de EDDA;
• 0,02 g de tricina;
• 15 pg de SnCl2.2H20
Após o procedimento de marcação com o ^^""Tc e incubação (banho-maria e
T° ambiente, completando 30 minutos), o pH final apresentava-se entre 6,5 e 7,0
( conferido por sistema de fitas indicadora universal de pH ).
4.3.2 - Determinação da pureza radioquímica
As impurezas radioquímicas formadas decorrentes do processo de marcação do
peptídeo foram determinadas pela técnica de Cromatografia em Camada Delgada
(CCD) com fitas sílica gel (ITLC-SG) usada como suporte em diferentes solventes e a
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) - coluna de C18 , 5 pm, 4,6 x 250
mm , Waters .
Como impurezas radioquímicas podemos considerar a presença do próprio
pertecnetato (^^'^Tc04'), decorrente da sua não redução, o óxido de tecnécio (TCO2,
espécie coloidal) e a formação de coligantes com o pertecnetato.
Na Cromatografia em Camada Delgada (CCD), a amostra do produto foi aplicada
sobre a fita sílica gel (ITLC-SG) - fase estacionária - e arrastada por um solvente -
fase móvel. Como fase móvel foi utilizado (Guggenberg et al.2004):
Metiletilcetona (MEC) - que apresentou na origem (Rf=0) o peptideo, o coligante
e o coloide e no fronte o ^^"'Tc04";
Tampão citrato de sódio 0,1 M pH 5,0 - que apresentou na origem (Rf=0) o
62
peptídeo e o coloide e no fronte o coligante marcado e o ^ ^ " " 1 0 0 4 "
• Metanol:acetato de amônia 1:1 - que apresentou na origem (Rf=0) o coloide e no
fronte o peptídeo, o coligante marcado e o ^^""1004" .
Tabela 7. CCD em ITC-SG: Rf* das espécies radioquímicas para as diferentes
fases móveis utilizadas no controle radioquímico da marcação de HYNIC-
octreotato com ^ ""Tc
Fase móvel TCO4 TcOa Coligante- ^ ""Tc Peptídeo-^^^'Tc
MEC Rf = 1 R f = 0 Rf = 0 Rf = 0
Tampão Citrato
de Sódio 0,1 M pH 5 Rf = 1 R f = 0 Rf = 1 Rf = 0
MetanohAcetato
de amônia (1:1) Rf = 1 R f = 0 Rf = 1 Rf = 1
* Rf = relação entre a distância de migração da espécie radioquímica e a distância de
migração do solvente
Na Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) a solução reativa foi analisada
em coluna de Cl 8, 5pm, 4,6 x 250 mm (Waters), utilizando-se gradiente de mistura de
ácido trifluoracético 0 ,1% e acetonitrila. Amostras de 20pL, aproximadamente 0,148 MBq
(4pCi) do peptídeo marcado foram analisadas sob um fluxo de 1 mL/ min, tempo de
corrida de 20 minutos em mistura da solução A (ácido trifluoracético 0,1%) e solução B
(acetonitrila), de acordo com gradiente ilustrado na Tabela 8.
63
Tabela 8. Condições do gradiente empregado na CLAE utilizada na
avaliação da pureza radioquímica da marcação de HYNIC-octreotato
com ^ •"Tc
Tempo (min) % Solução A % Solução B
0-1 100 0 3 100 0
10 34 66
15 34 66
17 0 100
19 100 0
4.3.3 - Estudo de variação do pH
Avaliou-se a pureza radioquímica do composto HYNIC-octreotato-^^'^Tc obtido
com marcação em pH final de 6,0, 7,0 e 8,0 utilizando-se a técnica de Cromatografía
em Camada Delgada (CCD) com fitas sílica gel (ITLC-SG). O estudo da variação do
pH foi obtido variando-se o pH do tampão fosfato pH 6,2 utilizado na dissolução do
coligante tricina.
4.3.4 - Estudo da influência do manitol na marcação do HYNIC-octreotato
com Tc
Avaliou-se, por meio das técnicas de CCD e CLAE, se o manitol a ser utilizado
como excipiente na composição do reagente para liofilização poderia influenciar na
eficiência de marcação da proteína.
Para tal avaliação, também foi estudada a biodistribuição da proteína marcada
em coelhos, utilizando-se a técnica de imagem cintilográfica, 1 e 3 horas após injeção
intra-venosa do peptídeo marcado com e sem manitol. As imagens foram adquiridas
por 5 minutos em gama câmara (Sophy Medical Vision) utilizando matriz 128x128,
pico de 149keV e janela de 15%.
4.3.5 - Elaboração do reagente liofilizado de HYNIC- octreotato
Entre as formulações encontradas na literatura para a realização do regente
liofilizado HYNIC-octreotato , foi escolhido o método de distribuição de todos os
componentes da fórmula em um único frasco liofilizado, acompanhando a marcação
um frasco com solução tampão fosfato pH 6,2.
Foram preparados reagentes liofilizados de HYNIC-octreotato para marcação
com tecnécio-99m, sendo a composição por frasco de:
" 20 pg do peptídeo HYNIC-Try^- octreotato;
- 0,01 g de EDDA;
• 0,02 g de tricina;
• 15 pg de SnCl2.2H20
• 50 mg de manitol
Foram realizados 3 lotes de reagentes liofilizados a fim de acompanhar
a estabilidade do reagente e as melhores condições de marcação:
> V Lote: 25 frascos com pré-congelamento em nitrogênio líquido, preparados da
seguinte forma:
• Dissolução de 500 pg do peptídeo HYNIC-Try^-octreotato em 0,5 mL de Etanol
10%;
• Dissolução 0,01 g SnCl2.2H20 em 10 mL de HCI 0,1 N, mantido sob nitrogenação
até o momento da utilização;
• Dissolução de 300 mg de EDDA em 10 mL de H2O purificada, sob aquecimento
suave e agitação;
• Dissolução de 600 mg de tricina em 10 mL de H2O purificada sob agitação;
• Pesagem de 1250 mg de manitol;
• Em um becker, sempre sob agitação magnética e nitrogenação, adicionou-se 8,3
mL da solução de EDDA, 8,3 mL da solução de tricina e os 1250 mg do manitol.
• Adicionou-se 500 pL da solução do peptídeo HYNIC-Try^-octreotato;
65
• Adicionou-se 375 | j L da solução de SnCl2.2H20;
• O pH da mistura foi acertado em 6,5 utilizando-se solução de HCI 0,1 N;
• O volume final da preparação foi ajustado para 25 mL utilizando-se água
purificada;
• A solução final foi aliquotada em frações de 1 mL em frascos tipo penicilina e
imediatamente pré-congelados com nitrogênio líquido;
• Os frascos pré-congelados foram colocados na bandeja do liofilizador, também
pré-congelada a -40,5°C e iniciou-se imediatamente o processo de liofilização;
• Ciclo de liofilização: Secagem primária ocorreu por 20 horas, com temperatura da
prateleira variando de -40°C a 2 5 X e pressão aproximada de 8x10'^ mbar. Na
secagem secundária a temperatura de 25°C é mantida por mais 5 horas. No final
do ciclo, ainda sob vácuo, os frascos foram fechados com rolhas de borracha e
posteriormente lacrados.
