Biologia Microbiana

Preparação de meios de culturaPesar constituintes

Dissolver(1 a 1 com agitação; aquecer se necessário)

Distribuir em tubos ou frascosAdicionar agar

Ajustar pH(se necessário)

Autoclavar

Plaquear

Cozer

Distribuir em tubos

Autoclavar

Solidificar em posição inclinada

Solidificar em posição vertical

AutoclavarFiltração∅ = 0.45 µm

Meios líquidosMeios sólidos

Embora existam numerosos meios de cultura os seus ingredientes essenciais são relativamente pouco numerosos. Constituintes essenciais para uma bactéria heterotrófica (E. coli): sais inorgânicos, fontes de carbono e azoto tipicamente glucose e (NH4)2SO4, tampão e um agente quelante como por exemplo o citrato ou EDTA .Meios de cultura: (i) composição química definida; (ii) complexos de composição química não definida baseados em hidrolizados proteicos; estes meios contêm uma mistura de produtos de degradação de proteínas como a caseína. Os principais métodos de hidrólise são: (a) hidrólise ácida (HCl) - hidrólise completa de proteínas parcialmente purificadas, como a caseína e a gelatina; (b) hidrólise enzimática pela pepsina, pancreatina, tripsina ou papaína. A digestão enzimática produz hidrolizados parciais (Peptona, Triptona) que geralmente são mais eficientes para o crescimento do que os hidrolizados totais ou a mistura de aminoácidos.As culturas tendem a modificar o pH durante o crescimento, estas alterações podem ser minimizadas incluindo um tampão no meio.Agente solidificante: Agar - polissacárido que forma um gel com a água (ponto de fusão 100ºC, solidifica a 40º - 45ºC), resiste à digestão pela maioria dos microrganismos. NOTA: o agar é hidrolizado em solução ácida após autoclavagem.Métodos de esterilização:1 - Calor: (a) calor húmido: (i) autoclave; (ii) tindalização (aquecimento a 100ºC 10 min - morte das células vegetativas - incubação durante algumas horas a 30ºC para germinação dos esporos - o ciclo repete-se 2 a 3x); (iii) fervura; (iv) pasteurização - aquecimento a temperaturas <100ºC; (b) calor seco -estufa.2 - Desinfectantes químicos3 - Filtração4 - Irradiação

Biologia Microbiana

Morfologia da colónia

Morfologia celular

Colónias

Morfologia

Cocos

Bastonetes

Cocobacilos

Isolados

Cadeias

Pares

Tétradas

Endósporos

Cápsulas

Células

Morfologia

Diâmetro

Pigmentação

Consistência

Opacidade

Textura

Forma

Elevação

Margem

- microscopia -

Características microscópicas

Dimensão: variável; podem formar uma colónia de tamanho limitado, independentemente do período de incubação; outras espalham-se à superfície do agar.Pigmentação: a coloração é variável.Consistência: seca, pulverulenta, húmida, viscosa.Opacidade: opaca, translúcida, iridiscente.Textura: lisa, rugosa, granular, radiada, concentricamente zonada.Forma: punctiforme, circular, elíptica, tripartida.Elevação: plana, elevada, convexa, estratificada.Margem: inteira, filamentosa, ciliada, lobadaOs endósporos bacterianos são estruturas de resistência - células vegetativas de paredes espessadas formadas durante a esporulação, que são resistentes à radiação, agentes químicos, temperaturas extremamente elevadas, dessecação (Bacillus e Clostridium).Cápsula: camada de polissacáridos(por vezes proteínas) protege a célula bacteriana, muitas vezes associada com bactérias patogénicas porque serve como uma barreira contra a fagocitose.

Biologia Microbiana

Células - suspensões

Contagem de células totais

cfu por µl vol. =superfície contada (mm2)* x profundidade

da câmara (0,1 mm) x diluição

cfu contadas

cfu/µl =nº contados x 1/400 x 0,1 x 10-D

células contadas

* = nº contados x 1/400

=nº contados

cfu contadasx 4000 x 10D = N x 4 x 103 x 10D

cfu/ml = N x 4 x 106 x 10D

1 mm

1 mm

Vcamâra = 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm3 400 quadrados pequenos (25 x 16 ) Vcontagem = 0,1/400 mm3 = 1/4 x 106 mL

O número total de células é geralmente determinado com o auxílio de uma câmara de contagem calibrada que é observada ao microscópio. Uma câmara típica tem uma depressão central, cuja superfície está dividida em quadrados de área conhecida.Uma gota da suspensão bacteriana é colocada nesta superfície e coberta com uma lamela espessa.9 quadrados - 1 quadrado = 1 mm2 - volume total = 0,9 mm3.

