Prática 8: Bolores e Leveduras (Reino Fungi)

Introdução:

O termo fungus (plural fungi) engloba organismos eucarióticos, com tipo de nutrição absorvativo, produtores de esporos, sem clorofila, e com reprodução assexuada e sexuada. Baseado na caracterização dos genes SSU rRNA e forma das cristas mitocôndriais, foram os fungos organizados filogenéticamente, em Eumycota (Verdadeiros Fungos) e Bolores Mucosos (Slime Moulds). Nos Eumycota incluem-se os Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes e Chytridiomycetes, os quais possuem mitocôndrias com cristas lamelares. Nos Bolores Mucosos incluem-se os Acrasiomycota (Bolores Mucosos Celulares) e os Myxomycota (Bolores Mucosos Acelulares). Estes por sua vez possuem mitocôndrias com cristas tubulares.

Finalmente os Oomycota (Bolores Aquáticos) incluem-se nos Stramenophiles e possuem também mitocôndrias com cristas tubulares (ver Prescott et al. 1999 ou edições mais recentes). Os fungos distribuem pelo meio terrestre e aquático, englobando espécies com importância industrial, pela sua capacidade de produzir ácidos, antibióticos etc, a nivel ambiental actuando como organismos decompositores de matéria orgânica, e por isso participando na reciclagem dos nutrientes (Prescott et al. 1999; Rheinheimer, 1992). Algumas espécies de fungos são agentes patogénicos em plantas e animais, e ainda outros produzem toxinas altamente venenosas.

As leveduras são caracterizadas por uma fase de desenvolvimento assexuado, com divisão por gemulação e uma fase sexuada com conjugação de 2 ascosporos ou 2 células somáticas, as quais funcionam como 2 gametangia. As leveduras que produzem ascosporos pertencem aos Ascomycota, aquelas que produzem basidiosporos incluem-se nos Basidiomycota. (ver www.mycolog.com, o site de Bryce Kendrick).

Pretende-se nesta aula examinar a estrutura de certos fungos, bolores e leveduras, classificá-los de acordo com a sua estrutura, observada ao microscópio óptico e com a ajuda de textos de apoio (Seeley et al. 1991; Collins et al. 1991).

Material e Métodos

O material necessário à execução deste trabalho prático consta de:

- Tubo de ensaio contendo o meio Agar Sabouraud Dextrose, em banho-maria, em placa de aquecimento. - Lâminas e lamelas de vidro. -Álcool 70-96% para esterilização e desinfecção. - Pinças de metal, ansas, e espátulas - Pipetas esterilizadas - Caixas de Petri esterilizadas - Papel de Filtro Circular - Lamparinas e fósforos - Pipetas Pasteur - Sacos Plásticos e Selador

- Água corrente, (em Erlenmeyer pequenos, com rolha de algodão) esterilizada por fervura em placa de aquecimento. - Iodo de Gram - Frutos variados, pão bolorento, fermento de padeiro.

O método a utilizar para a preparação dos Bolores descreve-se em seguida:

1ª Fase:

Preparação da Lâmina de Henrici

1. Limpe bem uma lâmina de vidro com álcool e sobre ela deite uma gota de meio agar Sabouraud Dextrose mantido líquido no banho-maria. Utilizaremos neste processo pipetas Pasteur de pontas grossas, as quais foram mantidas na estufa.

2. Após a solidificação da gota sobre a lâmina, corte -a mais ou menos a meio com uma pequena espátula esterilizada ou com uma ansa.

3. Utilizando uma ansa esterilizada, transfira uma amostra de bolor dos frutos ou em crescimento em agar nutriente para a gota de agar Sabouraud-Dextrose exactamente junto à área de corte.

4. Com uma pinça esterilizada, pegue numa lamela, mergulhar em álcool, passar na chama da lamparina para secar o álcool e colocar a lamela em cima da gota do meio inoculado. Pressione ligeiramente a lamela sobre o meio inoculado com ajuda da pinça.

5. Transfira a preparação para uma caixa de petri, cuja base contem um papel de filtro circular e um espalhador tal como se observa na fig. 65-1(retirada de Seeley et al. 1991) que o seu orientador lhe mostrará. A preparação fica sobre o espalhador.

6. Adicione 0.5 ml de água corrente esterilizada ao papel de filtro. Coloque a caixa de petri sem tampa dentro de um saco plástico, sele o saco e incube a 25oC ( na bancada do laboratório).

O método a utilizar para a preparação das leveduras descreve-se em seguida:

- Semeie meio Agar Sabouraud Dextrose com fermento, previamente díluido em água esterilizada. Utilize uma ansa e execute movimentos de zig-zag sobre o meio.

2ª Fase

Na próxima aula procederá ao exame dos bolores ao microscópio utilizando o seguinte procedimento:

1. Remova a lâmina do seu saco plástico (câmara húmida), e observe-a ao microscópio com objectiva 10x. Observe o micélio desenvolvido com as suas hifas.

2. Com cuidado observe com objectiva superior a fim de estudar a estrutura das hifas, verificando se são septadas ou não septadas. Desenhe o que vê ao microscópio, e reportando-se aos textos de apoio procure identificar o bolor.

das leveduras:

- Faça uma preparação a fresco da cultura de levedura desenvolvida no agar SD, numa gota de água iodada (1 gota de água e 1 gota de iodo de Gram). Observe ao microscópio com objectiva de imersão (Neste caso coloque lamela em cima da preparação).

A observação da fase sexuada do ciclo da levedura requer a sua sementeira em meio glucose-acetato por 2 a 3 semanas.

Literatura de Apoio:

Capitulo 25 de Prescott et al. (1999), capitulos 50 e 51 de Collins et al. (1999) são algumas das bibliografias úteis.