• Os frascos foram estocados entre 4° e 5°C
> 2** lote: 25 frascos sem pré-congelamento em nitrogênio líquido
As condições de preparo do reagente liofilizado foram exatamente iguais as do
1° lote. Somente não foi realizado o pré-congelamento com nitrogênio líquido, sendo
os frascos colocados, logo após a pipetagem de 1mL, diretamente na bandeja pré-
congelada do liofilizador. Os frascos liofilizados também foram estocados entre 4° e
5°C.
> 3° lote: 100 frascos com pré-congelamento em nitrogênio líquido
As condições de preparo do reagente liofilizado foram iguais as do 1° lote. Este
lote foi utilizado para estudo de variação das condições de marcação COM ^^"^Tc.
66
4.3.6 - Estabilidade do reagente liofilizado HYNIC- octreotato
Acompanhou-se a estabilidade dos reagentes liofilizados do 1° e 2° lote.
Foram realizados controle de pureza radioquímica das marcações com freqüência
imediata, quinzenal, mensal até o período de 5 meses após a produção. A
estabilidade foi avaliada através de controles radioquímicos utilizando-se a técnica de
Cromatografia em Camada Delgada (CCD) em fita sílica gel (ITLC-SG).
4.3.7 - Estudo das variáveis de marcação do reagente liofilizado HYNIC-
octreotato
Foi necessário a realização deste estudo para estabelecer as melhores
condições de marcação do reagente HYNIC-octreotato com ® " Tc
As variáveis estudadas foram:
> Atividade do pertecnetato de sódio (Na^^"^Tc04): 740, 1110, 1480, 1850 e 2220
MBq (20, 30, 40, 50 e 60 mCi, respectivamente). Todos os ensaios foram
realizados em duplicata.
> Volume do pertecnetato de sódio (Na^^"'Tc04): 1 mL, 2 mL, 3 mL e 4 mL. Todos
os ensaios foram realizados em duplicata.
> Condição de reação: temperatura ambiente, banho-maria (água fervendo) por 10,
15, 20 e 30 minutos. Todos os ensaios foram realizados em duplicata.
Ao estudar-se uma variável, as demais mantiveram-se fixas, da seguinte forma:
• Atividade do pertecnetato de sódio (Na^^'"Tc04) de 1110 MBq (30 mCi)
• Volume do pertecnetato de sódio (Na^^'"Tc04) de 1 mL
" Condição de reação - banho-maria por 15 minutos
• Volume do tampão fosfato 0,1M pH 6,2 em 1 mL
67
4.3.8 - Obtenção de modelo tumoral animal
Células de tumor pancreático de rato (AR42J), cultivadas no Laboratório de
Cultura Celular do Centro de Biologia Molecular (CBM) do IPEN/CNEN em meio de
cultura F12K (Cultilab), contendo 10 % de soro fetal bovino, penicilina e
estreptomicina, em estufa de CO2 a 37°C e 5 % de umidade. Para inoculação em
camundongos Nude, as células foram separadas do meio de cultura e injetadas
intradermicamente no dorso do animal na concentração de 5-6 x 10^ células em
lOOpL de PBS (tampão fosfato pH 7,5/ NaCI 0,9 %) .
Após 10-15 dias os animais apresentaram crescimento de massa supostamente
tumoral na região de inoculação de 0,5 a 1,0 cm de diâmetro. Amostras desta massa
foram enviadas ao Laboratório de Patologia do HC-FMUSP para análise histológica
(cortesia da Dra Sheila Siqueira).
O modelo tumoral escolhido para este trabalho foi obtido de referências da
literatura (Guggenberg et al.2004 e Ciávaro et al, 2005).
4.3.9 - Estudo da distribuição biológica do HYNIC-octreotato-^^'^Tc em
animais de laboratório
Os camundongos {Nude e Swiss) utilizados nos estudos de distribuição
biológica foram obtidos no Biotério do Centro de Biologia Molecular do IPEN/CNEN.
O radiofármaco foi administrado (40pCi/0,2mL) na veia caudal dos animais que foram
sacrificados (utilizando-se anestésico volátil - éter) 1,5 e 4 horas após a
administração. Os seguintes órgãos foram retirados: tireóide, pulmão, coração, baço,
fígado, estômago, rins, intestino delgado, intestino grosso, supra-renais, pâncreas,
rabo, fração muscular (amostra da pata traseira) e amostras de 100 pL de sangue
retirados da região orbital. Os órgãos foram lavados, pesados e colocados em tubos
apropriados para ser submetido à contagem da radioatividade em contador gama tipo
poço (Perkim Élmer). Nos camundongos Nude com tumor implantado, a massa
tumoral também foi retirada e submetida à contagem.
68
Um padrão de dose administrada em cada estudo biológico foi preparado a
partir da diluição da dose em um balão volumétrico de 10 mL e contagem em
contador gama de 3 alíquotas de 1 mL do padrão. Foi utilizado o valor da contagem
média obtida, multiplicado por 10 (fator de diluição). A porcentagem de dose presente
em cada órgão ou tecido analisado foi calculada a partir de um padrão real. Para
determinar esse padrão real foi utilizada a contagem por minuto (cpm) média do
padrão de dose administrada subtraída da contagem (cpm) do rabo de cada animal
seguindo a equação:
Padrão Real = cpm padrão dose administrada - cpm do rabo (EQ.1)
Com base no padrão real calculado para cada animal, a porcentagem de dose
presente em cada órgão/tecido de interesse foi calculada da seguinte forma:
% dose/órgão = (cpm órgão / cpm padrão real) x 100 (EQ.2)
% dose/grama = % dose/órgão / massa do órgão ou tecido (EQ.3)
Os cálculos da porcentagem da dose presente no sangue total do animal foram
determinados de acordo com as seguintes equações:
% dose sangue/mL - cpm 100 pl de sangue x 10 /cpm padrão real (EQ.4)
% dose sangue total = % dose sangue/mL x volemia do animal (EQ.5)
volemia = peso animal (g) x 0,07 (mL/g) (EQ.6)
O cálculo da porcentagem da dose administrada no músculo total do animal foi
calculado:
69
% dose músculo/grama = cpm amostra músculo retirada / peso da amostra / cpm
do padrão real ( EQ. 7)
% dose músculo total = % dose músculo/grama x 40% peso do animal ( EQ. 8)
Foi determinada a pureza radioquímica por CCD de todos os radiofármacos
utilizados para controle da biodistribuição.
4.3.10 - Estudo cintllográfico do HYNIC-octreotato -^ '"Tc
Os primeiros estudos cintilográficos foram realizados em 02 coelhos sadios
fornecidos pelo Laboratorio de Radiofarmácia do Centro de Medicina Nuclear -
FMUSP, 20 minutos, 1 hora e 4 horas após administração de 37 MBq (1 mCi)/0,1 mL
do radiofármaco em veia auricular. As imagens estáticas foram adquiridas durante 5
minutos com o animal em decúbito ventral utilizando matriz 128X128, energia de 149
keV e janela de 15 %. O colimador utilizado foi o de baixa energía e alta resolução.