Biologia Microbiana

Escala de McFarland

McFarland Scale

No. Bacteria (x106/ml)

1 300

2 600

3 900

4 1200

5 1500

6 1800

7 2100

8 2400

9 2700

10 3000

McFarland Standards are tubes labelled 1 through 10 and filled with suspensions of Barium salts.

Células totais

McFarland Standard No. 0.5 1 2 3 4

1.0% Barium chloride (ml) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4

1.0% Sulphuric acid (ml) 9.95 9.9 9.8 9.7 9.6

Approx. cell density (1X108ml) 1.5 3.0 6.0 9.0 12.0

% Transmittance* 74.3 55.6 35.6 26.4 21.5

Absorbance* 0.132 0.257 0.451 0.582 0.669

*Wavelength of 600 nm

McF 0.5 Ec 0.5 SF

Células - suspensões

Correlação com:

- peso fresco

- peso seco

- células/ml

- cfu/ml

Escala de McFarland - padrões de turbidez: BaCl2 1% e H2SO4 1% em diferentes proporções de modo a formar suspensões turvas de BaSO4.O número de células de uma supensão bacteriana pode ser determinado em aproximação, por comparação com os padrões da escala de McFarland.

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1

5

2

1

7

6

4

3

Purificação por esgotamento do inóculo

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PREPARAÇÃO DE UM ESFREGAÇO BACTERIANO

Espalhar a mistura H2O-bactérias

Secar ao ar

H2O + bactérias

1 2

3

Fixar pelo calor

4

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COLORAÇÃO

de

GRAM

Esfregaço

Lavar

Lavar

Violeta Cristal = 1 min

G+ G-

Lugol = 1 min

Álcool 95% até sair todo corante

Secar c/ papel

G+ G-

Lavar

Lavar

Safranina = 1 min

16

5

4

3

2

9

8

7

10 11

As células são fixadas pelo calor e coradas com um corante básico, O violeta cristal, que cora as células de azul; as preparações são depois tratadas com lugol que permite que o iodo penetre nas células e forme um complexo insolúvel em água com o violeta cristal. Este complexo é posteriormente eliminado com uma lavagem com alcool a 95% ou acetona, que solubilizam o complexo iodo-violeta cristal. Após o tratamento com o solvente apenas as bactérias gram + permanecem coradas, possivelmente devido à sua espessa parede celular, que não é permeável ao solvente. As células são então tratadas com um contracorante (safranina ou ácido fucsinico), para permitir a visualização das células gram - que se encontram descoradas. As células gram - aparecem coradas de vermelho e as gram + de azul (violeta).

Biologia Microbiana

CARÁCTER GRAM (Teste de KOH 3%)

Misturar KOH 3% + bactériasKOH 3% + bactérias

Gram negativa Gram positiva

1 2

3 3

teste KOH 3% (+) teste KOH 3% (-)

A parede das bactérias gram + é resistente à solução alcalina e por isso não ocorre lise celular. A parede das bactérias gram - não é resistente à solução alcalina e por isso ocorre lise celular; o DNA reage com o KOH e há formação de um fio viscoso

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TESTE DA CATALASE

palitos

Peróxido de hidrogénio + bactérias

H2O2

1

Misturar H2O2 + bactérias

2

catalase positiva (+)

3

catalase negativa (-)

3

2 H2O2 2 H2O + O2catalase

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TESTE DA OXIDASE

Misturar bactérias + TMPD contra papel de filtro

papel de filtro +tetrametil parafenilenodiamina

dihidrocloreto + bactéria

oxidase negativa (-)

TMPD

oxidase positiva (+)

1 2

3 3

Células c/ coloração violeta (resultado imediato)Oxidação do TMPD ► Redução do citrocromo c

palitos

Biologia Microbiana

COLORAÇÃO

de

ENDÓSPOROS

Esfregaço Bacillus sp.

Papel de filtro+

Verde malaquite

Safranina = 1 min

Secar c/ papel

Lavar

15

26

5 min s/ ferver

Lavar4

37

8

Cobre-se o esfregaço com papel de filtro (para evitar a evaporação do corante) saturado com verde malaquite (corante para endósporos - não tem afinidade para as células vegetativas). Aquece-se à chama 5 min sem deixar secar o papel de filtro para auxiliar a penetração do corante nos endósporos.