Os animais permaneceram em privação de movimento através da técnica de
imobilização em maca animal apropriada.
Posteriomiente foi realizado outro estudo cintilográfico em 02 camundongos
Nude com tumor pancreático implantado. As imagens foram adquiridas 3 horas após
a injeção de 37 MBq (ImCi) em 0,1 mL do radiofármaco em veia caudal. As imagens
foram adquiridas durante 5 minutos com os animais em decúbito dorsal para melhor
visualização da região de implante tumoral. Os parâmetros de aquisição utilizados
diferem dos acima em relação à matriz empregada (256x256) em virtude do tamanho
do modelo animal. Os animais foram contidos sob anestésico volátil (éter).
Posteriormente foram sacrificados e coletados seus órgãos e tecidos para controle
biológico invasivo.
70
5 - Resultados
5.1 •• Marcação do peptídeo HYNIC-octreotato com ^ ""Tc - estudo
da influência do pH
As marcações iniciais foram realizadas utilizando-se as condições descritas
na literatura (Guggenberg et al. 2004 e Ciávaro et al. 2005), conforme descrito
previamente e com pH final de marcação de 6,5-7,0 (Tabela 9). Os resultados dos
estudos de variação do pH final da marcação estão descritos na Tabela 9. A
eficiência de marcação foi determinada por Cromatografia em Camada Delgada
(CCD) em fita silica gel (ITLC-SG).
Tabela 9. Pureza radioquímica da marcação do Octreotato-HYNIC com ^ ""Tc
utilizando-se CCD em ITLC-SG: influência do pH
pH % Pureza Radioquímica
1 hora após marcação 3 horas após marcação
6 , 0 - 6 , 5 87,5 ±2,8 83,1 ± 5,5 n=4 6 , 5 - 7 , 0 94,9 ±2,6 90,0 ± 4,5 n=9 7 , 5 - 8 , 0 63,5 ±4,0 56,6 ± 5,4 n=4
As impurezas radioquímicas identificadas nas marcações acima foram o
^^'^Tc04', TCO2 e coligante marcado com tecnécio-99m nas porcentagens descritas
nas tabelas 10 e 11.
Tabela 10. Determinação das impurezas radioquímicas identificadas na
marcação do HYNIC-octreotato com ^ ""Tc 1 hora após marcação utilizando
CCD em ITLC-SG
pH % Impurezas Radioquímicas
'^"Tc04- ^'"Tc02 coligante -^^"Tc
6 , 0 - 6 , 5 4,4 ±2,9 1,4 ±0,8 5,4 ±1,2 6 , 5 - 7 , 0 0,4 ±0,3 0,5 ±0,2 3,3 ±1,3 7 , 5 - 8 , 0 25,7 ±7,7 2,2 ±1,1 8,6 ±1,0
71
Tabela 11. Determinação das impurezas radioquímicas identificadas na
marcação do HYNIC-octreotato com ^ ""Tc 3 horas após marcação utilizando
CCD em ITLC-SG
% Impurezas Radioquímicas
'''"TcOí" TcOz coligante - ""Tc
6 , 0 - 6 , 5 2,7 ±1,2 1,8 ±0,5 3,2 ±1,2 6 , 5 - 7 , 0 1,4 ±0,9 6,2 ± 0,8 5,8 ±1,9 7 , 5 - 8 , 0 15,4 ±5,2 7,5 ±2,6 18,8 ±3,0
5.2 - Marcação do peptídeo HYNIC-octreotato com ^ '"Tc - estudo
da influência do manitol
Estabelecendo o pH final da reação entre 6,5 e 7,0 foram realizados
estudos para verificar se a inclusão do manitol na composição do radiofármaco
alteraria os resultados da pureza radioquímica (Tabela 12).
Tabela 12. Pureza radioquímica da marcação do HYNIC-octreotato com ^ ""Tc
utilizando-se CCD em ITLC-SG 1 e 3 horas após a marcação: influência do
manitol
Octreotato- % Pureza Radioquímica
HYNIC-®®'"Tc 1 hora 3 horas
Sem manitol 91,34 ±3,58 89,19 ±4,51
Com 94,36 ± 2,83 93,27 ± 4,21
n=4
A pureza radioquímica dos compostos com ou sem a adição de manitol
também foi avaliada por meio da técnica de Cromatografía Líquida de Alta
Eficiência (CLAE) (Figuras 14, 15, 16 e 17 e Tabelas 13, 14, 15 e 16,
respectivamente).
72
CPM
1,40E+06 -
1,20E+06 -
1,0OE+06
800000,0
600000,0
400000,0
200000,0
0,0-'
0,00
Região 2
Região 1
/ V 5,00 10,00 15,00 20,00 min
Figura 14. Perfil de CLAE para o composto HYNIC-octreotato-^^'"Tc sem
adição de manitol 1 hora após marcação
Tabela 13. Demonstração dos tempos de retenção obtidos no perfil CLAE
( Figura 14) para o composto HYNIC-octreotato-^^"'Tc sem adição de manitol
1 hora após marcação
Início Fim Retenção Altura Área %ROI (min) (min) (min) (cpm) (cpm)
Região 1 3,30 4,10 3,70 16685,7 41400,0 1,19
Região 2 12,40 15,20 13,00 1367571,4 3424600,0 98,81
Encontramos dois picos de retenção, região 1 (3,70 minutos) e região 2 (13
minutos) (Tabela 13). De acordo com a literatura (Storch et al.2005 e Gandomkar
et al.2007) o pico da região 1 corresponde à presença de tecnécio-99m livre ou
complexos de coligante marcado com tecnécio-99m. O pico da região 2
corresponde ao peptídeo radiomarcado.
73
Região 2
CPM
500000,o]
450000,0^
400000,(h
350000,OÍ
300000,01
250000,0^
200000,o|
150000,0^
100000,0^
50000,0i
0,0-*-==
0,00
Região 1
i 10,00 20,00 30,00 min
Figura 15. Perfil de CLAE para o composto HYNIC-octreotato-^^'"Tc com
adição de manitol 1 hora após marcação
Tabela 14. Demonstração dos tempos de retenção obtidos no perfil CLAE
(Figura 15) para o composto HYNIC-octreotato-^^'^Tc com adição de manitol
1 hora após marcação
Início Fim Retenção Altura Area %ROI (min) (min) (min) (cpm) (cpm)
Região 1 3,30 4,00 3,70 11057,1 24904,3 2,21
Região 2 12,50 14,20 13,00 527742,9 1099718,6 97,79
A figura 15 mostra o perfil do peptídeo marcado com tecnécio-99m com a
presença do manitol em sua formulação, uma iiora após a marcação. Observa-se
que as regiões 1 e 2 apresentam os mesmos tempos de retenção (Tabela 14) em
relação ao composto marcado sem a presença do manitol (Tabela 13).
A figura 16 mostra o perfil do peptídeo marcado com tecnécio-99m sem a
presença do manitol em sua formulação, três horas após a marcação.Observa-se
uma região inicial com pico de retenção em 2,70 minutos e outro em 12 minutos.
74
que devem corresponder ao coligante e a proteina marcados, respectivamente
(Tabela 15).
CPM
240000,0
220000,0
200000,0
180000,0
160000,0
140000,0
120000,0
100000,0
80000,0
60000,0
40000,0
20000,0
0 , 0 - ^
0,00
Região 1
Região 2
5,00 10,00 15,00 20,00 min
Figura 16. Perfil de CLAE para o composto HYNIC-octreotato-^^'^Tc sem
adição de manitol 3 horas após marcação
Tabela 15. Demonstração dos tempos de retenção obtidos no perfil CLAE
(Figura 16) para o composto HYNIC-octreotato-^^'^Tc sem adição de manitol 3
horas após marcação
Início Fim Retenção Altura Área %ROI (min) (min) (min) (cpm) (cpm)
Região 1 2,10 3,30 2,70 17285,7 60657,1 9,79
Região 2 11,40 13,00 12,00 250657,1 558971,4 90,21
75
CPM
160000,0
140000,0
120000,0
100000,0
80000,0
60000.0
40000,0
20000,0
0,0- =
0,00
Região 3
I I
\
Região 2 Região 1
5,00 10,00 15,00 20,00min
Figura 17. Perfil de CLAE para o composto HYNIC-octreotato-^^^^Tc com
adição de manitol 3 horas após marcação
Tabela 16. Demonstração dos tempos de retenção obtidos no perfil CLAE
(Figura 17) para o composto HYNIC-octreotato-^^'^Tc com adição de manitol
3 horas após marcação
Início Fim Retenção Altura Área %ROI (min) (min) (min) (cpm) (cpm)
Região 1 2,40 2,70 2,60 14085,7 20153,6 3,60
Região 2 2,70 3,40 2,90 16514,3 42939,3 7,67
Região 3 11,50 13,40 12,20 172857,1 496896,4 88,73
A figura 17 mostra o perfil do peptídeo marcado com tecnécio-99m com a
presença do manitol em sua formulação, três fioras após a marcação. Foram
encontrados três picos de retenção, região 1 (2,60 minutos), região 2 (2,90
minutos) e região 3 (12,20 minutos) que devem provavelmente corresponder a
coligante marcado, tecnécio livre e proteína marcada, respectivamente.
76
O tempo de retenção do pertecnetato livre no mesmo sistema CLAE foi
determinado, conforme demonstrado na Figura 18, sendo de 3,3 minutos (Tabela
17).
CPM
700000,G
eooooo.G
500000,G
400000,G
300000,G
200000, G
100000,G
0,&
0,00
Região 1
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 min
Figura 18. Perfil de CLAE para o pertecnetato de sódio
Tabela 17. Demostração dos tempos de retenção obtidos no perfil CLAE
(Figura 18) para o pertecnetato de sódio
Início Fim Retenção Altura Área %ROI (min) (min) (min) (cpm) (cpm)
Região 1 3,10 3,90 3,30 760914,3 1280228,6 100,00
Como complemento à avaliação da interferência do manitol no composto
HYNIC-octreotato para marcação com tecnécio-99m, foram realizadas imagens
em coeliios dos complexos obtidos com e sem manitol (Figuras 19 e 20).
77
C O E L H U 1,- L O l l 0 8 / 1 4 / 0 7 C O E L H O 0 2 COM 0 8 / 1 4 / 0 7
fiNTERIOP i h A N T E R I O R 3 H O R f i S
C O E L H O 0 2 COM 0 8 / 1 4 / 0 7
fiNTERIOR 4 h
Figura 19. Imagem cintilográfica de coelhos em posição decúbito-ventral 1, 3
e 4 horas após injeção intravenosa do HYNIC-ocíreotato-^^'^Tc com manitol
em sua composição final.
C O E L H O 01 3/ m/lA^B? C O E L H O 01 3/ 0 8 / 1 4 / 0 7
. " Coração
Fígado M
Rins
"Bexiga
A N T E R I O R A N T E R I O R IH
C O E L H O 01 S/ 0 8 / 1 4 / 0 7 C O E L H O 01 S/ 0 8 / 1 4 / 0 7
A N T E R I O R 3 'HORfiS flNTERI0R/4H
Figura 20. Imagem cintilográfica de coelhos em posição decúbito-ventral 30
minutos, l h o r a , 3horas e 4 horas após injeção intravenosa do HYNIC-
octreotato-^^'^Tc sem manitol em sua composição final.
COMISSÃO NAF ;0'-:'-!. Í.IF F K E Í M ?WCLEAR'S?-I^S5
78
5.3 Avaliação da estabilidade do reagente liofilizado HYNIC-octreotato
Após verificar que a presença do excipiente manitol na formulação não
alterava o rendimento radioquímico e nem o perfil CLAE, procedeu-se a
elaboração do reagente liofilizado HYNIC-octreotato. Foi avaliada a estabilidade
dos reagentes com e sem pré-congelamento em nitrogênio líquido.
5.3.1- Estabilidade do reagente liofilizado HYNIC-octreotato (1° lote)
com pré-congelamento em nitrogênio líquido
A avaliação da estabilidade do primeiro lote de 25 frascos liofilizados com
pré-congelamento em nitrogênio líquido foi realizada durante 6 meses utilizando-
se da cromatografia em camada delgada (ITLC-SG) para determinação da pureza
radioquímica do peptídeo radiomarcado (Tabela 22).
Tabela 18. Avaliação da estabilidade do reagente liofilizado de HYNIC-
octreotato com pré-congelamento em nitrogênio líquido armazenado em
temperatura 4-5^*0. Avaliação da pureza radioquímica util izando CCD (ITLC-
SG)
Período % HYNIC-octreotato-'^^'Tc % HYNIC-octreotato-^'^^Tc
avaliado (dias) l h o r a após marcação 3 horas após marcação
10 91,5510,77 91.3710,48
20 94,56 ± 2,35 90,04 1 0,34
30 90,04 ± 0,34 91,4612,56
60 91,41 ±2,14 92,01 11,48
§0 90,82 ± 0,76 88,10 12,55
120 90,01 ±0,13 90,8710,18
150 86,98 ±1,79 86,39 1 1,30
n=3 para cada período avaliado
A estabilidade do reagente liofilizado de HYNIC-octreotato após 150 dias (5
meses) de sua elaboração também foi avaliada utilizando-se o método de CLAE
(Figura 21).
79
CPM
800000,0
700000,0
600000,0
500000,0
400000,0
300000,0
200000,0
100000,0-
0.0
Região 3
Região 1 Região 2
\ / \ X u
0,00 5,00 10,00 15,00 mm
Figura 21. Perfil de CLAE da marcação de reagente liofilizado de HYNIC-
octreotato após período de armazenamento de 5 meses da preparação
liofilizada
Foram encontrados três picos de retenção, região 1 (3 minutos), região 2
(3,60 minutos) e região 3 (12,70 minutos) que devem corresponder,
respectivamente, a coligante marcado, tecnécio livre e proteina marcada (Tabela
19).
Tabela 19 - Demonstração dos tempos de retenção obtidos no perfil de
CLAE (Figura 21) para o composto HYNIC-octreotato-^^'^Tc
Início Fim Retenção altura area %ROI
Região 1 2,70 3,40
Região 2 3,40 3,90
Região 3 12,00 13,70
3,00
3,60
12,70
56400,0
47085,7
155857,1
113542,9
7,79
5,68
838057,1 1731342,9 86,54
80
5.3.2 Estabilidade do reagente liofil izado de HYNIC-octreotato (2°lote) sem
pré-congelamento em nitrogênio líquido
A avaliação da estabilidade do segundo lote de 25 frascos liofilizados sem
pré-congelamento em nitrogênio líquido foi realizada durante 120 dias (4 meses)
utilizando-se da cromatografia em camada delgada (ITLC-SG) para determinação
da pureza radioquímica do peptídeo radiomarcado (Tabela 20). No entanto, por
um problema relacionado ao liofilizador (no momento em que os frascos são
lacrados), não foram obtidos um número adequado de frascos do reagente
liofilizado que apresentassem condições de vácuo ideal (condição para
preservação da massa de estanho). Com isso, o número de ensaios realizados
nesta etapa foi prejudicado.
Tabela 20. Determinação da estabilidade do reagente liofilizado de HYNIC-
octreotato sem pré-congelamento em nitrogênio líquido armazenado em
temperatura 4-5°C. Avaliação da pureza radioquímica utilizando CCD (ITLC-
SG)
Período % HYNIC-octreotato-^^'"Tc
avallado 1 hora
% HYNIC-octreotato-^^"'Tc
3 horas
5 días
10 días
30 dias
60 días
90 días
120 días
92,1810,66 n=3
91,8812,28 n=3
93,53
92,93
89,00
90,62
87,7713,47 n=3
89,98
93,28
92,01
89,21
87,74
5.4 Estudo das variáveis de marcação do reagente liofilizado de HYNIC-
octreotato
As variáveis de marcação do reagente liofilizado de HYNIC-octreotato com
^^""Tc avaliadas foram: atividade do pertecnetato de sódio, volume do pertecnetato
81
de sódio e condições de reação. No momento em que era realizada a avaliação
de um parâmetro, os demais se mantinham fixos:
• Volume do Na^^"'Tc04 igual a 1 mL
• Atividade do Na^^nc04 igual a 740MBq (20mCi)
• 1 mL de tampão fosfato pH 6,2
• Reação em banho-maria por 15 minutos (água em ebulição)
5.4.1 Avaliação da atividade do pertecnetato de sódio (Na^^"'Tc04)
A influência da variação da atividade de tecnécio-99m na pureza
radioquímica da marcação pode ser obsen/ada na Tabela 21 .
Tabela 21 . Estudo da variação da atividade do pertecnetato de sódio
(Na®®'"Tc04) na marcação do reagente liofilizado de HYNIC-octreotato
Atividade do % HYNIC-octreotato-^^'^Tc % HYNIC-octreotato-'^^Tc
Na^^'TcOí 1 hora 3 horas
740 MBq (20 mCi) 92,90 ± 0,89 91,43 ±0,09
1110 MBq (30mCi) 91,19±1,12 90,07 ±0,55
1200 MBq (40 mCi) 93,42 ± 0,93 92,37 ± 0,38
1500 MBq (50 mCi) 82,16 ±9,56 82,76 ± 9,39
1800 MBq (60mCi) 72,74 ± 8,42 71,59 ±9,56
n = 4 para cada atividade
5.4.2 - Avaliação do volume do pertecnetato de sódio (Na^^'"Tc04)
A influência da variação do volume da solução de tecnécio-99m na pureza
radioquímica da marcação pode ser observada na Tabela 22.
82
Tabela 22. Estudo da variação do volume do pertecnetato de sódio
(Na^^'"Tc04) na marcação do reagente liofilizado de HYNIC-octreotato
Volume do % HYNIC-octreotato-^^^Tc % HYNIC-octreotato-^^'"Tc
'4 1 hora 3 horas
1mL 88,41 ±4,41 88,44 ± 3,44
2mL 92,25 ±2,09 90,80 ±1,18
3mL 85,48 ± 4,37 85,64 ± 4,03
4mL 89,58 ± 0,60 87,86 ± 3,90
n = 4 para cada volume
Os valores encontrados no estudo de variação do volume do pertecnetato
(tabela 22), mais especificamente as porcentagens com o volume fixado em 1 mL,
diferem do valor encontrado na tabela 21 , quando também foi utilizado ImL de
pertecnetato porque os ensaios de variação do volume foram realizados quando o
lote de regente liofilizado já não apresentava rendimento de pureza radioquimica
superior a 90%, isto devido a estabilidade do produto já estar comprometida pelo
tempo.
5.4.3 - Avaliação do tempo de reação
A influência da variação do tempo e temperatura de incubação (condições
de incubação) na pureza radioquímica da marcação pode ser observada na
Tabela 23. Foi importante determinar se a reação poderia ocorrer em temperatura
ambiente, visto que muitos serviços de medicina nuclear não dispõem de
sistemas de aquecimento em banho-maria.
83
Tabela 23. Estudo da variação das condições de incubação na marcação do
reagente liofilizado de HYNIC-octreotato
Condição de % HYNIC-octreotato-^^-^Tc % HYNIC-octreotato-^^nc
incubação 1 hora 3 horas Temperatura Temperatura
38,76 ± 1,37 48,79 ± 1,6 ambiente
10 min baniio-maria 86,53 ± 2,86 81,65 ±5,72
15 min bantio-maria 93,42 ± 0,93 92,37 ± 0,38
20 min baniio-maha 90,86 ±2,08 85,58 ± 1,82
30 min banho-maria 87,73 ±2,88 47,24 ±4,63
n =4 para cada condição
5.5 Modelo tumoral de células AR-42J em camundongos Nude
Após intervalo de tempo de 10 a 15 dias da inoculação das células
de adenocarcinoma pancreático de ratos (AR42J) na região dorsal dos
camundongos Nude observou-se crescimento de massa palpável na
região de inoculação em 80% dos camundongos inoculados (Figuras 22 e
23).
(A) (B)
Figura 22. (A) Linhagem utilizada de camundongos Nude mantidos em
biotério provido de barreiras ¡soladoras (controle de contaminação de
agentes patógenos e condições adequadas para o desenvolvimento do
84
modelo tumoral); (B) Inoculação de células tumorais AR42J em dorso do
camundongo Nude.
Figura 23. Camundongo Nude com tumor em região dorsal de
aproximadamente 1 centímetro após 20 dias com retirada da massa tumoral
para análise histológica
A avaliação histológica da massa palpável foi realizada, confirmando a
presença de células neoplásicas indiferenciadas, conforme indicado nas Figuras
24 e 25.
Figura 24. Neoplasia indiferenciada, com alta celularidade, composta por
células epitelióides e fusiformes, sem arranjo característico e com estroma
escasso, formando blocos sólidos e ocupando o tecido celular subcutâneo
(lâmina 100x)
85
Figura 25. Neoplasia indiferenciada composta por células
predominantemente epitelióides, coesas, com núcleos grandes,
pleomórficos, com nucléolos evidentes e citoplasma ampio, eosinofílico
(lámina 400x)
5.6 - Estudo da distribuição biológica do HYNIC-octreotato-^®'"Tc em animais
de laboratorio
Os resultados dos estudos invasivos de biodistribuição em camundongos
Nude e Swiss estão representados nas Tabelas 24 e 25 e Tabelas 26 e 27,
respectivamente. Os valores foram expressos e, porcentagem dose/órgão ou
tecido e porcentagem dose/grama do órgão ou tecido, em relação ao tempo de
injeção (uma hora e meia e 4 horas após a injeção intravenosa)
86
Tabela 24. Porcentagem da atividade administrada/órgão-tecido do peptídeo
radiomarcado HYNIC-octreotato-^^'^Tc em camundongos Nude com
adenocarcinoma pancreático
Orgão/Tecido % dose/órgão ou tecido
l h o r a 30 minutos 4 horas
TIREÓIDE 0,14±0,12 0,02 ±0,02
PULMÃO 0,10 ±0,06 0,09 ±0,03
CORAÇÃO 0,02 ±0,01 0,01 ±0,001
BAÇO 0,02 ±0,01 0,02 ±0,01
FÍGADO 0,24 ±0,03 0,28 ±0,17
ESTÔMAGO VAZIO 0,22 ±0,04 0,15±0,16
MÚSCULO TOTAL 3,01 ±0,05 1,91 ± 0,04
RINS 4,79 ±1,45 1,55 ±1,20
INTES. DELGADO 1,06±0,16 0,57 ±0,07
INTES. GROSSO 0,75 ±0,47 1,08 ±0,06
PÂNCREAS 0,02 ±0,01 0,01 ±0,01
SUPRA-RENAIS 0,48 ±0,21 0,16 ±0,02
SANGUE TOTAL 0,42 ± 0,05 0,28 ±0,05
TUMOR 0,24 ±0,10 0,40 ±0,05
n=8
S7
Tabela 25. Porcentagem da atividade administrada/grama de órgão-tecido do
peptídeo radiomarcado HYNIC-octreotato-^^'"Tc em camundongos Nude com
adenocarcinoma pancreático
Órgâo/Tecido % dose/grama de órgão ou tecido
1 hora 30 minutos 4 horas
PULIVIÃO 1,02 ±0,11 0,67 ± 0,20
CORAÇÃO 0,25 ±0,07 0,12 ±0,01
BAÇO 0,50 ±0,17 0,21 ±0,18
FÍGADO 0,30 ± 0,05 0,28 ±0,11
ESTÔMAGO VAZIO 2,21 ±0,42 1,30 ±0,23
MÚSCULO 0,18±0,13 0,05 ± 0,03
RINS 21,12 ±10,43 3,98 ± 0,64
INTES. DELGADO 1,11 ±0,41 0,59 ±0,11
INTES. GROSSO 1,90 ±0,40 2,00± 0,28
PÂNCREAS 0,06 ± 0,06 0,02 ± 0,01
SANGUE/mL 0,27 ±0,06 0,14 ±0,07
TUMOR 0,35 ± 0,04 0,27 ± 0,06
n=8
A eficiência do ensaio foi assegurada realizando-se o controle radioquímico
do HYNIC-octreotato-^^'^Tc empregado nos estudos biológicos, utilizando-se CCD
em ITLC-SG, apresentando pureza radioquímica superiores a 90 %. A impureza
radioquímica que se apresentou em maior porcentagem foi o coligante marcado
com tecnécio-99m, com média encontrada de 5 %.
88
Tabela 26. Porcentagem da atividade administrada/órgão ou tecido do
peptídeo radiomarcado HYNIC-octreotato-®^'"Tc em camundongos Swiss
normais
Órgão/Tecido % dose/órgão ou tecido
1 hora 30 minutos 4 horas
TIREÓIDE 0,02 ±0,01 0,01 ±0,001
PULMÃO 0,75 ± 0,23 0,39 ± 0,22
CORAÇÃO 0,05 ±0,01 0,01 ±0,01
BAÇO 0,05 ±0,02 0,01 ±0,01
FÍGADO 0,69 ± 0,32 0,27 ±0,10
ESTÔMAGO VAZIO 1,60 ±0,40 0,67 ±0,26
MÚSCULO TOTAL 0,04 ± 0,02 0,02 ±0,01
RINS 25,11 ±5,41 10,64 ±7,53
INTES. DELGADO 3,08 ± 0,50 1,70 ±0,52
INTES. GROSSO 0,88 ±0,12 1,52 ±0,56
PÂNCREAS 1,13 ±0,25 0,33 ±0,17
SUPRA RENAIS 0,04 ± 0,03 0,01 ±0,01
SANGUE TOTAL 0,74 ± 0,48 0,24 ± 0,03
n=8
89
Tabela 27. Porcentagem da atividade administrada/grama de órgão ou tecido
do peptídeo radiomarcado HYNIC-octreotato-^^^^Tc em camundongos Swiss
normais
Órgão/Tecido % dose/grama de
l h o r a 30 minutos
órgão ou tecido
4 horas
PULMÃO 2,70 ± 0,62 1,49 ± 0,38
CORAÇÃO 0,37 ±0,16 0,11 ±0,07
BAÇO 0,52 ±0,21 0,15±0,12
FÍGADO 0,44 ±0,21 0,22 ±0,13
ESTÔMAGO VAZIO 5,61 ±1,67 2,47 ± 1,07
MÚSCULO 0,02 ±0,01 0,01 ± 0,001
RINS 64,07 ±20,59 22,93 ± 10,40
INTES. DELGADO 1,82 ±0,57 1,10 ±0,34
INTES. GROSSO 0,85 ±0,18 1,62 ±0,65
PÂNCREAS 2,58 ±0,75 0,76 ±0,28
SANGUE/mL 0,39 ±0,17 0,08 ±0,01
n=8
A eficiência do ensaio foi assegurada realizando-se o controle radioquímico
do HYNIC-octreotato-^^"^Tc empregado nos estudos biológicos, utilizando-se CCD
em ITLC-SG, apresentando pureza radioquimica superiores a 92 %. Também
neste caso, a impureza radioquímica que se apresentou em maior porcentagem
foi o coligante marcado com tecnécio-99m, com média encontrada de 5 %.
5.7 - Cintilografia util izando o reagente liofilizado de HYNIC-octreotato para
pronta marcação com tecnécio-99m em camundongos Nude com tumor de
células AR42J (Tumor pancreático de ratos)
Utilizou-se o reagente liofilizado de HYNIC-octreotato do 3° lote para a
realização das imagens cintilográficas em camundongos Nude com tumor
90
pancreático. A pureza radioquímica da proteína marcada foi de 91,36%, sendo
que encontramos a presença de 7,59% de coligante marcado com tecnécio-99m.
As imagens cintilográficas foram realizadas 3 Inoras após a injeção em veia
caudal do camundongo (Figura 26).
' .1 ». Tumor
Rim
Bexiga
.^Filtro em ^ -bexiga
Projeção lateral Projeção lateral
Tumor
\ Filtro em rins e bexiga
Projeção lateral
Figura 26 - Imagens cintilográficas de camundongo Nude com massa
tumoral implantada em dorso. Imagens realizadas 3 horas após a injeção do
HYNIC-octreotato-^^nc
As imagens da Figura 26 mostram uma captação intensa em rins e bexiga
e, em grau menor, mais de importância relevante, captação em região da massa
tumoral. Foi utilizado o recurso de filtros de ciiumbo para melhor visualização da
captação do radiofármaco em região tumoral.
91
6- Discussão
As primeiras marcações do HYNIC-Tyr^-octreotato (HYNIC-octreotato)
utilizando o EDDA e a tricina como coligantes foram realizadas, de acordo com a
formulação indicada em literatura para o HYNIC-Tyr^-octreotideo (Guggenberg et
al.2004 e Ciavarro et al.2005;).
Sabendo-se que o pH final influencia diretamente no rendimento
radioquímico da marcação, foram analisadas diferentes faixas de pH entre 6 e 8.
A variação do pH foi realizada no tampão fosfato 0,2N utilizado na dissolução do
coligante tricina. Os melhores resultados foram estabelecidos na faixa de pH entre
6,5 e 7,0. Nesta condição a pureza radioquímica encontrada foi de 91,34 ± 3,58 %
do complexo HYNIC-Try^-octreotato-^^'^Tc uma hora após a marcação e 89,19 ±
4,51 % três horas após a marcação. A literatura determina que a pureza
radioquímica seja superior a 90 %, de forma a possibilitar uma aplicação clinica do
radiofármaco. Desta forma, obteve-se um produto dentro das especificações
(Hubalewska-Dydejczyk et al. 2006).
Verificou-se que a adição do manitol (utilizado posteriormente como
excipiente da formulação liofilizada) não interferiu no rendimento da marcação. A
partir da estrutura química do manitol, com grupamentos hidrofílicos polares,
poder-se-ia supor que atuasse como um coligante, em competição com os
coligantes introduzidos (EDDA e tricina) na formação do complexo EDDA-tricina-
Tyr^-HYNIC-octreotato-^^'^Tc. A análise de CLAE do complexo formado na
presença e ausência de manitol (Figuras 14 e 15, respectivamente) mostram
perfis praticamente idênticos, com tempo de retenção do complexo peptídeo
radiomarcado de aproximadamente 13 minutos (Tabelas 13 e 14). Se houve
participação do manitol na formação do complexo, esta não ficou evidenciada
pelo perfil do CLAE. Além disso, o perfil da CLAE também mostra um pico inicial
de 3,70 minutos que pode ser atribuído, inicialmente, à presença do coligante
marcado ou tecnécio livre.
As duas impurezas radioquímicas, coligante marcado e tecnécio livre,
foram identificadas nas análises por cromatografia em camada delgada em ITLC-
SG. Neste caso, a porcentagem de coligante marcado sempre foi ligeiramente
maior que a porcentagem de tecnécio livre. Ao se analisar os perfis de CLAE das
92
misturas de marcação com e sem manitol, 3 horas após a marcação, duas
espécies radioquímicas foram identificadas, com RT muito próximos e picos
^ parcialmente sobrepostos, representando impurezas radioquímicas das
marcações, correspondendo, provavelmente, ao tecnécio livre e coligante
t> marcado.
A literatura também relata duas espécies radioquímicas com tempo de
retenção curtos e próximos, utilizando sistemas de CLAE semelhantes ao
empregado neste trabalho, qual seja, cromatografia de fase reversa, com coluna
do tipo C18 e mistura gradiente utilizando acetonitrila e tampão ou solução
aquosa ácida com porcentagem crescente de acetonitrila em função do tempo,
embora os análogos da somatostatina marcados com tecnécio sejam diferentes.
Guggenberg e colaboradores (2004) marcaram o análogo HYNIC-Tyr^-
octreotídeo com tecnécio-99m, utilizando EDDA e tricina como coligantes, e
obtiveram em análise CLAE um pico de retenção aos 10,7 minutos que
' correspondeu ao peptídeo radiomarcado e outras duas espécies com tempos de
retenção de 2,4 e 3,2 minutos, que foram relacionados ao coligante marcado e ao
tecnécio livre (^^'^Tc04"), respectivamente.
I Gandomkar e colaboradores (2007) marcaram o análogo HYNIC-Tyr^-i
i octreotideo, também utilizando o EDDA e a tricina como coligantes, e obtiveram
duas espécies radioquímicas com tempos de retenção aos 4,43 e 5,90 minutos
que atribuíram, respectivamente, ao coligante marcado e tecnécio livre e uma
espécie principal com tempo de retenção de 12,86 minutos atribuída ao peptídeo
radiomarcado.
No presente estudo, o perfil de CLAE para o pertecnetato de sódio
determinou um tempo de retenção em 3,3 minutos (Figura 18 e Tabela 17).
Comparando-se os perfis de CLAE deste estudo obtidos 1 e 3 horas após a
marcação, observa-se pequena diferença no RT do pico correspondente ao
, peptídeo marcado bem como das impurezas. Tal diferença pode ser atribuída ao
processo manual de injeção da amostra no equipamento utilizado e não será
valorizada nesta discussão. Mais importante, é verificar que após 3 horas de
marcação, os picos correspondentes às impurezas (tecnécio livre e coligante
marcado) ficam mais evidentes, possibilitando concluir pela presença das duas
93
espécies.
Desta forma, o perfil CLAE para o composto marcado sem manitol 3 horas
após a marcação com ^^""Tc (Figura 16 e Tabela 15) identificou uma região com
tempo de retenção em 2,7 minutos (porém com um pico alargado sugerindo a
presença de duas espécies radioquímicas) e outra correspondente ao peptídeo
radiomarcado em 12 minutos.
O perfil CLAE para o composto marcado com adição de manitol
apresentou, 3 horas após sua marcação, 2 picos de impureza com tempos de
retenção em 2,60 e 2,90 minutos e um com tempo de 12,2 minutos que foi
atribuído ao peptídeo radiomarcado (Figura 17 e Tabela 16).
Comparando os tempos de retenção encontrados nos perfis CLAE com a
presença de manitol, principalmente no de 3 horas após a marcação, com os
dados encontrados na literatura (Guggenberg et al.2004), podemos atribuir os
tempos de retenção (RT) de 2,60 minutos e 2,90 minutos ao coligante marcado e
tecnécio livre, respectivamente e o pico com tempo de retenção de 12,20 minutos
ao peptídeo radiomarcado. As diferenças de RTs podem ser atribuídas ao fato da
comparação envolver dois análogos diferentes de somatostatina, embora
marcados com os mesmos coligantes, bem como à pequenas diferenças no
sistema CLAE utilizados.
Verificamos também, nas imagens cintilográficas em coelhos sadios
(Figura 19 e 20), que a presença de manitol no composto aparentemente não
altera sua biodistribuição. Ambas as cintilografias revelaram o rápido clareamento
sanguíneo do composto, captação renal significativa, acúmulo do composto na
bexiga devido à eliminação renal e ausência de captação em demais órgãos da
região abdominal.
O modelo tumoral escolhido para este estudo foi o camundongo Nude
inoculado com células AR42J (célula de tumor pancreático). Observou-se um
grande aproveitamento dos camundongos inoculados (80% obtiveram
crescimento de massa na região de implantação das células). A análise
histológica dessa massa indicou a presença de tecido neoplásico com alta
celularidade, o que garantiu a integridade do modelo utilizado nos estudos de
biodistribuição.
94
Nos estudos de biodistribuição em camundongos normais Swiss,
evidenciou-se uma alta concentração do radiofámaco em rins (64,07 ± 20,59 % e
22,93 ± 10,40 % dose/g 1 e 4 horas após injeção, respectivamente), fato
explicado pela hidrofilicidade do peptídeo marcado. Estudos evidenciam que os
ò rins, principalmente a célula tubular renal e vasa recta apresentam alta densidade
de receptores para somatostatina, especialmente os tipos sst2 e sst5
(Kwekkeboom et al. 2000). Tal fato também deve contribuir para a alta captação
renal além da reabsorção do peptídeo radiomarcado nas células tubulares após
filtração glomerular.
Comparativamente, a captação renal observada nos camundongos Nude
(21,12 ± 10,43 % e 3,98 ± 0,64 % dose/g 1 e 4 horas após injeção,
respectivamente), é menor que a observada nos camundongos Swiss, porém
ainda expressiva.
Gandomkar e col. (2007) observaram níveis de captação renal do
^ complexo HYNIC-Thr®-octreotideo em ratos Lewis de 2,95 ± 0,56 % e 2,13 ± 0,20
% dose/g 1 hora e 4 horas após a administração do radiofármaco. Kopecky e col.
(2004), em estudo de biodistribuição do complexo EDDA-HYNIC-octreotídeo-
^^""Tc em ratos Wistar descrevem captação renal de 6,92 ± 3,11 % e 4,86 ± 0,69
%, 1 e 2 horas após a administração do radiofármaco.
A alta captação renal observada na biodistribuição do HYNIC-octreotato-
99mTc em comparação aos estudos publicados, pode ser atribuída a uma série
de fatores, dentre eles, diferenças inter-espécies (considerando-se a possibilidade
de haver expressão diferente de receptores para somatostatina no tecido renal,
nas diferentes espécies de animais), diferenças no estado de hidratação dos
animais, além de tratarem-se de derivados diferentes da somatostatina
(afinidades distintas pelos diferentes tipos de receptores de somatostatina).
Ainda nos estudos de biodistribuição, em contrapartida, observa-se uma
baixa e favorável captação do HYNIC-octreotato-^^'^Tc em fígado e Intestinos
delgado e grosso, considerada uma grande qualidade do radiofármaco, uma vez
que existe uma alta incidência de tumores e metástases neuroendócrinas na
região abdominal e captações nesses órgãos dificultariam uma avaliação.
O composto estudado apresentou um rápido clareamento sanguíneo. Uma
1:
95
hora após administração observa-se menos de 1 % (0,42 ± 0,05 e 0,74 ± 0,48 %
dose sangue total em Nudes e Swiss, respectivamente) da dose administrada na
corrente sanguínea. Além disso, baixa captação em tireóide e estômago indicam
uma alta estabilidade in vivo.
A captação tumoral aparentemente baixa, especialmente se comparada
com órgãos como os rins, deve ser avaliada em termos das relações tumor:
órgãos não alvos. Neste sentido, a razão tumormúsculo para o tempo de uma
hora foi de 2,0 e para o tempo de 3 horas de 4,8 (calculadas a partir da %
dose/grama). A razão tumormúsculo indica a facilidade com que a massa tumoral
poderá ser contrastada do tecido não específico para efeito de aquisição de
imagem. Os valores obtidos de razão tumormúsculo são considerados
excelentes, principalmente considerando-se o aumento da razão com o tempo,
fato que indica a permanência relativa do produto no tumor, provavelmente
relacionada à especificidade de ligação aos receptores tumorais e capacidade de
internalização do produto.
Outra razão importante de ser observada é a razão tumorsangue. Também
neste caso, a razão aumenta com o tempo, sendo de 1,29 para 1 hora e 1,92 para
4 horas, indicando a especificidade da ligação do composto ao tumor
Comparando-se o perfil de biodistribuição encontrado neste estudo com os
da literatura, observa-se que, embora os valores absolutos sejam diferentes, a
biodistribuição é comparável. Tais diferenças devem ser analisadas com critério,
tendo em vista o modelo animal e tumoral utilizado.
A literatura descreve diferentes formulações de reagentes liofilizados,
como por exemplo, utilizando frascos separados, ou seja, coligantes liofilizados
em um frasco e peptídeo e agente redutor em outro (Ciávaro et al, 2005).
Optou-se pela formulação mais prática, tanto para sua produção como para
a marcação, disponibilizando-se todos os reagentes liofilizados em um único
frasco, acompanhando para a marcação um frasco com tampão fosfato 0,1 M pH
6,2.
Avaliando a estabilidade do reagente liofilizado com pré-congelamento em
nitrogênio líquido até o 4° mês, não foram evidenciadas diferenças no rendimento
radioquímico das marcações dos liofilizados, ficando acima de 90 % da espécie
96
ativa em ambos os casos. O controle de 6 meses já demonstrou uma queda do
rendimento de marcação (88,62% em ITLC e 86,54% em CLAE), indicando que
possivelmente o prazo estabelecido para utilização do reagente liofilizado seja de
4 meses (Tabela 18) para as condições de liofilização utilizada.
A análise da formulação realizada sem o pré-congelamento líquido foi
prejudicada por problemas identificados no liofilizador (mencionado em
resultados). Os rendimentos radioquímicos até o 4° mês foram superiores a 90%,
indicando, talvez, que o pré-congelamento não acrescentaria estabilidade ao
reagente liofilizado. No entanto existe a necessidade de comprovação destes
resultados, em um estudo envolvendo um número maior de lotes produzidos nas
duas condições estudadas.
Entre os estudos dos parâmetros de marcação, evidenciados nas Tabelas
21 , 22 e 23, a condição de atividade máxima de 1480 MBq (40mCi) de
pertecnetato de sódio em 2 mL e banho-maria a 100°C (água em ebulição) por
15 minutos foi a condição que apresentou melhores resultados no rendimento
radioquímico (rendimentos superiores a 92%). Os resultados sugerem que um
frasco do reagente liofilizado possibilitaria a marcação e utilização para um
paciente adulto, considerando-se uma faixa de atividade a ser administrada em
torno de 1110 MBq (30mCi).
97
7 -Conclusão
Os resultados deste estudo possibilitaram estabelecer a formulação do
reagente liofilizado HYNIC-Tyr^-octreotato para pronta marcação com ^^'"Tc e as
melhores condições de marcação.
Os estudos realizados permitem concluir que o regente liofilizado EDDA-
tricina-HYNIC-Tyr^-octreotato foi obtido com estabilidade suficiente para
comercialização do produto. Os estudos das variáveis de marcação definiram os
limites para obtenção de bons resultados de pureza radioquimica e contribuindo
para a composição da bula do produto no requisito "Instruções de marcação".
Os resultados dos estudos de biodistribuição e, particularmente, o rápido
clareamento sanguíneo, a captação insignificante na região abdominal e
significativa captação tumoral, elegem o composto como candidato potencial para
aplicações e ensaios clínicos envolvendo o diagnóstico de tumores
neuroendócrinos.
COMISSÃO mm^i m.fm. .^'LCI^AP.'SP-ÍPEN